第2節(jié)二動物細(xì)胞融合技術(shù)與單克隆抗體第2章

細(xì)胞工程生物學(xué)習(xí)目標(biāo)1.通過問題探討，闡明動物細(xì)胞融合技術(shù)的概念和生物學(xué)原理，舉例說明誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合常用的技術(shù)方法。（科學(xué)探究、生命觀念）2.建構(gòu)單克隆抗體制備的基本流程圖，闡釋單克隆抗體制備流程。（生命觀念、科學(xué)思維）3.通過分析單克隆抗體的特點(diǎn)，認(rèn)同單克隆抗體在臨床上的重要應(yīng)用價值。（科學(xué)思維、社會責(zé)任）課堂導(dǎo)入資料1.AIDS、新型冠病毒抗原檢測試劑盒及其檢測原理：眾所周知，正常情況下人體感染某種病毒以后，機(jī)體免疫系統(tǒng)會對該病毒作出識別，并反應(yīng)性產(chǎn)生抗體，之后抗體可進(jìn)一步與病毒抗原發(fā)生特異性結(jié)合，這種特異性結(jié)合在體外也可發(fā)生。AIDS、新型冠狀病毒抗原檢測試劑盒就是利用了抗體與抗原能發(fā)生特異性結(jié)合的原理來捕獲特定抗原，進(jìn)而初步判斷有無新型冠狀病毒感染，操作相對簡單便捷，適合居家自測。資料2.利用高效的細(xì)胞毒素類藥物進(jìn)行化療可以有效殺傷腫瘤細(xì)胞，但細(xì)胞毒素沒有特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時還會對健康細(xì)胞造成傷害，這限制了它在臨床上的應(yīng)用?？茖W(xué)研究發(fā)現(xiàn)，將細(xì)胞毒素與能特異性識別腫瘤抗原的單克隆抗體結(jié)合，形成的抗體—藥物偶聯(lián)物（ADC）可有效實現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷。課堂導(dǎo)入醫(yī)療領(lǐng)域價值獨(dú)特如何獲得針對某種抗原的特異性抗體？體內(nèi)抗體分泌路徑溫故而知新：傳統(tǒng)抗體制備方法反復(fù)注射同種抗原動物血清中特異性抗體多達(dá)上百萬種??！產(chǎn)量低、純度低、特異性差！每種B淋巴細(xì)胞只產(chǎn)生一種特異性抗體可否通過體外培養(yǎng)單個B淋巴細(xì)胞來制備高純度抗體高度分化的B淋巴細(xì)胞難以在體外增殖！動物細(xì)胞融合技術(shù)19世紀(jì)30年代，科學(xué)家們相繼在肺結(jié)核、天花、水痘、麻疹等疾病患者的病理組織中觀察到多核細(xì)胞。1958年日本學(xué)者岡田(Okada)發(fā)現(xiàn)仙臺病毒具有誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合的效應(yīng)。1962年，日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)日本血凝性病毒能引起艾氏腹水瘤細(xì)胞融合成多核細(xì)胞。1965年，英國科學(xué)家進(jìn)一步證實了滅活的病毒在適當(dāng)條件下也可以誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合。啟示植物體細(xì)胞雜交技術(shù)探究一、動物細(xì)胞融合技術(shù)閱讀教材第48頁“動物細(xì)胞融合技術(shù)”內(nèi)容，結(jié)合動物細(xì)胞融合流程圖回答問題。

1.融合之前為什么要先對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)？2.動物細(xì)胞誘導(dǎo)融合常用的方法有哪些？

3.在利用病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合時為什么要先滅活？滅活病毒誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合的原理是什么？4.誘導(dǎo)融合后的細(xì)胞為什么還要經(jīng)過篩選？5.科學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)，某些動物細(xì)胞融合形成雜交細(xì)胞后，雖然雜交細(xì)胞含有了兩親本細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，但是卻并未表現(xiàn)出預(yù)期的融合性狀，試根據(jù)所學(xué)知識分析可能的原因。篩選A細(xì)胞B細(xì)胞加入滅活病毒混合培養(yǎng)

A細(xì)胞群B細(xì)胞群X細(xì)胞群克隆化培養(yǎng)雜交細(xì)胞探究一、動物細(xì)胞融合技術(shù)閱讀教材第48頁“動物細(xì)胞融合技術(shù)”內(nèi)容，結(jié)合動物細(xì)胞融合流程圖回答問題。

1.融合之前為什么要先對目標(biāo)細(xì)胞克隆化培養(yǎng)？由于誘導(dǎo)融合的成功率無法達(dá)到100%，因此往往需要在誘導(dǎo)融合前通過克隆化培養(yǎng)獲得更多的細(xì)胞，以保證融合后能夠獲得所需要的細(xì)胞。2.動物細(xì)胞誘導(dǎo)融合常用的方法有哪些？

PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法篩選A細(xì)胞B細(xì)胞加入滅活病毒混合培養(yǎng)

A細(xì)胞群B細(xì)胞群X細(xì)胞群克隆化培養(yǎng)雜交細(xì)胞探究一、動物細(xì)胞融合技術(shù)閱讀教材第48頁“動物細(xì)胞融合技術(shù)”內(nèi)容，結(jié)合動物細(xì)胞融合流程圖回答問題。

3.在利用病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合時為什么要先滅活？滅活病毒誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合的原理是什么？滅活的目的是使病毒失去感染能力，以防止病毒對細(xì)胞造成損傷；滅活病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細(xì)胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細(xì)胞相互凝聚，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合。篩選A細(xì)胞B細(xì)胞加入滅活病毒混合培養(yǎng)

A細(xì)胞群B細(xì)胞群X細(xì)胞群克隆化培養(yǎng)雜交細(xì)胞探究一、動物細(xì)胞融合技術(shù)閱讀教材第48頁“動物細(xì)胞融合技術(shù)”內(nèi)容，結(jié)合動物細(xì)胞融合流程圖回答問題。

4.誘導(dǎo)融合后的細(xì)胞為什么還要經(jīng)過篩選？為保證誘導(dǎo)融合的成功率，往往采用將克隆化培養(yǎng)的細(xì)胞群混合培養(yǎng)的方式誘導(dǎo)融合，該過程中會發(fā)生同種細(xì)胞以及不同種細(xì)胞相互融合和的現(xiàn)象，因此誘導(dǎo)融合的培養(yǎng)液中會存在未融合的親本細(xì)胞、融合的具有同種核的細(xì)胞和雜交細(xì)胞等多種細(xì)胞，所以融合后的細(xì)胞還要經(jīng)過篩選。篩選A細(xì)胞B細(xì)胞加入滅活病毒混合培養(yǎng)

A細(xì)胞群B細(xì)胞群X細(xì)胞群克隆化培養(yǎng)雜交細(xì)胞探究一、動物細(xì)胞融合技術(shù)閱讀教材第48頁“動物細(xì)胞融合技術(shù)”內(nèi)容，結(jié)合動物細(xì)胞融合流程圖回答問題。

5.科學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)，某些動物細(xì)胞融合形成雜交細(xì)胞后，雖然雜交細(xì)胞含有了兩親本細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，但是卻并未表現(xiàn)出預(yù)期的融合性狀，試根據(jù)所學(xué)知識分析可能的原因。不同生物細(xì)胞中基因的表達(dá)不是孤立的，它們之間是相互調(diào)控、相互影響的，因此，雜交細(xì)胞中雖然含有了兩親本細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，但這些遺傳物質(zhì)的表達(dá)相互干擾，不能像原有細(xì)胞那樣有序表達(dá)，雜交細(xì)胞也就不能同時表現(xiàn)出預(yù)期的融合性狀。篩選A細(xì)胞B細(xì)胞加入滅活病毒混合培養(yǎng)

A細(xì)胞群B細(xì)胞群X細(xì)胞群克隆化培養(yǎng)雜交細(xì)胞比較項目植物體細(xì)胞雜交動物細(xì)胞融合原理細(xì)胞膜流動性、植物細(xì)胞的全能性

細(xì)胞融合前的處理方法用__________________去除細(xì)胞壁，獲得__________目標(biāo)細(xì)胞的擴(kuò)大化培養(yǎng)誘導(dǎo)融合的方法

結(jié)果形成雜種植株

意義突破了___________，實現(xiàn)了遠(yuǎn)緣雜交育種，在___________________展現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢【拓展應(yīng)用】請結(jié)合動物細(xì)胞融合和植物體細(xì)胞雜交的相關(guān)知識完成下表。纖維素酶和果膠酶細(xì)胞膜的流動性原生質(zhì)體電融合法、離心法、聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+—高pH融合法PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法形成雜交細(xì)胞生殖隔離培育植物新品種方面突破了有性雜交的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能探究二：單克隆抗體及其應(yīng)用閱讀教材第48~49頁“單克隆抗體及其應(yīng)用”及圖2-16相關(guān)內(nèi)容，思考并回答下列問題：1.傳統(tǒng)的給實驗動物反復(fù)注射某種抗原后從其血清中分離制得的抗體為什么純度低、特異性差？2.米爾斯坦和科勒在制備單克隆抗體的過程中，向?qū)嶒炐∈篌w內(nèi)注射特定抗原后，能否立即從其體內(nèi)獲取B淋巴細(xì)胞，為什么？3.米爾斯坦和科勒在制備單克隆抗體的過程中，向?qū)嶒炐∈篌w內(nèi)注射特定抗原時往往需要間隔一定時間多次注射，其原因是什么？4.結(jié)合教材圖2-16“單克隆抗體制備過程示意圖”和資料1、2、3，設(shè)計從融合細(xì)胞體系中篩選能產(chǎn)生所需特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞的實驗方案。探究二：單克隆抗體及其應(yīng)用閱讀教材第48~49頁“單克隆抗體及其應(yīng)用”及圖2-16相關(guān)內(nèi)容，思考并回答下列問題。1.傳統(tǒng)的給實驗動物反復(fù)注射某種抗原后從其血清中分離制得的抗體為什么純度低、特異性差？傳統(tǒng)抗體制備主要通過向動物體內(nèi)反復(fù)注射某種抗原，使動物產(chǎn)生抗體，然后從動物血清中分離所需抗體。該方法是將所需抗體從蛋白質(zhì)種類極為復(fù)雜多樣的血清中分離、提純，由于受到分離技術(shù)條件的限制，得到的抗體產(chǎn)量低、純度低、特異性也較差。探究二：單克隆抗體及其應(yīng)用2.米爾斯坦和科勒在制備單克隆抗體的過程中，向?qū)嶒炐∈篌w內(nèi)注射特定抗原后能否立即從其體內(nèi)獲取B淋巴細(xì)胞，為什么？3.米爾斯坦和科勒在制備單克隆抗體的過程中，向?qū)嶒炐∈篌w內(nèi)注射特定抗原時往往需要間隔一定時間多次注射，其原因是什么？根據(jù)免疫學(xué)的相關(guān)知識，間隔一定時間再次注射同種抗原會引發(fā)二次免疫反應(yīng)，產(chǎn)生的B淋巴細(xì)胞和抗體會更多，更有利于從小鼠體內(nèi)獲得所需的B淋巴細(xì)胞。不能，給小鼠注射抗原的目的是刺激小鼠的免疫系統(tǒng)，使其形成能分泌特異性抗體的B淋巴細(xì)胞，該過程需要一定的時間，因此注射抗原后不能立即從其體內(nèi)獲取B淋巴細(xì)胞。探究二：單克隆抗體及其應(yīng)用4.結(jié)合教材圖2-16“單克隆抗體制備過程示意圖”和資料1、2、3，設(shè)計從融合細(xì)胞體系中篩選能產(chǎn)生所需特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞的實驗方案。資料1：克隆選擇學(xué)說認(rèn)為：免疫系統(tǒng)中的B細(xì)胞和T細(xì)胞表面的特異性受體具有獨(dú)特的抗原結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)某一B細(xì)胞或T細(xì)胞的受體與抗原匹配時，該細(xì)胞會被激活。激活的細(xì)胞通過克隆擴(kuò)增，產(chǎn)生大量具有相同抗原特異性的細(xì)胞。激活的B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，分泌大量特異性抗體。激活的T細(xì)胞分化為效應(yīng)T細(xì)胞，直接攻擊被感染的細(xì)胞或輔助其他免疫細(xì)胞。部分激活的B細(xì)胞和T細(xì)胞分化為記憶細(xì)胞，長期留存在體內(nèi)。當(dāng)再次遇到相同抗原時，記憶細(xì)胞能迅速啟動更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。探究二：單克隆抗體及其應(yīng)用資料2：多孔板培養(yǎng)法是將培養(yǎng)中的動物細(xì)胞稀釋后，制成細(xì)胞懸液，接種到96孔板中，保證每個孔中的細(xì)胞能夠獨(dú)立生長和增殖。將96孔板放在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期收集上清液用于特定分泌物檢測，將檢測呈陽性的孔內(nèi)的細(xì)胞保留，并用培養(yǎng)液稀釋至每孔約1個細(xì)胞，然后接種到新96孔板后繼續(xù)進(jìn)行上述操作，即可實現(xiàn)所需細(xì)胞的選擇純化和擴(kuò)大化培養(yǎng)。資料3：研究表明，細(xì)胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基蝶呤阻斷。免疫的B淋巴細(xì)胞有這兩種DNA的合成途徑，但它不能分裂增殖，其本身也不能在體外長期存活。小鼠骨髓瘤細(xì)胞只有D途徑，沒有S途徑，但它能不斷分裂增殖，如果它的D途徑被阻斷，則會因不能合成DNA而死亡。4.結(jié)合教材圖2-16“單克隆抗體制備過程示意圖”和資料1、2、3，設(shè)計從融合細(xì)胞體系中篩選能產(chǎn)生所需特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞的實驗方案。探究二：單克隆抗體及其應(yīng)用4.結(jié)合教材圖2-16“單克隆抗體制備過程示意圖”和資料1、2、3，設(shè)計從融合細(xì)胞體系中篩選能產(chǎn)生所需特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞的實驗方案。將誘導(dǎo)融合后的細(xì)胞用含有氨基蝶呤的培養(yǎng)液稀釋，然后置于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，一段時間后，用相應(yīng)的抗原檢測。將檢測呈陽性的孔中的細(xì)胞保留，并用培養(yǎng)液稀釋至每個培養(yǎng)孔中至多有一個細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)一段時間后，用相應(yīng)的抗原檢測，檢測呈陽性的孔中的細(xì)胞即為所需的雜交瘤細(xì)胞。為了獲得產(chǎn)生特定抗體的B細(xì)胞免疫的B淋巴細(xì)胞：骨髓瘤細(xì)胞：雜交瘤細(xì)胞：既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生專一抗體能產(chǎn)生抗體，但不能大量增殖不能產(chǎn)生抗體，但能大量增殖探究二：單克隆抗體及其應(yīng)用產(chǎn)生所需抗體抗原抗體反應(yīng)陽性的雜交瘤細(xì)胞：既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生針對特定抗原的專一性抗體。【拓展應(yīng)用】請結(jié)合單克隆抗體生產(chǎn)制備流程分析，與傳統(tǒng)抗體相比單克隆抗體的優(yōu)勢特點(diǎn)有哪些？結(jié)合課前資料搜集的相關(guān)內(nèi)容，整理單克隆抗體這些優(yōu)勢使其在醫(yī)療領(lǐng)域有哪些獨(dú)特的應(yīng)用優(yōu)勢？特異性強(qiáng)：可識別抗原細(xì)微差異臨床病原體檢測可大量制備、能凝集抗原臨床治療疾病可特異性識別病變細(xì)胞表面特定抗原并與之結(jié)合定向運(yùn)載特定藥物作用于病變細(xì)胞，減少藥物對正常細(xì)胞損害。研究發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）是一種細(xì)胞膜相關(guān)蛋白，其在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，而在正常肝組織中幾乎不表達(dá)。因