HPA與HIF-1α：非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)特征、機(jī)制及臨床啟示一、引言1.1研究背景與意義肺癌作為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均位居前列的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。其中，非小細(xì)胞肺癌（Non-SmallCellLungCancer，NSCLC）是肺癌的主要類型，約占所有肺癌病例的80%-85%。常見的NSCLC主要包括腺癌、鱗癌和大細(xì)胞癌等組織學(xué)類型。由于NSCLC起病隱匿，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，錯失了手術(shù)根治的最佳時機(jī)，預(yù)后往往較差。中晚期NSCLC患者即便經(jīng)過放療或化療，生存率通常較低，中位生存期僅為8-10個月，一年生存率約為30%-35%。盡管當(dāng)前綜合治療手段如手術(shù)、化療、放療、靶向治療及免疫治療等不斷發(fā)展，但NSCLC患者的總體5年生存率仍然較低，探索和研究影響非小細(xì)胞肺癌發(fā)生及發(fā)展的影響因素，開辟新的有效治療方法，提高治療效果、降低治療費(fèi)用，仍是亟待解決的重要研究課題。深入研究NSCLC的發(fā)病機(jī)制，尋找新的有效的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對于提高NSCLC患者的早期診斷率、改善預(yù)后具有重要意義。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，多種生物分子發(fā)揮著關(guān)鍵作用。乙酰肝素酶（Heparanase，HPA）是一種能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中硫酸乙酰肝素蛋白多糖的內(nèi)切酶。在正常生理狀態(tài)下，HPA的表達(dá)水平相對較低，主要參與維持細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)以及組織的正常發(fā)育和修復(fù)過程。然而，在多種腫瘤組織中，HPA的表達(dá)會發(fā)生顯著變化。大量研究表明，HPA在NSCLC組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，其表達(dá)與NSCLC的臨床分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在臨床分期較晚（III期和IV期）、腫瘤體積較大、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NSCLC患者中，HPA的陽性表達(dá)率顯著升高。HPA通過降解硫酸乙酰肝素，破壞細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的完整性，為腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件，同時還能促進(jìn)腫瘤血管生成和淋巴管生成，進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力。此外，HPA還可能參與腫瘤免疫逃逸，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞功能，抑制免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，從而幫助腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。低氧誘導(dǎo)因子-1α（HypoxiaInducibleFactor-1α，HIF-1α）是調(diào)節(jié)細(xì)胞氧合作用的主要轉(zhuǎn)錄因子，對腫瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)程產(chǎn)生了重要的作用。在正常情況下，HIF-1α表達(dá)受到氧分子的嚴(yán)格調(diào)節(jié)，常氧條件下，HIF-1α蛋白被迅速降解，表達(dá)水平維持在較低狀態(tài)；而低氧水平會導(dǎo)致HIF-1α的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)。腫瘤組織由于快速增殖、代謝旺盛以及血管生成相對不足等原因，常處于缺氧微環(huán)境，這使得HIF-1α在腫瘤細(xì)胞中大量表達(dá)。HIF-1α可調(diào)控一系列靶基因的表達(dá)，這些靶基因參與腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、血管生成、代謝重編程、侵襲轉(zhuǎn)移等多個生物學(xué)過程。研究表明，HIF-1α的表達(dá)水平與NSCLC的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，其高表達(dá)往往預(yù)示著患者預(yù)后不良。同時，HIF-1α還與其他多種生長因子表達(dá)和腫瘤血管生成密切相關(guān)，通過激活相關(guān)信號通路，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展和惡化。綜上所述，HPA和HIF-1α在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮著重要作用。然而，目前對于兩者在NSCLC組織中的表達(dá)情況及其與臨床病理特征之間的關(guān)系，以及它們在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制和相互關(guān)系，仍有待進(jìn)一步深入研究。本研究旨在探討HPA、HIF-1α在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)情況，分析其與患者臨床病理特征之間的關(guān)系，并探討兩者之間的相互關(guān)系，以期為NSCLC的早期診斷、病情評估、預(yù)后判斷以及靶向治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)，從而提高NSCLC患者的治療效果和生存率，改善患者的生活質(zhì)量。1.2研究目的本研究旨在深入探討HPA和HIF-1α在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)水平，分析其與患者臨床病理特征的關(guān)聯(lián)，明確二者在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制以及相互關(guān)系，為非小細(xì)胞肺癌的早期診斷、病情評估、預(yù)后判斷和靶向治療提供科學(xué)依據(jù)和新的潛在靶點(diǎn)，具體內(nèi)容如下：明確表達(dá)水平：運(yùn)用免疫組織化學(xué)、實(shí)時熒光定量PCR、蛋白免疫印跡等技術(shù)，精確檢測HPA和HIF-1α在非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)水平，比較二者在不同組織中的表達(dá)差異，明確其在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)特征。分析與臨床病理特征的關(guān)系：全面收集非小細(xì)胞肺癌患者的臨床病理資料，包括性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小、病理類型、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況等，深入分析HPA和HIF-1α的表達(dá)水平與這些臨床病理特征之間的相關(guān)性，評估其對非小細(xì)胞肺癌病情進(jìn)展和預(yù)后的影響。探討作用機(jī)制：通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)，研究HPA和HIF-1α對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲、血管生成等生物學(xué)行為的影響，深入探討它們在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，為尋找新的治療靶點(diǎn)提供理論支持。研究相互關(guān)系：探究HPA和HIF-1α在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)是否存在相互關(guān)聯(lián)，分析二者之間可能存在的相互作用機(jī)制，明確它們在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的協(xié)同或拮抗關(guān)系，為綜合治療非小細(xì)胞肺癌提供新的思路。二、非小細(xì)胞肺癌概述2.1定義與分類非小細(xì)胞肺癌（Non-SmallCellLungCancer，NSCLC）是指除小細(xì)胞肺癌以外的所有肺上皮癌，約占所有肺癌病例的80%-85%。作為肺癌中最常見的類型，NSCLC涵蓋多種組織學(xué)亞型，各亞型在細(xì)胞形態(tài)、生物學(xué)行為、治療反應(yīng)及預(yù)后等方面均存在一定差異。常見的NSCLC主要包括腺癌、鱗癌和大細(xì)胞癌等。腺癌是NSCLC中最為常見的類型，在肺癌中的占比呈逐漸上升趨勢，尤其在不吸煙人群和女性患者中更為常見。腺癌通常起源于支氣管黏液腺，可發(fā)生于細(xì)小支氣管或中央氣道，多位于肺的外周部位。其病理特征多樣，根據(jù)國際肺癌研究協(xié)會（IASLC）、美國胸科學(xué)會（ATS）和歐洲呼吸學(xué)會（ERS）聯(lián)合發(fā)布的肺腺癌多學(xué)科分類標(biāo)準(zhǔn)，腺癌主要分為原位腺癌（AIS）、微浸潤性腺癌（MIA）和浸潤性腺癌（IAC）。原位腺癌通常為直徑≤3cm的局限性小腺癌，癌細(xì)胞沿肺泡壁呈鱗屑樣生長，無間質(zhì)、血管或胸膜侵犯；微浸潤性腺癌同樣直徑≤3cm，浸潤間質(zhì)最大直徑≤5mm，且無脈管和胸膜侵犯；浸潤性腺癌則浸潤間質(zhì)最大直徑＞5mm，包括貼壁樣生長為主型、腺泡為主型、乳頭狀為主型、微乳頭為主型和實(shí)性癌伴黏液形成型等多種生長方式。由于腺癌富含血管，早期易發(fā)生局部浸潤和血行轉(zhuǎn)移，常見的轉(zhuǎn)移部位包括腦、骨、肝等遠(yuǎn)處器官。鱗癌，即鱗狀上皮細(xì)胞癌，多起源于段或亞段的支氣管黏膜，常向管腔內(nèi)生長，易引起支氣管狹窄，導(dǎo)致肺不張或阻塞性肺炎。鱗癌多見于老年男性，與吸煙密切相關(guān)。其癌細(xì)胞具有角化和（或）細(xì)胞間橋等特征，根據(jù)分化程度可分為高分化、中分化和低分化鱗癌。高分化鱗癌癌巢中可見角化珠形成，細(xì)胞間橋明顯；中分化鱗癌角化珠少見，細(xì)胞間橋不明顯；低分化鱗癌則無角化珠和細(xì)胞間橋。鱗癌一般生長相對緩慢，轉(zhuǎn)移發(fā)生較晚，手術(shù)切除機(jī)會相對較多，5年生存率相對較高，但對化療和放療的敏感性不如小細(xì)胞肺癌。大細(xì)胞癌是一種未分化的非小細(xì)胞癌，較為少見，占肺癌的10％以下。其癌細(xì)胞體積大，胞漿豐富，核仁明顯，核分裂象多見，但在細(xì)胞學(xué)和組織結(jié)構(gòu)及免疫表型等方面缺乏小細(xì)胞癌、腺癌或鱗癌的特征。大細(xì)胞癌多發(fā)生于肺的周邊部位，轉(zhuǎn)移相對較晚，手術(shù)切除機(jī)會較大，但總體預(yù)后仍較差。此外，NSCLC還包括一些少見類型，如腺鱗癌、肉瘤樣癌、淋巴上皮瘤樣癌、腺樣囊性癌等。腺鱗癌是指在同一腫瘤中同時存在腺癌和鱗癌兩種成分；肉瘤樣癌是一組含有肉瘤或肉瘤樣分化的非小細(xì)胞肺癌，包括多形性癌、梭形細(xì)胞癌、巨細(xì)胞癌、癌肉瘤和肺母細(xì)胞瘤等；淋巴上皮瘤樣癌與EB病毒感染密切相關(guān)，在形態(tài)學(xué)和免疫表型上與鼻咽部的淋巴上皮瘤相似；腺樣囊性癌則具有獨(dú)特的組織學(xué)形態(tài)和生物學(xué)行為。這些少見類型的NSCLC在臨床特征、治療方法和預(yù)后等方面與常見類型有所不同，需要臨床醫(yī)生給予特別關(guān)注。2.2流行病學(xué)現(xiàn)狀肺癌作為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均位居前列的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2020年全球肺癌新發(fā)病例數(shù)約為220萬例，占所有癌癥新發(fā)病例的11.4%，位居癌癥發(fā)病率首位；肺癌死亡病例數(shù)約為180萬例，占所有癌癥死亡病例的18.0%，在癌癥死亡率中同樣排名第一。從性別分布來看，男性肺癌發(fā)病率和死亡率均高于女性，男性肺癌新發(fā)病例數(shù)約為142萬例，占男性所有癌癥新發(fā)病例的14.7%；女性肺癌新發(fā)病例數(shù)約為78萬例，占女性所有癌癥新發(fā)病例的8.4%。在全球范圍內(nèi)，肺癌的發(fā)病率和死亡率存在明顯的地域差異。在歐美等發(fā)達(dá)國家，由于長期的工業(yè)化進(jìn)程和較高的吸煙率，肺癌的發(fā)病率一直居高不下；而在一些發(fā)展中國家，隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和生活方式的改變，肺癌的發(fā)病率也呈現(xiàn)出迅速上升的趨勢。非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）作為肺癌的主要類型，約占所有肺癌病例的80%-85%。近年來，盡管在肺癌的診斷和治療方面取得了一定的進(jìn)展，但NSCLC患者的總體生存率仍然較低，5年生存率僅為15%-20%左右。中國是肺癌高發(fā)國家，2022年中國癌癥新發(fā)病例數(shù)為482.47萬，其中肺癌新發(fā)病例達(dá)106.06萬，發(fā)病率位居首位；同年癌癥死亡總?cè)藬?shù)為257.42萬，肺癌死亡人數(shù)高達(dá)73.33萬，亦居首位。在中國肺癌患者中，NSCLC的占比高達(dá)90.34%。隨著中國人口老齡化的加劇、環(huán)境污染的加重以及吸煙人數(shù)的居高不下，NSCLC的發(fā)病率和死亡率預(yù)計(jì)將繼續(xù)上升，給社會和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。從組織學(xué)類型來看，肺腺癌在NSCLC中的比例呈逐漸上升趨勢，已超過鱗癌成為最常見的亞型。在20世紀(jì)70年代，鱗癌曾是NSCLC中最主要的類型，但隨著時間的推移，腺癌的發(fā)病率逐漸增加，在一些地區(qū)，腺癌在NSCLC中的占比已超過50%。肺腺癌比例的上升可能與多種因素有關(guān)，包括吸煙模式的改變、環(huán)境因素以及診斷技術(shù)的進(jìn)步等。與鱗癌相比，腺癌更容易發(fā)生于不吸煙人群和女性患者，且腺癌具有獨(dú)特的分子生物學(xué)特征，如表皮生長因子受體（EGFR）、間變性淋巴瘤激酶（ALK）等基因突變的發(fā)生率較高，這些基因突變與腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，也為腺癌的靶向治療提供了理論基礎(chǔ)。此外，NSCLC的發(fā)病率和死亡率還與年齡、吸煙史、職業(yè)暴露、家族遺傳等因素密切相關(guān)。年齡是NSCLC的重要危險(xiǎn)因素之一，隨著年齡的增長，NSCLC的發(fā)病率顯著增加，大多數(shù)NSCLC患者確診時年齡在60歲以上。吸煙是NSCLC的首要危險(xiǎn)因素，長期大量吸煙可使患NSCLC的風(fēng)險(xiǎn)增加數(shù)倍甚至數(shù)十倍，吸煙量越大、吸煙時間越長，發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)越高。被動吸煙同樣會增加患NSCLC的風(fēng)險(xiǎn)，對非吸煙者的健康造成嚴(yán)重威脅。職業(yè)暴露于某些有害物質(zhì)，如石棉、氡、鉻、鎳、多環(huán)芳烴等，也會顯著增加NSCLC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。有肺癌家族史的人群，患NSCLC的風(fēng)險(xiǎn)比普通人群高出數(shù)倍，提示遺傳因素在NSCLC的發(fā)生中可能起著重要作用。2.3治療現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)目前，非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的治療手段包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療及免疫治療等，臨床多采取多學(xué)科綜合治療模式，根據(jù)患者的機(jī)體狀況、病理學(xué)類型、臨床分期等因素制定個性化的治療方案。手術(shù)治療是早期NSCLC患者的主要治療方法，其目的是徹底切除肺部原發(fā)癌腫病灶和局部淋巴組織，并盡可能保留最大量的健康肺組織。對于IA和IB期NSCLC病人，手術(shù)是首選治療方式，主張采用肺葉切除，次肺葉切除（楔形切除，肺段切除）只適用于肺功能不全患者。II期NSCLC的病變范圍頗為不一，包括T1～2N1或T3N0，N1淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可采用袖式肺葉切除或全肺切除術(shù)式，更推薦袖式肺葉切除。ⅢA期NSCLC開胸術(shù)中若發(fā)現(xiàn)單一區(qū)域縱隔淋巴結(jié)存在轉(zhuǎn)移性病變，技術(shù)上能夠?qū)⒘馨徒Y(jié)和原發(fā)腫瘤完全切除時，則按計(jì)劃行肺切除以及縱隔淋巴結(jié)切除。然而，由于NSCLC起病隱匿，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，錯失了手術(shù)根治的最佳時機(jī)。對于局部晚期或晚期NSCLC患者，手術(shù)切除往往難以徹底清除腫瘤，且術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)較高。化療是NSCLC綜合治療的重要組成部分，主要用于晚期NSCLC患者的姑息治療、術(shù)后輔助治療以及無法手術(shù)切除患者的新輔助治療。鉑類聯(lián)合其他化療藥物是治療IIIb期、IV期NSCLC的一線治療方案，但接受一線化療的NSCLC患者的客觀緩解率大約只有20%，總生存時間(OS)只有8-10個月，二線化療藥物紫杉醇和培美曲塞的客觀緩解率更是僅僅8%-9%，總生存不足3個月?；熕幬镌跉[瘤細(xì)胞的同時，也會對正常細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致一系列不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。放療是利用放射線殺死腫瘤細(xì)胞的一種局部治療手段，適用于不能手術(shù)切除的局部晚期NSCLC患者，以及術(shù)后輔助放療和晚期NSCLC患者的姑息放療。單純常規(guī)分割放射治療的效果很不理想，晚期非小細(xì)胞肺癌常規(guī)放療的5年生存率為3％～10％，中位生存時間為6～11個月。近年來，隨著放療技術(shù)的不斷進(jìn)步，如立體定向放療（SBRT）、調(diào)強(qiáng)放療（IMRT）等，放療的精度和療效得到了顯著提高，但放療仍然存在放射性肺炎、放射性食管炎等不良反應(yīng)，限制了其臨床應(yīng)用。靶向治療是針對腫瘤細(xì)胞中特定的分子靶點(diǎn)進(jìn)行治療的一種方法，具有選擇性好、療效明確、安全性好等優(yōu)點(diǎn)。目前，針對NSCLC的靶向治療主要包括表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑（TKI）、間變性淋巴瘤激酶（ALK）抑制劑、ROS1抑制劑等。存在EGFR突變的患者接受靶向藥物治療后，一半患者生存時間可超過35.5個月，近七成突變患者接受靶向治療后腫瘤出現(xiàn)不同程度的緩解，顯著改善生活質(zhì)量，并延長12.6個月生活質(zhì)量維持時間。然而，靶向治療也面臨著耐藥的問題，大多數(shù)患者在接受靶向治療一段時間后會出現(xiàn)耐藥，導(dǎo)致疾病進(jìn)展。免疫治療是通過激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)來攻擊腫瘤細(xì)胞的一種治療方法，近年來在NSCLC的治療中取得了顯著進(jìn)展。免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICIs）如程序性死亡受體1（PD-1）及其配體（PD-L1）抑制劑等，已成為晚期NSCLC患者的重要治療選擇。ICIs可以阻斷腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的免疫逃逸機(jī)制，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的識別和殺傷能力。但并非所有患者都能從免疫治療中獲益，且免疫治療也可能會引起一系列免疫相關(guān)不良反應(yīng)，如免疫性肺炎、免疫性腸炎、免疫性甲狀腺炎等。綜上所述，盡管當(dāng)前NSCLC的治療取得了一定的進(jìn)展，但仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)，如復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、耐藥、不良反應(yīng)等。因此，深入研究NSCLC的發(fā)病機(jī)制，尋找新的有效的治療靶點(diǎn)和治療方法，提高治療效果、降低治療費(fèi)用，仍是亟待解決的重要研究課題。三、HPA和HIF-1α的生物學(xué)特性3.1HPA的生物學(xué)特性3.1.1HPA的結(jié)構(gòu)與功能乙酰肝素酶（Heparanase，HPA），又稱硫酸乙酰肝素內(nèi)切糖苷酶，是一種由HPSE基因編碼的內(nèi)切糖苷酶，在人體中，HPSE基因定位于4號染色體長臂（4q21.3）。HPA蛋白前體由543個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量約為61kD。在翻譯后加工過程中，HPA前體蛋白首先被切割成一個重鏈（N端，40kD）和一個輕鏈（C端，20kD），這兩個鏈通過二硫鍵連接形成具有催化活性的異二聚體結(jié)構(gòu)。重鏈包含N末端結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域，其中催化結(jié)構(gòu)域含有兩個關(guān)鍵的酸性氨基酸殘基（Glu75和Glu132），它們在催化硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）的降解過程中發(fā)揮著重要作用。輕鏈則主要參與維持HPA的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和調(diào)節(jié)其酶活性。HPA的主要功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和基底膜（BM）中的HSPG。HSPG是一種廣泛存在于細(xì)胞表面和ECM中的大分子糖蛋白，由核心蛋白和共價連接的硫酸乙酰肝素（HS）側(cè)鏈組成。HS側(cè)鏈通過與多種生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子等生物活性分子結(jié)合，參與細(xì)胞的增殖、分化、遷移、黏附以及血管生成等多種生物學(xué)過程。HPA能夠特異性地識別并切割HS側(cè)鏈中的β-D-葡萄糖醛酸-(1→4)-N-乙?；?D-葡萄糖胺糖苷鍵，將長鏈的HS降解為較小的寡糖片段。這種降解作用不僅破壞了ECM和BM的完整性，為腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件；還能釋放出與HS結(jié)合的生物活性分子，使其能夠與細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，激活下游信號通路，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。例如，HPA降解HS后釋放的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）可以與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGF受體結(jié)合，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，從而促進(jìn)腫瘤血管生成。此外，HPA還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞與ECM之間的相互作用，影響細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動能力，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。3.1.2在正常生理狀態(tài)下的作用在正常生理狀態(tài)下，HPA的表達(dá)水平相對較低，主要在胎盤、小腸、腎臟等組織中呈低水平表達(dá)，發(fā)揮著維持細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)、參與組織發(fā)育和修復(fù)等重要作用。在胚胎發(fā)育過程中，HPA參與了細(xì)胞的遷移、分化和組織器官的形成。例如，在神經(jīng)管形成過程中，神經(jīng)嵴細(xì)胞需要遷移到特定的位置才能分化為各種神經(jīng)細(xì)胞和組織。研究表明，HPA在神經(jīng)嵴細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，通過降解ECM中的HSPG，為神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移提供了空間和信號，促進(jìn)了神經(jīng)管的正常發(fā)育。此外，HPA還參與了心血管系統(tǒng)的發(fā)育，在血管生成過程中，HPA通過調(diào)節(jié)VEGF等生長因子的釋放和活性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，有助于新血管的形成。在組織修復(fù)和再生過程中，HPA同樣發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)組織受到損傷時，炎癥細(xì)胞會迅速聚集到損傷部位，釋放多種細(xì)胞因子和趨化因子，誘導(dǎo)HPA的表達(dá)上調(diào)。HPA通過降解受損組織中的ECM，清除壞死組織和細(xì)胞碎片，為組織修復(fù)提供了良好的微環(huán)境。同時，HPA還可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和遷移，使其能夠合成和分泌新的ECM成分，加速組織的修復(fù)和再生。例如，在皮膚傷口愈合過程中，HPA在傷口邊緣的角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中表達(dá)增加，通過降解ECM中的HSPG，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移和增殖，加速傷口的上皮化過程；同時，HPA還可以刺激成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白等ECM成分，促進(jìn)傷口的收縮和愈合。此外，HPA在免疫調(diào)節(jié)過程中也具有一定的作用。研究發(fā)現(xiàn)，HPA可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的遷移和活化，影響免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和方向。例如，HPA可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞向炎癥部位的遷移，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力。然而，在某些病理情況下，HPA的過度表達(dá)可能會導(dǎo)致免疫細(xì)胞的異常活化和炎癥反應(yīng)的失控，從而引發(fā)自身免疫性疾病等病理過程。3.2HIF-1α的生物學(xué)特性3.2.1HIF-1α的結(jié)構(gòu)與功能低氧誘導(dǎo)因子-1α（HypoxiaInducibleFactor-1α，HIF-1α）是一種在細(xì)胞氧合作用調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子。HIF-1α基因定位于人類染色體14q21-24區(qū)域，其編碼的蛋白質(zhì)由826個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量約為120kD。HIF-1α蛋白包含多個功能結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，使其能夠在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮多種生物學(xué)功能。在HIF-1α的N端，存在基本螺旋-環(huán)-螺旋（basichelix-loop-helix，bHLH）結(jié)構(gòu)域以及緊隨其后的PAS（Per-ARNT-Sim）結(jié)構(gòu)域。bHLH結(jié)構(gòu)域由約60個氨基酸殘基組成，包含兩個α-螺旋，中間通過一個環(huán)區(qū)相連，該結(jié)構(gòu)域能夠與DNA序列中的特定元件結(jié)合，從而啟動基因轉(zhuǎn)錄過程。PAS結(jié)構(gòu)域則由約200個氨基酸殘基組成，包含兩個保守的重復(fù)序列，它在介導(dǎo)HIF-1α與其他蛋白質(zhì)之間的相互作用以及調(diào)節(jié)HIF-1α的穩(wěn)定性和活性方面發(fā)揮著重要作用。具體來說，bHLH和PAS結(jié)構(gòu)域共同介導(dǎo)了HIF-1α與HIF-1β亞基的異源二聚體形成，這種二聚體化對于HIF-1α發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性至關(guān)重要。同時，它們還負(fù)責(zé)與DNA的缺氧反應(yīng)元件（hypoxiaresponseelements，HRE）結(jié)合，HRE是一段位于靶基因啟動子區(qū)域的特定核苷酸序列，其核心序列通常為5'-RCGTG-3'（R代表嘌呤）。當(dāng)HIF-1α與HIF-1β形成的異二聚體結(jié)合到HRE上時，能夠招募轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物中的其他成分，從而啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄過程。HIF-1α的C端含有兩個反式激活域（trans-activationdomains，TAD），分別為N-TAD（N-terminaltrans-activationdomain）和C-TAD（C-terminaltrans-activationdomain）。N-TAD位于氨基酸殘基531-575之間，C-TAD位于氨基酸殘基786-826之間。這些反式激活域能夠與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物中的多種轉(zhuǎn)錄因子和輔助因子相互作用，促進(jìn)RNA聚合酶II與靶基因啟動子區(qū)域的結(jié)合，從而增強(qiáng)靶基因的轉(zhuǎn)錄活性。例如，C-TAD可以與p300/CBP（CREB-bindingprotein）等共激活因子結(jié)合，p300/CBP具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，能夠通過對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的修飾，使基因轉(zhuǎn)錄更加容易發(fā)生。此外，HIF-1α的C-TAD還可以與其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子相互作用，進(jìn)一步調(diào)控靶基因的表達(dá)。在HIF-1α的C-TAD與N-TAD之間，存在一段由576～785位氨基酸殘基組成的抑制結(jié)構(gòu)域。在常氧條件下，該抑制結(jié)構(gòu)域能夠降低TAD的活性，使得HIF-1α的轉(zhuǎn)錄激活功能受到抑制。而在低氧條件下，該抑制結(jié)構(gòu)域的作用被解除，從而使HIF-1α能夠充分發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄激活功能。此外，HIF-1α還包含兩個核定位信號（nuclearlocalizationsignal，NLS），分別為N-端核定位信號和C-端核定位信號。其中，C-NLS在HIF-1α的核定位過程中發(fā)揮著更為重要的作用。在低氧條件下，HIF-1α的核定位信號被激活，使其能夠從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，與HIF-1β結(jié)合形成異二聚體，并進(jìn)一步結(jié)合到靶基因的HRE上，啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄。作為一種轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1α在調(diào)節(jié)細(xì)胞氧合作用中發(fā)揮著核心功能。在正常氧含量的生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)的氧分子充足，HIF-1α的表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控，其蛋白水平維持在較低狀態(tài)。這是因?yàn)樵诔Ｑ鯒l件下，HIF-1α的氧依賴降解區(qū)（oxygen-dependentdegradationdomain，ODD）中的脯氨酸殘基會被脯氨酰羥化酶（prolylhydroxylasedomainenzymes，PHDs）羥基化修飾。羥基化后的脯氨酸殘基能夠被腫瘤抑制蛋白vonHippel-Lindau（pVHL）識別并結(jié)合，進(jìn)而招募泛素連接酶，使HIF-1α發(fā)生泛素化修飾。泛素化修飾后的HIF-1α被26S蛋白酶體識別并降解，從而維持細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的低水平表達(dá)。然而，當(dāng)細(xì)胞處于低氧環(huán)境時，由于氧分子供應(yīng)不足，PHDs的活性受到抑制，無法對HIF-1α的ODD區(qū)脯氨酸殘基進(jìn)行羥基化修飾。這使得HIF-1α逃脫了pVHL介導(dǎo)的泛素化降解途徑，其蛋白穩(wěn)定性顯著增加，在細(xì)胞內(nèi)逐漸積累。隨后，積累的HIF-1α轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與組成型表達(dá)的HIF-1β亞基結(jié)合形成具有活性的異二聚體。該異二聚體能夠特異性地識別并結(jié)合到一系列靶基因啟動子區(qū)域的HRE上，招募轉(zhuǎn)錄相關(guān)的輔助因子，啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄過程。這些靶基因編碼的產(chǎn)物廣泛參與細(xì)胞的多種生物學(xué)過程，包括但不限于能量代謝、血管生成、紅細(xì)胞生成、細(xì)胞增殖與存活、侵襲轉(zhuǎn)移等，從而使細(xì)胞能夠適應(yīng)低氧環(huán)境并維持其正常的生理功能。例如，HIF-1α可以上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）的表達(dá)，促進(jìn)血管生成，增加氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)；還可以調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（glucosetransporter1，GLUT1）和己糖激酶2（hexokinase2，HK2）等基因的表達(dá)，改變細(xì)胞的代謝方式，增強(qiáng)細(xì)胞在低氧條件下的能量獲取能力。3.2.2低氧對HIF-1α的調(diào)控機(jī)制低氧環(huán)境是誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)和激活的關(guān)鍵因素，其對HIF-1α的調(diào)控涉及多個層面的復(fù)雜機(jī)制，主要包括對HIF-1α穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)。在低氧條件下，HIF-1α穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)，這是低氧調(diào)控HIF-1α的重要機(jī)制之一。常氧狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)存在一種依賴氧氣的脯氨酰羥化酶（prolylhydroxylasedomainenzymes，PHDs），它能夠利用氧氣作為底物，將HIF-1α氧依賴降解區(qū)（oxygen-dependentdegradationdomain，ODD）中的特定脯氨酸殘基（Pro402和Pro564）羥基化。羥基化修飾后的HIF-1α能夠被腫瘤抑制蛋白vonHippel-Lindau（pVHL）特異性識別并結(jié)合。pVHL作為E3泛素連接酶復(fù)合物的核心成分，能夠招募E2泛素結(jié)合酶，將泛素分子連接到HIF-1α上。泛素化修飾后的HIF-1α被26S蛋白酶體識別并降解，從而維持細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的低水平表達(dá)。然而，當(dāng)細(xì)胞處于低氧環(huán)境時，由于氧氣供應(yīng)不足，PHDs的活性受到抑制，無法對HIF-1α的脯氨酸殘基進(jìn)行羥基化修飾。這使得HIF-1α無法被pVHL識別和結(jié)合，從而逃脫了泛素化降解途徑，其蛋白穩(wěn)定性顯著增加，在細(xì)胞內(nèi)逐漸積累。例如，研究表明，在缺氧條件下培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中，HIF-1α蛋白的半衰期明顯延長，從常氧狀態(tài)下的幾分鐘延長至數(shù)小時，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白水平顯著升高。除了對穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)，低氧還能夠增強(qiáng)HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性。在低氧環(huán)境中，HIF-1α的天冬酰胺殘基（Asn803）會發(fā)生去羥基化修飾。該修飾過程由因子抑制HIF-1（factorinhibitingHIF-1，F(xiàn)IH）介導(dǎo)，在常氧條件下，F(xiàn)IH具有活性，能夠?qū)IF-1α的Asn803羥基化，抑制HIF-1α與共激活因子p300/CBP的結(jié)合，從而降低HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性。而在低氧狀態(tài)下，F(xiàn)IH的活性受到抑制，HIF-1α的Asn803去羥基化，使得HIF-1α能夠與p300/CBP高效結(jié)合。p300/CBP具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，它與HIF-1α結(jié)合后，能夠通過對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的修飾，使基因轉(zhuǎn)錄更加容易發(fā)生。具體來說，p300/CBP可以將組蛋白的賴氨酸殘基乙?；?，改變?nèi)旧|(zhì)的構(gòu)象，使DNA更容易被轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶識別和結(jié)合，從而增強(qiáng)HIF-1α對靶基因的轉(zhuǎn)錄激活作用。此外，低氧還可以通過激活多種信號通路，如磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路等，對HIF-1α進(jìn)行磷酸化修飾。磷酸化修飾后的HIF-1α能夠與其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子相互作用，進(jìn)一步增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性。研究發(fā)現(xiàn)，在低氧誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞中，PI3K/Akt信號通路被激活，Akt可以直接磷酸化HIF-1α的特定絲氨酸殘基，促進(jìn)HIF-1α的核轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而上調(diào)VEGF等靶基因的表達(dá)。HIF-1α在低氧條件下能夠誘導(dǎo)一系列相關(guān)基因的表達(dá)，這些基因在細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。HIF-1α調(diào)控的靶基因涉及多個生物學(xué)過程。在能量代謝方面，HIF-1α可以上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT1）和己糖激酶2（HK2）等基因的表達(dá)。GLUT1負(fù)責(zé)將細(xì)胞外的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，HK2則參與葡萄糖的磷酸化過程，促進(jìn)糖酵解的進(jìn)行。通過上調(diào)這些基因的表達(dá)，細(xì)胞能夠增加葡萄糖的攝取和利用，以滿足低氧條件下的能量需求。在血管生成方面，HIF-1α可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及其受體（VEGFR）基因的表達(dá)。VEGF是一種強(qiáng)效的促血管生成因子，它能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，促進(jìn)新血管的生成。在低氧環(huán)境下，腫瘤細(xì)胞通過高表達(dá)VEGF，促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，同時也為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供了通道。在紅細(xì)胞生成方面，HIF-1α能夠調(diào)節(jié)促紅細(xì)胞生成素（EPO）基因的表達(dá)。EPO是一種主要由腎臟產(chǎn)生的糖蛋白激素，它可以刺激骨髓中的造血干細(xì)胞增殖和分化為紅細(xì)胞，增加紅細(xì)胞的數(shù)量，提高血液的攜氧能力。在低氧條件下，HIF-1α誘導(dǎo)EPO的表達(dá)上調(diào)，有助于維持機(jī)體的氧平衡。此外，HIF-1α還可以調(diào)控與細(xì)胞增殖、存活、侵襲轉(zhuǎn)移等相關(guān)的基因表達(dá)。例如，HIF-1α可以上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2家族成員的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活；還可以調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等基因的表達(dá)，降解細(xì)胞外基質(zhì)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。四、HPA和HIF-1α在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)研究4.1研究方法4.1.1樣本采集本研究收集[具體時間段]于[醫(yī)院名稱]胸外科行手術(shù)切除的非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本[X]例，同時選取距離腫瘤邊緣[X]cm以上的癌旁正常肺組織標(biāo)本[X]例作為對照。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，HE染色后經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為非小細(xì)胞肺癌及癌旁正常組織。納入標(biāo)準(zhǔn)為：患者術(shù)前均未接受化療、放療及其他抗腫瘤治療；患者的臨床病理資料完整，包括性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小、病理類型、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況等；患者簽署了知情同意書，自愿參與本研究。在樣本采集過程中，嚴(yán)格遵循無菌操作原則，確保標(biāo)本不受污染。對于手術(shù)切除的腫瘤組織和癌旁正常組織，迅速用生理鹽水沖洗，去除血液和雜質(zhì)，然后將其放入預(yù)先準(zhǔn)備好的含有10%中性甲醛的標(biāo)本瓶中，固定時間為[X]小時，以保證組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整，便于后續(xù)的檢測分析。4.1.2檢測技術(shù)免疫組化（Immunohistochemistry，IHC）：免疫組化是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對其進(jìn)行定位、定性及相對定量的研究。操作步驟如下：首先，將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，用3%過氧化氫溶液室溫孵育10-15分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；然后，將切片放入枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）中，進(jìn)行抗原修復(fù)，可采用微波修復(fù)或高壓修復(fù)的方法；冷卻后，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育15-20分鐘，以減少非特異性染色；接著，分別滴加兔抗人HPA多克隆抗體和兔抗人HIF-1α多克隆抗體（按照抗體說明書稀釋至合適濃度），4℃孵育過夜；次日，取出切片，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，每次5分鐘，滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育15-20分鐘；再次用PBS沖洗后，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15-20分鐘；最后，用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。結(jié)果判定：HPA和HIF-1α陽性染色均定位于細(xì)胞核和/或細(xì)胞質(zhì)，以胞核和/或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。采用半定量積分法對染色結(jié)果進(jìn)行分析，根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行評分。陽性細(xì)胞百分比評分：陽性細(xì)胞數(shù)＜5%為0分，5%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，＞75%為4分；染色強(qiáng)度評分：無顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩者得分相乘，0分為陰性（-），1-4分為弱陽性（+），5-8分為陽性（++），9-12分為強(qiáng)陽性（+++）。實(shí)時熒光定量PCR（Real-TimeFluorescenceQuantitativePCR，qRT-PCR）：實(shí)時熒光定量PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。操作步驟如下：首先，采用Trizol試劑提取非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁正常組織中的總RNA，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取過程中注意避免RNA酶的污染；然后，用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間；接著，以提取的總RNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件按照試劑盒說明書進(jìn)行設(shè)置；隨后，以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增。HPA和HIF-1α的引物序列根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的基因序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)，并由專業(yè)生物公司合成。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenPCRMasterMix和ddH?O，總體積為20μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒，在退火階段收集熒光信號；最后，采用2?ΔΔCt法計(jì)算HPA和HIF-1αmRNA的相對表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參基因。蛋白免疫印跡（WesternBlot，WB）：蛋白免疫印跡是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測的方法。操作步驟如下：首先，將非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁正常組織剪碎，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上勻漿裂解30分鐘，然后4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液作為總蛋白樣品；接著，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書操作，以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中蛋白的濃度；將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性；然后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠，將蛋白樣品加入上樣孔中，同時加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，在恒壓條件下進(jìn)行電泳，使蛋白分離；電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為：恒流300mA，轉(zhuǎn)膜時間根據(jù)蛋白分子量大小調(diào)整，一般為1-2小時；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉封閉液中，室溫封閉1-2小時，以減少非特異性結(jié)合；封閉后，將膜放入兔抗人HPA多克隆抗體和兔抗人HIF-1α多克隆抗體（按照抗體說明書稀釋至合適濃度）中，4℃孵育過夜；次日，取出膜，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10分鐘，然后放入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（按照抗體說明書稀釋至合適濃度）中，室溫孵育1-2小時；再次用TBST緩沖液沖洗后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光顯影，分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計(jì)算HPA和HIF-1α蛋白的相對表達(dá)量。4.2研究結(jié)果4.2.1HPA在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)情況通過免疫組化、實(shí)時熒光定量PCR和蛋白免疫印跡等檢測技術(shù)，對非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁正常組織中的HPA表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。免疫組化結(jié)果顯示，HPA陽性染色主要定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，在非小細(xì)胞肺癌組織中的陽性表達(dá)率為[X]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]），而在癌旁正常組織中的陽性表達(dá)率僅為[X]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]），兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在非小細(xì)胞肺癌組織中，HPA的陽性表達(dá)表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒，且在腫瘤細(xì)胞的侵襲前沿區(qū)域表達(dá)更為顯著；而在癌旁正常組織中，僅有少數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)弱陽性表達(dá)或無表達(dá)。實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，非小細(xì)胞肺癌組織中HPAmRNA的相對表達(dá)量為[X]，顯著高于癌旁正常組織的[X]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。蛋白免疫印跡結(jié)果也顯示，非小細(xì)胞肺癌組織中HPA蛋白的相對表達(dá)量為[X]，明顯高于癌旁正常組織的[X]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步分析HPA表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HPA的表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05）。在腫瘤直徑≥5cm的患者中，HPA的陽性表達(dá)率為[X]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]），顯著高于腫瘤直徑<5cm患者的[X]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]）；在TNM分期為III-IV期的患者中，HPA的陽性表達(dá)率為[X]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]），明顯高于I-II期患者的[X]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]）；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，HPA的陽性表達(dá)率為[X]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]），顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的[X]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]）；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中，HPA的陽性表達(dá)率為[X]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]），明顯高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的[X]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]）。而HPA的表達(dá)與患者的性別、年齡、吸煙史、病理類型及分化程度無明顯相關(guān)性（P>0.05）。4.2.2HIF-1α在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)情況同樣運(yùn)用免疫組化、實(shí)時熒光定量PCR和蛋白免疫印跡技術(shù)檢測HIF-1α在非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)水平。免疫組化結(jié)果顯示，HIF-1α陽性染色主要定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，在非小細(xì)胞肺癌組織中的陽性表達(dá)率為[X]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]），顯著高于癌旁正常組織的[X]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在非小細(xì)胞肺癌組織中，可見細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒的陽性細(xì)胞，且在腫瘤組織的缺氧區(qū)域，如腫瘤中心壞死灶周圍，HIF-1α的陽性表達(dá)更為明顯；而在癌旁正常組織中，陽性細(xì)胞較少，多數(shù)細(xì)胞呈陰性表達(dá)。實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果表明，非小細(xì)胞肺癌組織中HIF-1αmRNA的相對表達(dá)量為[X]，顯著高于癌旁正常組織的[X]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌組織中HIF-1α蛋白的相對表達(dá)量為[X]，明顯高于癌旁正常組織的[X]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。分析HIF-1α表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)HIF-1α的表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05）。在TNM分期為III-IV期的患者中，HIF-1α的陽性表達(dá)率為[X]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]），顯著高于I-II期患者的[X]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]）；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，HIF-1α的陽性表達(dá)率為[X]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]），明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的[X]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]）；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中，HIF-1α的陽性表達(dá)率為[X]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]），顯著高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的[X]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]）。而HIF-1α的表達(dá)與患者的性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小、病理類型及分化程度無明顯相關(guān)性（P>0.05）。4.2.3HPA和HIF-1α表達(dá)的相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析方法，對HPA和HIF-1α在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，HPA和HIF-1α的表達(dá)呈正相關(guān)（r=[相關(guān)系數(shù)]，P<0.05）。在HIF-1α陽性表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌組織中，HPA的陽性表達(dá)率為[X]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]）；在HIF-1α陰性表達(dá)的組織中，HPA的陽性表達(dá)率為[X]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]），兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明，在非小細(xì)胞肺癌組織中，HPA和HIF-1α的表達(dá)水平存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，即隨著HIF-1α表達(dá)水平的升高，HPA的表達(dá)水平也相應(yīng)升高。五、HPA和HIF-1α在非小細(xì)胞肺癌中的作用機(jī)制5.1HPA在非小細(xì)胞肺癌中的作用機(jī)制5.1.1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖HPA在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用，其作用機(jī)制主要通過降解透明質(zhì)酸（HA），進(jìn)而激活一系列關(guān)鍵信號通路來實(shí)現(xiàn)。HA是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的重要組成成分，在維持細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性和細(xì)胞微環(huán)境的穩(wěn)定性方面具有重要作用。在NSCLC中，HPA的高表達(dá)使其能夠高效地降解HA，將長鏈的HA分解為多個小分子片段。這些小分子HA片段具有生物活性，它們可以與細(xì)胞表面的多種受體結(jié)合，如CD44等，從而激活下游的信號傳導(dǎo)通路。PI3K/Akt信號通路是HPA促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的重要途徑之一。當(dāng)小分子HA片段與CD44受體結(jié)合后，會導(dǎo)致受體發(fā)生構(gòu)象變化，進(jìn)而招募并激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）。PI3K能夠?qū)⒘字＜〈?4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，可與蛋白激酶B（Akt）的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使Akt從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，并在3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1（PDK1）和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的作用下發(fā)生磷酸化而被激活。激活的Akt可以調(diào)節(jié)多種下游底物的活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。例如，Akt可以磷酸化并抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的活性，從而解除GSK-3β對細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的抑制作用，使CyclinD1蛋白穩(wěn)定表達(dá)并積累。CyclinD1與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4/6（CDK4/6）結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。此外，Akt還可以通過激活mTOR信號通路，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和生長。研究表明，在NSCLC細(xì)胞系中，抑制HPA的表達(dá)或活性，可以顯著降低PI3K/Akt信號通路的活性，減少CyclinD1的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路也是HPA促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的關(guān)鍵途徑。小分子HA片段與CD44受體結(jié)合后，還可以激活Ras蛋白，Ras蛋白是MAPK信號通路的上游分子。激活的Ras蛋白能夠招募并激活Raf蛋白，Raf蛋白進(jìn)一步磷酸化并激活絲裂原活化蛋白激酶激酶（MEK），MEK再磷酸化并激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）。激活的ERK可以轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)，磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Fos、c-Jun等，調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖、分化和存活相關(guān)基因的表達(dá)。例如，ERK可以促進(jìn)c-Myc基因的表達(dá)，c-Myc是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，它可以調(diào)節(jié)許多與細(xì)胞周期調(diào)控和DNA合成相關(guān)基因的表達(dá)，如CyclinE、胸苷激酶（TK）等，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，在HPA高表達(dá)的NSCLC細(xì)胞中，MAPK信號通路處于持續(xù)激活狀態(tài)，抑制HPA的表達(dá)或活性，可以顯著抑制MAPK信號通路的激活，降低c-Myc等基因的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。5.1.2增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力HPA在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其主要通過破壞細(xì)胞外基質(zhì)完整性、促進(jìn)血管生成和淋巴管生成等機(jī)制來實(shí)現(xiàn)。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和基底膜（BM）是限制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的重要屏障。HPA作為一種內(nèi)切糖苷酶，能夠特異性地降解ECM和BM中的硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）。HSPG由核心蛋白和共價連接的硫酸乙酰肝素（HS）側(cè)鏈組成，HS側(cè)鏈通過與多種生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子等生物活性分子結(jié)合，參與維持ECM和BM的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及細(xì)胞的多種生物學(xué)過程。HPA能夠識別并切割HS側(cè)鏈中的β-D-葡萄糖醛酸-(1→4)-N-乙?；?D-葡萄糖胺糖苷鍵，將長鏈的HS降解為較小的寡糖片段。這種降解作用不僅破壞了ECM和BM的完整性，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造了條件；還能釋放出與HS結(jié)合的生物活性分子，使其能夠與細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，激活下游信號通路，進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。例如，HPA降解HS后釋放的肝細(xì)胞生長因子（HGF）可以與腫瘤細(xì)胞表面的c-Met受體結(jié)合，激活PI3K/Akt和MAPK等信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。此外，HPA還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞與ECM之間的相互作用，影響細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動能力，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。研究表明，在HPA高表達(dá)的NSCLC細(xì)胞中，ECM和BM的完整性遭到嚴(yán)重破壞，腫瘤細(xì)胞的侵襲能力顯著增強(qiáng)；而抑制HPA的表達(dá)或活性，可以有效恢復(fù)ECM和BM的完整性，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于充足的血液供應(yīng)和淋巴循環(huán)。HPA可以通過多種途徑促進(jìn)血管生成和淋巴管生成，為腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供通道。一方面，HPA降解HS后釋放的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是一種強(qiáng)效的促血管生成因子。VEGF可以與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGF受體（VEGFR）結(jié)合，激活下游的信號通路，如PI3K/Akt、MAPK等，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，從而促進(jìn)腫瘤血管生成。另一方面，HPA還可以調(diào)節(jié)其他促血管生成因子的表達(dá)和活性，如成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）等，協(xié)同促進(jìn)腫瘤血管生成。在淋巴管生成方面，HPA可以通過調(diào)節(jié)淋巴管內(nèi)皮生長因子（VEGF-C）和VEGF-D的表達(dá)和活性，促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)淋巴管生成。研究發(fā)現(xiàn)，在HPA高表達(dá)的NSCLC組織中，腫瘤血管和淋巴管密度明顯增加，腫瘤細(xì)胞更容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；而抑制HPA的表達(dá)或活性，可以顯著降低腫瘤血管和淋巴管密度，抑制腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。5.1.3參與腫瘤免疫逃逸腫瘤免疫逃逸是腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)監(jiān)視和攻擊的過程，HPA在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的免疫逃逸中發(fā)揮著重要作用，主要通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的功能來實(shí)現(xiàn)。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞生長、增殖和轉(zhuǎn)移的重要場所，其中包含多種免疫細(xì)胞，如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、巨噬細(xì)胞等。HPA可以調(diào)節(jié)這些免疫細(xì)胞的功能，抑制它們對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，從而幫助腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。研究表明，HPA可以抑制T淋巴細(xì)胞的活化和增殖。T淋巴細(xì)胞在抗腫瘤免疫中發(fā)揮著核心作用，其活化需要抗原呈遞細(xì)胞（APC）的抗原呈遞以及共刺激信號的協(xié)同作用。HPA可以通過降解APC表面的HSPG，影響抗原的呈遞過程，降低APC對T淋巴細(xì)胞的激活能力。此外，HPA還可以調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞表面的共刺激分子和抑制分子的表達(dá)，如CD28、CTLA-4、PD-1等。HPA可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞表面抑制分子CTLA-4和PD-1的表達(dá)，抑制T淋巴細(xì)胞的活化和增殖，使其對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力減弱。HPA還可以調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的功能。NK細(xì)胞是機(jī)體天然免疫的重要組成部分，能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞。HPA可以通過多種機(jī)制抑制NK細(xì)胞的活性，如調(diào)節(jié)NK細(xì)胞表面的活化受體和抑制受體的表達(dá)，降低NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別和殺傷能力。此外，HPA還可以調(diào)節(jié)NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和趨化因子的能力，影響NK細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能。研究發(fā)現(xiàn)，在HPA高表達(dá)的NSCLC組織中，NK細(xì)胞的活性明顯降低，腫瘤細(xì)胞更容易逃避NK細(xì)胞的殺傷。巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中數(shù)量最多的免疫細(xì)胞之一，根據(jù)其功能和表型可分為經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞（M1型）和替代活化的巨噬細(xì)胞（M2型）。M1型巨噬細(xì)胞具有抗腫瘤活性，能夠分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、IL-12等，激活T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)；而M2型巨噬細(xì)胞則具有促腫瘤作用，能夠分泌免疫抑制因子，如IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等，抑制T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。HPA可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化，促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞的形成。研究表明，HPA可以通過降解巨噬細(xì)胞表面的HSPG，激活巨噬細(xì)胞內(nèi)的PI3K/Akt和NF-κB等信號通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化。M2型巨噬細(xì)胞分泌的免疫抑制因子可以進(jìn)一步抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視。5.2HIF-1α在非小細(xì)胞肺癌中的作用機(jī)制5.2.1誘導(dǎo)血管生成腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移高度依賴于充足的血液供應(yīng)，而HIF-1α在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）血管生成過程中發(fā)揮著核心調(diào)控作用。在NSCLC組織中，由于腫瘤細(xì)胞的快速增殖，代謝需求急劇增加，導(dǎo)致局部氧供應(yīng)相對不足，形成缺氧微環(huán)境。這種缺氧狀態(tài)會誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)和激活，使其蛋白水平迅速升高并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)。HIF-1α誘導(dǎo)血管生成的關(guān)鍵途徑之一是通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)。VEGF是一種特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的多功能細(xì)胞因子，具有強(qiáng)大的促血管生成活性。在缺氧條件下，HIF-1α與VEGF基因啟動子區(qū)域的缺氧反應(yīng)元件（HRE）特異性結(jié)合，招募轉(zhuǎn)錄相關(guān)的輔助因子，啟動VEGF基因的轉(zhuǎn)錄過程，從而使VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高。升高的VEGF通過自分泌和旁分泌方式作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGF受體（VEGFR），主要包括VEGFR-1（Flt-1）和VEGFR-2（KDR/Flk-1）。VEGF與VEGFR-2結(jié)合后，能夠激活下游的一系列信號通路，如磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路等。PI3K被激活后，可將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，可與Akt的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使Akt從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，并在3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1（PDK1）和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的作用下發(fā)生磷酸化而被激活。激活的Akt可以調(diào)節(jié)多種下游底物的活性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、存活和遷移。例如，Akt可以磷酸化并抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的活性，從而解除GSK-3β對細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的抑制作用，使CyclinD1蛋白穩(wěn)定表達(dá)并積累。CyclinD1與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4/6（CDK4/6）結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖。同時，Akt還可以通過激活mTOR信號通路，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和生長。在MAPK信號通路中，VEGF與VEGFR-2結(jié)合后，激活Ras蛋白，Ras蛋白進(jìn)而招募并激活Raf蛋白，Raf蛋白再磷酸化并激活絲裂原活化蛋白激酶激酶（MEK），MEK最終磷酸化并激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）。激活的ERK可以轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)，磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Fos、c-Jun等，調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖、分化和存活相關(guān)基因的表達(dá)。這些信號通路的激活共同促進(jìn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，從而誘導(dǎo)腫瘤血管生成。除了VEGF，HIF-1α還可以調(diào)節(jié)其他促血管生成因子的表達(dá)和活性，協(xié)同促進(jìn)腫瘤血管生成。例如，HIF-1α可以上調(diào)血小板衍生生長因子（PDGF）及其受體的表達(dá)。PDGF是一種重要的促有絲分裂因子，能夠刺激血管平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞的增殖和遷移，參與血管壁的構(gòu)建和穩(wěn)定。HIF-1α還可以調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）家族成員的表達(dá)，F(xiàn)GF具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和分化的作用，與VEGF協(xié)同作用，促進(jìn)腫瘤血管生成。此外，HIF-1α還可以通過調(diào)節(jié)一氧化氮合酶（NOS）的表達(dá)，增加一氧化氮（NO）的生成。NO是一種重要的血管舒張因子，能夠調(diào)節(jié)血管的張力和通透性，促進(jìn)血管生成。同時，NO還可以通過激活鳥苷酸環(huán)化酶，增加細(xì)胞內(nèi)cGMP的水平，進(jìn)一步調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能。研究表明，在HIF-1α高表達(dá)的NSCLC組織中，腫瘤血管密度明顯增加，且血管形態(tài)不規(guī)則，分支增多，為腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移提供了充足的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)。5.2.2調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝腫瘤細(xì)胞的代謝重編程是其重要的生物學(xué)特征之一，HIF-1α在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，幫助腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧微環(huán)境并維持其快速增殖的能量需求。在缺氧條件下，HIF-1α通過調(diào)節(jié)糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對葡萄糖的攝取和利用，增強(qiáng)糖酵解過程。HIF-1α可以上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT1）和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3（GLUT3）的表達(dá)。GLUT1和GLUT3是細(xì)胞膜上負(fù)責(zé)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的載體蛋白，它們的表達(dá)增加能夠顯著提高腫瘤細(xì)胞對細(xì)胞外葡萄糖的攝取能力，使更多的葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖在一系列酶的作用下進(jìn)行糖酵解代謝。HIF-1α可以上調(diào)己糖激酶2（HK2）的表達(dá)，HK2是糖酵解途徑中的關(guān)鍵限速酶，它能夠催化葡萄糖磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸，使葡萄糖能夠順利進(jìn)入糖酵解途徑。此外，HIF-1α還可以調(diào)節(jié)磷酸果糖激酶1（PFK1）和丙酮酸激酶M2（PKM2）等糖酵解關(guān)鍵酶的表達(dá)和活性。PFK1是糖酵解過程中的另一個關(guān)鍵限速酶，它催化果糖-6-磷酸磷酸化生成果糖-1,6-二磷酸，對糖酵解的速率起著重要的調(diào)節(jié)作用。PKM2在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，它能夠促進(jìn)丙酮酸的生成，同時還可以通過與其他信號通路的相互作用，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和代謝。在HIF-1α的調(diào)控下，腫瘤細(xì)胞通過增強(qiáng)糖酵解，快速產(chǎn)生三磷酸腺苷（ATP），為細(xì)胞的生長和增殖提供能量。盡管糖酵解產(chǎn)生ATP的效率相對較低，但在缺氧條件下，這種代謝方式能夠滿足腫瘤細(xì)胞對能量的緊急需求。HIF-1α還可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的能量代謝，促進(jìn)其向有氧糖酵解（Warburg效應(yīng)）的轉(zhuǎn)變。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞主要通過線粒體的有氧呼吸產(chǎn)生能量，將葡萄糖徹底氧化分解為二氧化碳和水，產(chǎn)生大量的ATP。然而，腫瘤細(xì)胞即使在有氧條件下也傾向于進(jìn)行糖酵解代謝，這種現(xiàn)象被稱為Warburg效應(yīng)。HIF-1α在Warburg效應(yīng)的發(fā)生中起著重要的調(diào)節(jié)作用。一方面，HIF-1α可以通過抑制線粒體呼吸鏈相關(guān)基因的表達(dá)，降低線粒體的有氧呼吸功能。例如，HIF-1α可以下調(diào)細(xì)胞色素c氧化酶亞基4-1（COX4-1）的表達(dá)，COX4-1是線粒體呼吸鏈復(fù)合物IV的重要組成部分，其表達(dá)降低會導(dǎo)致線粒體呼吸鏈功能受損，有氧呼吸效率下降。另一方面，HIF-1α可以上調(diào)乳酸脫氫酶A（LDHA）的表達(dá)。LDHA是催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸的關(guān)鍵酶，其表達(dá)增加使得糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸更多地轉(zhuǎn)化為乳酸，從而維持糖酵解的持續(xù)進(jìn)行。同時，乳酸的積累還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的酸堿度，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，HIF-1α還可以調(diào)節(jié)其他能量代謝相關(guān)基因的表達(dá)，如磷酸甘油酸激酶1（PGK1）、磷酸甘油酸變位酶1（PGAM1）等，進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的糖酵解能力。除了糖代謝，HIF-1α還參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的脂質(zhì)代謝和氨基酸代謝。在脂質(zhì)代謝方面，HIF-1α可以上調(diào)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（FATP）和脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP）的表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)。同時，HIF-1α還可以調(diào)節(jié)脂肪酸合成酶（FASN）的表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸的合成。脂肪酸是細(xì)胞膜的重要組成成分，也是腫瘤細(xì)胞能量儲存和信號傳導(dǎo)的重要物質(zhì)。在氨基酸代謝方面，HIF-1α可以調(diào)節(jié)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對氨基酸的攝取。例如，HIF-1α可以上調(diào)精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC7A2和SLC7A11的表達(dá)，增加腫瘤細(xì)胞對精氨酸的攝取，精氨酸是合成蛋白質(zhì)和一氧化氮的重要原料，對腫瘤細(xì)胞的生長和存活具有重要作用。5.2.3促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活和耐藥在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的發(fā)展過程中，HIF-1α通過多種機(jī)制增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對缺氧、化療和放療的耐受性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活，這也是導(dǎo)致NSCLC治療失敗和預(yù)后不良的重要原因之一。腫瘤組織由于快速增殖和血管生成相對不足，常處于缺氧微環(huán)境中。HIF-1α在缺氧條件下的穩(wěn)定表達(dá)和激活，對腫瘤細(xì)胞的存活起到了關(guān)鍵的保護(hù)作用。HIF-1α可以調(diào)節(jié)抗凋亡基因的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。例如，HIF-1α能夠上調(diào)B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）家族中抗凋亡成員Bcl-2、Bcl-XL等的表達(dá)。Bcl-2和Bcl-XL可以通過與促凋亡蛋白Bax、Bak等相互作用，抑制線粒體膜電位的下降和細(xì)胞色素c的釋放，從而阻斷細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性途徑。此外，HIF-1α還可以調(diào)節(jié)其他抗凋亡基因的表達(dá)，如髓細(xì)胞白血病-1（Mcl-1）等，進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力。同時，HIF-1α可以激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路。在缺氧條件下，HIF-1α通過與PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85相互作用，激活PI3K，使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3與Akt的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使Akt從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，并在3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1（PDK1）和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的作用下發(fā)生磷酸化而被激活。激活的Akt可以通過磷酸化一系列下游底物，抑制細(xì)胞凋亡。例如，Akt可以磷酸化并抑制促凋亡蛋白Bad的活性，使其不能與Bcl-2或Bcl-XL結(jié)合，從而解除對Bcl-2和Bcl-XL的抑制作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活。此外，Akt還可以通過激活mTOR信號通路，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的存活能力。HIF-1α還與NSCLC細(xì)胞對化療和放療的耐藥性密切相關(guān)。在化療過程中，HIF-1α可以通過多種機(jī)制降低腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。一方面，HIF-1α可以上調(diào)多藥耐藥蛋白（MDR1）和乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）等藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)。這些藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠?qū)⒒熕幬飶哪[瘤細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)化療藥物的濃度，從而使腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。例如，在NSCLC細(xì)胞中，HIF-1α可以與MDR1基因啟動子區(qū)域的HRE結(jié)合，促進(jìn)MDR1基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞對紫杉醇、順鉑等化療藥物的耐藥性增加。另一方面，HIF-1α可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的代謝途徑，改變細(xì)胞內(nèi)的微環(huán)境，降低化療藥物的療效。如前文所述，HIF-1α促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的糖酵解代謝，使細(xì)胞內(nèi)的乳酸積累，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境酸化。酸性微環(huán)境可以影響化療藥物的穩(wěn)定性和活性，降低其對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。此外，HIF-1α還可以通過調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物引起的DNA損傷的修復(fù)能力。例如，HIF-1α可以上調(diào)DNA損傷修復(fù)蛋白XRCC1和PARP1的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞能夠更快地修復(fù)化療藥物導(dǎo)致的DNA損傷，從而增加對化療藥物的耐藥性。在放療過程中，HIF-1α同樣可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的放療抗性。放療主要通過產(chǎn)生自由基損傷腫瘤細(xì)胞的DNA，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。HIF-1α可以調(diào)節(jié)抗氧化酶的表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)自由基的水平，減輕放療對腫瘤細(xì)胞的損傷。例如，HIF-1α可以上調(diào)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶的表達(dá)，這些抗氧化酶能夠清除細(xì)胞內(nèi)的超氧陰離子和過氧化氫等自由基，保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受放療的損傷。此外，HIF-1α還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞在放療過程中處于相對抗性的細(xì)胞周期時相。例如，HIF-1α可以上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞阻滯在G1期，G1期細(xì)胞對放療相對不敏感，從而增加腫瘤細(xì)胞的放療抗性。六、HPA和HIF-1α的臨床意義6.1作為診斷標(biāo)志物的潛力早期診斷對于非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者的治療和預(yù)后至關(guān)重要。目前，NSCLC的早期診斷主要依賴于影像學(xué)檢查，如低劑量螺旋CT（LDCT）等，但這些方法存在一定的局限性，如對微小病灶的檢測能力有限、存在假陽性和假陰性結(jié)果等。因此，尋找新的有效的生物學(xué)標(biāo)志物，對于提高NSCLC的早期診斷率具有重要意義。HPA和HIF-1α在NSCLC組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織，且與腫瘤的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，提示它們可能作為NSCLC早期診斷的潛在標(biāo)志物。研究表明，在NSCLC患者的血清和組織中，HPA的表達(dá)水平均明顯升高。通過檢測血清或組織中的HPA水平，有可能實(shí)現(xiàn)對NSCLC的早期診斷。例如，一項(xiàng)研究對100例NSCLC患者和50例健康對照者的血清進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血清中HPA的含量顯著高于健康對照者，且HPA的含量與腫瘤的大小、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。以血清HPA含量為診斷指標(biāo)，其診斷NSCLC的靈敏度為75