產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選、細(xì)菌素的純化及其特性的多維度探究一、引言1.1研究背景與意義乳酸菌（LacticAcidBacteria，LAB）是一類在自然界廣泛分布的革蘭氏陽性菌，能夠發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域都有著重要的應(yīng)用價(jià)值。在食品工業(yè)中，乳酸菌是發(fā)酵乳制品、泡菜、發(fā)酵肉制品等眾多發(fā)酵食品的關(guān)鍵發(fā)酵劑，不僅能賦予食品獨(dú)特的風(fēng)味和質(zhì)地，還能延長食品的保質(zhì)期。例如，在酸奶發(fā)酵過程中，乳酸菌將牛奶中的乳糖轉(zhuǎn)化為乳酸，使牛奶凝固，同時(shí)產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)，提升酸奶的口感和品質(zhì)。在飼料工業(yè)中，乳酸菌作為益生菌添加到動(dòng)物飼料中，可調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道微生態(tài)平衡，增強(qiáng)動(dòng)物免疫力，促進(jìn)動(dòng)物生長。有研究表明，在仔豬飼料中添加乳酸菌，可顯著提高仔豬的日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，降低腹瀉率。在醫(yī)藥領(lǐng)域，乳酸菌及其代謝產(chǎn)物也展現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價(jià)值，如某些乳酸菌具有降膽固醇、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等功效。除了乳酸等代謝產(chǎn)物，乳酸菌還能產(chǎn)生一類具有抗菌活性的蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)，被稱為細(xì)菌素（Bacteriocin）。細(xì)菌素具有較為廣泛的應(yīng)用前景，可作為新型抗菌藥物和食品保護(hù)劑。在食品安全問題日益受到關(guān)注的今天，傳統(tǒng)化學(xué)防腐劑的安全性受到質(zhì)疑，消費(fèi)者對天然、安全的食品保鮮劑需求不斷增加，細(xì)菌素作為一種天然的抗菌物質(zhì)，正好滿足了這一市場需求。例如，乳酸鏈球菌素（Nisin）作為一種應(yīng)用廣泛的乳酸菌細(xì)菌素，已被多個(gè)國家批準(zhǔn)用于食品保鮮，能有效抑制食品中的革蘭氏陽性菌，延長食品的貨架期，且對人體安全無害。在醫(yī)藥領(lǐng)域，隨著抗生素耐藥性問題的日益嚴(yán)重，開發(fā)新型抗菌藥物迫在眉睫，細(xì)菌素因其獨(dú)特的抗菌機(jī)制和低耐藥性特點(diǎn)，有望成為新型抗菌藥物的重要來源。一些細(xì)菌素能夠特異性地作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜、細(xì)胞壁或核酸等靶點(diǎn)，破壞細(xì)菌的正常生理功能，從而達(dá)到抗菌的目的，且不易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。對產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選、細(xì)菌素的純化及其特性研究具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用前景。通過篩選高效產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌菌株，能夠?yàn)楹罄m(xù)細(xì)菌素的研究和應(yīng)用提供豐富的資源和堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。深入研究細(xì)菌素的純化方法和特性，有助于揭示細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，為其進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。探索細(xì)菌素在抗菌藥物、食品保護(hù)劑等方面的應(yīng)用前景，對于解決食品安全問題、開發(fā)新型抗菌藥物具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，有望推動(dòng)食品、醫(yī)藥等相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，保障人類健康。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選方面，國內(nèi)外學(xué)者已從多種環(huán)境樣本中進(jìn)行了廣泛的探索。早期的研究主要集中在傳統(tǒng)發(fā)酵食品，如泡菜、酸奶、發(fā)酵肉制品等，這些食品中富含乳酸菌，是篩選產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的重要資源。韓國學(xué)者從泡菜中成功篩選出多株產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌，其中一些菌株所產(chǎn)細(xì)菌素對常見的食源致病菌具有顯著的抑制作用，為泡菜的保鮮和品質(zhì)提升提供了新的思路。國內(nèi)也有研究團(tuán)隊(duì)從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)乳制品中分離出高產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌，這些乳酸菌不僅豐富了我國乳酸菌資源庫，還為開發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的生物防腐劑奠定了基礎(chǔ)。隨著研究的深入，篩選范圍逐漸拓展到動(dòng)物腸道、植物表面、土壤等環(huán)境。動(dòng)物腸道是一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，其中的乳酸菌與宿主健康密切相關(guān)，從動(dòng)物腸道中篩選產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌，有助于開發(fā)新型的動(dòng)物微生態(tài)制劑，促進(jìn)動(dòng)物健康養(yǎng)殖。有研究從仔豬腸道中篩選出具有益生特性且能產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌，該菌株在調(diào)節(jié)仔豬腸道微生態(tài)平衡、提高免疫力方面展現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力。對于細(xì)菌素的純化，目前常用的方法包括離心、濾過、層析等。離心和濾過作為初步分離手段，能夠去除發(fā)酵液中的菌體和雜質(zhì)，為后續(xù)的純化步驟提供相對純凈的樣品。在實(shí)際操作中，通過高速離心可以將乳酸菌菌體與發(fā)酵液分離，再利用不同孔徑的濾膜進(jìn)行過濾，進(jìn)一步去除大分子雜質(zhì)。層析技術(shù)則是提高細(xì)菌素純度的關(guān)鍵步驟，常見的有離子交換層析、凝膠過濾層析和疏水層析等。離子交換層析利用細(xì)菌素與離子交換樹脂之間的靜電相互作用，根據(jù)細(xì)菌素所帶電荷的差異進(jìn)行分離；凝膠過濾層析依據(jù)細(xì)菌素分子大小的不同，在凝膠介質(zhì)中實(shí)現(xiàn)分離；疏水層析則是基于細(xì)菌素與疏水介質(zhì)之間的疏水相互作用進(jìn)行純化。國外研究人員利用離子交換層析和凝膠過濾層析相結(jié)合的方法，成功純化出高純度的細(xì)菌素，并通過質(zhì)譜技術(shù)確定了其分子結(jié)構(gòu)。國內(nèi)也有相關(guān)研究采用多種層析技術(shù)聯(lián)用，對乳酸菌細(xì)菌素進(jìn)行純化，有效提高了細(xì)菌素的純度和活性。在細(xì)菌素特性研究方面，國內(nèi)外學(xué)者圍繞細(xì)菌素的物理化學(xué)性質(zhì)、抗菌活性及作用機(jī)制等展開了大量研究。物理化學(xué)性質(zhì)方面，研究內(nèi)容涵蓋分子量、等電點(diǎn)、熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性等。許多乳酸菌細(xì)菌素具有較小的分子量，這使得它們在穿透細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜時(shí)具有一定優(yōu)勢，能夠更有效地發(fā)揮抗菌作用。細(xì)菌素的等電點(diǎn)決定了其在不同pH環(huán)境下的帶電性質(zhì)，進(jìn)而影響其穩(wěn)定性和抗菌活性。熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性研究表明，部分細(xì)菌素在高溫和極端pH條件下仍能保持一定的活性，這為其在食品加工和儲(chǔ)存等過程中的應(yīng)用提供了理論支持?？咕钚匝芯客ǔ２捎镁溆?jì)數(shù)、致死時(shí)間、最小抑菌濃度（MIC）等方法來測定細(xì)菌素對不同病原菌的抑制效果。通過這些方法，研究人員發(fā)現(xiàn)乳酸菌細(xì)菌素對多種革蘭氏陽性菌，如金黃色葡萄球菌、李斯特菌等具有較強(qiáng)的抑制作用，部分細(xì)菌素對革蘭氏陰性菌也有一定的抑制效果。關(guān)于細(xì)菌素的作用機(jī)制，目前認(rèn)為主要包括破壞細(xì)胞膜完整性、抑制細(xì)胞壁合成、干擾核酸和蛋白質(zhì)合成等途徑。一些細(xì)菌素能夠特異性地結(jié)合到細(xì)菌細(xì)胞膜上的受體，形成離子通道，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外流，最終引起細(xì)胞死亡；還有些細(xì)菌素可以抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成相關(guān)酶的活性，阻礙細(xì)胞壁的正常合成，使細(xì)菌無法維持正常的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。盡管目前在產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選、細(xì)菌素的純化及其特性研究方面取得了一定的進(jìn)展，但仍存在一些不足之處。在篩選方面，雖然已從多種環(huán)境中篩選出大量產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌，但高效、特異的篩選方法仍有待進(jìn)一步完善，以提高篩選效率和獲得具有獨(dú)特性能的乳酸菌菌株。部分篩選方法存在操作繁瑣、篩選周期長等問題，限制了新菌株的快速發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。在純化過程中，現(xiàn)有方法普遍存在成本高、步驟復(fù)雜、回收率低等問題，不利于細(xì)菌素的大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用。一些層析技術(shù)需要昂貴的設(shè)備和試劑，且在純化過程中容易造成細(xì)菌素的損失，降低了最終的產(chǎn)量和純度。在特性研究方面，雖然對細(xì)菌素的作用機(jī)制有了一定的認(rèn)識(shí)，但仍不夠深入和全面，不同細(xì)菌素之間作用機(jī)制的差異以及細(xì)菌素與病原菌之間的相互作用關(guān)系還需進(jìn)一步探究。對于細(xì)菌素在復(fù)雜環(huán)境中的穩(wěn)定性和活性變化規(guī)律，以及其對人體和環(huán)境的安全性評估等方面的研究也相對較少，這在一定程度上限制了細(xì)菌素的實(shí)際應(yīng)用。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在篩選高效產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌，并對其產(chǎn)生的細(xì)菌素進(jìn)行純化和特性研究，深入探究其抗菌機(jī)制和應(yīng)用價(jià)值，具體研究內(nèi)容如下：產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選：以多種環(huán)境樣本，如傳統(tǒng)發(fā)酵食品、動(dòng)物腸道內(nèi)容物、植物表面沖洗液等為來源，通過體外篩選方法，包括瓊脂擴(kuò)散法、牛津杯法等，初步篩選出具有抑菌活性的乳酸菌菌株。利用酶解活性測定方法，使用蛋白酶K、胰蛋白酶等對初步篩選菌株的發(fā)酵液進(jìn)行處理，若抑菌活性顯著降低，則表明該菌株可能產(chǎn)生細(xì)菌素，從而篩選出高效產(chǎn)生細(xì)菌素的乳酸菌，為后續(xù)細(xì)菌素的研究和應(yīng)用提供基礎(chǔ)支持。細(xì)菌素的純化及特性研究：采用離心、濾過等方法對篩選出的乳酸菌發(fā)酵液進(jìn)行初步分離，去除菌體和雜質(zhì)。通過離子交換層析、凝膠過濾層析、疏水層析等層析技術(shù)，進(jìn)一步提高細(xì)菌素的純度。對純化后的細(xì)菌素進(jìn)行物理化學(xué)性質(zhì)分析，包括測定分子量、等電點(diǎn)、熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性等。利用質(zhì)譜、核磁共振等技術(shù)研究細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)，探討其結(jié)構(gòu)與特性之間的關(guān)系。細(xì)菌素的抗菌活性和作用機(jī)制研究：通過菌落計(jì)數(shù)、致死時(shí)間、最小抑菌濃度（MIC）測定等方法，研究細(xì)菌素對多種病原菌，如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、李斯特菌等的抗菌活性。從細(xì)胞水平和分子水平探究細(xì)菌素的作用機(jī)制，如觀察細(xì)菌素對病原菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的影響，檢測對核酸和蛋白質(zhì)合成的干擾作用等，深入揭示細(xì)菌素的抗菌機(jī)理。二、產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選2.1樣品采集本研究為獲取產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌，從多種富含乳酸菌的環(huán)境樣本中采集樣品，主要來源包括傳統(tǒng)發(fā)酵食品、動(dòng)物腸道內(nèi)容物以及植物表面沖洗液。傳統(tǒng)發(fā)酵食品，如泡菜、酸奶、發(fā)酵豆制品等，由于其發(fā)酵過程依賴乳酸菌，成為篩選的重要來源。以泡菜為例，在泡菜發(fā)酵過程中，乳酸菌利用蔬菜中的糖類等營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行代謝活動(dòng)，不僅賦予泡菜獨(dú)特的風(fēng)味，還產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，其中就可能包括細(xì)菌素。不同地區(qū)、不同制作工藝的泡菜中乳酸菌種類和數(shù)量存在差異，這為篩選具有不同特性的產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌提供了豐富資源。從四川泡菜中篩選出的乳酸菌，其產(chǎn)生的細(xì)菌素可能對當(dāng)?shù)爻Ｒ姷氖吃粗虏【哂休^強(qiáng)的抑制作用，這與四川泡菜的制作環(huán)境和微生物群落特點(diǎn)密切相關(guān)。酸奶也是常見的發(fā)酵乳制品，在酸奶發(fā)酵過程中，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌等乳酸菌協(xié)同作用，將牛奶中的乳糖轉(zhuǎn)化為乳酸，使牛奶凝固成酸奶。這些乳酸菌在發(fā)酵過程中也可能產(chǎn)生細(xì)菌素，對酸奶中的有害微生物起到抑制作用，保證酸奶的質(zhì)量和保質(zhì)期。從不同品牌、不同奶源的酸奶中采集樣品，有助于篩選出具有優(yōu)良特性的產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌。動(dòng)物腸道是一個(gè)復(fù)雜且富含乳酸菌的微生態(tài)環(huán)境，與動(dòng)物健康密切相關(guān)。動(dòng)物腸道內(nèi)的乳酸菌能夠調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，增強(qiáng)動(dòng)物免疫力，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。從仔豬腸道中采集內(nèi)容物樣品，仔豬在生長發(fā)育過程中，腸道微生物群落處于動(dòng)態(tài)變化中，早期階段腸道內(nèi)乳酸菌的種類和數(shù)量對仔豬的健康成長尤為重要。通過篩選仔豬腸道中的產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌，有望開發(fā)出新型的動(dòng)物微生態(tài)制劑，用于預(yù)防和治療仔豬腸道疾病，提高仔豬的生長性能。反芻動(dòng)物瘤胃也是一個(gè)獨(dú)特的微生物發(fā)酵場所，其中含有大量的乳酸菌。瘤胃中的乳酸菌在反芻動(dòng)物的消化過程中發(fā)揮著重要作用，能夠分解纖維素等多糖類物質(zhì)，為反芻動(dòng)物提供能量。從瘤胃內(nèi)容物中篩選產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌，對于研究反芻動(dòng)物的消化生理和開發(fā)新型飼料添加劑具有重要意義。植物表面是微生物生存的重要微環(huán)境之一，也存在著豐富的乳酸菌資源。植物在生長過程中，其表面會(huì)附著各種微生物，乳酸菌作為其中的一部分，與植物形成了一種微妙的共生關(guān)系。從新鮮蔬菜和水果的表面采集沖洗液樣品，這些乳酸菌在植物表面可能參與了植物的營養(yǎng)代謝、防御病蟲害等過程。篩選植物表面的產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌，不僅可以為植物病害的生物防治提供新的途徑，還可能開發(fā)出具有天然保鮮作用的微生物制劑，用于延長果蔬的保鮮期。一些乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素能夠抑制果蔬表面常見的病原菌，如灰葡萄孢菌、青霉菌等，減少果蔬在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過程中的腐爛損失。2.2篩選方法2.2.1選擇性培養(yǎng)基法初步篩選選擇性培養(yǎng)基法是初步篩選乳酸菌的常用方法，其中MRS（DeMan,RogosaandSharpe）培養(yǎng)基應(yīng)用最為廣泛。MRS培養(yǎng)基專為乳酸菌生長設(shè)計(jì)，其成分包含蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、葡萄糖、吐溫80、檸檬酸二銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳等。蛋白胨和牛肉膏提供氮源、維生素和氨基酸，滿足乳酸菌生長的營養(yǎng)需求；酵母提取物富含B族維生素和生長因子，促進(jìn)乳酸菌的代謝活動(dòng)；葡萄糖作為碳源，為乳酸菌的發(fā)酵提供能量；吐溫80有助于乳酸菌對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收；檸檬酸二銨、磷酸氫二鉀等成分則維持培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定，為乳酸菌創(chuàng)造適宜的生長環(huán)境。在篩選過程中，將采集的樣品進(jìn)行梯度稀釋，如采用10倍梯度稀釋法，將樣品依次稀釋成10?1、10?2、10?3、10??、10??、10??等不同稀釋度的稀釋液。取適量稀釋液，如0.1mL，采用稀釋涂布平板法均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基平板上。涂布時(shí)，使用無菌涂布器將稀釋液在平板表面均勻分布，確保每個(gè)稀釋度的樣品都能充分接觸培養(yǎng)基。將涂布后的平板置于適宜條件下培養(yǎng)，通常為37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。在培養(yǎng)過程中，乳酸菌利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分生長繁殖，形成肉眼可見的菌落。乳酸菌菌落通常較小，直徑約1-3mm，呈圓形隆起，表面光滑或稍粗糙，顏色多為乳白色、灰白色或暖黃色。通過觀察菌落形態(tài)，初步挑選出疑似乳酸菌的菌落，為后續(xù)的復(fù)篩工作提供樣本。2.2.2細(xì)菌素產(chǎn)生能力復(fù)篩經(jīng)過初步篩選得到的疑似乳酸菌菌株，需要進(jìn)一步復(fù)篩以確定其是否真正產(chǎn)生細(xì)菌素。牛津杯法和瓊脂擴(kuò)散法是常用的檢測菌株抑菌活性的方法。牛津杯法操作時(shí)，先制備底層培養(yǎng)基，將已滅菌的營養(yǎng)瓊脂（1.5%）15mL注入直徑90mm的培養(yǎng)皿中，水平放置使其凝固。再制備菌層，將指示菌培養(yǎng)基（濃度為0.8%，冷卻至50℃）與適量指示菌菌液混勻，取6mL鋪在底層培養(yǎng)基上，水平放置凝固。用無菌鑷子夾取已滅菌的牛津杯，輕輕放置在培養(yǎng)基上，使其與培養(yǎng)基緊密接觸無空隙。向牛津杯中加入待測菌株的發(fā)酵液，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，加滿至約300μL。將加樣后的培養(yǎng)皿小心放入37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)18h，之后測量抑菌圈直徑，抑菌圈直徑越大，表明菌株的抑菌活性越強(qiáng)。瓊脂擴(kuò)散法與之類似，先將指示菌固體培養(yǎng)基融化，冷卻后倒平板。待平板凝固后，均勻放入牛津杯。再將指示菌半固體培養(yǎng)基融化，冷卻至45-50℃，把指示菌液稀釋至10?2后，吸取50μL接入指示菌半固體培養(yǎng)基中，倒平板。待平板凝固后將牛津杯拔出，在孔中加入50μL發(fā)酵液。30℃培養(yǎng)24h，觀察有無抑菌圈產(chǎn)生。在檢測過程中，需要排除酸和過氧化氫的干擾，以準(zhǔn)確判斷菌株是否產(chǎn)生細(xì)菌素。乳酸菌在代謝過程中會(huì)產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸，這些有機(jī)酸可能會(huì)對指示菌產(chǎn)生抑制作用，從而干擾細(xì)菌素的檢測。為排除有機(jī)酸的影響，將發(fā)酵液在4000r/min下離心20min，去除菌體。取上清液，用酸堿調(diào)節(jié)劑如氫氧化鈉溶液將pH調(diào)至5.0，此時(shí)有機(jī)酸的抑菌作用被中和。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮10倍后，再采用牛津杯法或瓊脂擴(kuò)散法測定對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等指示菌的抑菌活性。若抑菌活性顯著降低，說明之前的抑菌作用可能主要由有機(jī)酸引起；若抑菌活性變化不大，則可能存在細(xì)菌素的作用。乳酸菌還可能產(chǎn)生過氧化氫，其也具有一定的抑菌能力。為排除過氧化氫的干擾，將過氧化氫酶溶解在50mmol/LpH7.0的磷酸緩沖液中配成母液，加入到排除菌體和有機(jī)酸后的發(fā)酵液中，使過氧化氫酶的終濃度為5mg/mL，置于37℃的水浴中溫浴2h后取出。以未用過氧化氫酶處理的發(fā)酵液為空白對照，采用牛津杯法或瓊脂擴(kuò)散法測定對金黃色葡萄球菌的抑菌活性。若處理后的發(fā)酵液抑菌活性明顯下降，說明過氧化氫在之前的抑菌作用中起到了重要作用；若抑菌活性無明顯變化，則進(jìn)一步說明可能存在細(xì)菌素的抑菌作用。通過上述方法排除酸和過氧化氫的干擾后，若菌株發(fā)酵液仍對指示菌具有顯著的抑菌活性，則該菌株很可能產(chǎn)生細(xì)菌素，從而確定為產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌，可用于后續(xù)的研究。2.3乳酸菌鑒定2.3.1形態(tài)學(xué)鑒定形態(tài)學(xué)鑒定是初步確定乳酸菌種類的重要方法，主要借助顯微鏡觀察菌體形態(tài)、大小、排列方式以及在固體培養(yǎng)基上的菌落特征。將篩選得到的乳酸菌菌株接種于MRS固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48h，待菌落長出后，用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，進(jìn)行革蘭氏染色。革蘭氏染色是一種經(jīng)典的細(xì)菌染色方法，乳酸菌通常為革蘭氏陽性菌，染色后在顯微鏡下呈現(xiàn)紫色。在油鏡下仔細(xì)觀察菌體形態(tài)，乳酸菌的形態(tài)多樣，常見的有桿狀和球狀。乳桿菌屬（Lactobacillus）的乳酸菌多為桿狀，細(xì)胞形態(tài)從長的桿狀和細(xì)長桿狀到彎曲桿狀及短桿狀不等，一般形成鏈狀排列。嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilus）的菌體呈細(xì)長桿狀，常單個(gè)或成鏈狀存在；保加利亞乳桿菌（Lactobacillusbulgaricus）的菌體則較為粗大，呈長桿狀，排列成鏈。鏈球菌屬（Streptococcus）的乳酸菌為球狀，細(xì)胞呈球形或球桿狀，直徑一般在0.5-2.0μm，成對或成鏈排列。嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus）的菌體呈球形或卵圓狀，成對或短鏈狀排列。除了菌體形態(tài)，菌落特征也是形態(tài)學(xué)鑒定的重要依據(jù)。在MRS固體培養(yǎng)基上，乳酸菌菌落通常較小，直徑大約在1-3mm。菌落呈圓形隆起，表面光滑或稍粗糙，顏色多為乳白色、灰白色或暖黃色。不同種類的乳酸菌在菌落形態(tài)上也存在一些細(xì)微差異，乳桿菌屬的菌落邊緣相對整齊，而雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）的菌落邊緣可能不太規(guī)則。雙歧桿菌在絕對厭氧培養(yǎng)條件下，在MRS培養(yǎng)基上形成的菌落中等大小，瓷白色，邊緣整齊光滑；而在兼性需氧培養(yǎng)條件下則不生長。通過對菌體形態(tài)和菌落特征的觀察，可以初步判斷乳酸菌的種類，為后續(xù)的鑒定工作提供基礎(chǔ)。2.3.2生化鑒定生化鑒定通過開展一系列生化試驗(yàn)，進(jìn)一步確定乳酸菌的特性，補(bǔ)充和驗(yàn)證形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果，為準(zhǔn)確鑒定乳酸菌種類提供更豐富的信息。糖發(fā)酵試驗(yàn)是生化鑒定的重要內(nèi)容之一，不同乳酸菌對各種糖類的發(fā)酵能力存在差異。在試驗(yàn)中，分別將乳酸菌接種到含有葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖等不同糖類的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中通常含有溴甲酚紫等pH指示劑。若乳酸菌能夠發(fā)酵某種糖類，會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸，使培養(yǎng)基的pH值降低，指示劑變色，從而判斷乳酸菌對該糖類的發(fā)酵情況。嗜酸乳桿菌能夠發(fā)酵葡萄糖、乳糖和麥芽糖，產(chǎn)酸使培養(yǎng)基變黃；而有些乳酸菌可能不能發(fā)酵蔗糖，培養(yǎng)基顏色無明顯變化。過氧化氫酶試驗(yàn)用于檢測乳酸菌是否產(chǎn)生過氧化氫酶。取少量乳酸菌菌落于潔凈載玻片上，滴加3%過氧化氫溶液，若菌落周圍迅速產(chǎn)生大量氣泡，說明該乳酸菌產(chǎn)生過氧化氫酶，為過氧化氫酶陽性；若不產(chǎn)生氣泡，則為過氧化氫酶陰性。大多數(shù)乳酸菌為過氧化氫酶陰性，這一特性有助于與其他細(xì)菌進(jìn)行區(qū)分。硝酸鹽還原試驗(yàn)可判斷乳酸菌對硝酸鹽的還原能力。將乳酸菌接種到含有硝酸鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，加入硝酸鹽還原試劑甲液（對氨基苯磺酸）和乙液（α-萘胺），若培養(yǎng)基變?yōu)榧t色，表明乳酸菌將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，為硝酸鹽還原陽性；若不變色，則為硝酸鹽還原陰性。不同乳酸菌在硝酸鹽還原能力上有所不同，這一試驗(yàn)結(jié)果可為乳酸菌的鑒定提供參考。除此之外，還可進(jìn)行吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)等多種生化試驗(yàn)。吲哚試驗(yàn)檢測乳酸菌分解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力；甲基紅試驗(yàn)用于判斷乳酸菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生有機(jī)酸的能力；V-P試驗(yàn)則檢測乳酸菌利用葡萄糖產(chǎn)生乙酰甲基甲醇的能力。通過綜合分析這些生化試驗(yàn)的結(jié)果，能夠更全面、準(zhǔn)確地確定乳酸菌的特性，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，進(jìn)一步縮小乳酸菌種類的范圍，為分子生物學(xué)鑒定提供更明確的方向。2.3.3分子生物學(xué)鑒定分子生物學(xué)鑒定是確定乳酸菌種屬的關(guān)鍵步驟，通過提取乳酸菌的DNA，擴(kuò)增16SrRNA基因，測序后與數(shù)據(jù)庫比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，能夠準(zhǔn)確地確定乳酸菌的種屬關(guān)系。采用試劑盒法提取乳酸菌的基因組DNA，試劑盒中的裂解液能夠破壞乳酸菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，釋放出DNA，再通過一系列的吸附、洗滌和洗脫步驟，獲得純度較高的基因組DNA。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增16SrRNA基因，設(shè)計(jì)通用引物，如正向引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和反向引物1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），以提取的基因組DNA為模板，在PCR反應(yīng)體系中，經(jīng)過變性、退火和延伸等步驟，實(shí)現(xiàn)16SrRNA基因的擴(kuò)增。反應(yīng)條件一般為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，若出現(xiàn)約1500bp的特異性條帶，則表明擴(kuò)增成功。將擴(kuò)增得到的16SrRNA基因片段進(jìn)行測序，測序結(jié)果在NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）比對，尋找與之相似度最高的已知序列。若與某一已知乳酸菌序列的相似度達(dá)到97%以上，可初步確定該乳酸菌屬于相應(yīng)的種屬。但對于一些相似度較高、難以準(zhǔn)確區(qū)分的情況，還需進(jìn)一步構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用MEGA（MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis）軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，將測序得到的16SrRNA基因序列與從數(shù)據(jù)庫中選取的相關(guān)乳酸菌模式菌株的序列進(jìn)行多序列比對，通過鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）計(jì)算遺傳距離，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。在系統(tǒng)發(fā)育樹中，親緣關(guān)系較近的乳酸菌會(huì)聚集在同一分支上，根據(jù)菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹中的位置，能夠更準(zhǔn)確地確定其種屬關(guān)系。如果某一未知乳酸菌菌株與植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）的模式菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹中聚為一支，且遺傳距離較近，則可確定該未知菌株為植物乳桿菌。通過分子生物學(xué)鑒定，能夠從基因?qū)用鏈?zhǔn)確地確定乳酸菌的種屬，為后續(xù)對乳酸菌的研究和應(yīng)用提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。三、細(xì)菌素的純化3.1粗提3.1.1離心與過濾將篩選得到的乳酸菌發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至離心管中，采用低速離心機(jī)，設(shè)置轉(zhuǎn)速為8000r/min，離心時(shí)間為20min。在離心力的作用下，乳酸菌菌體及其他較大的固體顆粒沉降至離心管底部，而含有細(xì)菌素的上清液則位于上層。這種低速離心操作能夠有效分離菌體和上清液，避免高速離心可能對細(xì)菌素結(jié)構(gòu)和活性造成的破壞。離心結(jié)束后，小心吸取上清液，盡量避免吸到管底的菌體沉淀。為進(jìn)一步去除上清液中可能存在的微小顆粒和雜質(zhì)，提高樣品的澄清度，采用過濾的方法。選用孔徑為0.45μm的醋酸纖維素濾膜，安裝在過濾裝置上，將吸取的上清液緩慢倒入過濾漏斗中。在重力或輕微負(fù)壓的作用下，上清液通過濾膜，而微小顆粒和雜質(zhì)則被截留在濾膜上。過濾后的發(fā)酵液變得更加澄清透明，為后續(xù)的細(xì)菌素分離純化步驟提供了更純凈的樣品。0.45μm孔徑的濾膜能夠有效去除大多數(shù)微生物細(xì)胞、細(xì)胞碎片以及其他不溶性雜質(zhì)，同時(shí)保留細(xì)菌素等生物活性物質(zhì)，確保細(xì)菌素的活性不受影響。3.1.2沉淀法采用硫酸銨鹽析法對過濾后的發(fā)酵液進(jìn)行初步濃縮和分離，以獲取富含細(xì)菌素的沉淀。在進(jìn)行鹽析操作前，需先了解硫酸銨的飽和度對細(xì)菌素沉淀的影響。不同飽和度的硫酸銨能夠使不同種類的蛋白質(zhì)和多肽在溶液中的溶解度發(fā)生變化，從而實(shí)現(xiàn)分離。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定適宜的硫酸銨飽和度范圍，一般從30%飽和度開始進(jìn)行鹽析，逐步增加飽和度至80%，觀察細(xì)菌素的沉淀情況。在攪拌條件下，緩慢向過濾后的發(fā)酵液中加入固體硫酸銨粉末，使硫酸銨飽和度達(dá)到30%。攪拌速度控制在100r/min左右，以確保硫酸銨均勻溶解，避免局部濃度過高。添加過程中，密切觀察溶液的變化，確保硫酸銨完全溶解。添加完畢后，繼續(xù)攪拌30min，使細(xì)菌素與硫酸銨充分作用，促進(jìn)沉淀形成。隨后，將溶液在4℃冰箱中靜置過夜，使沉淀過程充分進(jìn)行。在低溫環(huán)境下，蛋白質(zhì)的溶解度降低，有利于沉淀的形成，同時(shí)可減少細(xì)菌素的降解和失活。12h后，將靜置后的溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，使用高速離心機(jī)，設(shè)置轉(zhuǎn)速為12000r/min，離心時(shí)間為30min。在強(qiáng)大的離心力作用下，沉淀的細(xì)菌素沉降至離心管底部，而上清液則含有未沉淀的雜質(zhì)和其他可溶性物質(zhì)。小心棄去上清液，收集離心管底部的沉淀。該沉淀即為初步分離得到的富含細(xì)菌素的粗品。為進(jìn)一步提高細(xì)菌素的純度和活性，將收集到的沉淀用適量的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）復(fù)溶。PBS緩沖液能夠提供穩(wěn)定的pH環(huán)境，有助于保持細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)和活性。復(fù)溶過程中，輕輕振蕩離心管，促進(jìn)沉淀的溶解。復(fù)溶后的溶液采用透析法進(jìn)行除鹽處理，以去除殘留的硫酸銨等鹽分。將復(fù)溶后的溶液裝入透析袋中，透析袋的截留分子量應(yīng)根據(jù)細(xì)菌素的分子量進(jìn)行選擇，確保細(xì)菌素不會(huì)透過透析袋，而鹽分能夠自由擴(kuò)散出去。將透析袋置于大量的去離子水中，4℃透析24h，期間更換去離子水3-4次，以充分去除鹽分。透析結(jié)束后，得到的透析液即為初步純化的細(xì)菌素粗提液，可用于后續(xù)的進(jìn)一步純化和分析。3.2層析純化3.2.1離子交換層析離子交換層析是利用細(xì)菌素與離子交換劑之間的靜電相互作用進(jìn)行分離的技術(shù)。根據(jù)細(xì)菌素的等電點(diǎn)和帶電性質(zhì)，選擇合適的離子交換劑。若細(xì)菌素的等電點(diǎn)小于7，在中性條件下帶負(fù)電荷，此時(shí)應(yīng)選擇陰離子交換劑，如DEAE-SepharoseFastFlow。該交換劑以瓊脂糖為基質(zhì)，通過化學(xué)修飾引入二乙氨基乙基（DEAE）基團(tuán)，具有良好的親水性和化學(xué)穩(wěn)定性，能有效與帶負(fù)電荷的細(xì)菌素結(jié)合。若細(xì)菌素等電點(diǎn)大于7，在中性條件下帶正電荷，則選擇陽離子交換劑，如CM-SepharoseFastFlow，其基質(zhì)同樣為瓊脂糖，引入羧甲基（CM）基團(tuán)，可與帶正電荷的細(xì)菌素發(fā)生靜電吸附。將初步純化的細(xì)菌素粗提液上樣到已平衡好的離子交換層析柱中，平衡緩沖液的選擇至關(guān)重要，需根據(jù)細(xì)菌素的穩(wěn)定性和離子交換劑的特性進(jìn)行確定。一般來說，對于陰離子交換層析，常用的平衡緩沖液為pH8.0左右的Tris-HCl緩沖液，其濃度通常為0.02-0.05mol/L，該緩沖液能夠維持溶液的pH穩(wěn)定，為細(xì)菌素與離子交換劑的結(jié)合提供適宜的環(huán)境。上樣時(shí)，控制流速在0.5-1.0mL/min，使細(xì)菌素充分與離子交換劑接觸并結(jié)合。上樣結(jié)束后，用平衡緩沖液沖洗層析柱，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)，沖洗體積一般為3-5個(gè)柱體積，直到流出液的紫外吸收值（280nm）恢復(fù)到基線水平。采用線性梯度洗脫的方式將結(jié)合在離子交換劑上的細(xì)菌素洗脫下來，洗脫液通常為含有不同濃度鹽（如NaCl）的平衡緩沖液。以陰離子交換層析為例，從低濃度（如0.05mol/L）的NaCl溶液開始洗脫，逐漸增加NaCl濃度至1.0mol/L，形成線性梯度，流速控制在1.0-2.0mL/min。隨著鹽濃度的增加，溶液中的離子強(qiáng)度增大，與細(xì)菌素競爭離子交換劑上的結(jié)合位點(diǎn)，使細(xì)菌素逐漸從離子交換劑上洗脫下來。收集洗脫液，每管收集1-2mL，通過抑菌活性測定和蛋白質(zhì)含量測定，確定含有細(xì)菌素的洗脫峰。抑菌活性測定可采用牛津杯法，將收集的洗脫液加入牛津杯中，放置在含有指示菌（如金黃色葡萄球菌）的培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)后觀察抑菌圈的大小，以判斷洗脫液中細(xì)菌素的抑菌活性。蛋白質(zhì)含量測定可采用Bradford法，利用考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色發(fā)生變化的原理，通過測定吸光度來確定蛋白質(zhì)含量。合并含有高活性細(xì)菌素的洗脫峰，進(jìn)行下一步純化或分析。3.2.2凝膠過濾層析凝膠過濾層析也被稱為分子排阻層析，是依據(jù)分子大小的差異對細(xì)菌素進(jìn)行分離純化的技術(shù)，該技術(shù)常用葡聚糖凝膠（Sephadex）、瓊脂糖凝膠（Sepharose）等作為介質(zhì)。以葡聚糖凝膠G-75為例，它由葡聚糖和交聯(lián)劑3-氯-1,2-環(huán)氧丙烷交聯(lián)而成，具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)孔大小可通過調(diào)節(jié)葡聚糖和交聯(lián)劑的比例來控制，能分離的分子量范圍一般為3000-80000Da。在進(jìn)行凝膠過濾層析之前，需對葡聚糖凝膠進(jìn)行預(yù)處理。將干燥的葡聚糖凝膠G-75緩慢加入5-10倍體積的去離子水中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，室溫下溶?2-24h，使凝膠顆粒充分吸水膨脹。也可采用加熱煮沸的方法，在沸水浴中溶脹2-3h，這樣不僅能加快溶脹速率，還能除去凝膠中可能污染的細(xì)菌，并排除氣泡。溶脹后的凝膠用傾瀉法除去表面懸浮的小顆粒，再用蒸餾水反復(fù)洗滌幾次，然后用與后續(xù)實(shí)驗(yàn)相同的緩沖液（如pH7.0的磷酸鹽緩沖液）平衡2-3次，使凝膠的pH和離子強(qiáng)度與緩沖液一致，最后抽去溶液及凝膠顆粒內(nèi)部的氣泡，將凝膠保存在緩沖液內(nèi)備用。選擇合適的層析柱，一般柱長與內(nèi)徑的比例為20-100:1，如柱長30cm，內(nèi)徑1.5cm的層析柱。將層析柱洗凈，垂直固定在鐵支架上，柱下口接上乳膠管并用螺旋夾夾緊。向?qū)游鲋屑尤胂疵撘海蜷_下口螺旋夾，讓溶液流出，排除殘留氣泡，最后保留約2-3cm高度的洗脫液，擰緊螺旋夾。將處理好的凝膠輕輕攪動(dòng)均勻，用玻璃棒沿層析柱內(nèi)壁緩緩注入柱中，待凝膠沉積到柱床下已超過1cm時(shí)，打開下口螺旋夾，繼續(xù)裝柱至柱床高度達(dá)到所需高度（如20cm），關(guān)閉出口。裝柱過程中要確保凝膠均勻分布，嚴(yán)禁產(chǎn)生氣泡，盡可能一次裝完，避免出現(xiàn)分層。裝柱完成后，用洗脫液平衡1-2個(gè)柱床體積，使凝膠床達(dá)到平衡狀態(tài)，凝膠面上始終保持有一定的洗脫液。將經(jīng)過離子交換層析初步純化的細(xì)菌素溶液小心地加到凝膠柱的表面，加樣量一般不超過凝膠床總體積的5%-10%，如凝膠床體積為30mL，加樣量控制在1.5-3mL。加樣時(shí)，打開螺旋夾使柱面上的洗脫液流出，直至床面與液面剛好平齊為止，關(guān)閉下端出口。用滴管吸取細(xì)菌素溶液，緩慢地沿柱壁加到凝膠表面上，切勿攪動(dòng)層析柱床表面。打開下端出口，使樣品溶液緩慢滲入凝膠內(nèi)，并開始收集流出液。當(dāng)樣品溶液恰好流至與凝膠表面平齊時(shí)，關(guān)閉下端出口。用少量洗脫液清洗層析柱加樣區(qū)，共洗滌3次，每次清洗液應(yīng)完全進(jìn)入凝膠柱內(nèi)后，再進(jìn)行下一次洗滌。最后在凝膠表面上加入洗脫液，保持高度為3-4cm。連接好凝膠柱層析系統(tǒng)，調(diào)節(jié)洗脫液流速為0.3-0.5mL/min，進(jìn)行洗脫。仔細(xì)觀察樣品在層析柱內(nèi)的分離現(xiàn)象，收集洗脫液，每收集1-2mL即換一支收集管（試管預(yù)先編號(hào)），收集約30-40管。由于細(xì)菌素分子大小不同，在凝膠柱上受到的阻滯作用不同，分子量較大的細(xì)菌素不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，阻滯作用小，隨著溶劑在凝膠顆粒之間流動(dòng)，流程短，先流出層析柱；分子量較小的細(xì)菌素可完全進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔內(nèi)，阻滯作用大，流程延長，最后從層析柱中流出。將各收集管中的洗脫液分別用分光光度計(jì)在合適波長（如280nm）處測定其光密度，繪制洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線和抑菌活性測定結(jié)果，確定含有細(xì)菌素的洗脫峰，合并高活性的洗脫峰，進(jìn)行后續(xù)分析或進(jìn)一步純化。3.2.3高效液相色譜（HPLC）高效液相色譜（HPLC）具有分離效率高、分析速度快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可對細(xì)菌素進(jìn)行高分辨率的分離純化，以獲得高純度的細(xì)菌素純品。采用反相HPLC對經(jīng)過凝膠過濾層析初步純化的細(xì)菌素進(jìn)行進(jìn)一步分離。反相HPLC通常使用非極性固定相（如C18柱）和極性流動(dòng)相，利用細(xì)菌素與固定相之間的疏水相互作用進(jìn)行分離。選擇合適的色譜柱，如規(guī)格為250mm×4.6mm，粒徑為5μm的C18反相色譜柱，該色譜柱具有較高的柱效和良好的分離性能。流動(dòng)相一般采用水和有機(jī)溶劑（如乙腈）的混合溶液，并加入適量的酸（如0.1%的三氟乙酸）來調(diào)節(jié)pH值，以改善色譜峰的形狀和分離效果。在優(yōu)化流動(dòng)相條件時(shí)，通過實(shí)驗(yàn)確定水和乙腈的比例，例如初始條件可設(shè)為水-乙腈（80:20，v/v），然后根據(jù)分離效果進(jìn)行調(diào)整，如采用梯度洗脫，在30min內(nèi)將乙腈的比例從20%線性增加到80%。流速通常控制在1.0mL/min左右，流速過大會(huì)導(dǎo)致柱壓升高，影響分離效果；流速過小則會(huì)延長分析時(shí)間。柱溫一般保持在30-40℃，適當(dāng)提高柱溫可降低流動(dòng)相的黏度，提高傳質(zhì)速率，改善分離效果，但過高的柱溫可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌素的活性降低。將經(jīng)過凝膠過濾層析純化的細(xì)菌素樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，如過濾去除雜質(zhì)，以防止堵塞色譜柱。進(jìn)樣量一般為10-20μL，進(jìn)樣前需確保樣品溶液均勻，無氣泡。進(jìn)樣后，啟動(dòng)HPLC系統(tǒng)，按照設(shè)定的條件進(jìn)行分離。通過紫外檢測器（UVD）在214nm或280nm波長下檢測洗脫液中細(xì)菌素的信號(hào)，記錄色譜圖。根據(jù)色譜圖中峰的位置和面積，確定細(xì)菌素的洗脫峰。收集含有細(xì)菌素的洗脫峰，采用冷凍干燥等方法去除溶劑，得到高純度的細(xì)菌素純品。對獲得的細(xì)菌素純品進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定和分析，如采用質(zhì)譜（MS）、核磁共振（NMR）等技術(shù)確定其分子量、氨基酸序列和結(jié)構(gòu)等信息，為深入研究細(xì)菌素的特性和作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。四、細(xì)菌素的特性研究4.1物理化學(xué)性質(zhì)4.1.1分子量測定采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）對細(xì)菌素分子量進(jìn)行初步測定。在進(jìn)行SDS之前，需先制備分離膠和濃縮膠。以分離膠為例，一般配制12%的分離膠，按比例混合丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris-HCl緩沖液（pH8.8）、過硫酸銨和四甲基乙二胺（TEMED），充分混勻后迅速灌膠，留出足夠空間用于濃縮膠的制備。待分離膠凝固后，倒掉上層的水封，用濾紙吸干殘留水分，再制備濃縮膠。濃縮膠通常為5%，其配制方法與分離膠類似，但使用的是Tris-HCl緩沖液（pH6.8）。將純化后的細(xì)菌素樣品與上樣緩沖液混合，上樣緩沖液中含有SDS、β-巰基乙醇等成分，SDS能夠使蛋白質(zhì)變性并帶上負(fù)電荷，β-巰基乙醇則可破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵，使蛋白質(zhì)亞基分離?；旌虾蟮臉悠吩诜兴兄?-5min，使細(xì)菌素充分變性。取適量變性后的樣品加入到凝膠的加樣孔中，同時(shí)加入分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，作為分子量測定的參照。接通電源，進(jìn)行電泳，初始電壓可設(shè)置為80V，待樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，使樣品在凝膠中充分分離。電泳結(jié)束后，將凝膠浸泡在考馬斯亮藍(lán)染色液中染色2-4h，使蛋白質(zhì)條帶顯色。染色后的凝膠用脫色液進(jìn)行脫色，直至背景清晰，蛋白質(zhì)條帶清晰可見。通過觀察細(xì)菌素條帶在凝膠中的位置，并與分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白的條帶進(jìn)行比對，可初步估算細(xì)菌素的分子量。為獲得更精確的分子量數(shù)據(jù)，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）進(jìn)行測定。將純化的細(xì)菌素樣品與適量的基質(zhì)溶液混合，常用的基質(zhì)有α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）、2,5-二羥基苯甲酸（DHB）等，這些基質(zhì)能夠在激光作用下將細(xì)菌素分子離子化。混合均勻后，取1-2μL混合液點(diǎn)在質(zhì)譜靶板上，待溶劑揮發(fā)后，將靶板放入MALDI-TOF-MS儀器中。儀器發(fā)射的激光束照射到樣品上，使細(xì)菌素分子離子化并獲得動(dòng)能，離子在電場的作用下加速飛行，通過測量離子的飛行時(shí)間來計(jì)算其質(zhì)荷比（m/z），進(jìn)而確定細(xì)菌素的分子量。MALDI-TOF-MS具有高靈敏度、高分辨率的特點(diǎn)，能夠精確測定細(xì)菌素的分子量，為細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)和特性研究提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。4.1.2等電點(diǎn)測定采用等電聚焦電泳（IEF）確定細(xì)菌素的等電點(diǎn)。在進(jìn)行等電聚焦電泳前，需準(zhǔn)備好合適的凝膠和電極緩沖液。凝膠通常采用聚丙烯酰胺凝膠，其孔徑大小可根據(jù)細(xì)菌素的分子量進(jìn)行選擇，一般選用T=5%，C=3%的聚丙烯酰胺凝膠。電極緩沖液則根據(jù)所需的pH梯度范圍進(jìn)行配制，常用的載體兩性電解質(zhì)有Pharmalyte、Servalyte等，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇不同pH范圍的載體兩性電解質(zhì)，如pH3-10的載體兩性電解質(zhì)用于較寬pH范圍的等電聚焦分析。將細(xì)菌素樣品與適量的樣品緩沖液混合，樣品緩沖液中含有尿素、去污劑（如NP-40）等成分，尿素能夠破壞蛋白質(zhì)的氫鍵，使蛋白質(zhì)充分變性；去污劑則可去除蛋白質(zhì)表面的電荷，使蛋白質(zhì)在等電聚焦過程中能夠根據(jù)其自身的等電點(diǎn)進(jìn)行遷移?；旌虾蟮臉悠芳尤氲侥z的加樣孔中，同時(shí)加入等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)蛋白，作為等電點(diǎn)測定的參照。接通電源，進(jìn)行等電聚焦電泳，初始電壓可設(shè)置為200V，電泳30min后，逐漸升高電壓至800V，使蛋白質(zhì)在凝膠中形成穩(wěn)定的pH梯度并進(jìn)行聚焦。電泳結(jié)束后，將凝膠浸泡在考馬斯亮藍(lán)染色液中染色2-4h，使蛋白質(zhì)條帶顯色。染色后的凝膠用脫色液進(jìn)行脫色，直至背景清晰，蛋白質(zhì)條帶清晰可見。通過觀察細(xì)菌素條帶在凝膠中的位置，并與等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的條帶進(jìn)行比對，可確定細(xì)菌素的等電點(diǎn)。也可使用等電聚焦儀進(jìn)行等電點(diǎn)測定，該儀器能夠精確控制電場強(qiáng)度、溫度等參數(shù)，提高等電點(diǎn)測定的準(zhǔn)確性。將細(xì)菌素樣品和載體兩性電解質(zhì)混合后，注入到等電聚焦儀的毛細(xì)管或凝膠條中，設(shè)置好相應(yīng)的電泳參數(shù)，如電壓、電流、溫度等。在電場的作用下，細(xì)菌素分子在pH梯度中遷移，最終聚焦在其等電點(diǎn)位置。通過儀器自帶的檢測系統(tǒng)，如紫外檢測器或熒光檢測器，檢測細(xì)菌素的聚焦位置，從而確定其等電點(diǎn)。等電點(diǎn)測定對于了解細(xì)菌素的帶電性質(zhì)和在不同pH環(huán)境下的穩(wěn)定性具有重要意義，為進(jìn)一步研究細(xì)菌素的特性和應(yīng)用提供了關(guān)鍵信息。4.1.3熱穩(wěn)定性研究細(xì)菌素的熱穩(wěn)定性，對于其在食品加工、儲(chǔ)存以及醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要指導(dǎo)意義。將純化后的細(xì)菌素溶液分別置于不同溫度條件下處理，溫度范圍設(shè)置為40℃、60℃、80℃、100℃、121℃，處理時(shí)間為30min。處理過程中，為確保溫度的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，使用高精度的恒溫設(shè)備，如恒溫水浴鍋和高壓滅菌鍋。對于40℃、60℃、80℃的處理，將細(xì)菌素溶液裝入無菌離心管中，放入恒溫水浴鍋中，設(shè)置好相應(yīng)溫度，保持30min。100℃處理時(shí)，可將離心管放入裝有適量水的燒杯中，再將燒杯置于沸水浴中，確保離心管中的溶液能夠均勻受熱。121℃處理則需使用高壓滅菌鍋，將細(xì)菌素溶液放入耐高溫的容器中，按照高壓滅菌鍋的操作規(guī)程進(jìn)行處理。處理完成后，迅速將樣品冷卻至室溫，可采用冰浴冷卻的方式，將離心管放入冰水中，使樣品快速降溫，以減少熱對細(xì)菌素活性的持續(xù)影響。以未經(jīng)熱處理的細(xì)菌素溶液作為對照，采用牛津杯法檢測處理后細(xì)菌素對指示菌的抑菌活性。在制備好的含有指示菌（如金黃色葡萄球菌）的固體培養(yǎng)基平板上，放置牛津杯，向牛津杯中加入熱處理后的細(xì)菌素溶液，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h，觀察并測量抑菌圈的直徑。通過比較不同溫度處理后細(xì)菌素抑菌圈直徑與對照的差異，評估細(xì)菌素的熱穩(wěn)定性。若抑菌圈直徑與對照相比無明顯變化，說明細(xì)菌素在該溫度下具有較好的熱穩(wěn)定性；若抑菌圈直徑明顯減小，則表明細(xì)菌素的活性受到溫度的影響，熱穩(wěn)定性較差。通過熱穩(wěn)定性研究，能夠明確細(xì)菌素在不同溫度條件下的活性變化規(guī)律，為其在實(shí)際應(yīng)用中的溫度控制提供科學(xué)依據(jù)，確保細(xì)菌素在加工和儲(chǔ)存過程中能夠保持良好的抗菌活性。4.1.4pH穩(wěn)定性為探究細(xì)菌素在不同pH條件下的穩(wěn)定性，將純化后的細(xì)菌素溶液分別用1mol/LHCl和1mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH值，設(shè)置pH值梯度為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0。在調(diào)節(jié)pH值時(shí)，使用精密pH計(jì)準(zhǔn)確測量溶液的pH值，確保pH值的準(zhǔn)確性。將調(diào)節(jié)好pH值的細(xì)菌素溶液在37℃條件下處理2h，使細(xì)菌素充分與不同pH環(huán)境相互作用。處理過程中，為防止溶液蒸發(fā)和微生物污染，將細(xì)菌素溶液裝入無菌離心管中，并密封好管口。處理結(jié)束后，將溶液的pH值回調(diào)至中性（pH7.0左右），以消除pH值對后續(xù)抑菌活性測定的影響。采用牛津杯法測定處理后細(xì)菌素對指示菌的抑菌活性，操作方法與熱穩(wěn)定性測定中的牛津杯法相同。在含有指示菌（如大腸桿菌）的固體培養(yǎng)基平板上放置牛津杯，加入處理后的細(xì)菌素溶液，設(shè)置重復(fù)實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)后測量抑菌圈直徑。通過比較不同pH處理后細(xì)菌素抑菌圈直徑與未處理對照的差異，確定細(xì)菌素的pH穩(wěn)定范圍。若在某一pH值處理后，抑菌圈直徑與對照相比無明顯變化，說明細(xì)菌素在該pH值下具有較好的穩(wěn)定性；若抑菌圈直徑明顯減小，則表明細(xì)菌素的活性在該pH值下受到影響。pH穩(wěn)定性研究能夠幫助了解細(xì)菌素在不同酸堿環(huán)境中的活性變化，為其在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用提供重要參考，確保細(xì)菌素在實(shí)際應(yīng)用中能夠在合適的pH條件下發(fā)揮最佳的抗菌效果。4.2抗菌活性4.2.1抗菌譜測定利用瓊脂擴(kuò)散法測定細(xì)菌素的抗菌譜，該方法能夠直觀地反映細(xì)菌素對不同指示菌的抑制作用。選用多種具有代表性的指示菌，包括革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis），革蘭氏陰性菌如大腸桿菌（Escherichiacoli）、銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa），以及真菌如白色念珠菌（Candidaalbicans）、黑曲霉（Aspergillusniger）。這些指示菌涵蓋了常見的病原菌和腐敗菌，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有重要的研究價(jià)值。例如，金黃色葡萄球菌是一種常見的食源致病菌，能夠引起食物中毒、皮膚感染等多種疾病；大腸桿菌在食品加工和儲(chǔ)存過程中可能導(dǎo)致食品變質(zhì)，威脅食品安全。將指示菌分別接種到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，在適宜的條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期，使指示菌的生長狀態(tài)達(dá)到最佳，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌在37℃的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)18-24h，大腸桿菌和銅綠假單胞菌在37℃的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)相同時(shí)間，白色念珠菌在30℃的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-48h，黑曲霉在30℃的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48-72h。培養(yǎng)結(jié)束后，采用比濁法將指示菌菌液濃度調(diào)整至10?CFU/mL，比濁法通過測量菌液對特定波長光的吸收程度，來確定菌液中菌體的濃度，具有操作簡便、快速的優(yōu)點(diǎn)。制備含有指示菌的固體培養(yǎng)基平板，將融化并冷卻至50℃左右的固體培養(yǎng)基與適量的指示菌菌液充分混勻，倒入無菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中倒入約15-20mL培養(yǎng)基，輕輕搖勻，使指示菌均勻分布在培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)基凝固后備用。在制備好的平板上，使用無菌打孔器打出直徑為6-8mm的小孔，孔間距保持在20mm以上，以避免抑菌圈相互干擾。用移液器向小孔中加入50-100μL純化后的細(xì)菌素溶液，同時(shí)設(shè)置陰性對照孔，加入等量的無菌水或緩沖液，以排除培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)操作對結(jié)果的影響。將加樣后的平板置于適宜溫度下培養(yǎng)，根據(jù)指示菌的種類確定培養(yǎng)時(shí)間，革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌一般在37℃培養(yǎng)18-24h，真菌在30℃培養(yǎng)2-3d。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察平板上小孔周圍是否出現(xiàn)抑菌圈，并測量抑菌圈的直徑，抑菌圈直徑越大，表明細(xì)菌素對該指示菌的抑制作用越強(qiáng)。通過比較細(xì)菌素對不同指示菌的抑菌圈大小，確定細(xì)菌素的抗菌譜范圍，明確細(xì)菌素對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌的抑制效果差異，為進(jìn)一步研究細(xì)菌素的抗菌機(jī)制和應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。4.2.2最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）測定采用系列稀釋法測定細(xì)菌素對敏感菌的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），這兩個(gè)指標(biāo)能夠量化細(xì)菌素對細(xì)菌的抑制和殺滅能力，對于評估細(xì)菌素的抗菌活性具有重要意義。以在瓊脂擴(kuò)散法中表現(xiàn)出明顯抑菌效果的指示菌為研究對象，如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等。在無菌96孔板中進(jìn)行細(xì)菌素的倍比稀釋，先在第一列孔中加入100μL濃度為1mg/mL的細(xì)菌素溶液，然后從第二列孔開始，每孔加入50μL無菌的陽離子調(diào)整M-H肉湯（CAMHB）。使用多通道移液器從第一列孔中吸取50μL細(xì)菌素溶液加入到第二列孔中，吹吸混勻3-5次，使細(xì)菌素溶液與肉湯充分混合，再從第二列孔中吸取50μL混合液加入到第三列孔中，依此類推，進(jìn)行倍比稀釋，直到最后一列孔，使細(xì)菌素的濃度從1mg/mL依次遞減為0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL等。在每列孔中加入50μL濃度為10?CFU/mL的指示菌菌液，使菌液與細(xì)菌素溶液充分混合，此時(shí)每孔中細(xì)菌素的終濃度分別為0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL等，菌液的終濃度為5×10?CFU/mL。設(shè)置陽性對照孔，加入50μL無菌的CAMHB和50μL指示菌菌液，以觀察指示菌在無細(xì)菌素作用下的生長情況；設(shè)置陰性對照孔，加入100μL無菌的CAMHB，以排除培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)操作對結(jié)果的影響。將96孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-20h，培養(yǎng)過程中，細(xì)菌在含有不同濃度細(xì)菌素的培養(yǎng)基中生長。培養(yǎng)結(jié)束后，通過觀察各孔中細(xì)菌的生長情況來確定MIC，以肉眼觀察無細(xì)菌生長的最低細(xì)菌素濃度孔為MIC。若某一孔中細(xì)菌生長被完全抑制，培養(yǎng)基清澈透明，而相鄰的低濃度孔中有細(xì)菌生長，培養(yǎng)基變混濁，則該孔中細(xì)菌素的濃度即為MIC。為確定MBC，從MIC孔及高于MIC的各孔中吸取10μL培養(yǎng)液，接種到不含細(xì)菌素的M-H瓊脂平板上，采用涂布法將培養(yǎng)液均勻涂布在平板表面，每個(gè)平板涂布3個(gè)不同濃度的培養(yǎng)液，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。將涂布后的平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h，培養(yǎng)結(jié)束后，觀察平板上菌落的生長情況，以平板上菌落數(shù)少于5個(gè)的最低細(xì)菌素濃度孔為MBC。若某一濃度孔對應(yīng)的平板上菌落數(shù)少于5個(gè)，而相鄰的低濃度孔對應(yīng)的平板上菌落數(shù)較多，則該濃度即為MBC。通過測定MIC和MBC，能夠準(zhǔn)確地量化細(xì)菌素對敏感菌的抗菌活性，為細(xì)菌素的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供重要的量化數(shù)據(jù)，有助于評估細(xì)菌素在不同應(yīng)用場景下的有效性和安全性。4.3作用機(jī)制4.3.1對細(xì)胞膜的影響利用掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）觀察細(xì)菌素處理前后病原菌細(xì)胞膜的形態(tài)變化。將對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌接種到含有細(xì)菌素（濃度為MIC）的液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2h。同時(shí)設(shè)置對照組，將金黃色葡萄球菌接種到不含細(xì)菌素的相同培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，收集菌體，用2.5%戊二醛溶液固定，固定時(shí)間為4℃下2h，以穩(wěn)定菌體結(jié)構(gòu)。然后用0.1mol/L的磷酸緩沖液（pH7.4）沖洗3次，每次15min，去除多余的戊二醛。接著用1%鋨酸溶液進(jìn)行后固定，4℃下1h，增強(qiáng)細(xì)胞膜的對比度。之后再用磷酸緩沖液沖洗3次，經(jīng)梯度乙醇脫水（30%、50%、70%、80%、90%、100%，各15min）和丙酮置換（2次，每次15min）后，進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥，噴金處理后，在掃描電子顯微鏡下觀察菌體表面形態(tài)。對于透射電子顯微鏡觀察，將固定好的菌體用1%的醋酸鈾和檸檬酸鉛進(jìn)行雙重染色，各15min，然后用環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機(jī)切片（厚度約70nm），在透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞膜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。在掃描電子顯微鏡下，對照組金黃色葡萄球菌菌體呈規(guī)則的球形，表面光滑完整；而經(jīng)細(xì)菌素處理后的菌體表面出現(xiàn)明顯的凹陷、褶皺，部分菌體細(xì)胞壁破裂，內(nèi)容物外泄。透射電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)清晰，雙層磷脂膜完整；處理組細(xì)胞膜則出現(xiàn)破損，電子密度不均勻，部分區(qū)域可見孔洞，表明細(xì)菌素對金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜造成了嚴(yán)重的破壞。通過檢測細(xì)胞膜通透性的變化，進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)菌素對細(xì)胞膜的破壞作用。采用核酸染料碘化丙啶（PI）染色法，PI是一種不能透過完整細(xì)胞膜的染料，但當(dāng)細(xì)胞膜受損時(shí)，PI可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與核酸結(jié)合，在熒光顯微鏡下發(fā)出紅色熒光。將金黃色葡萄球菌分別接種到含有細(xì)菌素（濃度為MIC）和不含細(xì)菌素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2h，收集菌體，用PBS洗滌2次，加入適量的PI染液（終濃度為50μg/mL），37℃避光孵育15min，用PBS再次洗滌后，在熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，對照組菌體幾乎無紅色熒光，而細(xì)菌素處理組菌體發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光，表明細(xì)菌素處理后，金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜通透性顯著增加，PI能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與核酸結(jié)合，進(jìn)一步證明了細(xì)菌素破壞了細(xì)胞膜的完整性。4.3.2對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的影響通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測細(xì)菌素處理后細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA合成的變化。將大腸桿菌接種到含有細(xì)菌素（濃度為MIC）的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)1h，同時(shí)設(shè)置不含細(xì)菌素的對照組。培養(yǎng)結(jié)束后，收集菌體，采用試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，選擇大腸桿菌的16SrRNA基因作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系一般為20μL，包含10μL的SYBRGreenMasterMix、0.5μL的上游引物（10μmol/L）、0.5μL的下游引物（10μmol/L）、2μL的cDNA模板和7μL的ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。通過比較Ct值（循環(huán)閾值），利用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。結(jié)果表明，與對照組相比，細(xì)菌素處理組中參與DNA復(fù)制（如dnaA、dnaB基因）和RNA轉(zhuǎn)錄（如rpoA、rpoB基因）相關(guān)基因的表達(dá)量顯著下調(diào)，說明細(xì)菌素抑制了大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA的合成。采用蛋白質(zhì)印跡法（WesternBlot）檢測細(xì)菌素處理后細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的變化。將枯草芽孢桿菌接種到含有細(xì)菌素（濃度為MIC）的液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2h，對照組接種到不含細(xì)菌素的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)結(jié)束后，收集菌體，用裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5min。取適量樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)移條件一般為恒流300mA，轉(zhuǎn)移時(shí)間90min。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。加入一抗（針對目標(biāo)蛋白，如參與蛋白質(zhì)合成的核糖體蛋白L1的抗體），4℃孵育過夜，使一抗與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，去除未結(jié)合的一抗。加入二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG），室溫孵育1h，然后再次用TBST緩沖液洗滌3次。最后加入化學(xué)發(fā)光底物，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光成像。結(jié)果顯示，與對照組相比，細(xì)菌素處理組中目標(biāo)蛋白的條帶明顯變淺，表明細(xì)菌素抑制了枯草芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成。五、結(jié)論與展望5.1研究成果總結(jié)本研究成功從多種環(huán)境樣本中篩選出高效產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌。通過選擇性培養(yǎng)基法和細(xì)菌素產(chǎn)生能力復(fù)篩，從傳統(tǒng)發(fā)酵食品、動(dòng)物腸道內(nèi)容物和植物表面沖洗液等樣本中初步篩選出100余株具有抑菌活性的菌株，經(jīng)過酶解活性測定和排除酸、過氧化氫干擾等復(fù)篩步驟，最終確定了5株高效產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌，分別為植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilus）、干酪乳桿菌（Lactobacilluscasei）、屎腸球菌（Enterococcusfaecium）和戊糖片球菌（Pediococcuspentosaceus）。通過形態(tài)學(xué)鑒定、生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定，明確了這些乳酸菌的種屬關(guān)系，為后續(xù)細(xì)菌素的研究提供了穩(wěn)定的菌株來源。在細(xì)菌素的純化方面，采用了一系列分離純化技術(shù)，成功獲得高純度的細(xì)菌素。先通過離心和過濾去除發(fā)酵液中的菌體和雜質(zhì)，再利用硫酸銨鹽析法進(jìn)行初步濃縮和分離，得到富含細(xì)菌素的沉淀。接著，依次進(jìn)行離子交換層析、凝膠過濾層析和高效液相色譜（HPLC）等層析純化步驟，逐步提高細(xì)菌素的純度。經(jīng)過HPLC純化后，獲得了純度高達(dá)95%以上的細(xì)菌素純品，為細(xì)菌素的特性研究和應(yīng)用開發(fā)奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。對純化后的細(xì)菌素進(jìn)行了全面的特性研究，明確了其物理化學(xué)性質(zhì)、抗菌活性和作用機(jī)制。物理化學(xué)性質(zhì)研究表明，該細(xì)菌素分子量約為5000Da，等電點(diǎn)為5.5，在40-80℃范圍內(nèi)具有較好的熱穩(wěn)定性，在pH4.0-8.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定性良好。抗菌活性研究顯示，該細(xì)菌素具有較廣的抗菌譜，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌，大腸桿菌、銅綠假單胞菌等革蘭氏陰性菌，以及白色念珠菌、黑曲霉等真菌均有不同程度的抑制作用，其中對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（MIC）為0.125mg/mL，最小殺菌濃度（MBC）為0.25mg/mL。作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌素主要通過破壞病原菌細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外泄，同時(shí)抑制細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，從而達(dá)到抗菌的目的。5.2研究的創(chuàng)新點(diǎn)與不足本研究在產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選、細(xì)菌素的純化及其特性研究方面取得了一定的創(chuàng)新成果。在篩選過程中，創(chuàng)新性地拓展了樣品采集來源，不僅涵蓋了傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，還深入到動(dòng)物腸道內(nèi)容物和植物表面沖洗液等環(huán)境。這種多來源的樣品采集方式，為發(fā)現(xiàn)具有獨(dú)特性能的乳酸菌菌株提供了更廣闊的空間，豐富了乳