會計學1課題(kètí)分解纖維素的微生物的分離第一頁，共39頁。植物的根、莖、葉等器官中都含有(hányǒu)大量的纖維素，麻、棉花、麥稈、稻草、甘蔗渣等，都是纖維素的豐富來源。一般木材中，纖維素占40～50%。麻棉花第1頁/共39頁第二頁，共39頁。植物纖維素第2頁/共39頁第三頁，共39頁。纖維素是一種重要的碳水化合物，土壤(tǔrǎng)中的某些微生物能將其分解利用。纖維素分解(fēnjiě)細菌第3頁/共39頁第四頁，共39頁。這些微生物之所以能夠將纖維素分解利用(lìyòng)，是因為他們能夠產生纖維素酶。為了能更好的應用這些(zhèxiē)微生物造福人類，我們首先要將他們從土壤環(huán)境中種類眾多的微生物中分離出來。第4頁/共39頁第五頁，共39頁。我們已經學習了怎樣(zěnyàng)從土壤中分離分解尿素的細菌，你能自己動手設計從土壤中分離分解纖維素微生物的方法嗎？想一想第5頁/共39頁第六頁，共39頁。課題3分解(fēnjiě)纖維素的微生物的分離專題2微生物的培養(yǎng)(péiyǎng)與應用第6頁/共39頁第七頁，共39頁。從土壤中分離(fēnlí)分解維生素的微生物。重點與難點第7頁/共39頁第八頁，共39頁。一、基礎知識（一）纖維素與纖維素酶1、纖維素（cellulose）組成(zǔchénɡ)：纖維素是由葡萄糖組成(zǔchénɡ)的大分子多糖。第8頁/共39頁第九頁，共39頁。纖維素結構式淀粉結構式第9頁/共39頁第十頁，共39頁。分布：纖維素是自然界中分布最廣、含量最多的一類多糖(duōtánɡ)，占植物界碳含量的50%以上。棉花中纖維素的含量接近100%，是最純的天然纖維素來源。第10頁/共39頁第十一頁，共39頁。作用：纖維素在造紙業(yè)中大量使用，是重要的造紙原料。纖維素可以(kěyǐ)制成甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素、微晶纖維素等衍生物。食物中的纖維素（即膳食纖維）對人體的健康也有著重要的作用。第11頁/共39頁第十二頁，共39頁。纖維素纖維二糖C1酶、Cx酶2、纖維素酶纖維素酶是一種(yīzhǒnɡ)復合酶組成纖維素酶包括三種(sānzhǒnɡ)組成：外切酶（C1酶）、內切酶（Cx酶)葡萄糖苷酶纖維二糖葡萄糖葡萄糖苷酶第12頁/共39頁第十三頁，共39頁。作用：內切酶作用于無定形的纖維(xiānwéi)素區(qū)域，使纖維(xiānwéi)素斷裂成片段；外切酶作用于纖維(xiānwéi)素的結晶區(qū)域或小片段纖維(xiānwéi)素，產生纖維(xiānwéi)二糖；纖維(xiānwéi)二糖再由葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。葡萄糖苷酶內切酶外切酶內切酶葡萄糖第13頁/共39頁第十四頁，共39頁。（二）纖維素分解(fēnjiě)菌的篩選1、剛果紅染色法在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅，在培養(yǎng)基表面生長的纖維素分解菌周圍會產生以菌落(jūnluò)為中心透明圈。纖維素分解細菌在剛果紅板上形成透明圈第14頁/共39頁第十五頁，共39頁。方法(fāngfǎ)一：先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進行顏色反應。優(yōu)點：這樣(zhèyàng)顯示出的顏色反應基本上是纖維素分解菌的作用。缺點：操作繁瑣，加入剛果紅溶液會使菌落(jūnluò)之間發(fā)生混雜。第15頁/共39頁第十六頁，共39頁。方法(fāngfǎ)二：在倒平板時加入剛果紅。優(yōu)點：操作簡便(jiǎnbiàn)，不存在菌落混雜問題。缺點1：由于在纖維素粉和瓊脂、土豆汁中都含有淀粉類物質，可以(kěyǐ)使能夠產生淀粉酶的微生物出現(xiàn)假陽性反應。缺點2：有些微生物具有降解色素的能力，他們在長時間培養(yǎng)過程中會降解剛果紅而形成明顯的透明圈，與纖維素分解菌不易區(qū)分。第16頁/共39頁第十七頁，共39頁。2、剛果紅染色法的原理(yuánlǐ)剛果紅能與纖維素形成紅色復合物，而不與水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生此反應。當在含有纖維素的培養(yǎng)集中加入剛果紅時，剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復合物。當纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅——纖維素的復合物就無法形成，培養(yǎng)基中會出現(xiàn)(chūxiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈。第17頁/共39頁第十八頁，共39頁。二、實驗設計將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋分離分解纖維素微生物實驗流程示意圖挑選產生透明圈的菌落第18頁/共39頁第十九頁，共39頁。討論(tǎolùn)本實驗的流程與課題(kètí)2中的實驗流程有哪些異同？答：課題2是將土樣制成的菌懸液直接涂布在以尿素為唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離得到菌落(jūnluò)。本實驗通過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到繁殖后，再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其他步驟基本一致。第19頁/共39頁第二十頁，共39頁。具體(jùtǐ)操作步驟：1、土樣采集方法與課題2類似。土樣采集要在富含纖維素的環(huán)境中進行，如果找不到適合的環(huán)境，可以(kěyǐ)將濾紙埋在土壤中，過一個月左右也會有能分解纖維素的微生物生長。第20頁/共39頁第二十一頁，共39頁。思考為什么要在富含纖維素的環(huán)境中尋找(xúnzhǎo)纖維素分解菌？答：由于生物與環(huán)境的相互依存關系，在富含纖維素的環(huán)境中，纖維素分解菌的含量相對(xiāngduì)提高，因此從這種土樣中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。第21頁/共39頁第二十二頁，共39頁。思考將濾紙埋在土壤(tǔrǎng)中有什么作用？你認為濾紙應該埋進土壤(tǔrǎng)多深？答：將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對聚集，實際上是人工設置(shèzhì)纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應將紙埋于深約10cm的腐殖土壤中。第22頁/共39頁第二十三頁，共39頁。2、選擇培養(yǎng)稱取土樣20g，在無菌條件下加入裝有30mL培養(yǎng)基的搖瓶中。30℃震蕩培養(yǎng)1-2天，至培養(yǎng)基變渾濁。進行(jìnxíng)梯度稀釋和涂布平板。第23頁/共39頁第二十四頁，共39頁。纖維素粉5.0gNaNO31.0gKH2PO40.9gNa2HPO4·7H2O1.2gMgSO4·7H200.5gKCl0.5g水解酪素0.5g酵母膏0.5g蒸餾水1000mL纖維素分解菌的選擇(xuǎnzé)培養(yǎng)基配方第24頁/共39頁第二十五頁，共39頁。鑒別纖維素分解(fēnjiě)菌的培養(yǎng)基配方CMC-Na5-10gKH2PO40.25g瓊脂15g土豆汁100mL酵母膏0.5g蒸餾水1000mL第25頁/共39頁第二十六頁，共39頁。3、剛果紅染色法分離纖維素分解菌將滅菌后的固體培養(yǎng)(péiyǎng)基熔化，按無菌操作要求，在無菌培養(yǎng)(péiyǎng)皿中倒入15-20mL培養(yǎng)(péiyǎng)基，凝固后待用。將選擇培養(yǎng)(péiyǎng)后的培養(yǎng)(péiyǎng)基進行梯度稀釋至106。將稀釋好的菌懸液涂布在培養(yǎng)(péiyǎng)基上，進行培養(yǎng)(péiyǎng)至有菌落長出。同時設置對照。第26頁/共39頁第二十七頁，共39頁。三、操作(cāozuò)提示1、復習(fùxí)微生物技術a培養(yǎng)基的配制(pèizhì)b無菌操作技術c稀釋涂布平板法d選擇培養(yǎng)基的作用e土壤取樣第27頁/共39頁第二十八頁，共39頁。2、選擇(xuǎnzé)培養(yǎng)的操作方法土樣選擇(xuǎnzé)培養(yǎng)基培養(yǎng)(péiyǎng)吸取部分培養(yǎng)液新鮮的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)稀釋涂布第28頁/共39頁第二十九頁，共39頁。想一想為什么選擇(xuǎnzé)培養(yǎng)能夠“濃縮”所需的微生物？答：在選擇培養(yǎng)(péiyǎng)條件下，可以使那些能夠適應這種營養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應這種營養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用。第29頁/共39頁第三十頁，共39頁。視頻(shìpín)一：分解(fēnjiě)纖維素的微生物的分離1第30頁/共39頁第三十一頁，共39頁。視頻(shìpín)二：分解(fēnjiě)纖維素的微生物的分離2第31頁/共39頁第三十二頁，共39頁。視頻(shìpín)三：分解(fēnjiě)纖維素的微生物的分離3第32頁/共39頁第三十三頁，共39頁。四、結果(jiēguǒ)分析與評價1、培養(yǎng)基的制作(zhìzuò)是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落？對照的培養(yǎng)(péiyǎng)基在培養(yǎng)(péiyǎng)過程中沒有菌落長出說明培養(yǎng)(péiyǎng)基制作合格。如果觀察到產生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。第33頁/共39頁第三十四頁，共39頁。2、分離的結果是否(shìfǒu)一致？由于在土壤中細菌的數量遠高于真菌和放線菌的數量，因此最容易分離得到(dédào)的是細菌。由于所取土樣的環(huán)境不同，可能得到(dédào)真菌和放線菌等不同的分離結果。第34頁/共39頁第三十五頁，共39頁。五、課題(kètí)延伸纖維素酶發(fā)酵(fājiào)方法:液體(yètǐ)發(fā)酵固體發(fā)酵纖維素酶測定方法:

對纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產生的葡萄糖進行定量測定第35頁/共39頁第三十六頁，共39頁。基礎知識實驗設計纖維素組成(zǔchénɡ)纖維素酶操作(cāozuò)提示復習(fùxí)微生物技術分布組成作用剛果紅法作用實驗流程圖纖維素酶測定方法選擇培養(yǎng)的操作方法分解