運用植物體細胞雜交技術(shù)，可以跨越不同種植之間生殖隔離的屏障，培育出新的作物類型。有沒有技術(shù)能讓不同種動物的體細胞進行雜交，培育出集不同細胞的優(yōu)勢于一身的動物細胞呢？去除細胞壁雜種細胞再生

新細胞壁植物細胞融合脫

分化移

栽植物組織培養(yǎng)融合并篩選再

分化1970年人-鼠細胞融合實驗滅活的仙臺病毒誘導(dǎo)第2章

細胞工程第2節(jié)

動物細胞工程二、動物細胞融合與單克隆抗體【本節(jié)聚焦】1.什么是動物細胞融合技術(shù)？2.單克隆抗體是如何制備的？在臨床上有哪些應(yīng)用？一、動物細胞融合技術(shù)閱讀P48-49，思考1.動物細胞融合技術(shù)的結(jié)果是？原理是？誘導(dǎo)方法有？意義是？應(yīng)用有哪些？2.早期人們用怎樣的方法獲得抗體？該方法制備的抗體特點有？3.如何獲得既能無限增殖又能產(chǎn)生抗體的細胞？4.結(jié)合圖2-16，分析單克隆抗體的制備過程是怎樣的？要經(jīng)過幾次篩選？一、動物細胞融合技術(shù)1.概念：2.結(jié)果：3.原理：4.方法：使兩個或多個動物細胞結(jié)合形成一個細胞的技術(shù)。融合后形成的雜交細胞就有原來兩個或多個細胞的遺傳信息。細胞膜具有一定的流動性。物理方法：電融合法等化學(xué)方法：聚乙二醇（PEG）融合法生物方法：滅活病毒誘導(dǎo)法生物方法：滅活病毒誘導(dǎo)法滅活：是指用物理或化學(xué)手段使病毒或細菌失去感染能力，但并不破壞它們的抗原結(jié)構(gòu)。原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細胞相互凝集，細胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合。P49思考：19世紀30年代，科學(xué)家曾在肺結(jié)核、天花和麻疹等疾病的病人的病理組織中觀察到多核細胞。如何解釋這一現(xiàn)象？病人體內(nèi)病毒等誘導(dǎo)多個體細胞融合形成了多核細胞。一、動物細胞融合技術(shù)5.意義：突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能。(1)已成為研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段。(2)利用動物細胞融合技術(shù)發(fā)展起來的雜交瘤技術(shù)，為制造單克隆抗體開辟了新途徑。6.應(yīng)用：人們可以按照預(yù)先的設(shè)計使不同細胞融合，至今，種間、屬間、科間，甚至動物和植物之間的細胞融合都已獲得了成功。植物體細胞雜交動物細胞融合原理細胞融合前的處理方法誘導(dǎo)細胞融合的方法細胞融合成功的標(biāo)志結(jié)果意義細胞膜具有一定的流動性、植物細胞的全能性細胞膜具有一定的流動性果膠酶和纖維素酶去除細胞壁胰蛋白酶或膠原蛋白酶使細胞分散成單個細胞電融合法、離心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法再生出細胞壁細胞核的融合獲得完整的雜種植株得到雜交細胞打破生殖隔離，實現(xiàn)遠緣雜交育種，培育植物新品種突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能7.動物細胞融合和植物體細胞雜交的比較(1)生產(chǎn)方法二、單克隆抗體及其應(yīng)用向動物反復(fù)注射某種抗原使動物產(chǎn)生抗體從動物血清中分離所需抗體產(chǎn)量低、純度低、特異性差1.傳統(tǒng)抗體產(chǎn)生（多克隆抗體的產(chǎn)生）(2)缺點某種抗原抗體【拓展1】對于一個抗原的刺激，每個B細胞只能合成并分泌一種識別抗原特定區(qū)域（抗原決定簇）的特異性抗體。只含有針對一個抗原決定簇的抗體稱為單克隆抗體（純度高，特異性強，能準確識別抗原并與之特異性結(jié)合）一個抗原可有多個不同的抗原決定簇，因此一個抗原可刺激B細胞產(chǎn)生多種漿細胞，不同的漿細胞可產(chǎn)生針對不同抗原決定簇的多種抗體。這種由同一抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的針對多個抗原決定簇的抗體稱為多克隆抗體，即傳統(tǒng)抗體（產(chǎn)量低、純度低、特異性差）克隆B淋巴細胞不具有無限增殖的能力，因此上述方案不可行。如何獲得既能無限增殖又能產(chǎn)生抗體的細胞？一個B淋巴細胞B淋巴細胞群單克隆抗體產(chǎn)生動物體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體的種類超過百萬種，但每一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體。因此，要想獲得大量的單一抗體，必須克隆單一的B淋巴細胞，形成細胞群。思考：如何制備單克隆抗體如何獲得既能無限增殖又能產(chǎn)生抗體的細胞？1975年，英國科學(xué)家米爾斯坦和德國科學(xué)家科勒設(shè)計實驗獲得了單克隆抗體，因此獲得1984年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。實驗：把一種B淋巴細胞與能在體外大量增殖的骨髓瘤細胞融合，所得到的融合細胞就可能大量增殖，產(chǎn)生足夠數(shù)量的特定抗體。二、單克隆抗體及其應(yīng)用2.單克隆抗體制備過程二、單克隆抗體及其應(yīng)用2.單克隆抗體制備過程二、單克隆抗體及其應(yīng)用2.單克隆抗體制備過程注射特定抗原免疫小鼠培養(yǎng)小鼠骨髓瘤細胞多種B淋巴細胞骨髓瘤細胞多種細胞多種雜交瘤細胞抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞注射小鼠腹腔內(nèi)增殖體外培養(yǎng)小鼠腹水細胞培養(yǎng)液單克隆抗體誘導(dǎo)融合篩選1①未融合的、②融合的具有同種核的、③融合的雜交瘤細胞選擇培養(yǎng)基篩選2克隆化培養(yǎng)抗體檢測既能大量增殖，又能產(chǎn)生抗體分泌的抗體能與特定的抗原結(jié)合2.單克隆抗體制備過程二、單克隆抗體及其應(yīng)用多種細胞篩選1篩選2原因目的方法原理誘導(dǎo)融合后得到多種雜交細胞，未融合的細胞、同種細胞融合后形成的細胞。篩選出雜交瘤細胞特定的選擇培養(yǎng)基進行篩選：未融合的細胞和同種細胞融合后形成的細胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞才能生長選擇培養(yǎng)由于特定抗原刺激產(chǎn)生多種B淋巴細胞，因此經(jīng)選擇培養(yǎng)獲得的雜交瘤細胞中有能產(chǎn)生其他抗體的細胞。篩選出能產(chǎn)生所需抗體（抗體檢測呈陽性）的雜交瘤細胞克隆化培養(yǎng)和抗體檢測，經(jīng)多次篩選用96孔板培養(yǎng)和篩選：在每一個孔中盡量只接種一個雜交瘤細胞，進行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測，經(jīng)多次篩選，得到足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的細胞抗原與抗體特異性結(jié)合1.篩選1特定的選擇培養(yǎng)基，如HAT選擇培養(yǎng)基含次黃嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T）單克隆抗體制備中2次篩選的方法(1)細胞中合成DNA的2條途徑①D途徑：從頭合成途徑核苷酸某些氨基酸+CO2+葉酸+五碳糖+磷酸DNA合成堿基②S途徑：補救合成途徑利用非堿基成分合成DNA的過程利用核苷酸降解產(chǎn)物合成DNA的過程堿基+五碳糖+磷酸核苷酸DNA骨髓瘤細胞缺乏途徑S相關(guān)的酶?！就卣?】(2)HAT選擇培養(yǎng)基篩選原理未融合的B淋巴細胞融合的B淋巴細胞未融合的骨髓瘤細胞融合的骨髓瘤細胞雜交瘤細胞只能存活幾天，不能無限增殖而死亡骨髓瘤細胞本身缺乏補救途徑中相關(guān)酶，從頭合成途徑被氨基蝶呤阻斷，無法增殖而死亡。骨髓瘤細胞從B細胞那里獲得補救途徑中相關(guān)的酶，可以利用HAT培養(yǎng)基中的次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷經(jīng)過補救途徑合成DNA，從而可以生存并增殖。H次黃嘌呤A氨基蝶呤T胸腺嘧啶核苷D途徑：從頭合成途徑S途徑：補救合成途徑阻斷提供原料雜交瘤細胞懸液96孔細胞培養(yǎng)板(克隆化培養(yǎng))稀釋加到抗體檢測選擇陽性克隆稀釋加到用96孔板培養(yǎng)和篩選

雜交瘤細胞（每一個孔中盡量只接種一個雜交瘤細胞）2.篩選2---克隆化培養(yǎng)和抗體檢測將處于對數(shù)生長期的雜交瘤細胞用培養(yǎng)液充分稀釋，使分配到96孔板每個孔中的細胞數(shù)不超過1，通過培養(yǎng)讓它增殖為單克隆。稀釋加到克隆化培養(yǎng)放大雜交瘤細胞一般培養(yǎng)4~5d后，如果在倒置顯微鏡下見到一簇緊密生長的細胞，可認為這是單一克隆。經(jīng)過一次克隆化培養(yǎng)的細胞不能保證其來自單個細胞，一般經(jīng)過3~4次培養(yǎng)才可以獲得穩(wěn)定的單克隆?？贵w檢測選擇陽性克隆重復(fù)以上操作不斷純化這時候，如果再次檢測抗體為陽性，就可以進行大規(guī)模生產(chǎn)了。資料1:用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的“早早孕診斷試劑盒”在妊娠第8天就可以做出診斷，這比原來的診斷方法提前了10d左右。單克隆抗體的應(yīng)用思考·討論在受精后不久，胎盤滋養(yǎng)層細胞就會分泌人絨毛膜促性腺激素(HCG)，一種糖蛋白類激素，在孕婦的尿液中大量存在。而在非妊娠婦女尿液中幾乎不含有。單克隆抗體【思考】正常的性成熟女性每個月都會排卵，最佳受精時間為排卵后24-36小時。在女性的月經(jīng)周期中，尿液中的促黃體生成素會在排卵前24小時左右出現(xiàn)高峰值。據(jù)此可推測，排卵試紙起核心作用的物質(zhì)是

?？勾冱S體生成素單克隆抗體排卵試紙資料2：使用高效的細胞毒素類藥物進行化療可以有效殺傷腫瘤細胞。ADC示意圖問題：細胞毒素沒有特異性，在殺傷腫瘤細胞的同時還會對健康細胞造成傷害。解決方法：抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)，將細胞毒素與能特異性識別腫瘤抗原的單克隆抗體結(jié)合，實現(xiàn)了對腫瘤細胞的選擇性殺傷?？贵w藥物接頭ADC的作用機制示意圖①ADC②③④溶酶體裂解釋放藥物⑤細胞凋亡抗體藥物接頭抗體-藥物偶聯(lián)物抗原ADC被細胞吞噬優(yōu)點：不損傷正常細胞用藥量小毒副作用小腫瘤細胞討論1.ADC的抗體和藥物各具有什么作用？①抗體主要發(fā)揮靶向運輸作用，即通過特異性結(jié)合靶細胞表面的抗原，將連接的藥物輸送到靶細胞。②藥物發(fā)揮治療效應(yīng)。如殺傷靶細胞。2.除了細胞毒素，還有哪些物質(zhì)理論上可以作為ADC偶聯(lián)的藥物？①用放射性同位素標(biāo)記單克隆抗體進行靶向放療。②一些作用于細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的藥物可以通過阻斷腫瘤細胞的信號通路來抑制其生長，理論上也可以將這些藥物與單克隆抗體結(jié)合進行治療。討論3.單克隆抗體診斷試劑盒和ADC在臨床上各具有什么優(yōu)勢？①單克隆抗體診斷試劑盒中的單克隆抗體只與特定的抗原反應(yīng)，因此檢測的特異性和靈敏度大大提高；②生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細胞可以傳代培養(yǎng)、冷凍保存和復(fù)蘇利用,有利于控制產(chǎn)品的質(zhì)量和標(biāo)準化生產(chǎn)診斷試劑盒。③ADC能夠協(xié)同發(fā)揮抗體特異性識別的靶向作用和細胞毒素對腫瘤細胞的殺傷作用，因此它在臨床上具有靶點清楚、毒副作用小等優(yōu)點。討論4.單克隆抗體在臨床上還有哪些應(yīng)用？①治療方面：用于腫瘤、自身免疫病等疾病的治療，如利妥昔單抗被用于治療復(fù)發(fā)難治的低分化B細胞淋巴瘤；曲妥珠單抗被用于治療乳腺癌等。②診斷方面：一些感染性疾病的檢測、腫瘤的診斷、激素和細胞因子的測定等。甲胎蛋白(AFP)是一種特異性較強的腫瘤標(biāo)志物，用甲胎蛋白作為

免疫小鼠，制備

，并與含有放射性同位素的標(biāo)記物連接，單克隆抗體攜帶放射性標(biāo)記物通過血液可到達全身幾乎所有組織。由于腫瘤細胞表面的

會和單克隆抗體特異性的結(jié)合，所以放射性同位素標(biāo)記物就不斷積累在

上。通過一定的顯影技術(shù)就可以發(fā)現(xiàn)腫瘤所在。抗原抗AFP單克隆抗體AFP腫瘤二、單克隆抗體及其應(yīng)用3.單克隆抗體的優(yōu)點(1)能準確識別抗原的細微差異，與特定抗原發(fā)生特異性結(jié)合。(特異性強，靈敏度高）(2)可大量制備。(1)運載藥物(2)作診斷試劑(3)治療疾病如將細胞毒素與能特異性識別腫瘤抗原的單克隆抗體結(jié)合(抗體—藥物偶聯(lián)物)，可選擇性殺傷腫瘤細胞。利用同位素或熒光標(biāo)記的單克隆抗體在特定組織中成像的技術(shù)，可定位診斷腫瘤、心血管畸形等疾病。2015年，全球銷售額排名前十位的藥物中，單克隆抗體藥物就有5種。同年，我國的單克隆抗體藥物市場規(guī)模已達72億元。4.單克隆抗體的應(yīng)用排名藥物中文名銷售額(億美元)適應(yīng)癥類型1Humria修美樂199.36自身免疫疾病單抗6Herceptin赫賽汀70.32乳腺癌等多種癌癥單抗7Avastin安維汀68.98結(jié)腸癌等多中癌癥單抗8Rituxan美羅華68.01白血病單抗9Opdivo納武單抗67.35多種腫瘤單抗2018年全球藥物銷售額排名前1