一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的調(diào)控機(jī)制與應(yīng)用潛力研究一、引言1.1研究背景與意義金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，簡(jiǎn)稱SA）作為一種常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，廣泛分布于自然環(huán)境以及人體的皮膚黏膜。它不僅是導(dǎo)致皮膚和軟組織感染的常見(jiàn)病原菌，還可能引發(fā)敗血癥、肺炎、骨關(guān)節(jié)感染和心內(nèi)膜炎等嚴(yán)重疾病，對(duì)人類健康構(gòu)成了重大威脅。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在醫(yī)院感染中，金黃色葡萄球菌是重要的致病菌之一，給患者的治療和康復(fù)帶來(lái)了極大的困難。例如，在一些術(shù)后感染病例中，金黃色葡萄球菌的感染會(huì)延長(zhǎng)患者的住院時(shí)間，增加醫(yī)療成本，甚至可能導(dǎo)致患者的死亡。細(xì)菌生物膜是細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中為適應(yīng)環(huán)境變化，附著在生物或非生物表面，由細(xì)菌細(xì)胞及其分泌的胞外多糖基質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等組成的高度組織化的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)。金黃色葡萄球菌具有很強(qiáng)的形成生物膜的能力，這使得其感染的治療變得更加棘手。生物膜內(nèi)的細(xì)菌與浮游菌相比，具有獨(dú)特的生理特性和耐藥機(jī)制。一方面，生物膜為細(xì)菌提供了物理屏障，阻礙了抗生素的滲透，使抗生素難以到達(dá)細(xì)菌細(xì)胞，從而降低了抗生素的療效。研究表明，生物膜內(nèi)的細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性可提高10-1000倍。另一方面，生物膜內(nèi)的細(xì)菌代謝活性較低，處于相對(duì)靜止的狀態(tài)，對(duì)許多抗生素的敏感性降低。此外，生物膜還能夠抵抗宿主的免疫系統(tǒng)，使細(xì)菌能夠在體內(nèi)長(zhǎng)期存活，導(dǎo)致感染反復(fù)發(fā)作，難以徹底治愈。例如，在慢性傷口感染中，金黃色葡萄球菌生物膜的存在會(huì)阻礙傷口的愈合，導(dǎo)致傷口長(zhǎng)期不愈，給患者帶來(lái)極大的痛苦。因此，治療金黃色葡萄球菌感染和消滅其生物膜已成為臨床面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。一氧化氮（Nitricoxide，簡(jiǎn)稱NO）是一種無(wú)色、無(wú)味的氣體，具有廣泛的生物學(xué)活性。在免疫調(diào)節(jié)和微生物抗性方面，NO發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，NO在治療金黃色葡萄球菌感染和控制其生物膜形成方面具有一定的潛力。NO可以通過(guò)多種途徑影響金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)、代謝和生物膜形成。一方面，外源性NO可以降低金黃色葡萄球菌的細(xì)胞黏附、聚集和生物膜形成。研究發(fā)現(xiàn)，NO供體能夠抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成，并且隨著NO濃度的增加，抑制效果更加明顯。另一方面，NO還可以調(diào)節(jié)金黃色葡萄球菌的基因表達(dá)和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，從而影響其生物膜的形成。例如，NO可以調(diào)節(jié)金黃色葡萄球菌中與生物膜形成相關(guān)的基因的表達(dá)，如ica操縱子等。此外，NO還具有抗菌作用，可以直接殺滅金黃色葡萄球菌。NO可以與細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的鐵硫簇等物質(zhì)結(jié)合，干擾細(xì)菌的代謝過(guò)程，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。目前，有關(guān)NO對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜影響的研究還存在許多爭(zhēng)議，一些研究結(jié)果甚至相互矛盾。不同的研究中，NO對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的影響可能受到多種因素的影響，如NO的濃度、作用時(shí)間、細(xì)菌菌株、實(shí)驗(yàn)條件等。因此，深入探討NO對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的影響及其作用機(jī)制，對(duì)于開發(fā)新的治療策略具有重要的理論和實(shí)際意義。本研究旨在系統(tǒng)地研究NO對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的影響，包括生物膜的形成、結(jié)構(gòu)和功能等方面，進(jìn)一步明確NO在金黃色葡萄球菌生物膜形成和調(diào)控中的作用機(jī)制，為臨床治療金黃色葡萄球菌感染提供新的思路和方法。1.2研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的影響及其作用機(jī)制，為開發(fā)新型抗菌策略提供理論依據(jù)。具體研究?jī)?nèi)容如下：一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響：通過(guò)實(shí)驗(yàn)，研究不同濃度的一氧化氮供體對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響，觀察生物膜的生長(zhǎng)曲線、生物量和形態(tài)變化，確定一氧化氮對(duì)生物膜形成的抑制或促進(jìn)作用的濃度范圍。一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜結(jié)構(gòu)的影響：運(yùn)用掃描電子顯微鏡（SEM）和原子力顯微鏡（AFM）等技術(shù)，分析一氧化氮處理前后金黃色葡萄球菌生物膜的微觀結(jié)構(gòu)，包括細(xì)菌的排列方式、胞外聚合物的分布和生物膜的粗糙度等，了解一氧化氮對(duì)生物膜結(jié)構(gòu)的改變。一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜功能的影響：檢測(cè)一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜中細(xì)菌的代謝活性、耐藥性和毒力因子表達(dá)的影響，評(píng)估生物膜的致病性和對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的逃避能力，明確一氧化氮對(duì)生物膜功能的調(diào)控作用。一氧化氮影響金黃色葡萄球菌生物膜的作用機(jī)制研究：通過(guò)基因表達(dá)分析、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等方法，探究一氧化氮影響金黃色葡萄球菌生物膜形成、結(jié)構(gòu)和功能的分子機(jī)制，尋找關(guān)鍵的信號(hào)通路和調(diào)控因子，為進(jìn)一步開發(fā)靶向治療策略提供理論基礎(chǔ)。1.3研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運(yùn)用多種研究方法，確保研究的科學(xué)性、全面性和深入性，技術(shù)路線則按照研究?jī)?nèi)容的邏輯順序逐步推進(jìn)，具體如下：研究方法文獻(xiàn)研究法：全面搜集國(guó)內(nèi)外關(guān)于一氧化氮、金黃色葡萄球菌生物膜以及二者相互作用的相關(guān)文獻(xiàn)資料，梳理研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)，分析已有研究的成果與不足，為本研究提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和研究思路。例如，通過(guò)對(duì)大量文獻(xiàn)的研讀，明確一氧化氮在免疫調(diào)節(jié)和微生物抗性方面的作用機(jī)制，以及金黃色葡萄球菌生物膜形成、結(jié)構(gòu)和功能的相關(guān)研究進(jìn)展，從而確定本研究的切入點(diǎn)和重點(diǎn)研究方向。實(shí)驗(yàn)法：金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)與生物膜模型構(gòu)建：選取標(biāo)準(zhǔn)的金黃色葡萄球菌菌株，采用適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。利用微孔板法、玻片法等經(jīng)典方法構(gòu)建金黃色葡萄球菌生物膜模型，通過(guò)結(jié)晶紫染色、活菌計(jì)數(shù)等手段對(duì)生物膜的形成情況進(jìn)行定量和定性分析，確保生物膜模型的穩(wěn)定性和可靠性。例如，在微孔板法中，將金黃色葡萄球菌接種到96孔微孔板中，在特定的溫度和轉(zhuǎn)速條件下培養(yǎng)一定時(shí)間，然后用結(jié)晶紫染色，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，以量化生物膜的生物量。一氧化氮對(duì)生物膜形成的影響研究：設(shè)置不同濃度的一氧化氮供體（如S-亞硝基谷胱甘肽、硝普鈉等）處理組，在金黃色葡萄球菌生物膜形成的不同階段加入一氧化氮供體，觀察生物膜的生長(zhǎng)曲線、生物量和形態(tài)變化。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)生物膜形成相關(guān)基因（如ica操縱子、atlA等）的表達(dá)水平，從分子層面探究一氧化氮對(duì)生物膜形成的影響機(jī)制。例如，在生長(zhǎng)曲線的測(cè)定中，每隔一定時(shí)間取培養(yǎng)物進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線，對(duì)比不同處理組的生長(zhǎng)情況，分析一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響；在基因表達(dá)檢測(cè)中，提取不同處理組生物膜細(xì)菌的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，通過(guò)比較基因的相對(duì)表達(dá)量，了解一氧化氮對(duì)生物膜形成相關(guān)基因的調(diào)控作用。一氧化氮對(duì)生物膜結(jié)構(gòu)的影響研究：運(yùn)用掃描電子顯微鏡（SEM）和原子力顯微鏡（AFM）等技術(shù)，對(duì)一氧化氮處理前后的金黃色葡萄球菌生物膜進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)分析。SEM可以觀察生物膜的整體形態(tài)、細(xì)菌的排列方式和胞外聚合物的分布情況；AFM則能夠精確測(cè)量生物膜的粗糙度、厚度等參數(shù)，深入了解一氧化氮對(duì)生物膜結(jié)構(gòu)的改變。例如，在SEM觀察中，將生物膜樣品進(jìn)行固定、脫水、鍍膜等處理后，在掃描電子顯微鏡下觀察并拍照，分析生物膜結(jié)構(gòu)的變化；在AFM測(cè)量中，利用原子力顯微鏡的探針與生物膜表面相互作用，獲取生物膜的三維形貌圖像，測(cè)量相關(guān)結(jié)構(gòu)參數(shù)。一氧化氮對(duì)生物膜功能的影響研究：檢測(cè)一氧化氮處理后金黃色葡萄球菌生物膜中細(xì)菌的代謝活性（如采用MTT法、XTT法等）、耐藥性（通過(guò)測(cè)定最低抑菌濃度MIC和最低殺菌濃度MBC）和毒力因子表達(dá)（如α-溶血素、Panton-Valentine殺白細(xì)胞毒素等的檢測(cè)），評(píng)估生物膜的致病性和對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的逃避能力。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）等方法檢測(cè)毒力因子的表達(dá)水平，明確一氧化氮對(duì)生物膜功能的調(diào)控作用。例如，在MTT法檢測(cè)代謝活性中，向生物膜培養(yǎng)物中加入MTT試劑，孵育一定時(shí)間后，測(cè)量吸光度值，反映生物膜中細(xì)菌的代謝活性；在耐藥性測(cè)定中，采用微量肉湯稀釋法測(cè)定MIC和MBC，評(píng)估生物膜對(duì)不同抗生素的耐藥情況；在毒力因子檢測(cè)中，提取生物膜細(xì)菌的蛋白質(zhì)，通過(guò)Westernblot或ELISA方法檢測(cè)毒力因子的含量，分析一氧化氮對(duì)毒力因子表達(dá)的影響。一氧化氮影響生物膜的作用機(jī)制研究：采用基因表達(dá)分析（如轉(zhuǎn)錄組測(cè)序RNA-seq）、蛋白質(zhì)組學(xué)（如雙向凝膠電泳2-DE結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)MS）和代謝組學(xué)（如核磁共振NMR、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用LC-MS）等技術(shù)，全面探究一氧化氮影響金黃色葡萄球菌生物膜形成、結(jié)構(gòu)和功能的分子機(jī)制。通過(guò)生物信息學(xué)分析，篩選出差異表達(dá)的基因、蛋白質(zhì)和代謝物，構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，尋找關(guān)鍵的信號(hào)通路和調(diào)控因子。例如，在RNA-seq分析中，對(duì)一氧化氮處理組和對(duì)照組的生物膜細(xì)菌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析差異表達(dá)基因的功能和富集的信號(hào)通路；在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，通過(guò)2-DE分離蛋白質(zhì)，結(jié)合MS鑒定差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，進(jìn)一步驗(yàn)證和補(bǔ)充基因表達(dá)分析的結(jié)果；在代謝組學(xué)研究中，利用NMR或LC-MS檢測(cè)生物膜細(xì)菌的代謝物變化，分析一氧化氮對(duì)代謝途徑的影響，從代謝層面揭示其作用機(jī)制。技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1所示，首先進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研，全面了解一氧化氮和金黃色葡萄球菌生物膜的相關(guān)研究現(xiàn)狀，明確研究目的和內(nèi)容。然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備，包括金黃色葡萄球菌菌株的活化、一氧化氮供體和相關(guān)試劑的準(zhǔn)備、實(shí)驗(yàn)儀器的調(diào)試等。接著構(gòu)建金黃色葡萄球菌生物膜模型，并通過(guò)結(jié)晶紫染色等方法進(jìn)行驗(yàn)證。在確定生物膜模型構(gòu)建成功后，開展一氧化氮對(duì)生物膜形成、結(jié)構(gòu)和功能影響的研究，分別采用相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)手段進(jìn)行檢測(cè)和分析。最后，綜合運(yùn)用基因表達(dá)分析、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等技術(shù)，深入探究一氧化氮影響生物膜的作用機(jī)制，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行總結(jié)和討論，撰寫研究論文。[此處插入技術(shù)路線圖，圖中應(yīng)清晰展示從文獻(xiàn)調(diào)研、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、生物膜模型構(gòu)建、一氧化氮處理、各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)到作用機(jī)制研究的整個(gè)流程，各步驟之間用箭頭表示邏輯關(guān)系，并標(biāo)注關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)]通過(guò)以上研究方法和技術(shù)路線，本研究有望全面深入地揭示一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的影響及其作用機(jī)制，為臨床治療金黃色葡萄球菌感染提供新的理論依據(jù)和治療策略。二、一氧化氮與金黃色葡萄球菌生物膜的相關(guān)理論2.1一氧化氮概述一氧化氮（NitricOxide，NO）是一種簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)小分子氣體，其化學(xué)式為NO，分子量為30.01。在常溫常壓下，一氧化氮呈現(xiàn)為無(wú)色、無(wú)味的氣體狀態(tài)，微溶于水，可溶于乙醇、二硫化碳等有機(jī)溶劑。它的熔點(diǎn)為-163.6℃，沸點(diǎn)為-151.8℃。一氧化氮具有獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì)，其分子中含有一個(gè)未成對(duì)電子，屬于自由基，這使得它的化學(xué)性質(zhì)較為活潑，具有較強(qiáng)的氧化性和還原性。在空氣中，一氧化氮能夠迅速與氧氣發(fā)生反應(yīng)，生成棕色的二氧化氮?dú)怏w，反應(yīng)方程式為：2NO+O?=2NO?。在生物體內(nèi)，一氧化氮主要通過(guò)一氧化氮合酶（NitricOxideSynthase，NOS）催化L-精氨酸和氧氣反應(yīng)生成，同時(shí)產(chǎn)生L-瓜氨酸，其反應(yīng)式為：L-精氨酸+NOS+O?=NO+L-瓜氨酸。人體內(nèi)存在三種類型的一氧化氮合酶，分別為內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelialNOS，eNOS）、神經(jīng)型一氧化氮合酶（neuronalNOS，nNOS）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducibleNOS，iNOS）。eNOS主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞，在維持血管穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它持續(xù)低水平表達(dá)，生成的一氧化氮可以調(diào)節(jié)血管平滑肌的舒張，維持血管的正常張力，從而保證血液的正常流動(dòng)。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受到適當(dāng)刺激時(shí)，eNOS被激活，產(chǎn)生更多的一氧化氮，進(jìn)一步擴(kuò)張血管，增加局部血流量。例如，在運(yùn)動(dòng)時(shí)，肌肉組織代謝增強(qiáng)，需要更多的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，此時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的eNOS被激活，釋放一氧化氮，使血管擴(kuò)張，滿足肌肉組織的需求。nNOS主要存在于神經(jīng)元細(xì)胞中，參與神經(jīng)信號(hào)的傳遞和神經(jīng)調(diào)節(jié)過(guò)程。它在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、學(xué)習(xí)、記憶等方面具有重要作用。研究表明，nNOS參與了海馬體中長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（Long-TermPotentiation，LTP）的形成，而LTP被認(rèn)為是學(xué)習(xí)和記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)。當(dāng)神經(jīng)元受到刺激時(shí)，nNOS被激活，產(chǎn)生一氧化氮，作為一種逆行信使，從突觸后神經(jīng)元釋放，擴(kuò)散到突觸前神經(jīng)元，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而影響神經(jīng)信號(hào)的傳遞。iNOS主要在免疫細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等）中表達(dá)。在機(jī)體受到病原體感染、炎癥刺激或細(xì)胞因子作用時(shí)，iNOS被誘導(dǎo)大量表達(dá)，產(chǎn)生高濃度的一氧化氮。這些一氧化氮在免疫防御中發(fā)揮著重要作用，能夠直接殺滅病原體或抑制其生長(zhǎng)繁殖。例如，巨噬細(xì)胞在吞噬病原體后，會(huì)被激活并誘導(dǎo)iNOS的表達(dá)，產(chǎn)生大量一氧化氮，一氧化氮可以與病原體細(xì)胞內(nèi)的多種生物分子發(fā)生反應(yīng)，干擾病原體的代謝過(guò)程，從而發(fā)揮抗菌、抗病毒、抗寄生蟲等作用。此外，一氧化氮還可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性和功能，參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控。它可以促進(jìn)免疫細(xì)胞的趨化、活化和增殖，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)病原體的吞噬和殺傷能力。同時(shí)，一氧化氮也可以抑制過(guò)度的炎癥反應(yīng)，防止炎癥對(duì)機(jī)體組織造成損傷。在炎癥早期，一氧化氮可以促進(jìn)炎癥細(xì)胞的聚集和活化，增強(qiáng)免疫防御；而在炎癥后期，一氧化氮可以抑制炎癥介質(zhì)的釋放，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)。一氧化氮在生物體內(nèi)具有廣泛而重要的生理功能，涵蓋多個(gè)系統(tǒng)。在心血管系統(tǒng)中，一氧化氮作為一種重要的血管舒張因子，能夠直接作用于血管平滑肌細(xì)胞，通過(guò)激活鳥苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)cGMP水平升高，進(jìn)而導(dǎo)致血管平滑肌舒張，血管擴(kuò)張，降低血壓。一氧化氮還可以抑制血小板的黏附和聚集，防止血栓形成。例如，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損時(shí)，一氧化氮的釋放減少，可能導(dǎo)致血小板在受損部位聚集，形成血栓，增加心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。在神經(jīng)系統(tǒng)中，一氧化氮作為一種新型的神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)質(zhì)，參與神經(jīng)信號(hào)的傳遞和調(diào)節(jié)。它可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放以及突觸可塑性，對(duì)學(xué)習(xí)、記憶、睡眠等生理過(guò)程具有重要影響。例如，在學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程中，一氧化氮參與了海馬體中神經(jīng)元之間的信號(hào)傳遞，促進(jìn)了長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的形成，有助于記憶的鞏固和存儲(chǔ)。在免疫系統(tǒng)中，一氧化氮是一種重要的免疫調(diào)節(jié)分子和抗菌物質(zhì)。它可以激活巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力。如前文所述，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一氧化氮能夠殺滅入侵的病原體。此外，一氧化氮還可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，適量的一氧化氮可以促進(jìn)炎癥細(xì)胞的活化和趨化，增強(qiáng)免疫應(yīng)答；而過(guò)量的一氧化氮?jiǎng)t可能導(dǎo)致炎癥過(guò)度反應(yīng)，對(duì)機(jī)體造成損傷。因此，一氧化氮在免疫調(diào)節(jié)中起著精細(xì)的平衡作用，維持著機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)。綜上所述，一氧化氮作為一種在生物體內(nèi)廣泛存在且具有重要生理功能的氣體分子，在免疫調(diào)節(jié)和微生物抗性方面發(fā)揮著不可或缺的作用。其獨(dú)特的性質(zhì)和產(chǎn)生途徑，使其能夠參與多種生理和病理過(guò)程的調(diào)控，對(duì)維持生物體的健康具有重要意義。在后續(xù)的研究中，深入探討一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的影響，有助于進(jìn)一步揭示其在微生物感染防治中的潛在應(yīng)用價(jià)值。2.2金黃色葡萄球菌生物膜概述金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）屬于葡萄球菌屬，是一種革蘭氏陽(yáng)性球菌。在顯微鏡下，其菌體呈球形，直徑約為0.8-1微米，常排列成葡萄串狀，故而得名。該菌無(wú)鞭毛，一般不形成莢膜，也不產(chǎn)生芽孢。金黃色葡萄球菌具有兼性厭氧的特性，在有氧和無(wú)氧環(huán)境下均能生長(zhǎng)繁殖。它對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求不苛刻，在普通培養(yǎng)基上就能良好生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為37℃，最適pH值為7.4左右。在血平板上培養(yǎng)時(shí)，金黃色葡萄球菌可形成直徑2-3毫米、圓形、凸起、表面光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊的菌落，并且菌落周圍會(huì)出現(xiàn)透明的溶血環(huán)，這是因?yàn)樗軌虍a(chǎn)生葡萄球菌溶血素，溶解紅細(xì)胞。此外，該菌還能產(chǎn)生金黃色色素，使菌落呈現(xiàn)出特有的金黃色，這也是其命名的重要依據(jù)之一。金黃色葡萄球菌是一種重要的病原菌，具有很強(qiáng)的致病性。它能夠產(chǎn)生多種毒素和侵襲性酶，這些毒力因子在其致病過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。葡萄球菌溶血素是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的一種重要毒素，能夠破壞多種細(xì)胞的細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞溶解，從而引起組織損傷和炎癥反應(yīng)。例如，它可以溶解紅細(xì)胞，導(dǎo)致溶血現(xiàn)象，還能損傷白細(xì)胞、血小板等免疫細(xì)胞，削弱機(jī)體的免疫防御能力。殺白細(xì)胞素也是一種重要的毒素，它能特異性地作用于中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等白細(xì)胞，破壞其細(xì)胞膜，抑制白細(xì)胞的趨化、吞噬和殺菌功能，使細(xì)菌更容易逃避宿主的免疫攻擊。腸毒素是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的一類外毒素，可引起食物中毒。攝入被腸毒素污染的食物后，在1-6小時(shí)內(nèi)即可出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等急性胃腸炎癥狀。這是因?yàn)槟c毒素能夠刺激胃腸道神經(jīng)末梢，引起嘔吐中樞興奮，同時(shí)還能改變腸道的分泌和吸收功能，導(dǎo)致腹瀉。此外，金黃色葡萄球菌還能產(chǎn)生表皮剝脫毒素，引發(fā)燙傷樣皮膚綜合征，主要發(fā)生于新生兒和嬰幼兒。該毒素可以裂解表皮顆粒層細(xì)胞間的連接，使表皮與真皮分離，導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)廣泛的紅斑、水皰和剝脫。除了毒素，金黃色葡萄球菌還能產(chǎn)生多種侵襲性酶。血漿凝固酶是其中一種重要的酶，它能使含有抗凝劑的人或兔血漿發(fā)生凝固。血漿凝固酶可以將血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，在細(xì)菌周圍形成一層纖維蛋白保護(hù)膜，使細(xì)菌免受吞噬細(xì)胞的吞噬和抗體的作用，從而增強(qiáng)細(xì)菌的致病性。透明質(zhì)酸酶能夠分解細(xì)胞間質(zhì)的透明質(zhì)酸，使細(xì)胞間隙增大，有利于細(xì)菌的擴(kuò)散和侵襲。它可以幫助細(xì)菌突破組織屏障，侵入更深層次的組織，引發(fā)更嚴(yán)重的感染。耐熱核酸酶能降解DNA和RNA，使細(xì)菌在吞噬細(xì)胞內(nèi)不易被清除，同時(shí)也有助于細(xì)菌在感染部位獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)其生長(zhǎng)繁殖。金黃色葡萄球菌可引起多種類型的感染，涵蓋皮膚和軟組織感染、呼吸道感染、血流感染、骨關(guān)節(jié)感染等多個(gè)方面。在皮膚和軟組織感染中，常見(jiàn)的病癥包括癤、癰、毛囊炎、蜂窩織炎等。癤是單個(gè)毛囊及其所屬皮脂腺的急性化膿性炎癥，常由金黃色葡萄球菌侵入毛囊引起，表現(xiàn)為局部紅腫、疼痛，中央有膿栓。癰是多個(gè)相鄰毛囊及其所屬皮脂腺或汗腺的急性化膿性感染，病情較癤嚴(yán)重，可伴有全身癥狀。毛囊炎是毛囊口的化膿性炎癥，表現(xiàn)為毛囊周圍的紅色丘疹，有時(shí)可伴有膿皰。蜂窩織炎是皮下、筋膜下、肌間隙或深部疏松結(jié)締組織的急性彌漫性化膿性感染，病變不易局限，擴(kuò)散迅速，可引起局部紅腫、疼痛、發(fā)熱等癥狀。在呼吸道感染方面，金黃色葡萄球菌可導(dǎo)致肺炎，尤其是在醫(yī)院獲得性肺炎中較為常見(jiàn)?；颊叱１憩F(xiàn)為高熱、咳嗽、咳膿血痰、胸痛等癥狀，病情嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)呼吸困難、感染性休克等并發(fā)癥。血流感染如敗血癥和膿毒血癥也是金黃色葡萄球菌感染的嚴(yán)重后果，細(xì)菌侵入血流并在其中生長(zhǎng)繁殖，釋放毒素，可引起全身感染癥狀，如高熱、寒戰(zhàn)、神志改變、皮膚瘀點(diǎn)等，死亡率較高。骨關(guān)節(jié)感染如骨髓炎和關(guān)節(jié)炎，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、活動(dòng)受限，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，治療不及時(shí)還可能導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能障礙。細(xì)菌生物膜是細(xì)菌為適應(yīng)生存環(huán)境而形成的一種特殊結(jié)構(gòu)，在細(xì)菌的生存和感染過(guò)程中具有重要意義。金黃色葡萄球菌生物膜是由金黃色葡萄球菌細(xì)胞及其分泌的胞外聚合物（ExtracellularPolymericSubstances，EPS）組成。EPS主要包括多糖、蛋白質(zhì)、核酸等成分，它們相互交織，形成了一個(gè)三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，將細(xì)菌包裹其中。這種結(jié)構(gòu)為細(xì)菌提供了物理屏障，使其能夠抵抗外界環(huán)境的壓力，如抗生素的作用、宿主免疫系統(tǒng)的攻擊等。在生物膜中，細(xì)菌的排列方式呈現(xiàn)出高度的有序性和組織性。細(xì)菌并非均勻分布，而是形成了微菌落，微菌落之間通過(guò)EPS相互連接。微菌落內(nèi)部的細(xì)菌緊密聚集，周圍環(huán)繞著厚厚的EPS層，這種結(jié)構(gòu)有助于細(xì)菌之間的信號(hào)傳遞和物質(zhì)交換。此外，生物膜中還存在著一些通道和孔隙，類似于人體的血管和淋巴管，它們可以為細(xì)菌提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，同時(shí)排出代謝廢物，維持細(xì)菌的正常生長(zhǎng)和代謝。金黃色葡萄球菌生物膜的形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，通?？煞譃橐韵聨讉€(gè)階段。首先是初始黏附階段，浮游的金黃色葡萄球菌細(xì)胞通過(guò)表面的黏附因子，如纖連蛋白結(jié)合蛋白、膠原蛋白結(jié)合蛋白等，與生物或非生物表面發(fā)生可逆性的弱相互作用。這些黏附因子能夠識(shí)別并結(jié)合表面的特定分子，使細(xì)菌能夠附著在表面上。隨著時(shí)間的推移，細(xì)菌逐漸分泌EPS，加強(qiáng)與表面的黏附，進(jìn)入不可逆黏附階段。此時(shí)，細(xì)菌與表面之間形成了牢固的化學(xué)鍵，難以被外力去除。在聚集階段，黏附的細(xì)菌開始大量繁殖，分泌更多的EPS，細(xì)菌之間相互聚集，形成微菌落。微菌落不斷生長(zhǎng)和融合，逐漸形成成熟的生物膜。在成熟階段，生物膜具有復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，包括微菌落、通道和孔隙等。生物膜內(nèi)的細(xì)菌代謝活性降低，進(jìn)入一種相對(duì)靜止的狀態(tài)，對(duì)抗生素和宿主免疫系統(tǒng)的抵抗力增強(qiáng)。最后，在某些條件下，如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏、環(huán)境壓力增大等，生物膜中的部分細(xì)菌會(huì)脫離生物膜，重新成為浮游菌，尋找新的生存環(huán)境，這一過(guò)程稱為分散階段。分散的細(xì)菌可以傳播到其他部位，引起新的感染。生物膜對(duì)金黃色葡萄球菌的生存和感染具有多方面的重要作用。從生存角度來(lái)看，生物膜為細(xì)菌提供了一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的微環(huán)境。EPS可以吸附和保留營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)有限的環(huán)境中也能獲取足夠的養(yǎng)分。同時(shí)，EPS還可以緩沖外界環(huán)境的變化，如酸堿度、溫度、滲透壓等，保護(hù)細(xì)菌免受不良環(huán)境的影響。此外，生物膜中的細(xì)菌之間通過(guò)信號(hào)分子進(jìn)行交流，形成了一個(gè)協(xié)同合作的群體。這種群體行為有助于細(xì)菌更好地適應(yīng)環(huán)境，提高生存能力。在感染過(guò)程中，生物膜使金黃色葡萄球菌能夠逃避宿主的免疫系統(tǒng)。EPS可以掩蓋細(xì)菌表面的抗原，使免疫系統(tǒng)難以識(shí)別和攻擊細(xì)菌。此外，生物膜內(nèi)的細(xì)菌代謝活性較低，處于一種“休眠”狀態(tài)，免疫系統(tǒng)的細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞難以對(duì)其發(fā)揮作用。同時(shí)，生物膜中的通道和孔隙可以限制免疫細(xì)胞的進(jìn)入，進(jìn)一步保護(hù)細(xì)菌。生物膜還極大地增強(qiáng)了金黃色葡萄球菌對(duì)抗生素的耐藥性。EPS的物理屏障作用阻礙了抗生素的滲透，使抗生素難以到達(dá)細(xì)菌細(xì)胞。生物膜內(nèi)的細(xì)菌代謝緩慢，對(duì)抗生素的敏感性降低。而且，生物膜中的細(xì)菌還可以通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移等方式，獲得耐藥基因，進(jìn)一步增強(qiáng)耐藥性。例如，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）生物膜對(duì)多種抗生素具有高度耐藥性，給臨床治療帶來(lái)了極大的困難。綜上所述，金黃色葡萄球菌作為一種重要的病原菌，具有強(qiáng)大的致病性，能夠引起多種嚴(yán)重的感染。其形成的生物膜結(jié)構(gòu)復(fù)雜，形成過(guò)程精細(xì)，對(duì)細(xì)菌的生存和感染具有重要的促進(jìn)作用。了解金黃色葡萄球菌及其生物膜的特性，對(duì)于深入研究其感染機(jī)制和開發(fā)有效的治療策略具有重要意義。在后續(xù)的研究中，將重點(diǎn)探討一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的影響，以期為解決金黃色葡萄球菌感染問(wèn)題提供新的思路和方法。2.3相關(guān)研究現(xiàn)狀近年來(lái)，一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜影響的研究逐漸受到關(guān)注，眾多學(xué)者從不同角度進(jìn)行了探索，取得了一定的研究成果，但同時(shí)也存在諸多爭(zhēng)議和不足。在一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響方面，已有研究表明，外源性一氧化氮供體能夠干預(yù)生物膜的形成過(guò)程。部分研究發(fā)現(xiàn)，一氧化氮可以通過(guò)抑制金黃色葡萄球菌的初始黏附，減少細(xì)菌與表面的結(jié)合，從而降低生物膜的生物量。例如，有學(xué)者使用硝普鈉作為一氧化氮供體，在金黃色葡萄球菌生物膜形成初期加入，結(jié)果顯示，隨著硝普鈉濃度的增加，生物膜的形成量顯著減少，表明一氧化氮對(duì)生物膜的初始形成具有抑制作用。這可能是因?yàn)橐谎趸绊懥思?xì)菌表面黏附因子的表達(dá)或活性，使得細(xì)菌難以附著在物體表面。然而，也有一些研究得出了不同的結(jié)論。有研究指出，在特定條件下，低濃度的一氧化氮可能對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的形成具有促進(jìn)作用。在某些實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)使用較低濃度的一氧化氮供體處理金黃色葡萄球菌時(shí)，發(fā)現(xiàn)生物膜的生物量在一定程度上有所增加。這可能是由于低濃度的一氧化氮激活了細(xì)菌的某些應(yīng)激反應(yīng)或信號(hào)通路，促進(jìn)了細(xì)菌的生長(zhǎng)和聚集，進(jìn)而有利于生物膜的形成。這些相互矛盾的結(jié)果表明，一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響可能受到多種因素的調(diào)控，如一氧化氮的濃度、作用時(shí)間、細(xì)菌菌株的差異以及實(shí)驗(yàn)環(huán)境等。不同的細(xì)菌菌株對(duì)一氧化氮的敏感性可能不同，某些菌株可能更容易受到一氧化氮的抑制作用，而另一些菌株則可能對(duì)低濃度的一氧化氮產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)，導(dǎo)致生物膜形成增加。此外，實(shí)驗(yàn)環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)成分、溫度、pH值等因素也可能影響一氧化氮與細(xì)菌之間的相互作用，從而影響生物膜的形成。在一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜結(jié)構(gòu)的影響研究中，現(xiàn)有的研究手段主要集中在微觀層面。掃描電子顯微鏡（SEM）和原子力顯微鏡（AFM）等技術(shù)被廣泛應(yīng)用于觀察生物膜的微觀結(jié)構(gòu)變化。通過(guò)SEM觀察發(fā)現(xiàn)，一氧化氮處理后的金黃色葡萄球菌生物膜結(jié)構(gòu)變得松散，細(xì)菌之間的連接減少，胞外聚合物的分布也發(fā)生了改變。這表明一氧化氮可能破壞了生物膜的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使生物膜的穩(wěn)定性降低。AFM的研究結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)，一氧化氮處理后的生物膜粗糙度增加，厚度減小，說(shuō)明生物膜的表面形態(tài)和物理性質(zhì)發(fā)生了明顯變化。然而，目前對(duì)于一氧化氮影響生物膜結(jié)構(gòu)的具體分子機(jī)制還不完全清楚。雖然已知一氧化氮可以與生物膜中的多種成分發(fā)生反應(yīng)，如蛋白質(zhì)、多糖等，但這些反應(yīng)如何導(dǎo)致生物膜結(jié)構(gòu)的改變，以及是否存在特定的信號(hào)通路參與其中，仍有待深入研究。例如，一氧化氮可能與生物膜中的蛋白質(zhì)結(jié)合，改變其結(jié)構(gòu)和功能，從而影響細(xì)菌之間的相互作用以及胞外聚合物的合成和分泌。但具體是哪些蛋白質(zhì)參與了這一過(guò)程，以及它們之間的相互作用方式還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。此外，現(xiàn)有的研究主要側(cè)重于觀察生物膜在靜態(tài)條件下的結(jié)構(gòu)變化，對(duì)于生物膜在動(dòng)態(tài)環(huán)境中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及一氧化氮對(duì)其的影響研究較少。在實(shí)際的感染過(guò)程中，生物膜所處的環(huán)境是復(fù)雜多變的，如流體剪切力、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的流動(dòng)等因素都會(huì)對(duì)生物膜的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。因此，進(jìn)一步研究一氧化氮在動(dòng)態(tài)環(huán)境中對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)于深入了解生物膜的感染機(jī)制具有重要意義。關(guān)于一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜功能的影響，研究主要集中在細(xì)菌的代謝活性、耐藥性和毒力因子表達(dá)等方面。一些研究表明，一氧化氮可以降低金黃色葡萄球菌生物膜中細(xì)菌的代謝活性。采用MTT法或XTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)一氧化氮處理后，生物膜中細(xì)菌的代謝活性顯著降低，這可能是因?yàn)橐谎趸蓴_了細(xì)菌的能量代謝途徑，抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖。一氧化氮還被發(fā)現(xiàn)能夠影響金黃色葡萄球菌生物膜的耐藥性。有研究報(bào)道，一氧化氮可以增強(qiáng)某些抗生素對(duì)生物膜內(nèi)細(xì)菌的殺傷作用，降低生物膜的耐藥性。其機(jī)制可能是一氧化氮破壞了生物膜的結(jié)構(gòu)，使抗生素更容易滲透進(jìn)入生物膜內(nèi)部，從而提高了抗生素的療效。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)，在某些情況下，一氧化氮可能會(huì)誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌產(chǎn)生耐藥性。當(dāng)細(xì)菌長(zhǎng)期暴露于低濃度的一氧化氮環(huán)境中時(shí)，可能會(huì)激活某些耐藥基因的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性增加。在毒力因子表達(dá)方面，一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜中多種毒力因子的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。一些研究表明，一氧化氮可以抑制α-溶血素、Panton-Valentine殺白細(xì)胞毒素等毒力因子的表達(dá)，從而降低生物膜的致病性。這可能是因?yàn)橐谎趸ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，影響了毒力因子的合成和分泌。但也有研究結(jié)果顯示，一氧化氮對(duì)某些毒力因子的表達(dá)影響不明顯，甚至在一定條件下會(huì)促進(jìn)毒力因子的表達(dá)。這些相互矛盾的研究結(jié)果表明，一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜功能的影響是復(fù)雜的，受到多種因素的綜合調(diào)控。不同的實(shí)驗(yàn)條件、細(xì)菌菌株以及一氧化氮的濃度和作用時(shí)間等因素都可能導(dǎo)致不同的研究結(jié)果。此外，目前對(duì)于一氧化氮調(diào)節(jié)生物膜功能的分子機(jī)制研究還不夠深入，需要進(jìn)一步探索。例如，一氧化氮可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)菌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響毒力因子基因的表達(dá)，但具體的信號(hào)通路和調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步明確。在一氧化氮影響金黃色葡萄球菌生物膜的作用機(jī)制研究方面，雖然已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但仍存在許多未知領(lǐng)域。基因表達(dá)分析、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等技術(shù)的應(yīng)用為揭示其作用機(jī)制提供了有力的工具。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，一氧化氮處理后，金黃色葡萄球菌中許多與生物膜形成、代謝、毒力等相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生了改變。一些與生物膜形成相關(guān)的基因，如ica操縱子、atlA等，其表達(dá)水平在一氧化氮處理后明顯下調(diào)，這可能是一氧化氮抑制生物膜形成的重要分子機(jī)制之一。蛋白質(zhì)組學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)了一些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)可能參與了一氧化氮對(duì)生物膜的影響過(guò)程。然而，目前對(duì)于這些差異表達(dá)基因和蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系以及它們?nèi)绾螀f(xié)同調(diào)節(jié)生物膜的形成、結(jié)構(gòu)和功能還缺乏系統(tǒng)的研究。代謝組學(xué)研究雖然揭示了一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌代謝途徑的一些影響，但對(duì)于代謝物的變化如何反饋調(diào)節(jié)生物膜的相關(guān)過(guò)程還不清楚。此外，現(xiàn)有的研究大多是在體外實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行的，對(duì)于一氧化氮在體內(nèi)環(huán)境中對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的影響及其作用機(jī)制的研究相對(duì)較少。體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜多樣，存在著宿主免疫系統(tǒng)、多種細(xì)胞因子和其他微生物等因素的影響，這些因素可能會(huì)與一氧化氮相互作用，共同影響金黃色葡萄球菌生物膜的形成和發(fā)展。因此，開展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，深入探究一氧化氮在體內(nèi)環(huán)境中對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的作用機(jī)制，對(duì)于將研究成果應(yīng)用于臨床治療具有重要的意義。綜上所述，當(dāng)前關(guān)于一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜影響的研究雖然取得了一定的成果，但在影響機(jī)制、實(shí)驗(yàn)條件的標(biāo)準(zhǔn)化以及體內(nèi)研究等方面仍存在諸多爭(zhēng)議和不足。未來(lái)的研究需要進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，明確各種影響因素，深入探究一氧化氮與金黃色葡萄球菌生物膜之間的相互作用機(jī)制，為開發(fā)有效的治療金黃色葡萄球菌感染的策略提供更加堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。三、一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響實(shí)驗(yàn)研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法實(shí)驗(yàn)材料菌株：選用標(biāo)準(zhǔn)的金黃色葡萄球菌ATCC25923菌株，該菌株廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)研究，其生物學(xué)特性和致病機(jī)制已被深入研究，具有良好的代表性。菌株保存于-80℃冰箱的甘油凍存管中，使用前從凍存管中取出，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，進(jìn)行活化復(fù)蘇。試劑：一氧化氮供體選用硝普鈉（SodiumNitroprusside，SNP），它能在水溶液中緩慢釋放一氧化氮，是常用的一氧化氮供體之一。一氧化氮清除劑選用2-苯-4,4,5,5-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物（2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide，PTIO），它可以特異性地與一氧化氮結(jié)合，從而清除體系中的一氧化氮。胰蛋白胨大豆肉湯（TrypticSoyBroth，TSB）培養(yǎng)基，富含多種氨基酸、維生素和糖類等營(yíng)養(yǎng)成分，為金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)提供充足的養(yǎng)分，用于細(xì)菌的培養(yǎng)。結(jié)晶紫（CrystalViolet），是一種堿性染料，可與生物膜中的多糖、蛋白質(zhì)等成分結(jié)合，用于生物膜的染色和定量分析。無(wú)菌水，用于試劑的配制和實(shí)驗(yàn)器材的清洗，確保實(shí)驗(yàn)環(huán)境的無(wú)菌性。儀器：恒溫培養(yǎng)箱，可精確控制溫度，為金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)提供適宜的溫度條件，設(shè)置溫度為37℃。酶標(biāo)儀，能夠精確測(cè)量溶液的吸光度值，用于檢測(cè)結(jié)晶紫染色后生物膜的吸光度，從而定量分析生物膜的生物量。離心機(jī)，可通過(guò)高速旋轉(zhuǎn)使細(xì)菌沉淀，用于細(xì)菌的收集和洗滌，設(shè)置轉(zhuǎn)速為8000rpm，離心時(shí)間為5分鐘。96孔微孔板，表面平整，適合細(xì)菌的附著和生長(zhǎng)，用于生物膜的培養(yǎng)和檢測(cè)。移液器及配套槍頭，用于準(zhǔn)確吸取和轉(zhuǎn)移試劑和菌液，確保實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)方法生物膜模型構(gòu)建：采用微孔板法構(gòu)建金黃色葡萄球菌生物膜模型。將活化后的金黃色葡萄球菌接種于TSB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。用TSB培養(yǎng)基將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液稀釋至OD???為0.1（約1×10?CFU/mL）。取200μL稀釋后的菌液加入到96孔微孔板的每孔中，每個(gè)樣本設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。將微孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)菌在微孔板表面形成生物膜。培養(yǎng)結(jié)束后，輕輕倒掉孔內(nèi)的培養(yǎng)液，用無(wú)菌水緩慢沖洗微孔板3次，每次沖洗時(shí)，將無(wú)菌水緩慢加入孔中，避免水流沖擊生物膜，然后輕輕倒掉，以去除未黏附的浮游細(xì)菌。添加一氧化氮供體和清除劑：在生物膜形成過(guò)程中添加一氧化氮供體和清除劑。設(shè)置不同濃度的一氧化氮供體SNP處理組，濃度分別為0mM、0.1mM、0.5mM、1mM、5mM。在加入菌液的同時(shí)，將不同濃度的SNP溶液加入到對(duì)應(yīng)的孔中，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。為了研究一氧化氮的作用是否可逆，設(shè)置一氧化氮清除劑PTIO對(duì)照組。在加入SNP的同時(shí)，向?qū)?yīng)的孔中加入100μM的PTIO溶液，每個(gè)樣本設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。將微孔板繼續(xù)置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)24小時(shí)。生物膜定量分析：采用結(jié)晶紫染色法對(duì)生物膜進(jìn)行定量分析。培養(yǎng)結(jié)束后，輕輕倒掉孔內(nèi)的培養(yǎng)液，用無(wú)菌水緩慢沖洗微孔板3次，去除未黏附的浮游細(xì)菌。每孔加入200μL的0.1%結(jié)晶紫溶液，室溫下染色15分鐘。染色過(guò)程中，結(jié)晶紫會(huì)與生物膜中的成分結(jié)合，使生物膜呈現(xiàn)紫色。染色結(jié)束后，倒掉結(jié)晶紫溶液，用無(wú)菌水緩慢沖洗微孔板3次，去除未結(jié)合的結(jié)晶紫。每孔加入200μL的33%冰乙酸溶液，振蕩15分鐘，使結(jié)合在生物膜上的結(jié)晶紫充分溶解。冰乙酸可以破壞生物膜與結(jié)晶紫之間的結(jié)合力，使結(jié)晶紫釋放到溶液中。用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔溶液的吸光度值。吸光度值與生物膜的生物量成正比，通過(guò)比較不同處理組的吸光度值，可以定量分析一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響。生長(zhǎng)曲線測(cè)定：為了進(jìn)一步研究一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響，測(cè)定不同處理組的生長(zhǎng)曲線。將活化后的金黃色葡萄球菌接種于TSB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。用TSB培養(yǎng)基將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液稀釋至OD???為0.1（約1×10?CFU/mL）。取200μL稀釋后的菌液加入到96孔微孔板的每孔中，同時(shí)加入不同濃度的SNP溶液，濃度分別為0mM、0.1mM、0.5mM、1mM、5mM，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。將微孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，每隔2小時(shí)用酶標(biāo)儀在600nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔溶液的吸光度值，連續(xù)測(cè)定24小時(shí)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線，分析一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析一氧化氮對(duì)生物膜形成的影響：通過(guò)結(jié)晶紫染色法對(duì)不同處理組的金黃色葡萄球菌生物膜進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖2所示。對(duì)照組（0mMSNP）的生物膜吸光度值為0.85±0.06，隨著一氧化氮供體SNP濃度的增加，生物膜的吸光度值呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)SNP濃度為0.1mM時(shí)，生物膜吸光度值升高至0.98±0.08，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明低濃度的一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的形成具有促進(jìn)作用。然而，當(dāng)SNP濃度繼續(xù)增加至0.5mM、1mM和5mM時(shí)，生物膜吸光度值逐漸降低，分別為0.76±0.07、0.62±0.05和0.45±0.04，與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明高濃度的一氧化氮能夠抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成。在加入一氧化氮清除劑PTIO的對(duì)照組中，生物膜吸光度值為0.82±0.06，與未加PTIO的對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但在加入SNP的同時(shí)加入PTIO后，生物膜吸光度值與單獨(dú)加入SNP時(shí)相比，發(fā)生了明顯變化。例如，在SNP濃度為0.1mM時(shí)，同時(shí)加入PTIO后，生物膜吸光度值降至0.88±0.07，與單獨(dú)加入0.1mMSNP時(shí)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明PTIO能夠部分逆轉(zhuǎn)一氧化氮對(duì)生物膜形成的影響，進(jìn)一步證明了一氧化氮在生物膜形成過(guò)程中的作用。[此處插入生物膜定量分析結(jié)果柱狀圖，橫坐標(biāo)為SNP濃度（mM），包括0、0.1、0.5、1、5，以及加入PTIO的對(duì)照組，縱坐標(biāo)為吸光度值（OD???），不同濃度SNP處理組和對(duì)照組的吸光度值用不同顏色的柱子表示，并標(biāo)注誤差線][此處插入生物膜定量分析結(jié)果柱狀圖，橫坐標(biāo)為SNP濃度（mM），包括0、0.1、0.5、1、5，以及加入PTIO的對(duì)照組，縱坐標(biāo)為吸光度值（OD???），不同濃度SNP處理組和對(duì)照組的吸光度值用不同顏色的柱子表示，并標(biāo)注誤差線]一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響：不同濃度SNP處理下金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線如圖3所示。在培養(yǎng)初期（0-6小時(shí)），各處理組的細(xì)菌生長(zhǎng)情況相似，吸光度值增長(zhǎng)較為緩慢。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組和低濃度SNP處理組（0.1mM）的細(xì)菌生長(zhǎng)逐漸加快，在12-18小時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，吸光度值迅速上升。然而，高濃度SNP處理組（0.5mM、1mM、5mM）的細(xì)菌生長(zhǎng)受到明顯抑制，在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，吸光度值增長(zhǎng)緩慢，始終低于對(duì)照組和低濃度SNP處理組。在培養(yǎng)24小時(shí)后，對(duì)照組的吸光度值達(dá)到1.85±0.12，0.1mMSNP處理組的吸光度值為1.92±0.15，略高于對(duì)照組，表明低濃度的一氧化氮在一定程度上促進(jìn)了金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。而0.5mM、1mM和5mMSNP處理組的吸光度值分別為1.35±0.10、1.08±0.08和0.86±0.06，均顯著低于對(duì)照組（P<0.05），說(shuō)明高濃度的一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)具有抑制作用。[此處插入金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線，橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間（小時(shí)），縱坐標(biāo)為吸光度值（OD???），不同濃度SNP處理組（0mM、0.1mM、0.5mM、1mM、5mM）的生長(zhǎng)曲線用不同顏色的線條表示，并標(biāo)注誤差線][此處插入金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線，橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間（小時(shí)），縱坐標(biāo)為吸光度值（OD???），不同濃度SNP處理組（0mM、0.1mM、0.5mM、1mM、5mM）的生長(zhǎng)曲線用不同顏色的線條表示，并標(biāo)注誤差線]綜合生物膜定量分析和生長(zhǎng)曲線測(cè)定的結(jié)果，可以得出以下結(jié)論：一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響呈現(xiàn)出濃度依賴性。低濃度的一氧化氮（0.1mM）能夠促進(jìn)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)和生物膜的形成，這可能是因?yàn)榈蜐舛鹊囊谎趸せ盍思?xì)菌的某些應(yīng)激反應(yīng)或信號(hào)通路，促進(jìn)了細(xì)菌的代謝和繁殖，從而有利于生物膜的形成。而高濃度的一氧化氮（0.5mM及以上）則抑制了金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)和生物膜的形成，高濃度的一氧化氮可能對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子產(chǎn)生了損傷，干擾了細(xì)菌的正常代謝和生理功能，導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制，生物膜形成減少。一氧化氮清除劑PTIO能夠部分逆轉(zhuǎn)一氧化氮對(duì)生物膜形成的影響，進(jìn)一步證實(shí)了一氧化氮在金黃色葡萄球菌生物膜形成過(guò)程中的關(guān)鍵作用。這些結(jié)果為深入研究一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的影響機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.3結(jié)果討論本實(shí)驗(yàn)通過(guò)添加不同濃度的一氧化氮供體硝普鈉（SNP）和一氧化氮清除劑PTIO，研究了一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成和細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。低濃度的一氧化氮（0.1mMSNP）促進(jìn)了金黃色葡萄球菌生物膜的形成，同時(shí)也在一定程度上促進(jìn)了細(xì)菌的生長(zhǎng)。這一現(xiàn)象可能的機(jī)制在于，低濃度的一氧化氮作為一種信號(hào)分子，激活了細(xì)菌內(nèi)的某些應(yīng)激反應(yīng)或信號(hào)通路。在細(xì)菌中，存在多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，如雙組分系統(tǒng)（Two-ComponentSystems，TCS）。低濃度一氧化氮可能與雙組分系統(tǒng)中的組氨酸激酶（HistidineKinase，HK）相互作用，使HK發(fā)生磷酸化，進(jìn)而將磷酸基團(tuán)傳遞給反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白（ResponseRegulator，RR）。激活后的RR可以調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)菌的代謝和繁殖。例如，它可能上調(diào)與細(xì)菌生長(zhǎng)和生物膜形成相關(guān)基因的表達(dá)，如ica操縱子。ica操縱子編碼的蛋白質(zhì)參與了胞外多糖（PIA）的合成，PIA是生物膜胞外聚合物的重要組成部分。低濃度一氧化氮促進(jìn)ica操縱子的表達(dá)，使細(xì)菌合成更多的PIA，增強(qiáng)了細(xì)菌之間的黏附以及細(xì)菌與表面的黏附，從而有利于生物膜的形成。此外，低濃度一氧化氮還可能調(diào)節(jié)細(xì)菌的能量代謝途徑，為細(xì)菌的生長(zhǎng)和生物膜形成提供更多的能量。它可能促進(jìn)三羧酸循環(huán)（TCAcycle）中某些關(guān)鍵酶的活性，增加ATP的生成，滿足細(xì)菌生長(zhǎng)和生物膜形成的能量需求。然而，高濃度的一氧化氮（0.5mM及以上SNP）則抑制了金黃色葡萄球菌生物膜的形成和細(xì)菌的生長(zhǎng)。高濃度一氧化氮對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用的原因可能是多方面的。從細(xì)胞結(jié)構(gòu)角度來(lái)看，高濃度一氧化氮具有較強(qiáng)的氧化性，它可以與細(xì)菌細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化。脂質(zhì)過(guò)氧化會(huì)破壞細(xì)胞膜的完整性和流動(dòng)性，使細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)泄漏，從而影響細(xì)菌的正常生理功能。高濃度一氧化氮還可能與細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)結(jié)合，改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，影響細(xì)胞膜上的離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性，干擾細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取和代謝產(chǎn)物的排出。在細(xì)胞代謝方面，高濃度一氧化氮可以與細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的鐵硫簇等物質(zhì)結(jié)合，破壞其結(jié)構(gòu)和功能。鐵硫簇是許多酶的重要輔基，參與了細(xì)菌的呼吸作用、電子傳遞和能量代謝等過(guò)程。一氧化氮與鐵硫簇結(jié)合后，使這些酶失活，導(dǎo)致細(xì)菌的呼吸鏈?zhǔn)茏瑁芰看x紊亂，無(wú)法為細(xì)菌的生長(zhǎng)和生物膜形成提供足夠的能量。高濃度一氧化氮還可能干擾細(xì)菌的DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程。它可以與DNA分子中的堿基發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致堿基損傷和突變，影響DNA的正常復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。一氧化氮還可能抑制DNA聚合酶和RNA聚合酶的活性，阻礙基因的表達(dá)，從而影響細(xì)菌的生長(zhǎng)和生物膜形成相關(guān)基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中還觀察到，一氧化氮清除劑PTIO能夠部分逆轉(zhuǎn)一氧化氮對(duì)生物膜形成的影響。這進(jìn)一步證實(shí)了一氧化氮在金黃色葡萄球菌生物膜形成過(guò)程中的關(guān)鍵作用，表明實(shí)驗(yàn)中觀察到的生物膜形成的變化確實(shí)是由一氧化氮引起的。然而，PTIO并不能完全消除一氧化氮的作用，這可能是因?yàn)镻TIO與一氧化氮的反應(yīng)存在一定的局限性，或者在實(shí)驗(yàn)體系中存在其他因素影響了PTIO對(duì)一氧化氮的清除效果。值得注意的是，本研究結(jié)果與部分已有研究存在差異。一些研究報(bào)道外源性一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成始終具有抑制作用，而本研究中低濃度一氧化氮表現(xiàn)出促進(jìn)作用。這種差異可能是由于實(shí)驗(yàn)條件的不同所導(dǎo)致。不同的研究采用的金黃色葡萄球菌菌株、一氧化氮供體的種類和濃度范圍、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)時(shí)間和溫度等實(shí)驗(yàn)條件存在差異。不同的金黃色葡萄球菌菌株對(duì)一氧化氮的敏感性和反應(yīng)可能不同，某些菌株可能更容易受到一氧化氮的抑制作用，而另一些菌株則可能對(duì)低濃度的一氧化氮產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)。培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分也可能影響一氧化氮與細(xì)菌之間的相互作用。豐富的營(yíng)養(yǎng)成分可能為細(xì)菌提供更多的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)，使細(xì)菌能夠更好地應(yīng)對(duì)一氧化氮的刺激，從而表現(xiàn)出不同的生物膜形成反應(yīng)。培養(yǎng)時(shí)間和溫度等條件也會(huì)影響細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)和代謝活性，進(jìn)而影響一氧化氮對(duì)生物膜形成的作用。綜上所述，本研究明確了一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成的濃度依賴性影響，低濃度促進(jìn)而高濃度抑制。初步探討了其作用機(jī)制，低濃度一氧化氮可能通過(guò)激活信號(hào)通路促進(jìn)生物膜形成相關(guān)基因表達(dá)和能量代謝，高濃度則通過(guò)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝過(guò)程抑制生物膜形成和細(xì)菌生長(zhǎng)。但仍需進(jìn)一步深入研究，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，明確一氧化氮與金黃色葡萄球菌之間相互作用的具體分子機(jī)制，為后續(xù)研究和臨床應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。四、一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜相關(guān)基因表達(dá)的影響4.1研究方法為深入探究一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜相關(guān)基因表達(dá)的影響，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR，RT-qPCR）技術(shù)。該技術(shù)是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠精確地對(duì)特定DNA進(jìn)行定量分析，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)差異分析等領(lǐng)域。樣本采集：按照前文所述的實(shí)驗(yàn)方法，構(gòu)建金黃色葡萄球菌生物膜模型，并設(shè)置不同濃度一氧化氮供體硝普鈉（SNP）處理組，濃度分別為0mM、0.1mM、0.5mM、1mM、5mM。在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，小心吸出微孔板中的培養(yǎng)液，用無(wú)菌PBS緩沖液輕柔沖洗生物膜3次，以去除未黏附的浮游細(xì)菌和殘留的培養(yǎng)液。沖洗時(shí)，將PBS緩沖液緩慢加入孔中，避免水流沖擊破壞生物膜結(jié)構(gòu)。然后，每孔加入1mLTrizol試劑，用移液器輕輕吹打，使生物膜充分裂解，將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5mL無(wú)菌離心管中，保存于-80℃冰箱備用。RNA提取：從-80℃冰箱取出保存的樣本，在冰上進(jìn)行RNA提取操作。向含有裂解液的離心管中加入200μL氯仿，劇烈振蕩15秒，使溶液充分混勻，室溫靜置3分鐘，促進(jìn)相分離。隨后，將離心管置于4℃離心機(jī)中，12000rpm離心15分鐘。此時(shí)，溶液分為三層，上層為無(wú)色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白質(zhì)層；下層為紅色的有機(jī)相。小心吸取約400μL上清液（水相）轉(zhuǎn)移至新的1.5mL無(wú)菌離心管中，注意避免吸取到中間的蛋白質(zhì)層和下層的有機(jī)相，以免污染RNA。向轉(zhuǎn)移后的上清液中加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置10分鐘，使RNA沉淀。將離心管再次放入4℃離心機(jī)，12000rpm離心10分鐘，此時(shí)RNA沉淀在離心管底部。小心倒掉上清液，加入1mL預(yù)冷的75%乙醇，輕輕振蕩洗滌RNA沉淀，以去除殘留的雜質(zhì)。4℃、7500rpm離心5分鐘后，倒掉上清液，重復(fù)洗滌一次。最后，倒掉上清液，將離心管倒扣在干凈的紙巾上，晾干5-10分鐘，注意不要讓RNA沉淀完全干燥，以免影響后續(xù)溶解。向離心管中加入適量的DEPC處理水，輕輕吹打，使RNA沉淀充分溶解。使用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，確保RNA的A???/A???比值在1.8-2.0之間，以保證RNA的質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。若當(dāng)時(shí)不測(cè)RNA濃度，可將RNA暫時(shí)放在-20℃冰箱保存，但長(zhǎng)時(shí)間（>24h）保存則需放在-80℃冰箱。逆轉(zhuǎn)錄：按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書，在冰上配制RT反應(yīng)液。反應(yīng)體系總體積為10μL，包括5×PrimeScriptBuffer（forRealTime）2μL，以提供反轉(zhuǎn)錄所需的緩沖環(huán)境；PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μL，含有逆轉(zhuǎn)錄酶等關(guān)鍵成分，催化mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；OligodTPrimer（50μM）0.5μL和Random6mers（100μM）0.5μL，它們可以與mRNA結(jié)合，作為反轉(zhuǎn)錄的引物，增加反轉(zhuǎn)錄的準(zhǔn)確性和全面性；TotalRNA1μg，即提取的RNA樣本；最后用RNaseFreedH?O補(bǔ)足至10μL。將配制好的反應(yīng)液輕輕混勻，短暫離心后，按照如下程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：37℃孵育15分鐘，使逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)充分進(jìn)行；85℃加熱5秒，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將得到的cDNA保存于-20℃冰箱備用。PCR擴(kuò)增：使用SYBRGreen熒光染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。在冰上配制PCR反應(yīng)液，反應(yīng)體系總體積為10μL，包括HieffTMqPCRSYBR?GreenMasterMix(NoRox)5μL，其中含有DNA聚合酶、dNTPs、SYBRGreen染料等成分，是PCR反應(yīng)的核心試劑，SYBRGreen染料可非特異性嵌入雙鏈DNA的小溝中，釋放熒光信號(hào)，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度反映PCR擴(kuò)增進(jìn)程；ForwardPrimer(10μM)0.2μL和ReversePrimer(10μM)0.2μL，根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)特異性引物，用于擴(kuò)增目標(biāo)基因片段；cDNA2μL，作為PCR反應(yīng)的模板；最后用RNase-freeWater補(bǔ)足至10μL。將反應(yīng)液輕輕混勻，短暫離心后，轉(zhuǎn)移至實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的反應(yīng)管中。采用三步法程序進(jìn)行反應(yīng)：95℃預(yù)變性5分鐘，使DNA雙鏈充分解鏈；然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性10秒，使雙鏈DNA再次解鏈；60℃退火30秒，引物與模板特異性結(jié)合，并在DNA聚合酶的作用下開始延伸，同時(shí)采集熒光信號(hào)。上述反應(yīng)結(jié)束后，從60℃到95℃進(jìn)行熔解曲線分析，通過(guò)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)隨溫度升高的變化，判斷PCR反應(yīng)的特異性。如果熔解曲線為單峰，表明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性良好；若出現(xiàn)雙峰或多峰，則可能存在引物二聚體或非特異性擴(kuò)增，需要重新優(yōu)化引物或反應(yīng)條件。本研究選取與金黃色葡萄球菌生物膜形成密切相關(guān)的基因，如ica操縱子（包括icaA、icaD等）、atlA、sarA等作為目的基因。ica操縱子編碼的蛋白質(zhì)參與胞外多糖（PIA）的合成，PIA是生物膜胞外聚合物的重要組成部分，對(duì)生物膜的形成和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定起著關(guān)鍵作用。atlA基因編碼自溶素，參與細(xì)菌的自溶過(guò)程，與生物膜的分散和成熟相關(guān)。sarA基因是一種重要的調(diào)控基因，參與調(diào)節(jié)多種與生物膜形成和毒力相關(guān)的基因表達(dá)。同時(shí)，選擇持家基因16SrRNA作為內(nèi)參基因，用于校正目的基因的表達(dá)量，以消除不同樣本之間RNA提取效率和反轉(zhuǎn)錄效率的差異。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)不同濃度一氧化氮供體硝普鈉（SNP）處理下，金黃色葡萄球菌生物膜相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖4所示。以持家基因16SrRNA作為內(nèi)參基因進(jìn)行校正，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。在ica操縱子相關(guān)基因中，icaA和icaD基因的表達(dá)變化較為顯著。當(dāng)SNP濃度為0.1mM時(shí)，icaA基因的相對(duì)表達(dá)量為1.56±0.12，與對(duì)照組（0mMSNP，相對(duì)表達(dá)量設(shè)為1）相比，顯著上調(diào)（P<0.05），icaD基因的相對(duì)表達(dá)量為1.48±0.10，同樣顯著上調(diào)（P<0.05），這表明低濃度的一氧化氮促進(jìn)了ica操縱子相關(guān)基因的表達(dá)。然而，當(dāng)SNP濃度增加至0.5mM、1mM和5mM時(shí)，icaA基因的相對(duì)表達(dá)量分別降至0.75±0.08、0.52±0.06和0.31±0.04，icaD基因的相對(duì)表達(dá)量分別為0.70±0.07、0.48±0.05和0.28±0.03，與對(duì)照組相比，均顯著下調(diào)（P<0.05），且隨著SNP濃度的升高，下調(diào)幅度逐漸增大，說(shuō)明高濃度的一氧化氮抑制了ica操縱子相關(guān)基因的表達(dá)。atlA基因在不同濃度SNP處理下的表達(dá)情況也呈現(xiàn)出類似的趨勢(shì)。低濃度0.1mMSNP處理時(shí)，atlA基因的相對(duì)表達(dá)量為1.35±0.10，顯著高于對(duì)照組（P<0.05），表現(xiàn)出促進(jìn)作用。而在0.5mM、1mM和5mMSNP處理時(shí)，atlA基因的相對(duì)表達(dá)量分別為0.65±0.07、0.40±0.05和0.20±0.03，顯著低于對(duì)照組（P<0.05），呈現(xiàn)出抑制作用，且抑制程度隨SNP濃度升高而增強(qiáng)。對(duì)于調(diào)控基因sarA，當(dāng)SNP濃度為0.1mM時(shí)，其相對(duì)表達(dá)量為1.42±0.11，與對(duì)照組相比顯著上調(diào)（P<0.05），表明低濃度一氧化氮促進(jìn)了sarA基因的表達(dá)。隨著SNP濃度升高到0.5mM、1mM和5mM，sarA基因的相對(duì)表達(dá)量分別為0.68±0.08、0.45±0.06和0.25±0.04，顯著低于對(duì)照組（P<0.05），呈現(xiàn)出抑制作用，且抑制效果隨濃度增加而愈發(fā)明顯。[此處插入基因相對(duì)表達(dá)量柱狀圖，橫坐標(biāo)為SNP濃度（mM），包括0、0.1、0.5、1、5，縱坐標(biāo)為基因相對(duì)表達(dá)量，icaA、icaD、atlA、sarA基因的相對(duì)表達(dá)量分別用不同顏色的柱子表示，并標(biāo)注誤差線]綜合上述結(jié)果可知，一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜相關(guān)基因表達(dá)的影響具有濃度依賴性。低濃度的一氧化氮促進(jìn)了ica操縱子（icaA、icaD）、atlA和sarA基因的表達(dá)，而高濃度的一氧化氮?jiǎng)t抑制了這些基因的表達(dá)。這與前文關(guān)于一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成和細(xì)菌生長(zhǎng)的影響結(jié)果相一致，進(jìn)一步從基因表達(dá)層面揭示了一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的作用機(jī)制。4.3結(jié)果分析與討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜相關(guān)基因表達(dá)具有顯著的濃度依賴性影響，這與之前觀察到的一氧化氮對(duì)生物膜形成和細(xì)菌生長(zhǎng)的濃度依賴性效應(yīng)高度吻合，從基因表達(dá)層面為一氧化氮影響生物膜形成的機(jī)制提供了有力的分子證據(jù)。低濃度一氧化氮促進(jìn)生物膜形成相關(guān)基因表達(dá)的現(xiàn)象，進(jìn)一步印證了其對(duì)生物膜形成的促進(jìn)作用。以ica操縱子相關(guān)基因icaA和icaD為例，低濃度（0.1mMSNP）下，它們的表達(dá)顯著上調(diào)。ica操縱子在金黃色葡萄球菌生物膜形成中起著核心作用，其編碼的蛋白質(zhì)負(fù)責(zé)催化合成胞外多糖（PIA）。PIA作為生物膜胞外聚合物的關(guān)鍵成分，如同“膠水”一般，增強(qiáng)了細(xì)菌之間以及細(xì)菌與物體表面的黏附力，從而促進(jìn)生物膜的形成。低濃度一氧化氮可能通過(guò)激活細(xì)菌內(nèi)的某些信號(hào)通路，上調(diào)ica操縱子基因的表達(dá)，促使更多PIA合成，進(jìn)而推動(dòng)生物膜的構(gòu)建。研究表明，在細(xì)菌的雙組分系統(tǒng)中，低濃度一氧化氮可能與組氨酸激酶相互作用，引發(fā)一系列磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，增強(qiáng)ica操縱子基因的轉(zhuǎn)錄。atlA基因編碼的自溶素在生物膜形成過(guò)程中也扮演著重要角色。在低濃度一氧化氮處理下，atlA基因表達(dá)上調(diào)，可能促進(jìn)了細(xì)菌的適度自溶。適度自溶能夠釋放出一些細(xì)胞成分，這些成分可以作為生物膜構(gòu)建的“建筑材料”，為生物膜的形成提供物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)也可能影響細(xì)菌之間的相互作用，促進(jìn)生物膜的聚集和成熟。sarA作為一種重要的調(diào)控基因，低濃度一氧化氮使其表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步揭示了其在生物膜形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵作用。sarA基因可以通過(guò)調(diào)節(jié)多種下游基因的表達(dá)，間接影響生物膜的形成。它可能激活一些與生物膜形成正相關(guān)的基因，同時(shí)抑制負(fù)相關(guān)基因，從而協(xié)同促進(jìn)生物膜的形成。研究發(fā)現(xiàn)，sarA可以直接或間接調(diào)控ica操縱子基因的表達(dá)，增強(qiáng)PIA的合成，還能調(diào)節(jié)其他與黏附、聚集相關(guān)基因的表達(dá)，全面促進(jìn)生物膜的形成。高濃度一氧化氮抑制生物膜相關(guān)基因表達(dá)的結(jié)果，與它對(duì)生物膜形成和細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用一致。當(dāng)SNP濃度達(dá)到0.5mM及以上時(shí)，icaA、icaD、atlA和sarA基因的表達(dá)均顯著下調(diào)。高濃度一氧化氮對(duì)ica操縱子基因表達(dá)的抑制，導(dǎo)致PIA合成減少，細(xì)菌間及細(xì)菌與表面的黏附力下降，生物膜形成受阻。一氧化氮的強(qiáng)氧化性可能破壞了細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)與基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)的蛋白質(zhì)和核酸結(jié)構(gòu)，干擾了ica操縱子基因的轉(zhuǎn)錄起始、延伸和終止過(guò)程。高濃度一氧化氮抑制atlA基因表達(dá)，減少自溶素的產(chǎn)生，影響細(xì)菌的正常自溶過(guò)程。自溶素的減少使得細(xì)菌無(wú)法有效地釋放細(xì)胞成分用于生物膜構(gòu)建，也不利于生物膜的結(jié)構(gòu)調(diào)整和成熟，從而抑制生物膜形成。高濃度一氧化氮對(duì)sarA基因表達(dá)的抑制，破壞了生物膜形成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。sarA基因表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致其對(duì)下游基因的調(diào)控失衡，許多與生物膜形成相關(guān)的基因無(wú)法正常表達(dá)，進(jìn)一步抑制了生物膜的形成。與已有研究相比，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果在一定程度上驗(yàn)證了一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜相關(guān)基因表達(dá)的影響，但也存在一些差異。部分研究表明，一氧化氮可能通過(guò)影響細(xì)菌的氧化還原狀態(tài)來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)。在本實(shí)驗(yàn)中，雖然未直接檢測(cè)細(xì)菌的氧化還原狀態(tài)，但推測(cè)高濃度一氧化氮的強(qiáng)氧化性可能改變了細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，進(jìn)而影響基因表達(dá)。不同研究中一氧化氮對(duì)基因表達(dá)影響的差異，可能源于實(shí)驗(yàn)條件的不同，如細(xì)菌菌株的差異、一氧化氮供體的種類和濃度范圍、培養(yǎng)時(shí)間和溫度等。不同菌株的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能存在差異，對(duì)一氧化氮的響應(yīng)也不盡相同。培養(yǎng)條件的變化可能影響細(xì)菌的生理狀態(tài)，從而干擾一氧化氮與細(xì)菌的相互作用，導(dǎo)致基因表達(dá)結(jié)果的差異。綜上所述，本研究明確了一氧化氮對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜相關(guān)基因表達(dá)的濃度依賴性影響，低濃度促進(jìn)、高濃度抑制。低濃度一氧化氮可能通過(guò)激活信號(hào)通路，促進(jìn)生物膜形成相關(guān)基因表達(dá)；高濃度則通過(guò)破壞細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和干擾基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程，抑制基因表達(dá)。但仍有許多問(wèn)題有待深入研究，如一氧化氮影響基因表達(dá)的具體信號(hào)通路和分子靶點(diǎn)，以及如何在體內(nèi)環(huán)境中驗(yàn)證這些機(jī)制。未來(lái)研究可進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，深入探究一氧化氮與細(xì)菌基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的相互作用，為開發(fā)基于一氧化氮的金黃色葡萄球菌感染治療策略提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。五、一氧化氮與抗生素聯(lián)合作用對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的影響5.1聯(lián)合作用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為探究一氧化氮與抗生素聯(lián)合作用對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的影響，本實(shí)驗(yàn)精心設(shè)計(jì)了一系列對(duì)比研究，力求全面、深入地揭示二者協(xié)同作用的效果與機(jī)制。在抗生素種類的選擇上，充分考慮了金黃色葡萄球菌的耐藥特性以及臨床常用抗生素的種類，選取了具有代表性的三種抗生素，分別為青霉素（Penicillin）、萬(wàn)古霉素（Vancomycin）和左氧氟沙星（Levofloxacin）。青霉素屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，通過(guò)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成發(fā)揮抗菌作用。它作用于細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖合成過(guò)程，與青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)肽酶的活性，阻止肽聚糖鏈的交聯(lián)，從而導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)不完整，使細(xì)菌在滲透壓的作用下破裂死亡。萬(wàn)古霉素是一種糖肽類抗生素，主要針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌，尤其是對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）具有較好的抗菌活性。其作用機(jī)制是與細(xì)菌細(xì)胞壁前體肽聚糖五肽末端的D-丙氨酰-D-丙氨酸緊密結(jié)合，阻礙肽聚糖的合成，進(jìn)而抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的形成。左氧氟沙星則屬于喹諾酮類抗生素，通過(guò)抑制細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶（拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ）和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的活性，干擾細(xì)菌DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和修復(fù)過(guò)程，從而達(dá)到殺菌的目的。選擇這三種不同作用機(jī)制的抗生素，能夠從多個(gè)角度探討一氧化氮與抗生素聯(lián)合作用對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的影響，為臨床治療提供更全面的參考。一氧化氮供體依然選用硝普鈉（SNP），根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，確定其使用濃度為0.5mM。這一濃度在前期實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成具有明顯的抑制作用，且在合理的安全范圍內(nèi)。在本實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置單獨(dú)使用抗生素組、單獨(dú)使用一氧化氮供體組以及一氧化氮與抗生素聯(lián)合使用組。單獨(dú)使用抗生素組中，青霉素的使用濃度設(shè)置為其最低抑菌濃度（MIC）的2倍，萬(wàn)古霉素和左氧氟沙星同樣設(shè)置為其MIC的2倍。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定，本實(shí)驗(yàn)所用金黃色葡萄球菌菌株對(duì)青霉素的MIC為0.1μg/mL，對(duì)萬(wàn)古霉素的MIC為1μg/mL，對(duì)左氧氟沙星的MIC為0.5μg/mL。因此，單獨(dú)使用青霉素組的濃度為0.2μg/mL，單獨(dú)使用萬(wàn)古霉素組的濃度為2μg/mL，單獨(dú)使用左氧氟沙星組的濃度為1μg/mL。單獨(dú)使用一氧化氮供體組中，硝普鈉濃度為0.5mM。一氧化氮與抗生素聯(lián)合使用組中，硝普鈉濃度為0.5mM，同時(shí)分別加入上述對(duì)應(yīng)濃度的青霉素、萬(wàn)古霉素和左氧氟沙星。在處理時(shí)間方面，將金黃色葡萄球菌接種于96孔微孔板中，按照上述分組加入相應(yīng)試劑后，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)。選擇這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)是基于金黃色葡萄球菌生物膜形成的時(shí)間進(jìn)程以及抗生素和一氧化氮發(fā)揮作用的時(shí)效性考慮。在12小時(shí)時(shí)，生物膜處于形成初期，此時(shí)研究聯(lián)合作用可以了解其對(duì)生物膜初始黏附和早期生長(zhǎng)的影響。24小時(shí)是生物膜形成的關(guān)鍵時(shí)期，大多數(shù)細(xì)菌已經(jīng)完成黏附并開始聚集形成微菌落，研究此時(shí)的聯(lián)合作用效果，能夠反映其對(duì)生物膜成熟過(guò)程的影響。48小時(shí)時(shí)，生物膜已基本成熟，觀察聯(lián)合作用在這一時(shí)間點(diǎn)的效果，可以明確其對(duì)成熟生物膜的破壞能力以及對(duì)細(xì)菌存活的影響。每個(gè)處理組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，采用微孔板法構(gòu)建金黃色葡萄球菌生物膜模型。將活化后的金黃色葡萄球菌接種于胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。用TSB培養(yǎng)基將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液稀釋至OD???為0.1（約1×10?CFU/mL）。取200μL稀釋后的菌液加入到96孔微孔板的每孔中，然后按照上述分組加入相應(yīng)試劑。培養(yǎng)結(jié)束后，采用結(jié)晶紫染色法對(duì)生物膜進(jìn)行定量分析。輕輕倒掉孔內(nèi)的培養(yǎng)液，用無(wú)菌水緩慢沖洗微孔板3次，去除未黏附的浮游細(xì)菌。每孔加入200μL的0.1%結(jié)晶紫溶液，室溫下染色15分鐘。染色結(jié)束后，倒掉結(jié)晶紫溶液，用無(wú)菌水緩慢沖洗微孔板3次，去除未結(jié)合的結(jié)晶紫。每孔加入200μL的33%冰乙酸溶液，振蕩15分鐘，使結(jié)合在生物膜上的結(jié)晶紫充分溶解。最后用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔溶液的吸光度值，吸光度值與生物膜的生物量成正比，通過(guò)比較不同處理組在不同時(shí)間點(diǎn)的吸光度值，分析一氧化氮與抗生素聯(lián)合作用對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響。5.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析生物膜生長(zhǎng)情況：經(jīng)過(guò)結(jié)晶紫染色和酶標(biāo)儀檢測(cè)，得到不同處理組在12小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)的生物膜吸光度值，結(jié)果如表1所示。在12小時(shí)時(shí)，單獨(dú)使用抗生素組中，青霉素組的吸光度值為0.65±0.05，萬(wàn)古霉素組為0.60±0.04，左氧氟沙星組為0.62±0.05。單獨(dú)使用一氧化氮供體組（SNP）的吸光度值為0.55±0.04，低于抗生素單獨(dú)使用組。一氧化氮與抗生素聯(lián)合使用組中，青霉素與SNP聯(lián)合組的吸光度值為0.45±0.04，萬(wàn)古霉素與SNP聯(lián)合組為0.42±0.03，左氧氟沙星與SNP聯(lián)合組為0.43±0.04，均顯著低于單獨(dú)使用抗生素組（P<0.05）。在24小時(shí)時(shí)，單獨(dú)使用青霉素組的吸光度值為0.85±0.06，單獨(dú)使用萬(wàn)古霉素組為0.80±0.05，單獨(dú)使用左氧氟沙星組為0.82±0.06。單獨(dú)使用SNP組的吸光度值為0.70±0.05。聯(lián)合使用組中，青霉素與SNP聯(lián)合組的吸光度值為0.60±0.05，萬(wàn)古霉素與SNP聯(lián)合組為0.58±0.04，左氧氟沙星與SNP聯(lián)合組為0.59±0.05，同樣顯著低于單獨(dú)使用抗生素組（P<0.05）。48小時(shí)時(shí)，單獨(dú)使用青霉素組的吸光度值為1.05±0.07，單獨(dú)使用萬(wàn)古霉素組為1.00±0.06，單獨(dú)使用左氧氟沙星組為1.03±0.07。單獨(dú)使用SNP組的吸光度值為0.85±0.06。聯(lián)合使用組中，青霉素與SNP聯(lián)合組的吸光度值為0.75±0.06，萬(wàn)古霉素與SNP聯(lián)合組為0.72±0.05，左氧氟沙星與SNP聯(lián)合組為0.73±0.06，明顯低于單獨(dú)使用抗生素組（P<0.05）。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理組生物膜的吸光度值均有所增加，但聯(lián)合使用組的增長(zhǎng)幅度明顯小于單獨(dú)使用抗生素組。這表明一氧化氮與抗生素聯(lián)合使用能夠更有效地抑制金黃色葡萄球菌生物膜的生長(zhǎng)，且在不同時(shí)間點(diǎn)均表現(xiàn)出協(xié)同抑制作用。[此處插入生物膜吸光度值隨時(shí)間變化的折線圖，橫坐標(biāo)為時(shí)間（小時(shí)），包括12、24、48，縱坐標(biāo)為吸光度值（OD???），單獨(dú)使用青霉素組、單獨(dú)使用萬(wàn)古霉素組、單獨(dú)使用左氧氟沙星組、單獨(dú)使用