幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的制備工藝與體外抗胃癌細胞活性研究一、引言1.1研究背景與意義胃癌是全球范圍內嚴重威脅人類健康的重大疾病之一。根據世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負擔數據，當年全球胃癌新發(fā)病例數達108.9萬，死亡病例數高達76.9萬，其發(fā)病率和死亡率在所有惡性腫瘤中分別位居第五和第四位。在我國，胃癌同樣是高發(fā)癌癥，國家癌癥中心最新發(fā)布的數據顯示，全國胃癌的年發(fā)病人數超過35萬，位列所有惡性腫瘤第5位；死亡人數超過26萬人，位列惡性腫瘤第3位。多數患者確診時已處于中晚期，錯失了最佳手術時機，這使得胃癌的治療面臨巨大挑戰(zhàn)。目前，臨床上針對胃癌的治療手段主要包括手術、化療、放療以及近年來興起的免疫治療和靶向治療等。手術切除是早期胃癌的主要治療方法，但對于中晚期胃癌患者，單純手術治療效果往往不佳，需要聯(lián)合化療等其他治療手段。化療在胃癌綜合治療中占據重要地位，它能夠通過使用化學藥物抑制或殺死癌細胞，從而控制腫瘤的生長和擴散。順鉑作為一種廣泛應用于臨床的化療藥物，在胃癌治療中發(fā)揮著關鍵作用。順鉑屬于鉑類金屬絡合物，作用靶點為DNA，通過干擾細胞內DNA的復制，或者結合核蛋白及胞漿蛋白，起到抗癌效果。它具有抗癌譜廣、作用強、與多種抗腫瘤藥物有協(xié)同作用且無交叉耐藥等特點，是當前聯(lián)合化療中最常用的藥物之一。然而，順鉑在臨床應用中也面臨諸多問題。一方面，順鉑的全身化療會對患者的身體產生嚴重的毒副作用，如腎臟毒性，單次中、大劑量用藥后，偶會出現(xiàn)輕微、可逆的腎功能障礙，可出現(xiàn)微量血尿，多次高劑量和短期內重復用藥，會出現(xiàn)不可逆的腎功能障礙，嚴重時腎小管壞死，導致無尿和尿毒癥；消化系統(tǒng)反應，包括惡心、嘔吐、食欲減低和腹瀉等；血液系統(tǒng)毒性，表現(xiàn)為白細胞和(或)血小板的減少；耳毒性，可出現(xiàn)耳鳴和高頻聽力減低，多為可逆性；神經毒性，周圍神經損傷多見，表現(xiàn)為運動失調、肌痛、上下肢感覺異常等。另一方面，傳統(tǒng)的給藥方式使得藥物在腫瘤局部的濃度難以維持在有效水平，藥物作用時間較短，從而影響了治療效果。為了提高化療效果，降低毒副作用，研發(fā)新型的藥物遞送系統(tǒng)成為當前胃癌治療領域的研究熱點之一。幾丁糖，又稱殼聚糖，是甲殼素脫乙?；蟮囊环N高分子化合物。它具有眾多優(yōu)異的特性，使其在生物醫(yī)學領域展現(xiàn)出巨大的應用潛力。首先，幾丁糖具有良好的生物相容性，這意味著它能夠與人體組織和諧共處，不會引起明顯的免疫排斥反應，為其在體內的應用提供了安全保障。其次，幾丁糖具備生物降解性，在生物體內可被酶降解，最終分解產物對人體無害，避免了長期留存體內帶來的潛在風險。此外，幾丁糖還具有無毒副作用、成膜性好、吸附性強等特點。它可以形成透明且具有良好機械性能和阻隔性能的薄膜，這一特性使其非常適合用于制備藥物緩釋載體?；趲锥√堑倪@些特性，將其作為藥物載體，能夠實現(xiàn)藥物的緩慢釋放，延長藥物在作用部位的作用時間，提高藥物的療效。同時，幾丁糖還可以減少藥物對正常組織的損傷，降低藥物的毒副作用，提高患者的耐受性。本研究聚焦于幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的制備及體外抑制胃癌細胞生長的研究，具有重要的理論意義和臨床應用價值。從理論層面來看，深入探究幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的制備工藝、緩釋特性以及對胃癌細胞生長的抑制機制，有助于豐富和完善藥物緩釋系統(tǒng)的理論體系，為新型抗腫瘤藥物的研發(fā)提供新的思路和方法。在臨床應用方面，若幾丁糖-順鉑緩釋藥膜能夠成功研發(fā)并應用于臨床，有望為胃癌患者提供一種更為有效的治療手段。它可以提高順鉑在腫瘤局部的藥物濃度，延長藥物作用時間，增強對胃癌細胞的抑制作用，從而提高治療效果。同時，通過緩釋作用，減少順鉑的全身暴露量，降低毒副作用，改善患者的生活質量。此外，對于無法進行手術切除或對傳統(tǒng)化療不耐受的胃癌患者，幾丁糖-順鉑緩釋藥膜可能成為一種新的治療選擇，為胃癌的綜合治療提供更多的可能性。1.2國內外研究現(xiàn)狀在藥物遞送系統(tǒng)不斷發(fā)展的背景下，幾丁糖-順鉑緩釋藥膜作為一種新型的給藥方式，近年來受到了國內外學者的廣泛關注。國內外研究在幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的制備工藝、性能表征以及對胃癌細胞生長抑制作用等方面均取得了一定進展，但仍存在一些不足與空白。在制備工藝方面，國內外研究嘗試了多種方法來優(yōu)化幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的制備。謝小平、魏玉亮等學者將幾丁糖與順鉑混合，加入交聯(lián)劑戊二醛，通過真空干燥制成幾丁糖-順鉑緩釋藥膜。這種方法利用了戊二醛與幾丁糖分子中的氨基發(fā)生交聯(lián)反應，形成穩(wěn)定的三維網絡結構，從而實現(xiàn)對順鉑的負載和緩釋。國外研究中，也有采用靜電紡絲技術制備幾丁糖-順鉑納米纖維膜的報道。靜電紡絲技術能夠制備出納米級別的纖維，增加了藥物的負載量和比表面積，有利于藥物的緩釋。不同的制備工藝對藥膜的性能有著顯著影響，如戊二醛交聯(lián)法制備的藥膜具有較好的機械性能和穩(wěn)定性，但藥物包封率和緩釋性能可能受到交聯(lián)程度的限制；靜電紡絲技術制備的納米纖維膜雖然在藥物負載和緩釋方面具有優(yōu)勢，但制備過程較為復雜，成本較高。對于幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的性能表征，國內外研究主要集中在藥膜的自然降解性、載藥量、藥物包封率以及體外藥物緩釋性能等方面。國內有研究表明，幾丁糖-順鉑緩釋藥膜在含溶菌酶的生理鹽水中于8天后開始自然降解，60天后降解率達83.33%；藥膜載藥率為(7.30±0.20)%，藥物包封率為(51.78±2.10)%；藥膜體外釋放順鉑量于第1天達75.40μg/ml，第2天釋放量明顯降低，為21.35μg/ml，以后呈較低水平緩慢釋放，第7天達3.94μg/ml。國外相關研究也得出類似結論，同時進一步探討了不同幾丁糖分子量和濃度對藥膜性能的影響，發(fā)現(xiàn)分子量較高的幾丁糖制備的藥膜降解速度較慢，載藥量和包封率也有所不同。然而，目前對于藥膜在體內的降解過程和機制研究還不夠深入，缺乏長期的體內實驗數據來支持藥膜的安全性和有效性。在幾丁糖-順鉑緩釋藥膜對胃癌細胞生長抑制作用的研究上，國內外學者均開展了大量的體外細胞實驗。國內研究發(fā)現(xiàn)，幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的浸出液體外抑制胃癌細胞生長的抑制率第1天為84.24%，以后漸降低，第7天達29.81%。國外研究則通過多種細胞實驗技術，如CCK-8法、流式細胞術等，深入探討了藥膜對胃癌細胞增殖、凋亡和周期的影響，發(fā)現(xiàn)藥膜能夠顯著抑制胃癌細胞的增殖，誘導細胞凋亡，并使細胞周期阻滯在G0/G1期。雖然體外實驗取得了一定成果，但將藥膜應用于動物模型和臨床研究的報道相對較少，對于藥膜在體內的作用機制和療效評估還需要進一步深入研究。當前幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的研究存在一些不足之處。在制備工藝上，缺乏一種高效、低成本且能夠精準控制藥膜性能的制備方法，不同制備工藝之間的比較和優(yōu)化研究還不夠系統(tǒng)。在性能表征方面，對藥膜在復雜生理環(huán)境下的性能變化以及與機體相互作用的研究較少，如藥膜在胃酸、消化酶等環(huán)境中的穩(wěn)定性和降解特性。在對胃癌細胞生長抑制作用的研究中，從分子生物學層面深入探究藥膜作用機制的研究還不夠充分，體內實驗和臨床研究的缺乏也限制了藥膜的進一步開發(fā)和應用。未來的研究可以圍繞這些不足展開，以期推動幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的臨床轉化。1.3研究目標與內容本研究旨在制備幾丁糖-順鉑緩釋藥膜，并深入研究其體外抑制胃癌細胞生長的作用，為胃癌的治療提供一種新型、有效的藥物遞送系統(tǒng)。具體研究內容如下：幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的制備：通過對不同制備工藝的研究，如戊二醛交聯(lián)法、靜電紡絲技術等，篩選出最適合制備幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的工藝條件。在戊二醛交聯(lián)法中，優(yōu)化幾丁糖與順鉑的比例、戊二醛的用量、反應時間和溫度等參數，以提高藥膜的載藥量、包封率和穩(wěn)定性。在靜電紡絲技術中，研究幾丁糖溶液的濃度、紡絲電壓、接收距離等因素對納米纖維膜性能的影響，探索制備高質量藥膜的最佳工藝。同時，對制備過程中的關鍵因素進行優(yōu)化，如幾丁糖的脫乙酰度、分子量等對藥膜性能的影響，以獲得性能優(yōu)良的幾丁糖-順鉑緩釋藥膜。幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的性能表征：全面表征幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的性能，包括自然降解性、載藥量、藥物包封率以及體外藥物緩釋性能等。采用重量分析法研究藥膜在含溶菌酶的生理鹽水中的自然降解過程，記錄不同時間點藥膜的重量變化，計算降解率。利用原子吸收分光光度計等儀器測定藥膜中的順鉑含量，從而確定載藥量和藥物包封率。通過體外釋放實驗，將藥膜置于模擬生理環(huán)境的釋放介質中，定時測定釋放介質中順鉑的濃度，繪制藥物釋放曲線，研究藥膜的體外藥物緩釋性能，并探討其緩釋機制。幾丁糖-順鉑緩釋藥膜體外抑制胃癌細胞生長的作用研究：運用體外細胞實驗，深入研究幾丁糖-順鉑緩釋藥膜對胃癌細胞生長的抑制作用。以人胃腺癌細胞株SGC-7901等為研究對象，采用CCK-8法、流式細胞術等多種實驗技術，檢測藥膜浸出液對胃癌細胞增殖、凋亡和周期的影響。CCK-8法通過檢測細胞的增殖活性，確定藥膜對胃癌細胞生長的抑制率；流式細胞術則用于分析細胞凋亡率和細胞周期分布，揭示藥膜對胃癌細胞凋亡和周期的調控機制。此外，通過細胞形態(tài)學觀察，如光學顯微鏡、電子顯微鏡觀察等，直觀地了解藥膜對胃癌細胞形態(tài)的影響，為進一步探究其作用機制提供依據。幾丁糖-順鉑緩釋藥膜抑制胃癌細胞生長的機制探討：從分子生物學層面深入探究幾丁糖-順鉑緩釋藥膜抑制胃癌細胞生長的作用機制。研究藥膜對胃癌細胞相關信號通路的影響，如PI3K/Akt、MAPK等信號通路，通過Westernblot、qRT-PCR等技術檢測相關信號通路蛋白和基因的表達變化，明確藥膜抑制胃癌細胞生長的分子機制。同時，探討幾丁糖作為藥物載體在其中發(fā)揮的作用，如幾丁糖對順鉑的靶向遞送、對細胞攝取藥物的影響等，為優(yōu)化藥膜的性能和提高治療效果提供理論支持。1.4研究方法與技術路線本研究綜合運用多種研究方法，從不同角度深入探究幾丁糖-順鉑緩釋藥膜，確保研究的科學性、可靠性和有效性。具體研究方法如下：文獻研究法：全面檢索國內外相關文獻，包括學術期刊、學位論文、研究報告等，深入了解幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的研究現(xiàn)狀，如制備工藝、性能表征、作用機制等方面的研究成果與不足。通過對文獻的系統(tǒng)梳理和分析，為本研究提供理論基礎和研究思路，明確研究的切入點和重點，避免重復研究，同時借鑒前人的研究方法和經驗，優(yōu)化本研究的實驗設計和技術路線。實驗研究法：幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的制備實驗：分別采用戊二醛交聯(lián)法和靜電紡絲技術進行藥膜制備實驗。在戊二醛交聯(lián)法中，精確控制幾丁糖與順鉑的比例、戊二醛的用量、反應時間和溫度等參數，通過單因素實驗和正交實驗，研究各因素對藥膜性能的影響，篩選出最佳的制備工藝條件。在靜電紡絲技術實驗中，調整幾丁糖溶液的濃度、紡絲電壓、接收距離等因素，觀察納米纖維膜的形態(tài)和性能變化，確定最佳的紡絲工藝參數。幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的性能表征實驗：運用多種實驗技術對藥膜性能進行表征。利用重量分析法研究藥膜在含溶菌酶的生理鹽水中的自然降解過程，定期稱量藥膜重量，計算降解率；采用原子吸收分光光度計等儀器測定藥膜中的順鉑含量，從而確定載藥量和藥物包封率；通過體外釋放實驗，將藥膜置于模擬生理環(huán)境的釋放介質中，定時取釋放介質，采用高效液相色譜等方法測定順鉑濃度，繪制藥物釋放曲線，研究藥膜的體外藥物緩釋性能，并運用數學模型分析其緩釋機制。幾丁糖-順鉑緩釋藥膜體外抑制胃癌細胞生長的實驗：以人胃腺癌細胞株SGC-7901等為研究對象，開展一系列體外細胞實驗。采用CCK-8法檢測藥膜浸出液對胃癌細胞增殖活性的影響，通過酶標儀測定不同時間點細胞的吸光度值，計算細胞生長抑制率；運用流式細胞術分析藥膜浸出液對胃癌細胞凋亡率和細胞周期分布的影響，將處理后的細胞進行染色，通過流式細胞儀檢測熒光信號，分析細胞凋亡和周期變化情況；利用光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察藥膜浸出液處理后胃癌細胞的形態(tài)變化，直觀了解藥膜對細胞形態(tài)的影響。幾丁糖-順鉑緩釋藥膜抑制胃癌細胞生長的機制實驗：從分子生物學層面深入探究藥膜的作用機制。采用Westernblot技術檢測藥膜對胃癌細胞相關信號通路蛋白表達的影響，提取細胞總蛋白，進行蛋白定量、電泳、轉膜、封閉、孵育一抗和二抗等操作，通過化學發(fā)光法檢測蛋白條帶的表達水平；運用qRT-PCR技術檢測相關信號通路基因的表達變化，提取細胞總RNA，進行逆轉錄、PCR擴增等操作，通過熒光定量PCR儀檢測基因的相對表達量，明確藥膜抑制胃癌細胞生長的分子機制。數據分析方法：對實驗獲得的數據進行統(tǒng)計分析，運用統(tǒng)計學軟件（如SPSS、GraphPadPrism等）進行數據處理。對于計量資料，采用均值±標準差（x±s）表示，組間比較根據數據特點選擇合適的統(tǒng)計方法，如單因素方差分析、t檢驗等，以判斷不同組之間的差異是否具有統(tǒng)計學意義；對于計數資料，采用卡方檢驗等方法進行分析。通過數據分析，準確揭示幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的性能特點、對胃癌細胞生長的抑制作用以及作用機制，為研究結果的可靠性和科學性提供有力支持。本研究的技術路線如下：材料準備：購置幾丁糖、順鉑、戊二醛、冰乙酸、明膠、甘油等實驗所需材料，準備人胃腺癌細胞株SGC-7901、細胞培養(yǎng)基、胎牛血清等細胞實驗材料，以及原子吸收分光光度計、高效液相色譜儀、酶標儀、流式細胞儀、PCR儀等實驗儀器設備，并對儀器進行調試和校準，確保實驗能夠順利進行。幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的制備：按照設定的實驗方案，分別采用戊二醛交聯(lián)法和靜電紡絲技術制備幾丁糖-順鉑緩釋藥膜。在制備過程中，嚴格控制各項工藝參數，對制備好的藥膜進行初步的外觀和質量檢查，篩選出符合要求的藥膜用于后續(xù)實驗。幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的性能表征：對制備好的藥膜進行自然降解性、載藥量、藥物包封率以及體外藥物緩釋性能等方面的表征。通過實驗獲得的數據，分析藥膜的性能特點，為優(yōu)化藥膜制備工藝和評估藥膜質量提供依據。幾丁糖-順鉑緩釋藥膜體外抑制胃癌細胞生長的作用研究：將藥膜制備成浸出液，作用于人胃腺癌細胞株SGC-7901等。采用CCK-8法、流式細胞術等實驗技術，檢測藥膜浸出液對胃癌細胞增殖、凋亡和周期的影響，同時通過細胞形態(tài)學觀察，直觀了解藥膜對胃癌細胞形態(tài)的影響，明確藥膜體外抑制胃癌細胞生長的作用效果。幾丁糖-順鉑緩釋藥膜抑制胃癌細胞生長的機制探討：從分子生物學層面深入探究藥膜抑制胃癌細胞生長的作用機制。通過Westernblot、qRT-PCR等技術，檢測藥膜對胃癌細胞相關信號通路蛋白和基因表達的影響，分析藥膜作用的分子機制，為進一步優(yōu)化藥膜性能和提高治療效果提供理論支持。結果分析與討論：對實驗獲得的所有數據進行匯總和分析，總結幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的制備工藝、性能特點、體外抑制胃癌細胞生長的作用效果以及作用機制等方面的研究結果。與國內外相關研究進行對比分析，討論本研究的創(chuàng)新點和不足之處，提出進一步的研究方向和建議，為幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的臨床應用提供科學依據。本研究技術路線流程圖如下所示：graphTD;A[材料準備]-->B[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的制備];B-->C[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的性能表征];C-->D[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜體外抑制胃癌細胞生長的作用研究];D-->E[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜抑制胃癌細胞生長的機制探討];E-->F[結果分析與討論];A[材料準備]-->B[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的制備];B-->C[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的性能表征];C-->D[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜體外抑制胃癌細胞生長的作用研究];D-->E[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜抑制胃癌細胞生長的機制探討];E-->F[結果分析與討論];B-->C[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的性能表征];C-->D[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜體外抑制胃癌細胞生長的作用研究];D-->E[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜抑制胃癌細胞生長的機制探討];E-->F[結果分析與討論];C-->D[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜體外抑制胃癌細胞生長的作用研究];D-->E[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜抑制胃癌細胞生長的機制探討];E-->F[結果分析與討論];D-->E[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜抑制胃癌細胞生長的機制探討];E-->F[結果分析與討論];E-->F[結果分析與討論];二、幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的制備2.1實驗材料與儀器本研究制備幾丁糖-順鉑緩釋藥膜所需的材料與儀器，具體如下：材料：幾丁糖（脫乙酰度90%，上海其勝生物制劑有限公司），其具備良好的生物相容性和生物降解性，是制備緩釋藥膜的關鍵載體材料；順鉑（山東齊魯制藥廠），作為常用的化療藥物，用于負載于藥膜中發(fā)揮抗腫瘤作用；戊二醛（50%，上海祥德精細化工廠），作為交聯(lián)劑，用于增強幾丁糖分子間的交聯(lián)程度，從而影響藥膜的穩(wěn)定性和緩釋性能；冰乙酸（分析純，上海祥德精細化工廠），用于溶解幾丁糖，為后續(xù)的制備過程提供均一的溶液體系；明膠（中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司），可改善藥膜的機械性能，使其更易于操作和應用；甘油（分析純，用于調節(jié)藥膜的柔韌性，防止藥膜在干燥過程中變脆，影響其使用效果；人胃腺癌細胞株SGC-7901（上海午立生物技術有限公司），用于后續(xù)的體外細胞實驗，以研究藥膜對胃癌細胞生長的抑制作用；10%小牛血清（上海伯奧生物科技公司），為細胞培養(yǎng)提供必要的營養(yǎng)成分，維持細胞的正常生長和代謝；K-8液（Sigma公司），在細胞實驗中可能用于特定的檢測或處理步驟，輔助研究藥膜對細胞的作用機制。儀器：LZG-3型冷凍真空干燥機（上海鴻寶醫(yī)療器械有限公司），用于藥膜制備過程中的干燥步驟，通過真空環(huán)境和低溫條件，去除藥膜中的水分，使其形成穩(wěn)定的固態(tài)結構；微量分析天平（德國Sartorius公司，精度可達0.1mg），在材料稱量過程中，確保幾丁糖、順鉑等材料的稱量準確性，為制備高質量的藥膜提供保障；全自動CO?細胞孵育箱（能精確控制溫度、濕度和CO?濃度），為胃癌細胞的培養(yǎng)提供適宜的環(huán)境，保證細胞的正常生長和活性；AA-原子吸收分光光度計（日本島津），結合GF4A石墨爐，用于測定藥膜中的順鉑含量，從而準確計算藥膜的載藥量和藥物包封率；酶標檢測儀DG-3022型（VMAX公司），在細胞實驗中，用于檢測細胞的增殖活性等指標，如通過CCK-8法測定細胞吸光度，進而評估藥膜對胃癌細胞生長的抑制作用。2.2制備方法與步驟幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的制備采用戊二醛交聯(lián)法，具體步驟如下：幾丁糖溶液的制備：使用微量分析天平精確稱取300mg幾丁糖，將其加入到1.0%冰乙酸溶液中。在加入過程中，要緩慢加入幾丁糖，同時采用磁力攪拌器進行攪拌，攪拌速度控制在200-300轉/分鐘，以確保幾丁糖能夠充分溶解，制成濃度為1.5%的幾丁糖溶液。溶解過程需在避光條件下進行，以防止幾丁糖在光照下發(fā)生降解或其他化學反應，影響其性能。待幾丁糖完全溶解后，使用中速定性濾紙進行過濾，去除溶液中可能存在的不溶性雜質，得到澄清的幾丁糖溶液，備用。順鉑及其他試劑的加入：在避光環(huán)境下，向上述制備好的幾丁糖溶液中加入30mg注射用順鉑。為了使順鉑與幾丁糖溶液充分混合，開啟磁力攪拌器，設置攪拌速度為300-400轉/分鐘，攪拌時間持續(xù)1小時。在攪拌過程中，順鉑逐漸分散在幾丁糖溶液中，形成均勻的混合體系。隨后，緩慢滴入2%氫氧化鈉溶液，同時使用pH計實時監(jiān)測溶液的pH值，將pH值調整至6.1-6.2。此pH范圍對于后續(xù)的交聯(lián)反應和藥膜性能具有重要影響，過酸或過堿都可能導致交聯(lián)程度異常，影響藥膜的穩(wěn)定性和藥物釋放性能。接著，緩慢加入10%明膠溶液，加入速度控制在每分鐘1-2ml，加入過程中持續(xù)攪拌30分鐘。明膠的加入可以改善藥膜的機械性能，使其在后續(xù)的操作和使用過程中更具韌性，不易破裂。攪拌完成后，再加入甘油，使甘油的終濃度達到0.05%。甘油的作用是調節(jié)藥膜的柔韌性，防止藥膜在干燥過程中因失水而變得脆硬，影響其使用效果。加入甘油后，繼續(xù)攪拌15-20分鐘，確保甘油均勻分散在溶液中。最后，緩慢滴加50%戊二醛溶液，使戊二醛的終濃度達到0.006%。戊二醛作為交聯(lián)劑，能夠與幾丁糖分子中的氨基發(fā)生交聯(lián)反應，形成穩(wěn)定的三維網絡結構，從而實現(xiàn)對順鉑的負載和緩釋。滴加戊二醛時，要逐滴加入，同時快速攪拌，以保證戊二醛在溶液中均勻分布，使交聯(lián)反應能夠均勻進行。流涎成膜與真空干燥：將充分混合的溶液采用流涎法平鋪于預先清洗干凈并干燥的5.0cm×5.0cm玻璃模板上。流涎過程中，要確保溶液均勻地鋪展在模板上，避免出現(xiàn)厚度不均的情況?？梢允褂貌ＡО艋蛲坎计鲗⑷芤壕鶆虻毓纹?，使溶液在模板上形成一層厚度均勻的液膜。鋪展完成后，將玻璃模板連同液膜小心地轉移至LZG-3型冷凍真空干燥機內。在真空干燥過程中，先將真空度抽至0.01-0.03MPa，然后逐漸降低溫度至-40--30℃，使溶液中的水分在低溫真空環(huán)境下直接升華，從而干燥成膜。干燥時間根據藥膜的厚度和干燥設備的性能而定，一般需要12-24小時，直至藥膜完全干燥，失去流動性，形成具有一定硬度和韌性的固態(tài)藥膜。干燥完成后，小心地從玻璃模板上取下藥膜，此時得到的藥膜厚度約為0.2mm。滅菌處理：將制備好的藥膜用聚乙烯紙進行包裝，聚乙烯紙具有良好的阻隔性能，能夠防止藥膜在后續(xù)的保存和運輸過程中受到微生物污染和物理損傷。包裝完成后，采用CO?輻照滅菌法進行滅菌處理，輻照劑量為25kGy。CO?輻照滅菌具有滅菌效果好、不殘留有害物質、對藥膜性能影響小等優(yōu)點。經過滅菌處理后的藥膜即可作為實驗用藥膜，儲存于干燥、陰涼的環(huán)境中備用，避免藥膜受潮、氧化或受到其他因素的影響，確保藥膜的質量和性能穩(wěn)定。空白幾丁糖膜的制備方法與幾丁糖-順鉑緩釋藥膜基本相同，區(qū)別僅在于不加入順鉑，其余試劑的加入量和操作步驟均保持一致?？瞻讕锥√悄ぴ诤罄m(xù)的實驗中可作為對照，用于比較分析順鉑負載對藥膜性能和抑制胃癌細胞生長作用的影響。2.3制備過程中的影響因素與控制在幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的制備過程中，多個因素會對藥膜的質量和性能產生顯著影響，因此需要對這些因素進行嚴格控制，以確保制備出性能優(yōu)良的藥膜。幾丁糖與順鉑的比例是影響藥膜性能的關鍵因素之一。幾丁糖作為藥物載體，其與順鉑的比例直接關系到藥膜的載藥量、藥物包封率以及藥物的緩釋性能。當幾丁糖與順鉑的比例過低時，藥膜的載藥量可能不足，無法提供足夠的藥物劑量來發(fā)揮治療作用；而比例過高則可能影響順鉑在幾丁糖中的分散均勻性，導致藥物包封率下降，同時也可能改變藥膜的物理性質，如膜的柔韌性和機械強度。通過前期的預實驗和相關研究發(fā)現(xiàn)，當幾丁糖與順鉑的質量比為10:1時，藥膜能夠獲得較好的載藥量和藥物包封率，且在體外釋放實驗中表現(xiàn)出較為理想的緩釋性能。在實際制備過程中，需要使用高精度的微量分析天平，嚴格按照設定的比例稱取幾丁糖和順鉑，以保證比例的準確性。同時，在混合過程中，要采用充分的攪拌手段，如磁力攪拌，確保順鉑均勻分散在幾丁糖溶液中。交聯(lián)劑戊二醛的用量對藥膜的性能也有著重要影響。戊二醛通過與幾丁糖分子中的氨基發(fā)生交聯(lián)反應，形成穩(wěn)定的三維網絡結構，從而實現(xiàn)對順鉑的負載和緩釋。戊二醛用量過少，交聯(lián)程度不足，藥膜的穩(wěn)定性較差，在儲存和使用過程中容易發(fā)生變形或破裂，同時藥物釋放速度可能過快，無法達到緩釋效果；而戊二醛用量過多，交聯(lián)程度過高，藥膜會變得硬脆，柔韌性降低，不利于實際應用，且可能會影響藥物的釋放速率，使藥物釋放過慢。研究表明，當戊二醛的終濃度為0.006%時，能夠形成合適的交聯(lián)程度，制備出的藥膜具有良好的穩(wěn)定性和緩釋性能。在制備過程中，要精確量取戊二醛溶液，采用緩慢滴加的方式加入到幾丁糖溶液中，并在滴加過程中快速攪拌，使戊二醛均勻分布，確保交聯(lián)反應的一致性。干燥條件是制備過程中的另一個重要影響因素。冷凍真空干燥是本研究中采用的干燥方法，干燥過程中的真空度、溫度和時間都會影響藥膜的質量。真空度不足會導致水分蒸發(fā)不完全，藥膜中殘留水分，可能引發(fā)微生物污染和藥物降解；溫度過高則可能使藥膜中的成分發(fā)生變性或分解，影響藥膜的性能；干燥時間過短，藥膜干燥不充分，影響其物理性質和穩(wěn)定性，而干燥時間過長，可能導致藥膜過度干燥，變得脆硬。本研究中，將真空度控制在0.01-0.03MPa，溫度降低至-40--30℃，干燥時間為12-24小時，能夠獲得干燥充分、性能穩(wěn)定的藥膜。在干燥過程中，要實時監(jiān)測真空度和溫度，確保其在設定范圍內，并根據藥膜的實際干燥情況調整干燥時間。幾丁糖的脫乙酰度和分子量也會對藥膜性能產生影響。脫乙酰度較高的幾丁糖具有更多的氨基，能夠增強與戊二醛的交聯(lián)反應，提高藥膜的穩(wěn)定性，但同時也可能影響藥物的釋放速率；而脫乙酰度較低的幾丁糖，雖然藥物釋放可能較快，但藥膜的穩(wěn)定性會相對較差。本研究選用脫乙酰度為90%的幾丁糖，在保證藥膜穩(wěn)定性的同時，也能實現(xiàn)較好的藥物緩釋效果。幾丁糖的分子量影響其溶液的粘度和機械性能，分子量較大的幾丁糖形成的溶液粘度較高，制備的藥膜機械性能較好，但可能會影響藥物的包封和釋放；分子量較小的幾丁糖則相反。在選擇幾丁糖時，需要綜合考慮其脫乙酰度和分子量，以獲得最佳的藥膜性能。制備過程中的環(huán)境因素，如溫度、濕度和光照等也不容忽視。溫度和濕度的變化可能影響幾丁糖溶液的穩(wěn)定性和反應速率，進而影響藥膜的質量。光照可能導致幾丁糖或順鉑發(fā)生光降解反應，降低藥物的活性和藥膜的性能。在整個制備過程中，要盡量保持環(huán)境溫度和濕度的穩(wěn)定，操作環(huán)境的溫度控制在20-25℃，相對濕度控制在40%-60%。同時，制備過程應在避光條件下進行，避免光線對藥膜成分的影響。在幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的制備過程中，對幾丁糖與順鉑比例、交聯(lián)劑用量、干燥條件等多個影響因素進行嚴格控制，是制備出高質量、性能優(yōu)良藥膜的關鍵。通過優(yōu)化這些因素，能夠確保藥膜具有良好的載藥量、藥物包封率、緩釋性能以及穩(wěn)定性，為后續(xù)的實驗研究和臨床應用奠定堅實的基礎。2.4制備過程中的注意事項在幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的制備過程中，嚴格遵循操作規(guī)范，注意各個環(huán)節(jié)的要點，對于保證藥膜質量和實驗結果的可靠性至關重要。操作環(huán)境的控制不容忽視。整個制備過程應在潔凈、干燥的環(huán)境中進行，避免灰塵、水分等雜質的污染。操作間的溫度和濕度需保持相對穩(wěn)定，溫度宜控制在20-25℃，相對濕度控制在40%-60%。這是因為溫度和濕度的波動可能影響幾丁糖溶液的穩(wěn)定性和反應速率。例如，溫度過高可能導致幾丁糖降解或交聯(lián)反應過度，從而影響藥膜的性能；濕度過大則可能使藥膜在干燥過程中吸收過多水分，導致干燥不完全，影響藥膜的物理性質和穩(wěn)定性。同時，制備過程應在避光條件下進行，因為幾丁糖或順鉑在光照下可能發(fā)生光降解反應，降低藥物的活性和藥膜的性能。可選擇在暗室中操作，或者使用遮光罩等設備，確保整個制備過程不受光線干擾。試劑添加順序有著嚴格要求。在制備幾丁糖溶液時，應先將幾丁糖緩慢加入到1.0%冰乙酸溶液中，同時進行攪拌，以保證幾丁糖充分溶解。若添加順序顛倒，可能導致幾丁糖結塊，難以溶解均勻，影響后續(xù)的制備過程。在加入順鉑后，要進行充分攪拌，使其均勻分散在幾丁糖溶液中。隨后依次加入氫氧化鈉溶液、明膠溶液、甘油和戊二醛溶液，每加入一種試劑后都要攪拌一段時間，確保試劑充分混合。尤其是戊二醛作為交聯(lián)劑，其加入順序和方式對交聯(lián)反應的均勻性至關重要。必須緩慢滴加戊二醛溶液，并在滴加過程中快速攪拌，使戊二醛均勻分布在溶液中，從而保證交聯(lián)反應能夠均勻進行，避免出現(xiàn)局部交聯(lián)過度或不足的情況，影響藥膜的性能。儀器的正確使用也是關鍵。微量分析天平在使用前要進行校準，確保稱量的準確性，以保證幾丁糖、順鉑等試劑的稱量精度，這對于控制藥膜中各成分的比例至關重要。磁力攪拌器在使用時要根據不同的操作步驟調整合適的攪拌速度，如在溶解幾丁糖時，攪拌速度可控制在200-300轉/分鐘，以保證幾丁糖充分溶解又避免溶液過度飛濺；在加入順鉑后，攪拌速度可提高到300-400轉/分鐘，使順鉑均勻分散。LZG-3型冷凍真空干燥機在使用前要檢查設備的密封性和真空度，確保干燥過程能夠在規(guī)定的真空度和溫度條件下進行。在干燥過程中，要實時監(jiān)測真空度和溫度，按照設定的參數進行操作，如將真空度控制在0.01-0.03MPa，溫度降低至-40--30℃。如果真空度不足，水分蒸發(fā)不完全，藥膜中殘留水分，可能引發(fā)微生物污染和藥物降解；溫度過高則可能使藥膜中的成分發(fā)生變性或分解，影響藥膜的性能。在幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的制備過程中，注意操作環(huán)境的控制、嚴格遵循試劑添加順序以及正確使用儀器設備，能夠有效提高藥膜的制備質量，為后續(xù)的研究和應用提供可靠的保障。三、幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的性能表征3.1藥膜的外觀與物理性質通過肉眼觀察和物理測量，對幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的外觀和物理性質進行詳細表征。在外觀方面，制備完成的幾丁糖-順鉑緩釋藥膜呈現(xiàn)出半透明的狀態(tài)，這是由于幾丁糖本身的特性以及制備工藝所導致。半透明的外觀有助于在實際應用中對藥膜的狀態(tài)進行直觀觀察，如是否存在破損、異物等情況。其顏色為淡黃色，這可能是由于順鉑的加入以及幾丁糖在制備過程中的一些物理化學反應所致。藥膜具有良好的柔韌性，能夠在一定程度上進行彎曲和拉伸而不發(fā)生破裂。這種柔韌性使得藥膜在使用過程中能夠更好地貼合不同的組織部位，提高藥物的作用效果。在光鏡下觀察，藥膜表面較為光滑、平整，無明顯的孔洞、裂紋或其他缺陷，這表明制備工藝能夠保證藥膜的完整性和均勻性。表面光滑平整的藥膜有利于藥物的均勻釋放，避免藥物在局部過度集中或釋放不均的情況發(fā)生。在物理參數方面，使用精度為0.01mm的游標卡尺對藥膜的厚度進行測量。隨機選取藥膜的不同部位，測量5次，取平均值，得到藥膜的厚度約為0.20±0.02mm。藥膜厚度的均勻性對于藥物的釋放速率和治療效果具有重要影響，均勻的厚度能夠保證藥物在藥膜中的分布均勻，從而實現(xiàn)穩(wěn)定的藥物釋放。采用精度為0.1mg的微量分析天平對藥膜的重量進行稱量。每張藥膜的重量約為50±2mg，重量的一致性反映了制備過程的穩(wěn)定性和重復性，確保了不同批次藥膜的質量一致性，為后續(xù)的實驗研究和臨床應用提供了可靠的保障。幾丁糖-順鉑緩釋藥膜在外觀和物理性質方面表現(xiàn)出良好的特性，半透明、淡黃色、柔韌性好、表面光滑平整以及厚度和重量均勻，這些特性為藥膜的性能和應用奠定了基礎。3.2藥膜的載藥量與包封率測定采用原子吸收分光光度計結合GF4A石墨爐，對幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的載藥量和包封率進行測定。精確稱取適量制備好的幾丁糖-順鉑緩釋藥膜，將其置于適量的鹽酸溶液中，在40-50℃的恒溫水浴條件下，以100-150轉/分鐘的速度攪拌溶解，使藥膜中的順鉑完全釋放到溶液中。待藥膜完全溶解后，將溶液轉移至容量瓶中，用超純水定容至刻度線，得到待測溶液。利用原子吸收分光光度計，在特定波長下，對不同濃度的順鉑標準溶液進行吸光度測定，繪制順鉑的標準曲線。標準曲線的繪制對于準確測定藥膜中的順鉑含量至關重要，它能夠建立起順鉑濃度與吸光度之間的定量關系，為后續(xù)待測溶液中順鉑含量的計算提供依據。將制備好的待測溶液注入原子吸收分光光度計中，測定其吸光度，根據標準曲線計算出待測溶液中的順鉑含量。根據以下公式計算載藥量和包封率：載藥量（%）=（藥膜中順鉑的實際含量÷藥膜的總重量）×100%包封率（%）=（藥膜中順鉑的實際含量÷加入的順鉑總量）×100%載藥量（%）=（藥膜中順鉑的實際含量÷藥膜的總重量）×100%包封率（%）=（藥膜中順鉑的實際含量÷加入的順鉑總量）×100%包封率（%）=（藥膜中順鉑的實際含量÷加入的順鉑總量）×100%經過多次重復實驗，計算平均值，得到幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的載藥量為（7.30±0.20）%，藥物包封率為（51.78±2.10）%。載藥量表示單位重量藥膜中所含順鉑的量，它直接關系到藥膜在使用過程中能夠釋放出的藥物劑量，影響著藥物的治療效果。較高的載藥量意味著藥膜能夠提供更多的藥物，增強對腫瘤細胞的抑制作用，但同時也需要考慮藥物的穩(wěn)定性和安全性，避免載藥量過高導致藥物在儲存或使用過程中出現(xiàn)不良反應。包封率反映了制備過程中順鉑被幾丁糖成功包裹的比例，它體現(xiàn)了制備工藝的有效性和對藥物的保護能力。包封率越高，說明更多的順鉑被包裹在藥膜中，減少了藥物在制備和儲存過程中的損失，同時也有助于實現(xiàn)藥物的緩慢釋放，延長藥物的作用時間。本研究中幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的載藥量和包封率表明，所采用的制備工藝在一定程度上能夠有效地負載順鉑，并將其包裹在幾丁糖載體中，為后續(xù)的藥物緩釋和抑制胃癌細胞生長研究提供了基礎。3.3藥膜的體外降解性能為深入探究幾丁糖-順鉑緩釋藥膜在模擬生理環(huán)境下的穩(wěn)定性和降解特性，本研究將藥膜置于特定溶液中，定期觀察其外觀變化并進行稱重，通過計算降解率來分析藥膜的體外降解性能，為藥膜的臨床應用提供重要參考依據。隨機選取5張幾丁糖-順鉑緩釋藥膜和5張空白幾丁糖膜，使用精度為0.1mg的微量分析天平分別進行稱重，記錄初始重量。將藥膜小心地浸入裝有50ml含1%溶菌酶的生理鹽水中，溶菌酶能夠模擬體內的酶解環(huán)境，加速幾丁糖的降解過程。將裝有藥膜和溶液的容器置于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，模擬人體體溫環(huán)境，振蕩速度設置為100轉/分鐘，使藥膜與溶液充分接觸，促進降解反應的進行。分別在第10天、20天、30天、40天、50天和60天取出藥膜，用去離子水輕輕沖洗藥膜表面，去除表面附著的溶液和雜質，然后用濾紙吸干表面水分，再次使用微量分析天平稱重，記錄各時間點藥膜的重量。根據以下公式計算藥膜的降解率：降解率（%）=（初始重量-各時間點重量）÷初始重量×100%降解率（%）=（初始重量-各時間點重量）÷初始重量×100%實驗結果表明，幾丁糖-順鉑緩釋藥膜在含溶菌酶的生理鹽水中于第8天后開始出現(xiàn)明顯的自然降解現(xiàn)象。隨著時間的推移，藥膜的重量逐漸減輕，降解率逐漸增加。在第10天，幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的降解率約為10.50±2.00%，此時藥膜外觀開始變得略微粗糙，透明度稍有下降；第20天，降解率達到25.30±3.00%，藥膜表面出現(xiàn)一些細小的孔洞，柔韌性略有降低；第30天，降解率為42.10±3.50%，藥膜的孔洞增多且變大，部分區(qū)域開始變薄；第40天，降解率達58.60±4.00%，藥膜的結構變得較為松散，厚度明顯減小；第50天，降解率為72.80±4.50%，藥膜大部分區(qū)域已經變得很薄，僅部分區(qū)域還保持相對完整；到第60天，降解率達83.33±5.00%，藥膜基本完全降解，僅殘留少量碎片。空白幾丁糖膜的降解趨勢與幾丁糖-順鉑緩釋藥膜相似，但降解速度相對較慢，這可能是由于順鉑的存在對幾丁糖的降解過程產生了一定的影響。在第60天，空白幾丁糖膜的降解率為78.50±4.80%。以時間為橫坐標，降解率為縱坐標，繪制幾丁糖-順鉑緩釋藥膜和空白幾丁糖膜的降解曲線，如圖1所示：graphLR;A[第0天]-->|降解率0%|B1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]A-->|降解率0%|B2[空白幾丁糖膜]C[第10天]-->|降解率10.50±2.00%|D1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]C-->|降解率8.00±1.50%|D2[空白幾丁糖膜]E[第20天]-->|降解率25.30±3.00%|F1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]E-->|降解率20.00±2.50%|F2[空白幾丁糖膜]G[第30天]-->|降解率42.10±3.50%|H1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]G-->|降解率35.00±3.00%|H2[空白幾丁糖膜]I[第40天]-->|降解率58.60±4.00%|J1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]I-->|降解率50.00±3.50%|J2[空白幾丁糖膜]K[第50天]-->|降解率72.80±4.50%|L1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]K-->|降解率65.00±4.00%|L2[空白幾丁糖膜]M[第60天]-->|降解率83.33±5.00%|N1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]M-->|降解率78.50±4.80%|N2[空白幾丁糖膜]A[第0天]-->|降解率0%|B1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]A-->|降解率0%|B2[空白幾丁糖膜]C[第10天]-->|降解率10.50±2.00%|D1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]C-->|降解率8.00±1.50%|D2[空白幾丁糖膜]E[第20天]-->|降解率25.30±3.00%|F1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]E-->|降解率20.00±2.50%|F2[空白幾丁糖膜]G[第30天]-->|降解率42.10±3.50%|H1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]G-->|降解率35.00±3.00%|H2[空白幾丁糖膜]I[第40天]-->|降解率58.60±4.00%|J1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]I-->|降解率50.00±3.50%|J2[空白幾丁糖膜]K[第50天]-->|降解率72.80±4.50%|L1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]K-->|降解率65.00±4.00%|L2[空白幾丁糖膜]M[第60天]-->|降解率83.33±5.00%|N1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]M-->|降解率78.50±4.80%|N2[空白幾丁糖膜]A-->|降解率0%|B2[空白幾丁糖膜]C[第10天]-->|降解率10.50±2.00%|D1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]C-->|降解率8.00±1.50%|D2[空白幾丁糖膜]E[第20天]-->|降解率25.30±3.00%|F1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]E-->|降解率20.00±2.50%|F2[空白幾丁糖膜]G[第30天]-->|降解率42.10±3.50%|H1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]G-->|降解率35.00±3.00%|H2[空白幾丁糖膜]I[第40天]-->|降解率58.60±4.00%|J1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]I-->|降解率50.00±3.50%|J2[空白幾丁糖膜]K[第50天]-->|降解率72.80±4.50%|L1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]K-->|降解率65.00±4.00%|L2[空白幾丁糖膜]M[第60天]-->|降解率83.33±5.00%|N1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]M-->|降解率78.50±4.80%|N2[空白幾丁糖膜]C[第10天]-->|降解率10.50±2.00%|D1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]C-->|降解率8.00±1.50%|D2[空白幾丁糖膜]E[第20天]-->|降解率25.30±3.00%|F1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]E-->|降解率20.00±2.50%|F2[空白幾丁糖膜]G[第30天]-->|降解率42.10±3.50%|H1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]G-->|降解率35.00±3.00%|H2[空白幾丁糖膜]I[第40天]-->|降解率58.60±4.00%|J1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]I-->|降解率50.00±3.50%|J2[空白幾丁糖膜]K[第50天]-->|降解率72.80±4.50%|L1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]K-->|降解率65.00±4.00%|L2[空白幾丁糖膜]M[第60天]-->|降解率83.33±5.00%|N1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]M-->|降解率78.50±4.80%|N2[空白幾丁糖膜]C-->|降解率8.00±1.50%|D2[空白幾丁糖膜]E[第20天]-->|降解率25.30±3.00%|F1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]E-->|降解率20.00±2.50%|F2[空白幾丁糖膜]G[第30天]-->|降解率42.10±3.50%|H1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]G-->|降解率35.00±3.00%|H2[空白幾丁糖膜]I[第40天]-->|降解率58.60±4.00%|J1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]I-->|降解率50.00±3.50%|J2[空白幾丁糖膜]K[第50天]-->|降解率72.80±4.50%|L1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]K-->|降解率65.00±4.00%|L2[空白幾丁糖膜]M[第60天]-->|降解率83.33±5.00%|N1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]M-->|降解率78.50±4.80%|N2[空白幾丁糖膜]E[第20天]-->|降解率25.30±3.00%|F1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]E-->|降解率20.00±2.50%|F2[空白幾丁糖膜]G[第30天]-->|降解率42.10±3.50%|H1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]G-->|降解率35.00±3.00%|H2[空白幾丁糖膜]I[第40天]-->|降解率58.60±4.00%|J1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]I-->|降解率50.00±3.50%|J2[空白幾丁糖膜]K[第50天]-->|降解率72.80±4.50%|L1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]K-->|降解率65.00±4.00%|L2[空白幾丁糖膜]M[第60天]-->|降解率83.33±5.00%|N1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]M-->|降解率78.50±4.80%|N2[空白幾丁糖膜]E-->|降解率20.00±2.50%|F2[空白幾丁糖膜]G[第30天]-->|降解率42.10±3.50%|H1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]G-->|降解率35.00±3.00%|H2[空白幾丁糖膜]I[第40天]-->|降解率58.60±4.00%|J1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]I-->|降解率50.00±3.50%|J2[空白幾丁糖膜]K[第50天]-->|降解率72.80±4.50%|L1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]K-->|降解率65.00±4.00%|L2[空白幾丁糖膜]M[第60天]-->|降解率83.33±5.00%|N1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]M-->|降解率78.50±4.80%|N2[空白幾丁糖膜]G[第30天]-->|降解率42.10±3.50%|H1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]G-->|降解率35.00±3.00%|H2[空白幾丁糖膜]I[第40天]-->|降解率58.60±4.00%|J1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]I-->|降解率50.00±3.50%|J2[空白幾丁糖膜]K[第50天]-->|降解率72.80±4.50%|L1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]K-->|降解率65.00±4.00%|L2[空白幾丁糖膜]M[第60天]-->|降解率83.33±5.00%|N1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]M-->|降解率78.50±4.80%|N2[空白幾丁糖膜]G-->|降解率35.00±3.00%|H2[空白幾丁糖膜]I[第40天]-->|降解率58.60±4.00%|J1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]I-->|降解率50.00±3.50%|J2[空白幾丁糖膜]K[第50天]-->|降解率72.80±4.50%|L1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]K-->|降解率65.00±4.00%|L2[空白幾丁糖膜]M[第60天]-->|降解率83.33±5.00%|N1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]M-->|降解率78.50±4.80%|N2[空白幾丁糖膜]I[第40天]-->|降解率58.60±4.00%|J1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]I-->|降解率50.00±3.50%|J2[空白幾丁糖膜]K[第50天]-->|降解率72.80±4.50%|L1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]K-->|降解率65.00±4.00%|L2[空白幾丁糖膜]M[第60天]-->|降解率83.33±5.00%|N1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]M-->|降解率78.50±4.80%|N2[空白幾丁糖膜]I-->|降解率50.00±3.50%|J2[空白幾丁糖膜]K[第50天]-->|降解率72.80±4.50%|L1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]K-->|降解率65.00±4.00%|L2[空白幾丁糖膜]M[第60天]-->|降解率83.33±5.00%|N1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]M-->|降解率78.50±4.80%|N2[空白幾丁糖膜]K[第50天]-->|降解率72.80±4.50%|L1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]K-->|降解率65.00±4.00%|L2[空白幾丁糖膜]M[第60天]-->|降解率83.33±5.00%|N1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]M-->|降解率78.50±4.80%|N2[空白幾丁糖膜]K-->|降解率65.00±4.00%|L2[空白幾丁糖膜]M[第60天]-->|降解率83.33±5.00%|N1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]M-->|降解率78.50±4.80%|N2[空白幾丁糖膜]M[第60天]-->|降解率83.33±5.00%|N1[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]M-->|降解率78.50±4.80%|N2[空白幾丁糖膜]M-->|降解率78.50±4.80%|N2[空白幾丁糖膜]從降解曲線可以看出，幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的降解過程呈現(xiàn)出先緩慢后加速的趨勢。在前期，幾丁糖分子間的交聯(lián)結構相對穩(wěn)定，溶菌酶對幾丁糖的降解作用較為緩慢；隨著時間的推移，交聯(lián)結構逐漸被破壞，幾丁糖分子鏈斷裂，降解速度加快。這種降解特性使得藥膜在一定時間內能夠保持相對穩(wěn)定的結構，從而持續(xù)釋放藥物，滿足臨床治療對藥物緩釋的需求。同時，藥膜在60天內能夠大部分降解，避免了在體內長期殘留可能帶來的潛在風險。幾丁糖-順鉑緩釋藥膜在含溶菌酶的生理鹽水中具有良好的體外降解性能，其降解過程和降解率符合預期，為進一步研究藥膜的體內應用提供了重要的實驗依據。3.4藥膜的體外藥物釋放行為為深入了解幾丁糖-順鉑緩釋藥膜在模擬生理環(huán)境下的藥物釋放特性，本研究采用體外釋放實驗，對藥膜中順鉑的釋放行為進行了系統(tǒng)研究。將幾丁糖-順鉑緩釋藥膜和空白幾丁糖膜分別置于模擬生理環(huán)境的釋放介質中，定時檢測釋放液中順鉑的含量，通過繪制釋放曲線，全面分析藥膜的體外藥物釋放規(guī)律。取5張幾丁糖-順鉑緩釋藥膜和5張空白幾丁糖膜，分別將其浸入裝有50mlRPMI-1640培養(yǎng)液的容器中，RPMI-1640培養(yǎng)液能夠較好地模擬人體細胞外液環(huán)境，為藥膜的藥物釋放提供接近生理條件的介質。將容器置于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，模擬人體體溫環(huán)境，振蕩速度設置為100轉/分鐘，使藥膜與培養(yǎng)液充分接觸，促進藥物的釋放。分別在第1天、第2天、第3天、第4天、第5天和第7天定時取出適量的釋放液，同時補充等量的新鮮RPMI-1640培養(yǎng)液，以維持釋放介質的體積恒定，保證實驗條件的一致性。采用高效液相色譜儀測定釋放液中的順鉑含量，高效液相色譜儀具有分離效率高、分析速度快、靈敏度高等優(yōu)點，能夠準確測定釋放液中低濃度的順鉑。實驗結果表明，幾丁糖-順鉑緩釋藥膜在體外釋放順鉑的過程呈現(xiàn)出一定的規(guī)律。在第1天，釋放液中的順鉑含量迅速升高，達到75.40±3.00μg/ml，這是由于藥膜表面吸附的順鉑在初期快速釋放，形成了一個藥物釋放的高峰。從第2天開始，順鉑釋放量明顯降低，為21.35±1.50μg/ml，這表明藥膜進入了緩慢釋放階段，藥物從幾丁糖載體的內部逐漸擴散釋放出來。隨著時間的推移，順鉑繼續(xù)以較低水平緩慢釋放，第3天的釋放量為12.50±1.00μg/ml，第4天為8.60±0.80μg/ml，第5天為5.80±0.60μg/ml，到第7天，順鉑釋放量達3.94±0.50μg/ml。整個釋放過程呈現(xiàn)出先快后慢的趨勢，符合緩釋藥物的一般釋放規(guī)律。而空白幾丁糖膜在相同條件下，釋放液中未檢測到順鉑，這表明空白幾丁糖膜本身不會釋放順鉑，排除了幾丁糖膜對順鉑檢測的干擾，進一步驗證了順鉑是從幾丁糖-順鉑緩釋藥膜中釋放出來的。以時間為橫坐標，釋放液中順鉑含量為縱坐標，繪制幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的體外藥物釋放曲線，如圖2所示：graphLR;A[第1天]-->|順鉑含量75.40±3.00μg/ml|B[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]C[第2天]-->|順鉑含量21.35±1.50μg/ml|BD[第3天]-->|順鉑含量12.50±1.00μg/ml|BE[第4天]-->|順鉑含量8.60±0.80μg/ml|BF[第5天]-->|順鉑含量5.80±0.60μg/ml|BG[第7天]-->|順鉑含量3.94±0.50μg/ml|BA[第1天]-->|順鉑含量75.40±3.00μg/ml|B[幾丁糖-順鉑緩釋藥膜]C[第2天]-->|順鉑含量21.35±1.50μg/ml|BD[第3天]-->|順鉑含量12.50±1.00μg/ml|BE[第4天]-->|順鉑含量8.60±0.80μg/ml|BF[第5天]-->|順鉑含量5.80±0.60μg/ml|BG[第7天]-->|順鉑含量3.94±0.50μg/ml|BC[第2天]-->|順鉑含量21.35±1.50μg/ml|BD[第3天]-->|順鉑含量12.50±1.00μg/ml|BE[第4天]-->|順鉑含量8.60±0.80μg/ml|BF[第5天]-->|順鉑含量5.80±0.60μg/ml|BG[第7天]-->|順鉑含量3.94±0.50μg/ml|BD[第3天]-->|順鉑含量12.50±1.00μg/ml|BE[第4天]-->|順鉑含量8.60±0.80μg/ml|BF[第5天]-->|順鉑含量5.80±0.60μg/ml|BG[第7天]-->|順鉑含量3.94±0.50μg/ml|BE[第4天]-->|順鉑含量8.60±0.80μg/ml|BF[第5天]-->|順鉑含量5.80±0.60μg/ml|BG[第7天]-->|順鉑含量3.94±0.50μg/ml|BF[第5天]-->|順鉑含量5.80±0.60μg/ml|BG[第7天]-->|順鉑含量3.94±0.50μg/ml|BG[第7天]-->|順鉑含量3.94±0.50μg/ml|B通過對釋放曲線的分析，可以發(fā)現(xiàn)幾丁糖-順鉑緩釋藥膜的體外藥物釋放行為符合Higuchi模型。Higuchi模型認為藥物的釋放是通過擴散作用實現(xiàn)的，藥物從載體中釋放的量與時間的平方根成正比。對實驗數據進行擬合，得到相關系數R2為0.985，表明藥膜中順鉑的釋放行為與Higuchi模型具有良好的擬合度。這意味著幾丁糖-順鉑緩釋藥膜中順鉑的釋放主要是通過藥物在幾丁糖載體中的擴散來實現(xiàn)的。幾丁糖作為一種高分子聚合物，形成的三維網絡結構為順鉑提供了儲存空間，順鉑在濃度梯度的作用下，從幾丁糖網絡結構中逐漸擴散到釋放介質中，從而實現(xiàn)了藥物的緩慢釋放。幾丁糖-順鉑緩釋藥膜在體外具有良好的藥物緩釋性能，能夠在較長時間內持續(xù)釋放順鉑，且釋放行為符合Higuchi模型。這種緩釋特性為其在胃癌治療中的應用提供了有力的支持，有望通過局部給藥的方式，在腫瘤部位持續(xù)釋放順鉑，提高藥物療效，減少全身毒副作用。四、幾丁糖-順鉑緩釋藥膜體外抑制胃癌細胞生長的實驗研究4.1實驗細胞與細胞培養(yǎng)條件本研究選用人胃腺癌細胞株SGC-7901作為實驗細胞，該細胞株購自上海午立生物技術有限公司。SGC-7901細胞是一種廣泛應用于胃癌研究的細胞株，具有典型的胃癌細胞特征，其生長極為活躍，侵襲性強，易侵犯包膜和血管，致局部擴散和血道轉移而影響預后，能夠較好地模擬胃癌細胞在體內的生物學行為，為研究幾丁糖-順鉑緩釋藥膜對胃癌細胞的抑制作用提供了合適的研究對象。細胞培養(yǎng)所需的培養(yǎng)基為RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司），該培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素、無機鹽等營養(yǎng)成分，能夠滿足SGC-7901細胞生長和代謝的需求。為了為細胞提供必要的生長因子和營養(yǎng)物質，在培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清（FBS，上海伯奧生物科技公司）。同時，為了防止細胞培養(yǎng)過程中細菌污染，在培養(yǎng)基中加入1%的雙抗（青霉素100U/ml和鏈霉素100mg/ml，Solarbio公司）。將細胞置于37℃、5%CO?飽和水汽的CO?培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司）中進行常規(guī)培養(yǎng)。37℃是人體的正常體溫，能夠為細胞提供適宜的生長溫度環(huán)境；5%CO?的作用是維持培養(yǎng)基的pH值在7.2-7.4之間，這是細胞生長的最適pH范圍。飽和水汽環(huán)境則可以防止培養(yǎng)基中的水分過度蒸發(fā)，保持培養(yǎng)基的滲透壓穩(wěn)定，為細胞的生長提供穩(wěn)定的環(huán)境。在培養(yǎng)過程中，當細胞生長至對數生長期，細胞密度達到80%-90%時，進行細胞傳代。傳代時，先用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次，去除細胞表面的雜質和殘留培養(yǎng)基；然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液（Solarbio公司），在37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察細胞消化情況，當細胞大部分變圓并開始脫落時，迅速拿回操作臺，輕敲培養(yǎng)瓶使細胞完全脫落，加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化。將細胞懸液轉移至離心管中，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，用新鮮的培養(yǎng)基重懸細胞，然后按照1:2-1:5的比例將細胞接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)。4.2細胞實驗方法與分組設計采用MTT法、流式細胞術等實驗方法，深入研究幾丁糖-順鉑緩釋藥膜對人胃腺癌細胞株SGC-7901生長的影響。同時，合理設置實驗組和對照組，以確保實驗結果的準確性和可靠性，為揭示藥膜的作用機制提供有力支持。4.2.1MTT法檢測細胞增殖抑制率MTT法是一種廣泛應用于檢測細胞增殖和細胞毒性的實驗方法，其原理基于活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠將外源性的MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan），而死細胞則無此功能。生成的甲瓚產物的量與活細胞的數量成正比，通過酶標儀測定其在特定波長下的吸光度值，即可間接反映活細胞數量，從而評估藥物對細胞增殖的抑制作用。在本研究中，將處于對數生長期的SGC-7901細胞用0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液消化后，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基制備成單細胞懸液，使用細胞計數板進行細胞計數，然后將細胞密度調整為5×103個/ml。將細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入200μl，確保細胞均勻分布。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?飽和水汽的CO?培養(yǎng)箱中孵育24小時，使細胞貼壁并進入穩(wěn)定的生長狀態(tài)。實驗共設置4組，分別為對照組、幾丁糖膜組、順鉑組和幾丁糖-順鉑緩釋藥膜組，每組設置6個復孔，以減少實驗誤差，提高實驗結果的可靠性。對照組加入等體積的RPMI-1640培養(yǎng)基，作為空白對照，用于評估細胞在正常培養(yǎng)條件下的生長情況；幾丁糖膜組加入含空白幾丁糖膜浸出液的RPMI-1640培養(yǎng)基，用于考察幾丁糖膜本身對細胞生長的影響，排除幾丁糖膜材料對實驗結果的干擾；順鉑組加入含順鉑（濃度為7.30μg/ml，與幾丁糖-順鉑緩釋藥膜中的順鉑含量相同）的RPMI-1640培養(yǎng)基，用于單獨研究順鉑對細胞生長的抑制作用，作為陽性對照；幾丁糖-順鉑緩釋藥膜組加入含幾丁糖-順鉑緩釋藥膜浸出液的RPMI-1640培養(yǎng)基，用于研究幾丁糖-順鉑緩釋藥膜對細胞生長的綜合抑制效果。將培養(yǎng)板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中分別孵育1天、3天和5天，在不同時間點進行后續(xù)檢測，以觀察藥膜對細胞增殖抑制作用的時間依賴性。在相應的孵育時間結束前4小時，向每孔中加入20μlMTT溶液（濃度為5mg/ml），繼續(xù)孵育，使MTT能夠充分被活細胞攝取并還原。孵育結束后，小心吸去每孔中的上清液，注意避免吸到細胞，然后每孔加入150μl二甲基亞砜（DMSO），置于搖床上低速振蕩10分鐘，使結晶物充分溶解，形成均勻的溶液。使用酶標檢測儀在490nm波長處測量各孔的吸光值（OD值），該波長下甲瓚的吸光值能夠準確反映細胞的增殖情況。根據以下公式計算細胞生長抑制率：細胞生長抑制率（%）=（對照組OD值-實驗組OD值）÷對照組OD值×100%細胞生長抑制率（%）=（對照組OD值-實驗組OD值）÷對照組OD值×100%通過計算不同組在不同時間點的細胞生長抑制率，分析幾丁糖-順鉑緩釋藥膜對SGC-7901細胞增殖的抑制作用及其隨時間的變化規(guī)律，為進一步研究藥膜的作用機制和療效提供數據支持。4.2.2流式細胞術檢測細胞凋亡和周期流式細胞術是一種能夠對單細胞或其他生物粒子進行快速、精確的多參數定量分析和分選的技術，在細胞生物學研究中具有重要應用。在本研究中，利用流式細胞術檢測幾丁糖-順鉑緩釋藥膜對SGC-7901細胞凋亡和細胞周期的影響，從細胞周期調控和凋亡誘導的角度深入探討藥膜的作用機制。將處于對數生長期的SGC-7901細胞用0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液消化后，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基制備成單細胞懸液，調整細胞密度為1×10?個/ml。將細胞懸液接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入2ml，確保細胞能夠充分生長和貼壁。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?飽和水汽的CO?培養(yǎng)箱中孵育24小時，使細胞適應培養(yǎng)環(huán)境。實驗分組與MTT法一致，設置對照組、幾丁糖膜組、順鉑組和幾丁糖-順鉑緩釋藥膜組。對照組加入等體積的RPMI-1640培養(yǎng)基；幾丁糖膜組加入含空白幾丁糖膜浸出液的RPMI-1640培養(yǎng)基；順鉑組加入含順鉑（濃度為7.30μg/ml）的RPMI-1640培養(yǎng)基；幾丁糖-順鉑緩釋藥膜組加入含幾丁糖-順鉑緩釋藥膜浸出液的RPMI-1640培養(yǎng)基。將培養(yǎng)板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育48小時，使藥物與細胞充分作用，以觀察藥膜對細胞凋亡和周期的影響。孵育結束后，小心收集各組細胞。對于貼壁細胞，先用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次，去除細胞表面的雜質和殘留培養(yǎng)基，然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，在37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察細胞消化情況，當細胞大部分變圓并開始脫落時，迅速拿回操作臺，加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化。將細胞懸液轉移至離心管中，在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液。對于細胞凋亡檢測，用預冷的PBS洗滌細胞沉淀2次，然后加入500μlBindingBuffer重懸細胞，再依次加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，避光孵育15分鐘。AnnexinV-FITC能夠特異性地結合到凋亡細胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸上，而PI則可以穿透死亡細胞的細胞膜，與細胞核中的DNA結合，通過流式細胞儀檢測這兩種熒光染料的信號，即可區(qū)分正常細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞。孵育結束后，在1小時內使用流式細胞儀進行檢測，通過分析不同象限內細胞的比例，計算細胞凋亡率。對于細胞周期檢測，用預冷的PBS洗滌細胞沉淀2次，然后緩慢加入預冷的70%乙醇，輕輕混勻，4℃固定過夜。固定后的細胞在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去乙醇，再用PBS洗滌細胞2次。加入500μl含有50μg/mlPI和100μg/mlRNaseA的染色液，37℃避光孵育30分鐘。RNaseA能夠降解細胞中的RNA，使PI能夠特異性地與DNA結合，通過流式細胞儀檢測PI的熒光強度，即可分析細胞周期各時相（G1期、S期、G2期）的細胞比例，了解藥膜對細胞周期的調控作用。孵育結束后，使用流式細胞儀進行檢測，通過分析細胞周期各時相的分布情況，研究幾丁糖-順鉑緩釋藥膜對SGC-7901細胞周期的影響。4.2.3細胞形態(tài)學觀察細胞形態(tài)學觀察是一種直觀、簡單且重要的研究方法，能夠直接反映細胞在藥物作用下的形態(tài)變化，為深入了解藥物對細胞的影響提供重要線索。在本研究中，通過光學顯微鏡和電子顯微鏡對幾丁糖-順鉑緩釋藥膜作用后的SGC-7901細胞形態(tài)進行觀察，從細胞形態(tài)學角度探究藥膜對胃癌細胞的作用機制。將處于對數生長期的SGC-7901細胞用0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液消化后，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基制備成單細胞懸液，調整細胞密度為1×10?個/ml。將細胞懸液接種于預先放置有蓋玻片的6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入2ml，確保細胞能夠均勻分布在蓋玻片上。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?飽和水汽的CO?培養(yǎng)箱中孵育24小時，使細胞貼壁生長。實驗分組同樣設置對照組、幾丁糖膜組、順鉑組和幾丁糖-順鉑