第2章細(xì)胞工程第2節(jié)動(dòng)物細(xì)胞工程二動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)與單克隆抗體教學(xué)分析教學(xué)分析教學(xué)目標(biāo)1.通過分析動(dòng)物細(xì)胞融合的概念和生物學(xué)原理，探究動(dòng)物細(xì)胞融合的常用技術(shù)方法，培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)探究能力和生命觀念。2.建構(gòu)單克隆抗體制備的基本流程圖，闡釋單克隆抗體制備流程。（生命觀念、科學(xué)思維）3.通過分析單克隆抗體的特點(diǎn)及其在臨床上的應(yīng)用價(jià)值，培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)思維能力和社會責(zé)任感。教學(xué)重難點(diǎn)重點(diǎn):建構(gòu)單克隆抗體制備的基本流程圖，闡釋單克隆抗體制備流程。難點(diǎn):單克隆抗體制備過程中雜交瘤細(xì)胞的篩選原理。教學(xué)方法1.講授法：講解動(dòng)物細(xì)胞融合的原理、方法，單克隆抗體的概念、制備過程等基礎(chǔ)知識。2.直觀演示法：利用圖片、動(dòng)畫、視頻等多媒體手段，展示動(dòng)物細(xì)胞融合和單克隆抗體制備的過程。3.討論法：組織學(xué)生圍繞單克隆抗體的應(yīng)用價(jià)值、生物技術(shù)的倫理問題等進(jìn)行討論。4.探究法：引導(dǎo)學(xué)生設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，解決實(shí)際問題，例如利用單克隆抗體檢測某種疾病。課時(shí)安排1課時(shí)教學(xué)準(zhǔn)備多媒體、白板、學(xué)案、PPT等。課前任務(wù)：請學(xué)生搜集單克隆抗體在疾病檢測中的應(yīng)用和“生物導(dǎo)彈”——ADC的藥物種類及其在醫(yī)療領(lǐng)域中的應(yīng)用實(shí)例。教學(xué)教學(xué)設(shè)計(jì)導(dǎo)入新課通過PPT展示課前讓同學(xué)們搜集的資料：1.AIDS1.AIDS、新型冠病毒抗原檢測試劑盒及其檢測原理：眾所周知，正常情況下人體感染某種病毒以后，機(jī)體免疫系統(tǒng)會對該病毒作出識別，并反應(yīng)性產(chǎn)生抗體，之后抗體可進(jìn)一步與病毒抗原發(fā)生特異性結(jié)合，這種特異性結(jié)合在體外也可發(fā)生。AIDS、新型冠狀病毒抗原檢測試劑盒就是利用了抗體與抗原能發(fā)生特異性結(jié)合的原理來捕獲特定抗原，進(jìn)而初步判斷有無新型冠狀病毒感染，操作相對簡單便捷，適合居家自測。資料2.高效的細(xì)胞毒素類藥物進(jìn)行化療可以有效殺傷腫瘤細(xì)胞，但細(xì)胞毒素沒有特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)還會對健康細(xì)胞造成傷害，這限制了它在臨床上的應(yīng)用。科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，將細(xì)胞毒素與能特異性識別腫瘤抗原的單克隆抗體結(jié)合，研發(fā)而成的抗體藥物偶聯(lián)物（ADC），可有效實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷。通過上述資料，引導(dǎo)同學(xué)們認(rèn)識到抗體在醫(yī)療領(lǐng)域中的某些特殊應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)，請同學(xué)們結(jié)合已有免疫學(xué)知識思考：如何獲得針對某種抗原的特異性抗體？在同學(xué)們思考回答后，簡要介紹傳統(tǒng)抗體制備流程及其難以提純的劣勢，科學(xué)家們對通過體外培養(yǎng)B淋巴細(xì)胞來獲取抗體的嘗試及失敗的原因。復(fù)習(xí)回顧植物體細(xì)胞雜交技術(shù)的優(yōu)勢（打破生殖隔離，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交育種，在培育植物新品種等方面展示出獨(dú)特的優(yōu)勢）?？煞駞⒄沾思夹g(shù)培育出集不同優(yōu)勢于一身的動(dòng)物細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生能夠大量增殖且能產(chǎn)生特異性抗體的細(xì)胞呢？(設(shè)計(jì)意圖：結(jié)合免疫學(xué)和植物體細(xì)胞雜交的相關(guān)知識，由生活情境分析導(dǎo)入,引出本節(jié)課要解決的問題，既能激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣,又能引導(dǎo)學(xué)生深入了解主題，效果較好。)過渡：PPT展示科學(xué)研究歷程——19世紀(jì)30年代，科學(xué)家們相繼在肺結(jié)核、天花、水痘、麻疹等疾病患者的病理組織中觀察到多核細(xì)胞。1958年日本學(xué)者岡田(Okada)發(fā)現(xiàn)仙臺病毒具有誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合的效應(yīng)。1962年，日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)日本血凝性病毒能引起艾氏腹水瘤細(xì)胞融合成多核細(xì)胞。1965年，英國科學(xué)家進(jìn)一步證實(shí)了滅活的病毒在適當(dāng)條件下也可以誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合。探究一、動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)篩選A篩選A細(xì)胞B細(xì)胞加入滅活病毒混合培養(yǎng)A細(xì)胞群B細(xì)胞群X細(xì)胞群克隆化培養(yǎng)雜交細(xì)胞1.融合之前為什么要先對目標(biāo)細(xì)胞克隆化培養(yǎng)？2.動(dòng)物細(xì)胞誘導(dǎo)融合常用的方法有哪些？3.在利用病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合時(shí)為什么要先滅活？滅活病毒誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合的原理是什么？4.誘導(dǎo)融合后的細(xì)胞為什么還要經(jīng)過篩選？5.科學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，某些動(dòng)物細(xì)胞融合形成雜交細(xì)胞后，雖然雜交細(xì)胞含有了兩親本細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，但是卻并未表現(xiàn)出預(yù)期的融合性狀，試根據(jù)所學(xué)知識分析可能的原因。學(xué)生獨(dú)立思考后，組織進(jìn)行小組交流并展示，教師予以點(diǎn)評補(bǔ)充。（設(shè)計(jì)意圖：通過結(jié)合動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)流程示意圖，引導(dǎo)同學(xué)們帶著問題閱讀、整合教材基礎(chǔ)知識，同時(shí)通過分析培養(yǎng)后篩選的目的，為下一環(huán)節(jié)單克隆抗體制備過程中的難點(diǎn)問題“為什么要進(jìn)行兩次篩選”做好鋪墊。）評價(jià)設(shè)計(jì)：教師展示學(xué)案【拓展應(yīng)用】“動(dòng)物細(xì)胞融合與植物體細(xì)胞雜交的比較”表格的答案，小組成員互評，最后教師點(diǎn)評。教師點(diǎn)評環(huán)節(jié)重點(diǎn)突出動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)專用的融合方法及其結(jié)果和意義與植物體細(xì)胞雜交的區(qū)別。植物體細(xì)胞雜交動(dòng)物細(xì)胞融合原理細(xì)胞膜流動(dòng)性、植物細(xì)胞的全能性細(xì)胞融合前的處理方法誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法結(jié)果意義探究二、單克隆抗體及其應(yīng)用PPT展示思考題，學(xué)生自主閱讀教材第48~49頁“單克隆抗體及其應(yīng)用”及圖216，思考并回答下列問題。1.傳統(tǒng)的給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物反復(fù)注射某種抗原后從血清中分離制得的抗體為什么純度低、特異性差？2.米爾斯坦和科勒在制備單克隆抗體的過程中，向?qū)嶒?yàn)小鼠注射特定抗原后能否立即從其體內(nèi)獲取B淋巴細(xì)胞，為什么？3.米爾斯坦和科勒在制備單克隆抗體的過程中，向?qū)嶒?yàn)小鼠注射特定抗原時(shí)往往需要間隔一定時(shí)間多次注射，其原因是什么？4.結(jié)合課本圖216和給定的資料，設(shè)計(jì)從融合細(xì)胞體系中篩選能產(chǎn)生所需特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方案。資料1：克隆選擇學(xué)說認(rèn)為：免疫系統(tǒng)中的B細(xì)胞和T細(xì)胞表面的特異性受體具有獨(dú)特的抗原結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)某一B細(xì)胞或T細(xì)胞的受體與抗原匹配時(shí)，該細(xì)胞會被激活。激活的細(xì)胞通過克隆擴(kuò)增，產(chǎn)生大量具有相同抗原特異性的細(xì)胞。激活的B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，分泌大量特異性抗體。激活的T細(xì)胞分化為效應(yīng)T細(xì)胞，直接攻擊被感染的細(xì)胞或輔助其他免疫細(xì)胞。部分激活的B細(xì)胞和T細(xì)胞分化為記憶細(xì)胞，長期留存在體內(nèi)。當(dāng)再次遇到相同抗原時(shí)，記憶細(xì)胞能迅速啟動(dòng)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。資料2：多孔板培養(yǎng)法是將培養(yǎng)中的動(dòng)物細(xì)胞稀釋后，制成細(xì)胞懸液，接種到96孔板中，保證每個(gè)孔中的細(xì)胞能夠獨(dú)立生長和增殖。將96孔板放在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期收集上清液用于特定分泌物檢測，將檢測呈陽性的孔內(nèi)的細(xì)胞保留，并用培養(yǎng)液稀釋至每孔約1個(gè)細(xì)胞，然后接種到新96孔板后繼續(xù)進(jìn)行上述操作，即可實(shí)現(xiàn)所需細(xì)胞的選擇純化和擴(kuò)大化培養(yǎng)。資料3：研究表明，細(xì)胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基蝶呤阻斷。免疫的B淋巴細(xì)胞有這兩種DNA的合成途徑，但它不能分裂增殖，其本身也不能在體外長期存活。小鼠骨髓瘤細(xì)胞只有D途徑，沒有S途徑，但它能不斷分裂增殖，如果它的D途徑被阻斷，則會因不能合成DNA而死亡。學(xué)生獨(dú)立思考并完成后，教師組織進(jìn)行小組交流，交流完成后小組展示，不同小組間相互補(bǔ)充，最后教師進(jìn)行點(diǎn)評和補(bǔ)充：問題1重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)：傳統(tǒng)抗體制備技術(shù)是從蛋白質(zhì)種類極為復(fù)雜多樣的血清中分離、提純某種特異性的抗體，這對技術(shù)要求非常高，且分離得到的抗體產(chǎn)量低、純度低、特異性差。問題2、3重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)：在從小鼠體內(nèi)獲取B淋巴細(xì)胞前，需要給小鼠多次注射抗原，以刺激小鼠的免疫系統(tǒng)，使其形成更多的能分泌特異性抗體的B淋巴細(xì)胞。問題4為單克隆抗體制備過程中的難點(diǎn)問題，如果同學(xué)們思考和回答有困難，可以在探究一問題4的基礎(chǔ)上給予同學(xué)們以下提示：篩選過程應(yīng)該分兩步，第一步是篩選雜交瘤細(xì)胞，由于誘導(dǎo)融合后產(chǎn)生的細(xì)胞并非都是雜交瘤細(xì)胞，因此需要用選擇培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞；第二步是篩選能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞，由于無法保證小鼠在實(shí)驗(yàn)前不接觸其他抗原，因此從小鼠體內(nèi)獲取的B淋巴細(xì)胞的種類是多樣化的，從而導(dǎo)致用選擇性培養(yǎng)基篩選獲得的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體也是多樣化的，故還需要通過抗體檢測進(jìn)行篩選。在此基礎(chǔ)上可進(jìn)一步延伸講解多孔板培養(yǎng)技術(shù)在分離純化動(dòng)物細(xì)胞上的應(yīng)用。（設(shè)計(jì)意圖：通過精心設(shè)計(jì)問題，引導(dǎo)同學(xué)們將教材基礎(chǔ)知識、給定的資料信息和教材流程圖信息進(jìn)行整合，在落實(shí)必備知識的同時(shí)進(jìn)一步提升學(xué)生獲取和加工信息的能力。）評價(jià)設(shè)計(jì)：結(jié)合【拓展應(yīng)用】問題回答情況，進(jìn)行評價(jià)，參考標(biāo)準(zhǔn)如下評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)成員1成員2成員3成員4成員5A等810分：單克隆抗體優(yōu)勢特點(diǎn)分析全面準(zhǔn)確，與臨床應(yīng)用對應(yīng)分析邏輯嚴(yán)密。B等48分：單克隆抗體優(yōu)勢特點(diǎn)分析全面，與臨床應(yīng)用分析基本對應(yīng)。C等04分：單克隆抗體優(yōu)勢特點(diǎn)能有分析但不全，與臨床應(yīng)用能基本對應(yīng)。評價(jià)反饋評價(jià)反饋結(jié)合當(dāng)堂訓(xùn)練完成情況給予評價(jià)課堂小結(jié)課堂小結(jié)教師用PPT展示學(xué)案背景材料及問題：【材料】研究發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）是一種細(xì)胞膜相關(guān)蛋白，其在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，而在正常肝組織中幾乎不表達(dá)。因此，GPC3是單克隆抗體的理想靶點(diǎn)。【問題】假設(shè)你是一家生物制藥公司的研發(fā)人員，請結(jié)合本節(jié)課的學(xué)習(xí)內(nèi)容，幫助公司設(shè)計(jì)開發(fā)一種新型單克隆抗體用于治療肝癌。（要求盡可能完整的闡釋研發(fā)流程）利用該問題情境引導(dǎo)學(xué)生總結(jié)本節(jié)課相關(guān)知識，構(gòu)建知識體系。布置作業(yè)布置作業(yè)完成課后練習(xí)（30分鐘）。教學(xué)反思教學(xué)反思本節(jié)課的教學(xué)設(shè)計(jì)以學(xué)生探究為中心，注重學(xué)生的自主學(xué)習(xí)與合作探究。在課堂上教師采用了問題引導(dǎo)、情境分析等方式展開教學(xué)。在整個(gè)教學(xué)過程中，充分發(fā)揮學(xué)生學(xué)習(xí)的主動(dòng)性，鼓勵(lì)他們大膽去探究、主動(dòng)地獲取知識，打造高效課堂。反思整堂課，主要在以下幾方面做得較好：(1)注重科學(xué)思維方式的教學(xué)，通過問題設(shè)計(jì)，引導(dǎo)學(xué)生運(yùn)用教材相關(guān)素材、已有知識和給定資料解決現(xiàn)實(shí)生活情境中的實(shí)際問題。(2)課堂上通過開展學(xué)生探究討論活動(dòng)，激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情。(3)通過學(xué)生的實(shí)地調(diào)研、資料整理、素材分析等多種策略，更加直觀地幫助學(xué)生梳理相關(guān)知識，形成體系。本堂課也有一些不足之處：課堂容量偏大，加上部分學(xué)生對免疫學(xué)相關(guān)知識理解不到位，某些問題分析起來有難度。如果多找些生活實(shí)例來強(qiáng)化學(xué)生對這部分內(nèi)容的理解，學(xué)生掌握得會更好。板書設(shè)計(jì)板書設(shè)計(jì)第2節(jié)動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)與單克隆抗體一、動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)1.概念：兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞融合成一個(gè)細(xì)胞2.誘導(dǎo)方法：PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法3.應(yīng)用：單克隆抗體制備二、單克隆抗體及其應(yīng)用細(xì)胞選擇→細(xì)胞培養(yǎng)→細(xì)胞融合→細(xì)胞篩選→細(xì)胞鑒定→擴(kuò)大化培養(yǎng)備課資源備課資源單克隆抗體的研發(fā)歷程單克隆抗體的研發(fā)歷史可以追溯到20世紀(jì)中期，以下是其發(fā)展的詳細(xì)歷程：

早期探索（20世紀(jì)初）抗體發(fā)現(xiàn)：20世紀(jì)初，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)動(dòng)物在感染病原體后會產(chǎn)生特異性抗體，這些抗體能夠識別并中和病原體。早期研究主要使用多克隆抗體，即由不同B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體混合物，雖然有效，但存在批次間差異和特異性不足的問題。理論基礎(chǔ)（20世紀(jì)中期）克隆選擇學(xué)說：1957年，澳大利亞免疫學(xué)家弗蘭克·麥克法蘭·伯內(nèi)特提出克隆選擇學(xué)說，解釋了抗體如何通過B細(xì)胞克隆產(chǎn)生，為單克隆抗體的研發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。技術(shù)突破（1975年）雜交瘤技術(shù)：1975年，喬治·克勒和塞薩爾·米爾斯坦成功開發(fā)雜交瘤技術(shù)，通過將B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，產(chǎn)生能夠無限增殖并分泌單一抗體的雜交瘤細(xì)胞，標(biāo)志著單克隆抗體技術(shù)的誕生。這一突破性成果使克勒和米爾斯坦在1984年獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。初步應(yīng)用（20世紀(jì)80年代）首個(gè)單抗藥物：1986年，美國FDA批準(zhǔn)首個(gè)單克隆抗體藥物OrthocloneOKT3用于預(yù)防腎移植后的排斥反應(yīng)，盡管存在副作用，但開啟了單抗治療的新時(shí)代。伴隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的興起，科學(xué)家開始通過基因工程改造抗體，減少免疫原性并提高療效。技術(shù)進(jìn)步（20世紀(jì)90年代）人源化抗體：20世紀(jì)90年代，人源化抗體技術(shù)出現(xiàn)，通過將鼠源抗體的可變區(qū)與人源抗體的恒定區(qū)結(jié)合，降低了免疫原性。治療性單抗：1997年，首個(gè)治療性單抗Rituxan（利妥昔單抗）獲批，用于治療非霍奇金淋巴瘤，標(biāo)志著單抗在癌癥治療中的成功應(yīng)用?？焖侔l(fā)展（21世紀(jì)初）全人源抗體：2002年，首個(gè)全人源單抗Humira（阿達(dá)木單抗）獲批，用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，進(jìn)一步減少了免疫原性。廣泛應(yīng)用：單抗在癌癥、自身免疫病、感染性疾病等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，成為生物制藥的重要組成部分。雙特異性抗體：雙特異性抗體能夠同時(shí)結(jié)合兩個(gè)不同抗原，增強(qiáng)了治療效