FGFR4和DDR1特異性小分子抑制劑的理性設(shè)計(jì)、精準(zhǔn)合成與多維生物活性解析一、引言1.1研究背景與意義癌癥，作為嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，一直是全球醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)領(lǐng)域。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)年全球新增癌癥病例1929萬例，癌癥死亡病例996萬例。癌癥不僅給患者帶來了巨大的身心痛苦，也給家庭和社會(huì)造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在癌癥治療方面取得了一定進(jìn)展，如手術(shù)、化療、放療、免疫治療和靶向治療等多種手段的應(yīng)用，但癌癥的總體治愈率仍有待提高，許多患者在治療后仍面臨復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，因此，開發(fā)更有效的癌癥治療方法和藥物具有迫切的需求。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體4（FGFR4）和盤狀結(jié)構(gòu)域受體1（DDR1）是兩種在癌癥發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的受體蛋白。FGFR4屬于受體酪氨酸激酶家族（RTKs），它與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGFs）相互作用，形成FGF/FGFR信號(hào)通路，該通路在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、遷移和血管生成等多種生理過程中起著重要的調(diào)控作用。然而，當(dāng)FGFR4基因發(fā)生異常，如突變、擴(kuò)增或過表達(dá)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致FGF/FGFR信號(hào)通路的過度激活，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、侵襲和轉(zhuǎn)移。研究表明，在多種癌癥中都存在FGFR4的異常表達(dá)，如在肝細(xì)胞癌中，大約30%的患者存在FGFR4異常高表達(dá)，且與患者的預(yù)后差密切相關(guān)；在乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌等癌癥中，F(xiàn)GFR4的異常表達(dá)也被發(fā)現(xiàn)與腫瘤的惡性程度和不良預(yù)后相關(guān)。DDR1同樣屬于受體酪氨酸激酶家族，它主要被各種類型的膠原蛋白激活，在細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用中發(fā)揮重要作用。DDR1參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、遷移、侵襲和存活等過程。在正常生理狀態(tài)下，DDR1的表達(dá)和活性受到嚴(yán)格調(diào)控，但在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中，DDR1常常出現(xiàn)異常表達(dá)和活化。許多研究表明，DDR1在乳腺癌、卵巢癌、食道癌、肺癌等多種癌癥組織中顯著過表達(dá)，并且其過表達(dá)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成以及患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。例如，在乳腺癌中，DDR1的高表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)，通過抑制DDR1的活性，可以顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。鑒于FGFR4和DDR1在癌癥發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用，它們成為了極具潛力的癌癥治療靶點(diǎn)。特異性小分子抑制劑能夠通過與FGFR4和DDR1的特定結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，阻斷其信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，為癌癥治療提供了新的策略和方法。目前，雖然一些針對(duì)FGFR4和DDR1的抑制劑已經(jīng)進(jìn)入研究階段，但在抗癌活性、選擇性、毒副作用等方面仍存在諸多挑戰(zhàn)，如部分抑制劑的抗癌活性不夠理想，無法有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)；一些抑制劑的選擇性較差，在抑制靶點(diǎn)的同時(shí)，也會(huì)對(duì)其他正常細(xì)胞和生理過程產(chǎn)生不良影響；還有些抑制劑存在較大的毒副作用，限制了其在臨床上的應(yīng)用。因此，進(jìn)一步研究設(shè)計(jì)具有更好生物活性、高選擇性和低毒副作用的FGFR4和DDR1特異性小分子抑制劑具有重要的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)意義。本研究致力于設(shè)計(jì)、合成FGFR4和DDR1特異性小分子抑制劑，并對(duì)其生物活性進(jìn)行深入研究。通過本研究，有望獲得具有良好抗癌活性和安全性的小分子抑制劑，為癌癥治療提供新的藥物候選分子，推動(dòng)癌癥治療領(lǐng)域的發(fā)展。同時(shí)，本研究的成果也將為深入理解FGFR4和DDR1的生物學(xué)功能以及癌癥的發(fā)病機(jī)制提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為后續(xù)相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)，在新藥研發(fā)方面，本研究的方法和思路可以為其他抗癌藥物的設(shè)計(jì)和開發(fā)提供借鑒，有助于加速新藥研發(fā)的進(jìn)程，提高新藥研發(fā)的成功率，具有重要的理論和實(shí)踐價(jià)值。1.2FGFR4和DDR1的結(jié)構(gòu)與功能1.2.1FGFR4的結(jié)構(gòu)與功能FGFR4是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體家族中的一員，其結(jié)構(gòu)具有受體酪氨酸激酶的典型特征。從整體結(jié)構(gòu)來看，F(xiàn)GFR4主要由三個(gè)部分組成：細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域是FGFR4與配體相互作用的關(guān)鍵區(qū)域，它包含三個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域（IgI、IgII和IgIII）。IgI結(jié)構(gòu)域在配體結(jié)合中起到一定的調(diào)節(jié)作用，它可以影響FGFR4與配體結(jié)合的親和力和特異性；IgII和IgIII結(jié)構(gòu)域則直接參與配體的識(shí)別和結(jié)合過程，它們通過特定的氨基酸序列和空間構(gòu)象，與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGFs）中的相應(yīng)區(qū)域相互作用，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。在FGFR4與FGF19的結(jié)合過程中，IgII和IgIII結(jié)構(gòu)域中的一些關(guān)鍵氨基酸殘基與FGF19的特定結(jié)構(gòu)域相互契合，從而實(shí)現(xiàn)高親和力的結(jié)合，這種特異性結(jié)合是FGFR4信號(hào)傳導(dǎo)的起始步驟?？缒そY(jié)構(gòu)域由一段疏水氨基酸組成，它將FGFR4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域連接起來，并將受體錨定在細(xì)胞膜上。跨膜結(jié)構(gòu)域的主要作用是在細(xì)胞外配體與受體結(jié)合后，將細(xì)胞外的信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的一系列變化，從而激活下游信號(hào)通路。細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域是FGFR4發(fā)揮激酶活性的區(qū)域，它包含一個(gè)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。當(dāng)FGFR4與配體結(jié)合后，受體發(fā)生二聚化，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域相互靠近并發(fā)生自磷酸化。自磷酸化過程使得酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域中的多個(gè)酪氨酸殘基被磷酸化，這些磷酸化的酪氨酸殘基成為下游信號(hào)分子的結(jié)合位點(diǎn)，通過招募和激活一系列下游信號(hào)分子，如磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。MAPK信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，而PI3K信號(hào)通路的激活則與細(xì)胞的存活和代謝調(diào)節(jié)相關(guān)。FGFR4在正常生理過程中，參與了胚胎發(fā)育、組織修復(fù)和血管生成等重要生物學(xué)過程。在胚胎發(fā)育階段，F(xiàn)GFR4信號(hào)通路對(duì)于心臟、骨骼、肌肉等器官和組織的形成和發(fā)育起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。在心臟發(fā)育過程中，F(xiàn)GFR4通過與特定的FGF配體結(jié)合，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的增殖、分化和遷移，確保心臟的正常形態(tài)和功能的形成；在骨骼發(fā)育中，F(xiàn)GFR4信號(hào)參與了成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化和增殖，影響骨骼的生長(zhǎng)和重塑。在組織修復(fù)過程中，F(xiàn)GFR4可以促進(jìn)受損組織周圍細(xì)胞的增殖和遷移，加速傷口愈合。當(dāng)皮膚受到損傷時(shí)，局部細(xì)胞會(huì)分泌FGFs，激活FGFR4信號(hào)通路，促使成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞增殖并遷移到傷口部位，合成膠原蛋白和其他細(xì)胞外基質(zhì)成分，促進(jìn)傷口的愈合。在血管生成方面，F(xiàn)GFR4信號(hào)通路可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，從而促進(jìn)新血管的生成，為組織和器官提供充足的血液供應(yīng)。然而，在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中，F(xiàn)GFR4常常出現(xiàn)異常表達(dá)和活化?；?qū)用嫔希現(xiàn)GFR4基因可能發(fā)生突變、擴(kuò)增或過表達(dá)等異常改變。在一些肝細(xì)胞癌患者中，發(fā)現(xiàn)了FGFR4基因的點(diǎn)突變，如V550L突變，這種突變導(dǎo)致FGFR4的激酶活性增強(qiáng)，使其能夠持續(xù)激活下游信號(hào)通路，即使在沒有配體存在的情況下，也能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。FGFR4基因的擴(kuò)增也較為常見，例如在部分乳腺癌患者中，F(xiàn)GFR4基因的拷貝數(shù)明顯增加，導(dǎo)致FGFR4蛋白的表達(dá)量大幅上升，進(jìn)而過度激活相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。FGFR4的過表達(dá)可以通過多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)，如轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常、表觀遺傳修飾改變等。某些轉(zhuǎn)錄因子的異常激活或抑制，可能導(dǎo)致FGFR4基因的轉(zhuǎn)錄水平升高，從而使FGFR4蛋白表達(dá)增加；DNA甲基化、組蛋白修飾等表觀遺傳變化也可能影響FGFR4基因的表達(dá)，促進(jìn)其在腫瘤細(xì)胞中的過表達(dá)。異常活化的FGFR4通過激活下游信號(hào)通路，如RAS/RAF/MEK/ERK和PI3K/AKT/mTOR等信號(hào)通路，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。在RAS/RAF/MEK/ERK信號(hào)通路中，F(xiàn)GFR4的激活會(huì)導(dǎo)致RAS蛋白的活化，進(jìn)而依次激活RAF、MEK和ERK等激酶。ERK被激活后，會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)一系列與細(xì)胞增殖、分化和存活相關(guān)的基因表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。在PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路中，F(xiàn)GFR4激活PI3K，使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，招募并激活A(yù)KT蛋白激酶。AKT進(jìn)一步激活mTOR等下游分子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成、代謝和存活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和增殖。FGFR4還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。FGFR4的異?；罨€與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)密切相關(guān)。它可以上調(diào)一些與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)的分子表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件；同時(shí)，F(xiàn)GFR4還可以調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，使上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在乳腺癌細(xì)胞中，F(xiàn)GFR4的異?；罨梢哉T導(dǎo)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，如Snail、Slug等，這些轉(zhuǎn)錄因子抑制上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)，促使乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，進(jìn)而增強(qiáng)其侵襲和轉(zhuǎn)移能力。1.2.2DDR1的結(jié)構(gòu)與功能DDR1同樣屬于受體酪氨酸激酶家族，其結(jié)構(gòu)也由細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成，但各結(jié)構(gòu)域具有獨(dú)特的特征和功能。DDR1的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域含有一個(gè)盤狀結(jié)構(gòu)域（Discoidindomain）和兩個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。盤狀結(jié)構(gòu)域是DDR1與膠原蛋白結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，它具有特殊的結(jié)構(gòu)和氨基酸組成，能夠特異性地識(shí)別和結(jié)合各種類型的膠原蛋白，如I型、II型、III型和VI型膠原蛋白等。盤狀結(jié)構(gòu)域中的一些保守氨基酸殘基與膠原蛋白的特定序列相互作用，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而激活DDR1。在與I型膠原蛋白結(jié)合時(shí)，盤狀結(jié)構(gòu)域中的某些氨基酸殘基能夠與I型膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)中的特定區(qū)域緊密結(jié)合，引發(fā)DDR1的構(gòu)象變化，進(jìn)而啟動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)過程。免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域在DDR1的功能中也起到重要作用，它們可能參與調(diào)節(jié)DDR1與膠原蛋白的結(jié)合親和力，以及與其他細(xì)胞表面分子的相互作用?？缒そY(jié)構(gòu)域與FGFR4類似，由一段疏水氨基酸組成，將DDR1固定在細(xì)胞膜上，并負(fù)責(zé)將細(xì)胞外的信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)DDR1與膠原蛋白結(jié)合后，跨膜結(jié)構(gòu)域會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，這種變化會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的活性，從而激活下游信號(hào)通路。細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包含酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域和多個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。當(dāng)DDR1與膠原蛋白結(jié)合并發(fā)生二聚化后，細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域會(huì)發(fā)生自磷酸化，使多個(gè)酪氨酸殘基被磷酸化。這些磷酸化的酪氨酸殘基成為下游信號(hào)分子的結(jié)合位點(diǎn)，通過招募和激活一系列下游信號(hào)分子，如PLCγ、PI3K、SHC等，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。PLCγ被激活后，會(huì)水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2），產(chǎn)生兩個(gè)重要的第二信使：三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DAG）。IP3可以促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度，進(jìn)而影響細(xì)胞的多種生理功能；DAG則可以激活蛋白激酶C（PKC），PKC參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和存活等過程。PI3K被激活后，通過激活A(yù)KT等下游分子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝、存活和遷移等過程。SHC被招募到磷酸化的DDR1上后，會(huì)激活RAS/RAF/MEK/ERK信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。在正常生理狀態(tài)下，DDR1主要參與細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、遷移和存活等過程。在胚胎發(fā)育過程中，DDR1對(duì)于組織和器官的形態(tài)發(fā)生和發(fā)育至關(guān)重要。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中，DDR1可以調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的遷移和分化，確保神經(jīng)元在正確的位置形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)；在皮膚發(fā)育中，DDR1參與調(diào)節(jié)表皮細(xì)胞的增殖和分化，維持皮膚的正常結(jié)構(gòu)和功能。在組織修復(fù)和再生過程中，DDR1也發(fā)揮著重要作用。當(dāng)組織受到損傷時(shí)，DDR1可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，參與傷口愈合和血管新生過程。在傷口愈合過程中，DDR1可以通過與膠原蛋白結(jié)合，激活下游信號(hào)通路，促使成纖維細(xì)胞遷移到傷口部位，合成膠原蛋白和其他細(xì)胞外基質(zhì)成分，促進(jìn)傷口的愈合。然而，在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中，DDR1常常出現(xiàn)異常表達(dá)和活化。許多研究表明，DDR1在多種癌癥組織中顯著過表達(dá)，如乳腺癌、卵巢癌、食道癌、肺癌等。在乳腺癌中，DDR1的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度和轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)。高表達(dá)DDR1的乳腺癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，更容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。DDR1的異?；罨梢酝ㄟ^多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。DDR1可以激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和遷移。它可以上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖；同時(shí)，DDR1還可以抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，如Bax等，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的存活能力。在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移方面，DDR1可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。它可以上調(diào)MMPs的表達(dá)，降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的遷移開辟道路；DDR1還可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的黏附能力，使腫瘤細(xì)胞更容易脫離原發(fā)腫瘤部位，進(jìn)入血液循環(huán)并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。DDR1還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成和免疫逃逸。DDR1可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等促血管生成因子，促進(jìn)腫瘤血管的生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)；DDR1還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞功能，抑制免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，針對(duì)FGFR4和DDR1特異性小分子抑制劑的研究在國(guó)內(nèi)外都受到了廣泛關(guān)注，取得了一定的進(jìn)展，但也面臨著諸多挑戰(zhàn)和問題。在FGFR4特異性小分子抑制劑的研究方面，國(guó)外起步相對(duì)較早，投入了大量的科研資源和資金。一些知名的制藥公司和科研機(jī)構(gòu)在這一領(lǐng)域開展了深入研究，并取得了一些重要成果。諾華公司研發(fā)的FGF401是一種口服的FGFR4選擇性抑制劑，在多項(xiàng)臨床前研究中表現(xiàn)出了對(duì)FGFR4信號(hào)通路的有效抑制作用。在肝癌細(xì)胞系和小鼠異種移植模型中，F(xiàn)GF401能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，并且具有較好的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。FGF401在臨床試驗(yàn)中也面臨一些挑戰(zhàn)，部分患者出現(xiàn)了耐藥現(xiàn)象，且藥物的毒副作用如高磷血癥等也限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。BlueprintMedicines公司的BLU-554同樣是一種具有潛力的FGFR4抑制劑，它對(duì)FGFR4具有較高的選擇性和親和力。臨床前研究表明，BLU-554在抑制FGFR4信號(hào)通路相關(guān)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移方面表現(xiàn)出良好的效果。在針對(duì)攜帶FGFR4突變或FGF19過表達(dá)的肝細(xì)胞癌患者的臨床試驗(yàn)中，BLU-554顯示出一定的抗腫瘤活性，但也存在一些不良反應(yīng)，如腹瀉、疲勞等。國(guó)內(nèi)的科研團(tuán)隊(duì)和企業(yè)也在積極開展FGFR4特異性小分子抑制劑的研究，并取得了一些令人矚目的成果。和譽(yù)醫(yī)藥的irpagratinib（ABSK011）是一款高選擇性的FGFR4小分子抑制劑，已獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)開展單藥在晚期肝細(xì)胞癌患者中的1期臨床試驗(yàn)，以及中國(guó)國(guó)家藥監(jiān)局批準(zhǔn)的聯(lián)合侖伐替尼治療晚期或不可切除肝細(xì)胞癌的2期臨床試驗(yàn)申請(qǐng)。臨床前研究顯示，irpagratinib具有較好的效力和抗腫瘤療效，并且在物理化學(xué)性質(zhì)方面表現(xiàn)良好。初步的臨床結(jié)果表明，irpagratinib展現(xiàn)出較好的安全性及療效，但仍需要進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證其長(zhǎng)期有效性和安全性。一些國(guó)內(nèi)高校和科研機(jī)構(gòu)也在FGFR4抑制劑的設(shè)計(jì)和合成方面進(jìn)行了大量基礎(chǔ)研究，通過結(jié)構(gòu)優(yōu)化和計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)等方法，試圖開發(fā)出具有更好活性和選擇性的FGFR4抑制劑。然而，整體而言，國(guó)內(nèi)在FGFR4抑制劑的研發(fā)進(jìn)度和臨床應(yīng)用方面與國(guó)外相比仍有一定差距，需要進(jìn)一步加強(qiáng)基礎(chǔ)研究和臨床轉(zhuǎn)化研究。在DDR1特異性小分子抑制劑的研究領(lǐng)域，國(guó)外同樣處于領(lǐng)先地位。多家國(guó)際知名藥企致力于DDR1抑制劑的研發(fā)，并在臨床前研究中取得了一些進(jìn)展。禮來公司開發(fā)的一款DDR1抑制劑，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型中能夠有效抑制DDR1的活性，阻斷下游信號(hào)通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。該抑制劑在乳腺癌和肺癌等腫瘤模型中表現(xiàn)出較好的抗腫瘤效果，但在進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)中，由于藥物的生物利用度較低以及一些不可預(yù)測(cè)的毒副作用，導(dǎo)致研發(fā)進(jìn)程受阻。一些科研機(jī)構(gòu)通過高通量篩選技術(shù)，從大量化合物庫(kù)中篩選出了一些具有DDR1抑制活性的先導(dǎo)化合物，并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和作用機(jī)制研究。雖然這些先導(dǎo)化合物在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出一定的活性，但距離成為有效的臨床藥物仍有很長(zhǎng)的路要走。國(guó)內(nèi)對(duì)DDR1特異性小分子抑制劑的研究相對(duì)較少，但也有一些團(tuán)隊(duì)開始關(guān)注這一領(lǐng)域。部分科研團(tuán)隊(duì)通過與國(guó)外合作或自主研發(fā)，在DDR1抑制劑的設(shè)計(jì)合成方面取得了一些初步成果。一些研究通過對(duì)DDR1的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制進(jìn)行深入分析，設(shè)計(jì)并合成了一系列新型的小分子抑制劑，并在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中對(duì)其生物活性進(jìn)行了評(píng)估。這些研究雖然處于起步階段，但為后續(xù)的DDR1抑制劑研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。由于DDR1抑制劑的研發(fā)難度較大，目前國(guó)內(nèi)在這一領(lǐng)域的研究仍面臨諸多挑戰(zhàn)，如缺乏有效的篩選模型、藥物的成藥性差等問題亟待解決。盡管國(guó)內(nèi)外在FGFR4和DDR1特異性小分子抑制劑的研究方面取得了一定的成果，但仍存在許多不足之處和挑戰(zhàn)。從抑制劑的活性方面來看，目前許多抑制劑的抗癌活性不夠理想，無法完全抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，難以達(dá)到臨床治療的要求。部分FGFR4抑制劑在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中雖然能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，但在動(dòng)物模型或臨床試驗(yàn)中，其抗腫瘤效果明顯減弱，這可能與藥物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、腫瘤微環(huán)境等因素有關(guān)。從選擇性方面而言，一些抑制劑的選擇性較差，在抑制FGFR4或DDR1的同時(shí)，也會(huì)對(duì)其他相關(guān)的受體酪氨酸激酶或正常細(xì)胞生理過程產(chǎn)生影響，導(dǎo)致不必要的副作用。某些泛FGFR抑制劑在抑制FGFR4的，也會(huì)抑制FGFR1、FGFR2等其他受體，從而引起一系列不良反應(yīng)。在藥物的毒副作用方面，許多已開發(fā)的抑制劑存在不同程度的毒副作用，如肝臟毒性、胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制等，這嚴(yán)重限制了它們?cè)谂R床上的應(yīng)用。一些FGFR4抑制劑會(huì)導(dǎo)致高磷血癥，影響患者的鈣磷代謝平衡，增加患者的痛苦和治療風(fēng)險(xiǎn)。研發(fā)過程中還面臨著藥物耐藥性的問題，腫瘤細(xì)胞在長(zhǎng)期接觸抑制劑后，可能會(huì)通過多種機(jī)制產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致藥物治療失效。腫瘤細(xì)胞可能通過基因突變、信號(hào)通路的代償性激活等方式逃避抑制劑的作用，從而使腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。綜上所述，目前FGFR4和DDR1特異性小分子抑制劑的研究雖然取得了一定進(jìn)展，但在提高抑制劑的活性、選擇性、降低毒副作用以及克服耐藥性等方面仍有大量的工作需要開展，這也是未來該領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和方向。二、FGFR4和DDR1特異性小分子抑制劑的設(shè)計(jì)2.1基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)原理基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)（SBDD）是現(xiàn)代藥物研發(fā)中的重要策略，其核心原理是依據(jù)靶標(biāo)蛋白的三維結(jié)構(gòu)信息，設(shè)計(jì)能夠與之特異性結(jié)合并調(diào)節(jié)其功能的小分子化合物。在設(shè)計(jì)FGFR4和DDR1特異性小分子抑制劑時(shí)，基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)原理發(fā)揮著關(guān)鍵作用。蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)決定了其功能和與其他分子的相互作用方式。FGFR4和DDR1作為受體酪氨酸激酶，其激酶結(jié)構(gòu)域中的活性位點(diǎn)是與ATP結(jié)合以及下游信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵區(qū)域。ATP結(jié)合位點(diǎn)通常具有特定的氨基酸殘基組成和空間構(gòu)象，形成一個(gè)相對(duì)保守的口袋結(jié)構(gòu)。小分子抑制劑要發(fā)揮作用，就需要與ATP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到這個(gè)活性位點(diǎn)上，阻斷激酶的磷酸化過程，從而抑制其下游信號(hào)傳導(dǎo)。通過解析FGFR4和DDR1的晶體結(jié)構(gòu)或利用同源建模等方法構(gòu)建其三維結(jié)構(gòu)模型，可以清晰地了解活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特征，包括口袋的大小、形狀、電荷分布以及關(guān)鍵氨基酸殘基的位置等信息。這些結(jié)構(gòu)信息為小分子抑制劑的設(shè)計(jì)提供了重要的基礎(chǔ)和指導(dǎo)。分子對(duì)接是基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)中常用的計(jì)算方法，它模擬小分子與靶標(biāo)蛋白活性位點(diǎn)的結(jié)合過程。在分子對(duì)接過程中，將小分子配體放置到受體蛋白的活性位點(diǎn)中，通過計(jì)算小分子與受體之間的相互作用能，如范德華力、靜電相互作用、氫鍵等，評(píng)估小分子與受體的結(jié)合親和力和結(jié)合模式。以FGFR4為例，通過分子對(duì)接，可以預(yù)測(cè)小分子抑制劑與FGFR4活性位點(diǎn)中關(guān)鍵氨基酸殘基之間形成氫鍵的可能性和位置。如果小分子抑制劑中的某些原子能夠與FGFR4活性位點(diǎn)中的絲氨酸、蘇氨酸等具有羥基的氨基酸殘基形成穩(wěn)定的氫鍵，就可能增強(qiáng)小分子與FGFR4的結(jié)合親和力，從而提高其抑制活性。分子對(duì)接還可以考慮小分子與受體之間的空間互補(bǔ)性，確保小分子能夠以合適的取向進(jìn)入活性位點(diǎn)口袋，并與周圍的氨基酸殘基緊密契合。如果小分子的形狀與活性位點(diǎn)口袋不匹配，即使存在潛在的相互作用，也難以形成穩(wěn)定的結(jié)合復(fù)合物，從而無法有效抑制FGFR4的活性。除了分子對(duì)接，還可以利用基于結(jié)構(gòu)的藥效團(tuán)模型進(jìn)行小分子抑制劑的設(shè)計(jì)。藥效團(tuán)是指藥物分子中對(duì)活性起關(guān)鍵作用的原子或基團(tuán)及其空間排列方式。通過對(duì)FGFR4和DDR1與已知抑制劑復(fù)合物的結(jié)構(gòu)分析，可以提取出與活性相關(guān)的藥效團(tuán)特征。這些特征可能包括氫鍵供體、氫鍵受體、疏水基團(tuán)、芳香環(huán)等。在設(shè)計(jì)新的小分子抑制劑時(shí)，根據(jù)這些藥效團(tuán)特征進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，確保新設(shè)計(jì)的小分子具備與靶標(biāo)蛋白相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)要素。如果從已知的FGFR4抑制劑結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)，一個(gè)特定的芳香環(huán)和相鄰的氫鍵供體基團(tuán)對(duì)于與FGFR4的結(jié)合至關(guān)重要，那么在設(shè)計(jì)新的抑制劑時(shí)，可以保留或優(yōu)化這一結(jié)構(gòu)特征，以提高新化合物與FGFR4的結(jié)合能力和抑制活性。在基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)過程中，還需要考慮小分子抑制劑的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和類藥性。藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)包括藥物的吸收、分布、代謝和排泄（ADME）過程，良好的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)是藥物能夠在體內(nèi)有效發(fā)揮作用的重要保障。類藥性則是指小分子化合物具備成為藥物的潛在可能性，如合適的分子量、脂溶性、水溶性、穩(wěn)定性等。在設(shè)計(jì)FGFR4和DDR1小分子抑制劑時(shí)，通過合理的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，引入適當(dāng)?shù)幕鶊F(tuán)或修飾，以改善小分子的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和類藥性。引入親水性基團(tuán)可以提高小分子的水溶性，有利于其在體內(nèi)的吸收和分布；合理控制分子的脂溶性，避免過高或過低的脂溶性導(dǎo)致藥物難以透過生物膜或在體內(nèi)蓄積產(chǎn)生毒性。同時(shí)，考慮到小分子抑制劑在體內(nèi)可能面臨的代謝途徑，通過結(jié)構(gòu)修飾來增加其代謝穩(wěn)定性，減少不必要的代謝產(chǎn)物生成，從而提高藥物的療效和安全性。2.2FGFR4特異性小分子抑制劑的設(shè)計(jì)策略FGFR4的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為其特異性小分子抑制劑的設(shè)計(jì)提供了重要線索。FGFR4的激酶結(jié)構(gòu)域中存在一些獨(dú)特的氨基酸殘基和結(jié)構(gòu)特征，這些特征可作為設(shè)計(jì)特異性抑制劑的關(guān)鍵靶點(diǎn)。在FGFR4的ATP結(jié)合位點(diǎn)附近，存在一個(gè)相對(duì)保守的區(qū)域，其中的氨基酸殘基與ATP的結(jié)合和激酶活性的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。C552殘基是FGFR4激酶結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)半胱氨酸殘基，它位于ATP結(jié)合位點(diǎn)的邊緣，具有較高的反應(yīng)活性。利用C552殘基的特性，設(shè)計(jì)能夠與之形成共價(jià)鍵的小分子抑制劑，是一種重要的設(shè)計(jì)策略。共價(jià)抑制劑可以與C552殘基發(fā)生不可逆的共價(jià)結(jié)合，從而穩(wěn)定地占據(jù)ATP結(jié)合位點(diǎn)，有效地抑制FGFR4的激酶活性。這種共價(jià)結(jié)合方式相較于非共價(jià)結(jié)合，具有更強(qiáng)的結(jié)合力和更長(zhǎng)的作用時(shí)間，能夠更持久地抑制FGFR4信號(hào)通路。基于FGFR4與其他FGFR亞型之間的結(jié)構(gòu)差異，也是設(shè)計(jì)特異性小分子抑制劑的關(guān)鍵。雖然FGFR家族成員的激酶結(jié)構(gòu)域具有一定的相似性，但FGFR4與FGFR1-3在某些區(qū)域仍存在明顯的結(jié)構(gòu)差異。FGFR4的激酶結(jié)構(gòu)域中，某些氨基酸殘基的組成和空間構(gòu)象與其他亞型不同，這些差異導(dǎo)致其ATP結(jié)合口袋的形狀和電荷分布也有所不同。在設(shè)計(jì)小分子抑制劑時(shí)，可以利用這些結(jié)構(gòu)差異，設(shè)計(jì)能夠特異性識(shí)別FGFR4ATP結(jié)合口袋的化合物。通過優(yōu)化小分子的結(jié)構(gòu)，使其與FGFR4的ATP結(jié)合口袋具有更好的空間互補(bǔ)性和相互作用特異性，從而提高抑制劑對(duì)FGFR4的選擇性，減少對(duì)其他FGFR亞型的影響。從藥效團(tuán)模型的角度出發(fā)，根據(jù)FGFR4與已知抑制劑的相互作用模式，提取關(guān)鍵的藥效團(tuán)特征，也是設(shè)計(jì)新型小分子抑制劑的有效策略。已知的FGFR4抑制劑與FGFR4結(jié)合時(shí)，通常會(huì)通過特定的原子或基團(tuán)與FGFR4的氨基酸殘基形成氫鍵、疏水相互作用、π-π堆積等相互作用。通過對(duì)這些相互作用的分析，可以確定與FGFR4結(jié)合活性密切相關(guān)的藥效團(tuán)特征，如氫鍵供體、氫鍵受體、疏水基團(tuán)等。在設(shè)計(jì)新的小分子抑制劑時(shí)，按照這些藥效團(tuán)特征進(jìn)行結(jié)構(gòu)構(gòu)建和優(yōu)化，確保新分子具備與FGFR4有效結(jié)合的能力。設(shè)計(jì)含有特定氫鍵供體和受體基團(tuán)的小分子，使其能夠與FGFR4活性位點(diǎn)中的關(guān)鍵氨基酸殘基形成穩(wěn)定的氫鍵，增強(qiáng)小分子與FGFR4的結(jié)合親和力。同時(shí)，合理安排疏水基團(tuán)的位置，使其與FGFR4的疏水區(qū)域相互作用，進(jìn)一步提高小分子與FGFR4的結(jié)合穩(wěn)定性。在設(shè)計(jì)FGFR4特異性小分子抑制劑時(shí)，還需要考慮小分子的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和類藥性。為了使小分子抑制劑能夠在體內(nèi)有效地發(fā)揮作用，需要優(yōu)化其吸收、分布、代謝和排泄等藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。通過引入合適的親水性或疏水性基團(tuán)，調(diào)整小分子的脂水分配系數(shù)，提高其在胃腸道的吸收能力和在體內(nèi)的分布均勻性。同時(shí)，考慮到小分子在體內(nèi)可能的代謝途徑，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，避免產(chǎn)生具有毒性的代謝產(chǎn)物，或增強(qiáng)其代謝穩(wěn)定性，延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間。在類藥性方面，遵循Lipinski的“五規(guī)則”等經(jīng)驗(yàn)法則，控制小分子的分子量、氫鍵供體和受體數(shù)量、脂溶性等參數(shù)，使其具備良好的成藥潛力。一般來說，小分子的分子量應(yīng)控制在500Da以下，氫鍵供體不超過5個(gè)，氫鍵受體不超過10個(gè)，脂水分配系數(shù)（logP）在合適的范圍內(nèi)，以確保小分子具有較好的溶解性、膜通透性和穩(wěn)定性，便于后續(xù)的藥物開發(fā)和臨床應(yīng)用。2.3DDR1特異性小分子抑制劑的設(shè)計(jì)策略DDR1獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征為其特異性小分子抑制劑的設(shè)計(jì)提供了重要依據(jù)。DDR1的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的盤狀結(jié)構(gòu)域是與膠原蛋白結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜且具有高度特異性。盤狀結(jié)構(gòu)域由多個(gè)β-折疊和α-螺旋組成，形成了一個(gè)獨(dú)特的口袋狀結(jié)構(gòu)，能夠精確識(shí)別并結(jié)合膠原蛋白的特定氨基酸序列。在設(shè)計(jì)DDR1特異性小分子抑制劑時(shí)，可以考慮針對(duì)盤狀結(jié)構(gòu)域的這一特點(diǎn)，設(shè)計(jì)能夠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合到盤狀結(jié)構(gòu)域與膠原蛋白結(jié)合位點(diǎn)的小分子。通過分子模擬和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，一些小分子能夠與盤狀結(jié)構(gòu)域中的關(guān)鍵氨基酸殘基形成氫鍵和疏水相互作用，從而阻礙膠原蛋白與DDR1的結(jié)合，抑制DDR1的激活。DDR1的激酶結(jié)構(gòu)域同樣是設(shè)計(jì)小分子抑制劑的重要靶點(diǎn)。其激酶結(jié)構(gòu)域中的ATP結(jié)合位點(diǎn)是激酶活性的關(guān)鍵部位，ATP在此處與激酶結(jié)合并提供磷酸基團(tuán)，促進(jìn)激酶的磷酸化和下游信號(hào)傳導(dǎo)。研究表明，DDR1的ATP結(jié)合位點(diǎn)具有一些獨(dú)特的氨基酸殘基和空間構(gòu)象，與其他受體酪氨酸激酶的ATP結(jié)合位點(diǎn)存在差異。利用這些差異，可以設(shè)計(jì)出能夠特異性結(jié)合到DDR1的ATP結(jié)合位點(diǎn)的小分子抑制劑。通過優(yōu)化小分子的結(jié)構(gòu)，使其與DDR1的ATP結(jié)合位點(diǎn)具有更好的互補(bǔ)性和親和力，從而阻斷ATP與DDR1的結(jié)合，抑制激酶的活性?？梢栽O(shè)計(jì)含有特定雜環(huán)結(jié)構(gòu)和側(cè)鏈基團(tuán)的小分子，使其能夠與ATP結(jié)合位點(diǎn)中的氨基酸殘基形成穩(wěn)定的相互作用，如氫鍵、π-π堆積等，從而有效地抑制DDR1的激酶活性?；贒DR1與底物或其他配體的相互作用模式，也是設(shè)計(jì)小分子抑制劑的有效策略。通過解析DDR1與底物或其他配體的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，可以了解它們之間的相互作用細(xì)節(jié)，包括氫鍵、疏水相互作用、離子鍵等。根據(jù)這些相互作用信息，設(shè)計(jì)能夠模擬底物或配體與DDR1結(jié)合的小分子抑制劑。如果發(fā)現(xiàn)DDR1與底物結(jié)合時(shí)，通過特定的氨基酸殘基形成了多個(gè)氫鍵，那么在設(shè)計(jì)小分子抑制劑時(shí)，可以引入能夠形成類似氫鍵的基團(tuán)，增強(qiáng)小分子與DDR1的結(jié)合能力。同時(shí)，考慮小分子的空間構(gòu)象和電子性質(zhì)，使其能夠以合適的方式與DDR1相互作用，達(dá)到抑制DDR1活性的目的。在設(shè)計(jì)DDR1特異性小分子抑制劑時(shí)，也需要充分考慮小分子的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和類藥性。DDR1在體內(nèi)廣泛分布，參與多種生理和病理過程，因此需要確保小分子抑制劑能夠有效地到達(dá)靶組織和靶細(xì)胞。通過優(yōu)化小分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，引入合適的親水性或疏水性基團(tuán)，調(diào)整其脂水分配系數(shù)，提高小分子的膜通透性和在體內(nèi)的吸收、分布能力?？紤]小分子在體內(nèi)的代謝穩(wěn)定性，避免其被快速代謝或產(chǎn)生具有毒性的代謝產(chǎn)物。通過結(jié)構(gòu)修飾，如引入穩(wěn)定的化學(xué)鍵或保護(hù)基團(tuán)，增加小分子的代謝穩(wěn)定性，延長(zhǎng)其在體內(nèi)的作用時(shí)間。在類藥性方面，遵循相關(guān)的規(guī)則和經(jīng)驗(yàn)，控制小分子的分子量、氫鍵供體和受體數(shù)量、極性表面積等參數(shù)，使其具備良好的成藥潛力。一般來說，小分子的分子量應(yīng)適中，避免過大或過小影響其藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和生物活性；氫鍵供體和受體數(shù)量應(yīng)合理，以保證小分子能夠與靶標(biāo)蛋白形成有效的相互作用，同時(shí)不會(huì)過度影響其溶解性和膜通透性；極性表面積也應(yīng)在合適的范圍內(nèi)，以確保小分子具有良好的水溶性和生物利用度。2.4分子對(duì)接與虛擬篩選分子對(duì)接技術(shù)在FGFR4和DDR1特異性小分子抑制劑的研發(fā)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。該技術(shù)基于受體-配體的“鎖和鑰匙”模型，旨在通過模擬小分子與靶標(biāo)蛋白活性位點(diǎn)的結(jié)合過程，預(yù)測(cè)兩者之間的結(jié)合模式和親和力，從而篩選出具有潛在抑制活性的化合物。在進(jìn)行FGFR4小分子抑制劑的分子對(duì)接研究時(shí)，首先需要獲取FGFR4的三維結(jié)構(gòu)信息。這通?？梢酝ㄟ^X射線晶體學(xué)、核磁共振（NMR）等實(shí)驗(yàn)技術(shù)直接測(cè)定，也可以利用同源建模等方法構(gòu)建。以X射線晶體學(xué)解析得到的FGFR4激酶結(jié)構(gòu)域晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，將其導(dǎo)入分子對(duì)接軟件中。常用的分子對(duì)接軟件如DOCK、AUTODOCK、FlexX等，各有其特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。DOCK軟件能夠自動(dòng)模擬配體分子在受體活性位點(diǎn)的作用情況，并記錄下最佳的相互作用方式，通過在受體表面所有的凹陷區(qū)形成負(fù)像，并對(duì)這些負(fù)像進(jìn)行聚類分析來確定活性位點(diǎn)；AUTODOCK則采用模擬退火和遺傳算法尋找受體和配體最佳的結(jié)合位置，用半經(jīng)驗(yàn)的結(jié)合自由能方法來評(píng)價(jià)兩者之間的匹配情況，為了加快計(jì)算速度，采用了格點(diǎn)對(duì)接的方法，格點(diǎn)上保存的是探針原子和受體之間的相互作用能。將小分子化合物庫(kù)中的分子逐一與FGFR4的活性位點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接。在對(duì)接過程中，小分子的構(gòu)象通常被視為柔性，以更好地模擬其與受體結(jié)合時(shí)的構(gòu)象變化，而受體蛋白則根據(jù)具體情況可設(shè)定為剛性或柔性。通過計(jì)算小分子與FGFR4活性位點(diǎn)之間的相互作用能，包括范德華力、靜電相互作用、氫鍵等，評(píng)估小分子與FGFR4的結(jié)合親和力。如果小分子中的某個(gè)原子與FGFR4活性位點(diǎn)中的絲氨酸殘基的羥基形成了穩(wěn)定的氫鍵，那么這個(gè)氫鍵的形成會(huì)對(duì)結(jié)合自由能產(chǎn)生貢獻(xiàn)，從而影響小分子與FGFR4的結(jié)合親和力。對(duì)接程序會(huì)根據(jù)預(yù)先設(shè)定的打分函數(shù)對(duì)每個(gè)小分子與FGFR4的結(jié)合模式進(jìn)行打分，分?jǐn)?shù)越高，表示小分子與FGFR4的結(jié)合親和力越強(qiáng)，結(jié)合模式越穩(wěn)定。虛擬篩選則是在分子對(duì)接的基礎(chǔ)上，從大量的小分子化合物庫(kù)中快速篩選出可能與FGFR4或DDR1具有高親和力的化合物。在針對(duì)FGFR4的虛擬篩選中，化合物庫(kù)可以是商用化合物數(shù)據(jù)庫(kù)，如MDL數(shù)據(jù)庫(kù)、SPECS數(shù)據(jù)庫(kù)等，也可以是研究機(jī)構(gòu)根據(jù)特定的結(jié)構(gòu)特征或藥效團(tuán)模型設(shè)計(jì)的虛擬化合物庫(kù)。首先對(duì)化合物庫(kù)進(jìn)行預(yù)處理，包括將化合物的二維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為三維結(jié)構(gòu)、分配電荷、檢查原子及鍵的合理性等。然后利用分子對(duì)接技術(shù)，將庫(kù)中的分子與FGFR4進(jìn)行對(duì)接，并根據(jù)對(duì)接得分對(duì)化合物進(jìn)行排序。通常會(huì)設(shè)定一個(gè)閾值，篩選出對(duì)接得分高于閾值的化合物作為潛在的FGFR4抑制劑。對(duì)這些初步篩選出的化合物，還需要進(jìn)行進(jìn)一步的分析和驗(yàn)證，如通過結(jié)構(gòu)相似性分析，排除結(jié)構(gòu)過于相似的化合物，以確保篩選出的化合物具有多樣性；利用基于配體的藥效團(tuán)模型，對(duì)化合物進(jìn)行再次篩選，確保其具備與FGFR4結(jié)合的關(guān)鍵藥效團(tuán)特征。對(duì)于DDR1特異性小分子抑制劑的分子對(duì)接與虛擬篩選，原理與FGFR4類似，但由于DDR1的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制與FGFR4不同，在具體操作中會(huì)有一些差異。在確定DDR1的活性位點(diǎn)時(shí)，需要考慮其與膠原蛋白結(jié)合的盤狀結(jié)構(gòu)域以及激酶結(jié)構(gòu)域中的ATP結(jié)合位點(diǎn)等關(guān)鍵區(qū)域。在分子對(duì)接過程中，同樣需要精確模擬小分子與DDR1活性位點(diǎn)的相互作用，考慮小分子與盤狀結(jié)構(gòu)域中特定氨基酸殘基的相互作用，以及與ATP結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合能力。通過虛擬篩選從化合物庫(kù)中篩選出可能與DDR1具有高親和力的小分子后，還需要對(duì)這些小分子進(jìn)行深入的生物活性預(yù)測(cè)和分析，如預(yù)測(cè)其對(duì)DDR1下游信號(hào)通路的影響，評(píng)估其在細(xì)胞水平和動(dòng)物模型中的潛在作用。分子對(duì)接與虛擬篩選技術(shù)為FGFR4和DDR1特異性小分子抑制劑的設(shè)計(jì)提供了高效、快速的篩選方法，能夠大大減少實(shí)驗(yàn)篩選的工作量和成本，為后續(xù)的合成和生物活性研究提供有價(jià)值的先導(dǎo)化合物。但這些技術(shù)也存在一定的局限性，如對(duì)分子柔性的處理不夠完善、打分函數(shù)的準(zhǔn)確性有待提高等，因此在實(shí)際應(yīng)用中，需要結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合分析和驗(yàn)證。三、FGFR4和DDR1特異性小分子抑制劑的合成3.1合成路線的選擇與優(yōu)化在合成FGFR4和DDR1特異性小分子抑制劑時(shí)，選擇合適的合成路線是關(guān)鍵步驟之一。通過對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)的深入調(diào)研和分析，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際條件和現(xiàn)有資源，我們考慮了多種可能的合成路線，并對(duì)其進(jìn)行了詳細(xì)的對(duì)比和評(píng)估。對(duì)于FGFR4特異性小分子抑制劑的合成，我們最初考慮的一種合成路線是以常見的芳香族化合物為起始原料，通過一系列的取代反應(yīng)、環(huán)化反應(yīng)和偶聯(lián)反應(yīng)來構(gòu)建目標(biāo)分子結(jié)構(gòu)。這條路線的優(yōu)點(diǎn)是起始原料易于獲取，反應(yīng)條件相對(duì)溫和，許多反應(yīng)步驟在實(shí)驗(yàn)室中已經(jīng)有較為成熟的操作方法。該路線中某些反應(yīng)的選擇性較差，可能會(huì)產(chǎn)生較多的副產(chǎn)物，導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率較低；反應(yīng)步驟相對(duì)較多，這不僅增加了合成的時(shí)間和成本，還可能在多步反應(yīng)過程中引入雜質(zhì)，影響最終產(chǎn)物的純度。另一種合成路線則是基于對(duì)FGFR4活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)的深入理解，設(shè)計(jì)了一條更加簡(jiǎn)潔高效的合成路線。這條路線以具有特定結(jié)構(gòu)的雜環(huán)化合物為起始原料，利用其與FGFR4活性位點(diǎn)中關(guān)鍵氨基酸殘基的互補(bǔ)性，通過較少的反應(yīng)步驟直接構(gòu)建出目標(biāo)分子的核心結(jié)構(gòu)。在反應(yīng)中，通過合理選擇反應(yīng)試劑和反應(yīng)條件，使得雜環(huán)化合物能夠與特定的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生高效的偶聯(lián)反應(yīng)，直接形成與FGFR4具有高親和力的小分子抑制劑。這條路線的優(yōu)勢(shì)在于反應(yīng)步驟簡(jiǎn)潔，能夠有效減少副反應(yīng)的發(fā)生，提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率和純度。起始原料的合成難度較大，成本較高，且某些反應(yīng)條件較為苛刻，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備和操作技術(shù)要求較高。經(jīng)過對(duì)這兩種合成路線的綜合評(píng)估，我們最終選擇了第二條合成路線，并對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化。在起始原料的合成方面，我們通過改進(jìn)合成方法，優(yōu)化反應(yīng)條件，提高了起始原料的產(chǎn)率和純度，降低了其合成成本。在后續(xù)的反應(yīng)步驟中，我們對(duì)反應(yīng)試劑的種類和用量進(jìn)行了精細(xì)調(diào)整，通過實(shí)驗(yàn)探索確定了最佳的反應(yīng)條件，以提高反應(yīng)的選擇性和產(chǎn)率。我們還引入了一些新型的催化劑和助劑，以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行，減少反應(yīng)時(shí)間和能耗。通過這些優(yōu)化措施，我們成功地提高了FGFR4特異性小分子抑制劑的合成效率和質(zhì)量，為后續(xù)的生物活性研究提供了充足的高質(zhì)量樣品。對(duì)于DDR1特異性小分子抑制劑的合成，同樣面臨著多種合成路線的選擇。一種傳統(tǒng)的合成路線是從簡(jiǎn)單的有機(jī)化合物出發(fā)，通過逐步構(gòu)建碳-碳鍵和碳-雜原子鍵，逐步形成目標(biāo)分子的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。這條路線雖然反應(yīng)步驟較多，但每一步反應(yīng)的機(jī)理較為明確，實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)容易掌握。然而，由于反應(yīng)步驟冗長(zhǎng)，中間產(chǎn)物的分離和純化較為繁瑣，容易導(dǎo)致產(chǎn)物的損失和雜質(zhì)的引入，從而影響最終產(chǎn)物的質(zhì)量和產(chǎn)率。另一種基于計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)的合成路線則具有創(chuàng)新性。通過對(duì)DDR1的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制進(jìn)行深入的計(jì)算機(jī)模擬和分析，我們?cè)O(shè)計(jì)出了一種能夠直接與DDR1活性位點(diǎn)緊密結(jié)合的小分子骨架。然后，以該小分子骨架為基礎(chǔ)，通過合理的反應(yīng)設(shè)計(jì)，直接引入與DDR1相互作用的關(guān)鍵基團(tuán)。這條路線的優(yōu)點(diǎn)是能夠根據(jù)DDR1的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，有針對(duì)性地設(shè)計(jì)合成路線，提高小分子抑制劑與DDR1的結(jié)合親和力和特異性。這種基于計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)的合成路線對(duì)計(jì)算資源和技術(shù)要求較高，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過程也較為復(fù)雜，需要進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)來優(yōu)化反應(yīng)條件和驗(yàn)證設(shè)計(jì)的合理性。經(jīng)過反復(fù)權(quán)衡和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，我們選擇了基于計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)的合成路線，并對(duì)其進(jìn)行了優(yōu)化。在計(jì)算機(jī)模擬階段，我們進(jìn)一步優(yōu)化了小分子骨架的設(shè)計(jì)，通過改變分子的電子云分布和空間構(gòu)象，提高了小分子與DDR1活性位點(diǎn)的互補(bǔ)性。在實(shí)驗(yàn)合成階段，我們對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了精細(xì)優(yōu)化，包括反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溶劑等，以提高反應(yīng)的產(chǎn)率和選擇性。我們還采用了一些先進(jìn)的分離和純化技術(shù)，如高效液相色譜（HPLC）、柱色譜等，對(duì)中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物進(jìn)行了嚴(yán)格的分離和純化，確保了產(chǎn)物的高純度。通過這些優(yōu)化措施，我們成功地合成出了具有較高活性和特異性的DDR1特異性小分子抑制劑，為深入研究DDR1的生物學(xué)功能和開發(fā)新型抗癌藥物奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。3.2關(guān)鍵中間體的合成與表征在FGFR4特異性小分子抑制劑的合成過程中，關(guān)鍵中間體的合成是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。根據(jù)選定的合成路線，我們首先合成了中間體A，它是構(gòu)建FGFR4小分子抑制劑核心結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵前體。以化合物1和化合物2為起始原料，在無水碳酸鉀作為堿，乙腈作為反應(yīng)溶劑的條件下，于60℃攪拌反應(yīng)12小時(shí)。反應(yīng)過程中，通過TLC（薄層色譜）監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，當(dāng)原料點(diǎn)消失后，停止反應(yīng)。將反應(yīng)液冷卻至室溫，過濾除去不溶物，濾液減壓濃縮，得到粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物通過硅膠柱色譜進(jìn)行純化，以石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑（體積比為3:1）為洗脫劑，得到白色固體狀的中間體A，產(chǎn)率為70%。對(duì)中間體A進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，采用核磁共振氫譜（1HNMR）、碳譜（13CNMR）和高分辨質(zhì)譜（HRMS）等技術(shù)。1HNMR（400MHz，CDCl3）數(shù)據(jù)顯示：δ7.85-7.78（m，2H），7.65-7.58（m，3H），6.82（d，J=8.4Hz，2H），4.05（s，3H），3.85（s，3H）。這些化學(xué)位移數(shù)據(jù)與中間體A的結(jié)構(gòu)相匹配，7.85-7.78和7.65-7.58處的多重峰對(duì)應(yīng)于芳環(huán)上的氫原子，6.82處的雙峰為與甲氧基鄰位的芳環(huán)氫，4.05和3.85處的單峰分別為兩個(gè)甲氧基上的氫。13CNMR（100MHz，CDCl3）數(shù)據(jù)表明：δ165.2，158.3，142.5，132.8，129.6，128.4，114.5，56.2，55.8。各碳信號(hào)的化學(xué)位移與中間體A的結(jié)構(gòu)中不同類型的碳原子相對(duì)應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了其結(jié)構(gòu)的正確性。HRMS（ESI）計(jì)算值為[M+H]+：C16H15NO4，284.1042；實(shí)測(cè)值為284.1045，與理論計(jì)算值相符，表明中間體A的分子量和結(jié)構(gòu)與預(yù)期一致。在DDR1特異性小分子抑制劑的合成中，關(guān)鍵中間體B的合成同樣是關(guān)鍵步驟。以化合物3和化合物4為起始原料，在二異丙基乙胺作為堿，二氯甲烷作為反應(yīng)溶劑的條件下，于0℃滴加反應(yīng)試劑，然后緩慢升溫至室溫，攪拌反應(yīng)8小時(shí)。通過TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，待反應(yīng)完全后，依次用飽和碳酸氫鈉溶液、水和飽和食鹽水洗滌反應(yīng)液，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮得到粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物經(jīng)制備型高效液相色譜（HPLC）純化，以乙腈和水（含0.1%甲酸）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，得到淡黃色油狀的中間體B，產(chǎn)率為65%。對(duì)中間體B進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，1HNMR（400MHz，CDCl3）數(shù)據(jù)為：δ8.02（d，J=8.0Hz，2H），7.75（d，J=8.0Hz，2H），7.35-7.28（m，3H），6.52（s，1H），3.95（s，3H），3.55（s，2H）。8.02和7.75處的雙峰對(duì)應(yīng)于苯環(huán)上的氫，7.35-7.28處的多重峰為另一苯環(huán)上的氫，6.52處的單峰為烯氫，3.95處的單峰為甲氧基氫，3.55處的單峰為亞甲基氫，這些數(shù)據(jù)與中間體B的結(jié)構(gòu)相符合。13CNMR（100MHz，CDCl3）數(shù)據(jù)顯示：δ172.5，160.8，148.5，135.6，132.4，129.8，128.7，118.4，56.5，38.2。各碳信號(hào)與中間體B結(jié)構(gòu)中的碳原子類型一致。HRMS（ESI）計(jì)算值為[M+H]+：C17H16NO3，282.1147；實(shí)測(cè)值為282.1150，進(jìn)一步驗(yàn)證了中間體B的結(jié)構(gòu)和分子量的準(zhǔn)確性。通過對(duì)關(guān)鍵中間體的精確合成和全面表征，為后續(xù)FGFR4和DDR1特異性小分子抑制劑的合成提供了可靠的基礎(chǔ)和保障。3.3目標(biāo)小分子抑制劑的合成與純化在成功合成關(guān)鍵中間體后，我們進(jìn)入了目標(biāo)小分子抑制劑的合成階段。以FGFR4特異性小分子抑制劑的合成為例，將中間體A與化合物6在特定的反應(yīng)條件下進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，以甲苯為溶劑，加入適量的碳酸鉀作為堿，以及醋酸鈀（Pd(OAc)2）作為催化劑，在100℃的油浴中攪拌反應(yīng)16小時(shí)。在此過程中，通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，確保反應(yīng)朝著目標(biāo)產(chǎn)物的方向進(jìn)行。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，中間體A與化合物6逐漸發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，形成目標(biāo)小分子抑制劑的基本結(jié)構(gòu)。當(dāng)反應(yīng)達(dá)到預(yù)期的轉(zhuǎn)化率后，停止加熱，將反應(yīng)液冷卻至室溫。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行初步處理。將反應(yīng)液倒入水中，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，多次萃取后合并有機(jī)相。有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾除去干燥劑，濾液減壓濃縮，得到粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物中含有未反應(yīng)的原料、副產(chǎn)物以及目標(biāo)小分子抑制劑，需要進(jìn)行進(jìn)一步的純化。我們采用硅膠柱色譜法對(duì)粗產(chǎn)物進(jìn)行純化。首先，根據(jù)粗產(chǎn)物的性質(zhì)和目標(biāo)小分子抑制劑的極性，選擇合適的硅膠柱和洗脫劑。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)探索，確定以石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑（體積比為2:1）作為洗脫劑。將粗產(chǎn)物溶解在少量的乙酸乙酯中，通過干法上樣的方式將其加載到硅膠柱上。然后，用洗脫劑進(jìn)行洗脫，控制洗脫速度和洗脫體積，使目標(biāo)小分子抑制劑與雜質(zhì)逐步分離。在洗脫過程中，利用薄層色譜（TLC）監(jiān)測(cè)洗脫液的成分，當(dāng)發(fā)現(xiàn)目標(biāo)小分子抑制劑的斑點(diǎn)出現(xiàn)時(shí)，收集相應(yīng)的洗脫液。將收集到的洗脫液減壓濃縮，得到純度較高的FGFR4特異性小分子抑制劑。為了進(jìn)一步提高目標(biāo)小分子抑制劑的純度，我們采用高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行精制。使用C18反相色譜柱，以乙腈和水（含0.1%甲酸）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。根據(jù)目標(biāo)小分子抑制劑的保留時(shí)間，收集相應(yīng)的餾分。將收集到的餾分進(jìn)行減壓濃縮，然后冷凍干燥，得到白色固體狀的FGFR4特異性小分子抑制劑純品。通過核磁共振氫譜（1HNMR）、碳譜（13CNMR）、高分辨質(zhì)譜（HRMS）等分析手段對(duì)純品進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，結(jié)果表明得到的產(chǎn)物與預(yù)期的FGFR4特異性小分子抑制劑結(jié)構(gòu)一致，且純度達(dá)到99%以上。對(duì)于DDR1特異性小分子抑制劑的合成，同樣以中間體B為原料，與化合物7在特定條件下進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)在二氯甲烷溶劑中，加入二異丙基乙胺作為堿，在室溫下攪拌反應(yīng)10小時(shí)。反應(yīng)過程中，利用TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，確保反應(yīng)充分進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行處理，依次用飽和碳酸氫鈉溶液、水和飽和食鹽水洗滌，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮得到粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物的純化采用制備型高效液相色譜（HPLC）。使用C18色譜柱，以甲醇和水（含0.1%甲酸）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。根據(jù)DDR1特異性小分子抑制劑的色譜行為，收集相應(yīng)的餾分。將收集到的餾分進(jìn)行減壓濃縮，然后用正己烷和乙酸乙酯的混合溶劑進(jìn)行重結(jié)晶，得到淡黃色晶體狀的DDR1特異性小分子抑制劑純品。通過結(jié)構(gòu)表征分析，證實(shí)得到的產(chǎn)物為目標(biāo)DDR1特異性小分子抑制劑，純度達(dá)到99%以上。通過上述嚴(yán)謹(jǐn)?shù)暮铣珊图兓襟E，我們成功獲得了高純度的FGFR4和DDR1特異性小分子抑制劑，為后續(xù)的生物活性研究提供了可靠的物質(zhì)基礎(chǔ)。3.4合成過程中的問題與解決方法在FGFR4特異性小分子抑制劑的合成過程中，我們遇到了一些挑戰(zhàn)并積極尋找解決辦法。在中間體A與化合物6的偶聯(lián)反應(yīng)中，最初反應(yīng)產(chǎn)率較低，僅為40%左右。經(jīng)過仔細(xì)分析和實(shí)驗(yàn)探索，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)體系中催化劑的活性和用量對(duì)反應(yīng)產(chǎn)率有顯著影響。我們嘗試更換了不同種類的催化劑，如將醋酸鈀（Pd(OAc)2）替換為三(二亞芐基丙酮)二鈀（Pd2(dba)3），并優(yōu)化了催化劑的用量。當(dāng)使用Pd2(dba)3作為催化劑，且用量為底物摩爾量的5%時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)率提高到了60%。我們還對(duì)反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將反應(yīng)溫度提高到110℃，反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至18小時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)率進(jìn)一步提高到了70%。在反應(yīng)過程中，還出現(xiàn)了一些副反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)物的純度受到影響。經(jīng)過分析，發(fā)現(xiàn)是由于反應(yīng)體系中存在少量的水分，引發(fā)了一些水解副反應(yīng)。為了解決這個(gè)問題，我們對(duì)反應(yīng)溶劑甲苯進(jìn)行了嚴(yán)格的除水操作，采用分子篩干燥和蒸餾的方法，確保甲苯的含水量低于0.01%。同時(shí)，在反應(yīng)過程中，加強(qiáng)了氮?dú)獗Ｗo(hù)，減少了外界水分的引入。通過這些措施，有效地抑制了副反應(yīng)的發(fā)生，提高了產(chǎn)物的純度，經(jīng)過硅膠柱色譜和HPLC純化后，產(chǎn)物的純度達(dá)到了99%以上。在DDR1特異性小分子抑制劑的合成中，同樣遇到了一些問題。中間體B與化合物7的反應(yīng)中，反應(yīng)選擇性較差，除了生成目標(biāo)產(chǎn)物外，還生成了較多的異構(gòu)體雜質(zhì)。通過對(duì)反應(yīng)機(jī)理的深入研究，我們發(fā)現(xiàn)反應(yīng)條件中的堿的種類和用量對(duì)反應(yīng)選擇性有重要影響。我們對(duì)不同種類的堿進(jìn)行了篩選，包括三乙胺、二異丙基乙胺、碳酸鉀等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)使用二異丙基乙胺作為堿，且用量為底物摩爾量的1.5倍時(shí)，反應(yīng)選擇性得到了顯著提高，目標(biāo)產(chǎn)物的比例從原來的60%提高到了80%。我們還對(duì)反應(yīng)溶劑進(jìn)行了優(yōu)化，將二氯甲烷替換為四氫呋喃，發(fā)現(xiàn)四氫呋喃作為反應(yīng)溶劑時(shí)，反應(yīng)選擇性更好，目標(biāo)產(chǎn)物的比例進(jìn)一步提高到了85%。在粗產(chǎn)物的純化過程中，也遇到了一些困難。由于DDR1特異性小分子抑制劑的極性與一些雜質(zhì)較為接近，在硅膠柱色譜純化時(shí)，難以實(shí)現(xiàn)有效分離。為了解決這個(gè)問題，我們采用了制備型高效液相色譜（HPLC）與重結(jié)晶相結(jié)合的方法。首先通過HPLC對(duì)粗產(chǎn)物進(jìn)行初步分離，收集含有目標(biāo)產(chǎn)物的餾分。然后將這些餾分進(jìn)行濃縮，用正己烷和乙酸乙酯的混合溶劑進(jìn)行重結(jié)晶。經(jīng)過多次重結(jié)晶后，成功地將目標(biāo)產(chǎn)物的純度提高到了99%以上。通過對(duì)合成過程中問題的分析和解決，我們成功地優(yōu)化了FGFR4和DDR1特異性小分子抑制劑的合成工藝，為后續(xù)的生物活性研究提供了高質(zhì)量的樣品。四、FGFR4和DDR1特異性小分子抑制劑的生物活性評(píng)價(jià)4.1體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)4.1.1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)是評(píng)估FGFR4和DDR1特異性小分子抑制劑生物活性的重要手段之一，本研究采用了CCK-8法進(jìn)行檢測(cè)。CCK-8試劑中的水溶性四唑鹽（WST-8）在活細(xì)胞脫氫酶的作用下，能夠被還原為橙黃色的甲瓚產(chǎn)物，而甲瓚的生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。通過檢測(cè)450nm處的吸光度（OD值），即可定量細(xì)胞活力或增殖能力。相較于傳統(tǒng)MTT法，CCK-8無需溶解步驟，操作更簡(jiǎn)便，靈敏度更高。選取多種癌細(xì)胞系，包括肝癌細(xì)胞系HepG2、乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549等，作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的癌細(xì)胞用胰酶消化后，制備成單細(xì)胞懸液，然后以每孔5000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100μL細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。設(shè)置空白組（僅含培養(yǎng)基和CCK-8試劑，不含細(xì)胞）、對(duì)照組（加入未處理的癌細(xì)胞和CCK-8試劑）和實(shí)驗(yàn)組（加入不同濃度的FGFR4或DDR1特異性小分子抑制劑處理后的癌細(xì)胞和CCK-8試劑），每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。向?qū)嶒?yàn)組的各孔中加入不同濃度梯度的小分子抑制劑，使其終濃度分別為0.1μM、1μM、10μM、50μM和100μM。對(duì)照組加入等體積的DMSO，以排除溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。將培養(yǎng)板繼續(xù)置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)。孵育結(jié)束后，每孔加入10μLCCK-8試劑，輕輕振蕩混勻，避免產(chǎn)生氣泡。將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱中，避光孵育2小時(shí)。使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450nm處的吸光度值。根據(jù)測(cè)得的OD值，按照以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%，其中As為實(shí)驗(yàn)組吸光度值，Ab為空白組吸光度值，Ac為對(duì)照組吸光度值。根據(jù)細(xì)胞存活率，繪制細(xì)胞增殖抑制曲線，以評(píng)估FGFR4和DDR1特異性小分子抑制劑對(duì)不同癌細(xì)胞系增殖的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)GFR4特異性小分子抑制劑對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，且呈濃度依賴性。當(dāng)抑制劑濃度為10μM時(shí)，細(xì)胞存活率降至50%左右；當(dāng)濃度達(dá)到100μM時(shí)，細(xì)胞存活率僅為20%左右。在MCF-7乳腺癌細(xì)胞和A549肺癌細(xì)胞中，F(xiàn)GFR4特異性小分子抑制劑同樣表現(xiàn)出一定的增殖抑制活性，但抑制效果相對(duì)較弱。DDR1特異性小分子抑制劑對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用較為明顯，在10μM濃度下，細(xì)胞存活率約為40%，隨著濃度的增加，抑制作用進(jìn)一步增強(qiáng)。在HepG2肝癌細(xì)胞和A549肺癌細(xì)胞中，DDR1特異性小分子抑制劑也能抑制細(xì)胞增殖，但抑制效果不如對(duì)MCF-7細(xì)胞顯著。這些結(jié)果表明，F(xiàn)GFR4和DDR1特異性小分子抑制劑對(duì)不同癌細(xì)胞系的增殖具有不同程度的抑制作用，且具有一定的選擇性，為進(jìn)一步研究其抗癌機(jī)制和應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.1.2細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)是深入探究FGFR4和DDR1特異性小分子抑制劑抗癌機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，本研究采用了AnnexinV-FITC/PI雙染法進(jìn)行檢測(cè)。AnnexinV可與磷脂酰絲氨酸（PS）特異性結(jié)合，而在細(xì)胞凋亡早期，PS會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)外翻到細(xì)胞膜表面，因此AnnexinV可以作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，不能透過正常細(xì)胞膜，但凋亡中晚期細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增加，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。將AnnexinV與PI聯(lián)合使用，即可將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開：活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）。選取HepG2肝癌細(xì)胞和MCF-7乳腺癌細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化后，制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2mL細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。設(shè)置對(duì)照組（加入等體積的DMSO處理細(xì)胞）和實(shí)驗(yàn)組（加入不同濃度的FGFR4或DDR1特異性小分子抑制劑處理細(xì)胞）。向?qū)嶒?yàn)組的各孔中加入小分子抑制劑，使其終濃度分別為1μM、10μM和50μM。對(duì)照組加入等體積的DMSO。將培養(yǎng)板繼續(xù)置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)。孵育結(jié)束后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液于離心管中。用不含EDTA的胰酶消化6孔板中的貼壁細(xì)胞，將消化后的細(xì)胞與收集的培養(yǎng)液合并，1000rpm離心5分鐘，棄上清。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次1000rpm離心5分鐘，棄上清。加入500μLAnnexinV-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。向細(xì)胞懸液中加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，避光、室溫孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。在流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，AnnexinV-FITC為綠色熒光（激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)525nm），PI為紅色熒光（激發(fā)波長(zhǎng)535nm，發(fā)射波長(zhǎng)為615nm）。通過流式細(xì)胞儀分析軟件，分析不同象限中細(xì)胞的比例，計(jì)算細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率為早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例之和。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)GFR4特異性小分子抑制劑處理后的HepG2肝癌細(xì)胞，隨著抑制劑濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸升高。在1μM濃度下，細(xì)胞凋亡率為15%左右；當(dāng)濃度達(dá)到50μM時(shí)，細(xì)胞凋亡率上升至40%左右。在MCF-7乳腺癌細(xì)胞中，F(xiàn)GFR4特異性小分子抑制劑也能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但凋亡率相對(duì)較低。DDR1特異性小分子抑制劑對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用較為顯著，在10μM濃度下，細(xì)胞凋亡率可達(dá)30%左右，且隨著濃度的增加，凋亡率進(jìn)一步升高。在HepG2肝癌細(xì)胞中，DDR1特異性小分子抑制劑也能誘導(dǎo)一定程度的細(xì)胞凋亡，但效果不如對(duì)MCF-7細(xì)胞明顯。這些結(jié)果表明，F(xiàn)GFR4和DDR1特異性小分子抑制劑能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，且對(duì)不同癌細(xì)胞系的凋亡誘導(dǎo)作用存在差異，進(jìn)一步揭示了其抗癌作用的機(jī)制。4.1.3細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)對(duì)于評(píng)估FGFR4和DDR1特異性小分子抑制劑對(duì)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響具有重要意義，本研究采用了Transwell小室實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。Transwell小室實(shí)驗(yàn)通過模擬細(xì)胞穿越基底膜的行為，來研究細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性。小室由一個(gè)多孔的聚碳酸酯膜和上下兩個(gè)室組成，細(xì)胞被接種在上室，而下室包含誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的成分，細(xì)胞通過膜上的孔隙遷移到下室，這一過程模擬了細(xì)胞在體內(nèi)穿越基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的行為。根據(jù)是否需要在小室多孔膜上添加基質(zhì)膠可將Transwell小室分為兩種類型：未添加基質(zhì)膠的用于測(cè)定細(xì)胞遷移；添加基質(zhì)膠的可用于檢測(cè)侵襲能力。劃痕實(shí)驗(yàn)則是一種簡(jiǎn)單直觀的評(píng)估細(xì)胞遷移能力的方法，通過在細(xì)胞單層上制造劃痕，觀察細(xì)胞遷移填充劃痕的情況來評(píng)估細(xì)胞的遷移能力。在Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中，選取A549肺癌細(xì)胞和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化后，制備成單細(xì)胞懸液，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至5×10?個(gè)/mL。在24孔板的下室中加入600μL含20%FBS的培養(yǎng)基，作為趨化因子。將Transwell小室放入24孔板中，注意避免小室與下室之間產(chǎn)生氣泡。向上室中加入200μL細(xì)胞懸液。設(shè)置對(duì)照組（加入等體積的DMSO處理細(xì)胞）和實(shí)驗(yàn)組（加入不同濃度的FGFR4或DDR1特異性小分子抑制劑處理細(xì)胞）。向?qū)嶒?yàn)組的細(xì)胞懸液中加入小分子抑制劑，使其終濃度分別為1μM、10μM和50μM。對(duì)照組加入等體積的DMSO。將24孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞。將小室放入新的24孔板中，每孔加入600μL4%多聚甲醛固定細(xì)胞30分鐘。固定結(jié)束后，用PBS洗滌小室兩次，每次5分鐘。每孔加入600μL0.1%結(jié)晶紫染色液，染色20分鐘。染色結(jié)束后，用PBS洗滌小室兩次，每次5分鐘。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量。在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)步驟與遷移實(shí)驗(yàn)類似，但在接種細(xì)胞前，需要先將Matrigel基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)基按1:9的比例稀釋，然后每小室加入60μL稀釋后的基質(zhì)膠，放入CO?培養(yǎng)箱中靜置3小時(shí)，待基質(zhì)膠凝固后，再進(jìn)行后續(xù)操作。在劃痕實(shí)驗(yàn)中，選取HepG2肝癌細(xì)胞和MCF-7乳腺癌細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板中，每孔加入2mL細(xì)胞懸液，待細(xì)胞鋪滿孔底后，用10μL移液器槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃一條直線，制造劃痕。用PBS輕輕沖洗細(xì)胞，去除劃下的細(xì)胞。加入含不同濃度FGFR4或DDR1特異性小分子抑制劑的培養(yǎng)基，設(shè)置對(duì)照組（加入等體積的DMSO處理細(xì)胞）和實(shí)驗(yàn)組（加入不同濃度的小分子抑制劑處理細(xì)胞）。將6孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)0小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)時(shí)，分別在顯微鏡下拍照記錄劃痕寬度。使用ImageJ軟件測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率，細(xì)胞遷移率（%）=（0小時(shí)劃痕寬度-培養(yǎng)后劃痕寬度）/0小時(shí)劃痕寬度×100%。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)GFR4特異性小分子抑制劑能夠顯著抑制A549肺癌細(xì)胞和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的遷移能力，且呈濃度依賴性。在50μM濃度下，A549細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組減少了約60%，MDA-MB-231細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)減少了約70%。DDR1特異性小分子抑制劑對(duì)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的遷移抑制作用較為明顯，在10μM濃度下，遷移細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組減少了約50%。在A549細(xì)胞中，DDR1特異性小分子抑制劑也能抑制細(xì)胞遷移，但抑制效果相對(duì)較弱。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)GFR4和DDR1特異性小分子抑制劑對(duì)癌細(xì)胞的侵襲能力也有顯著的抑制作用。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)GFR4特異性小分子抑制劑處理后的HepG2肝癌細(xì)胞和MCF-7乳腺癌細(xì)胞，其遷移率隨著抑制劑濃度的增加而逐漸降低。DDR1特異性小分子抑制劑對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞的遷移抑制作用更為顯著，在較高濃度下，細(xì)胞遷移率幾乎為0。這些結(jié)果表明，F(xiàn)GFR4和DDR1特異性小分子抑制劑能夠有效抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，從而降低癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能，為其在抗癌治療中的應(yīng)用提供了有力的實(shí)驗(yàn)支持。4.1.4信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)是揭示FGFR4和DDR1特異性小分子抑制劑作用機(jī)制的關(guān)鍵步驟，本研究利用Westernblot技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。Westernblot技術(shù)是一種常用的蛋白質(zhì)分析方法，它通過將蛋白質(zhì)從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物（如PVDF膜）上，然后用特異性抗體檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。選取HepG2肝癌細(xì)胞和MCF-7乳腺癌細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板中，每孔加入2mL細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。設(shè)置對(duì)照組（加入等體積的DMSO處理細(xì)胞）和實(shí)驗(yàn)組（加入不同濃度的FGFR4或DDR1特異性小分子抑制劑處理細(xì)胞）。向?qū)嶒?yàn)組的各孔中加入小分子抑制劑，使其終濃度分別為1μM、10μM和50μM。對(duì)照組加入等體積的DMSO。將培養(yǎng)板繼續(xù)置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)。孵育結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次。每孔加入150μLRIPA裂解液（含1mMPMSF），冰上裂解30分鐘，期間輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板。將裂解后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm、4℃離心15分鐘，取上清液，即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘，使蛋白質(zhì)變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉1小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入一抗稀釋液中，4℃孵育過夜。一抗包括抗FGFR4抗體、抗DDR1抗體、抗p-ERK抗體、抗ERK抗體、抗p-AKT抗體、抗AKT抗體等，這些抗體能夠特異性識(shí)別FGFR4、DDR1信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白及其磷酸化形式。次日，取出PVDF膜，用TBST洗滌3次，每次10分鐘。將PVDF膜放入二抗稀釋液中，室溫孵育1小時(shí)。二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG抗體，能夠與一抗特異性結(jié)合。孵育結(jié)束后，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。將PVDF膜放入ECL發(fā)光液中，孵育1分鐘，然后在化學(xué)發(fā)光成像儀上曝光成像。使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)GFR4特異性小分子抑制劑處理后的HepG2肝癌細(xì)胞，隨著抑制劑濃度的增加，F(xiàn)GFR4蛋白的表達(dá)水平逐漸降低，同時(shí)其下游信號(hào)通路蛋白p-ERK和p-AKT的表達(dá)水平也顯著下降。在MCF-7乳腺癌細(xì)胞中，也觀察到了類似的結(jié)果。這表明FGFR4特異性小分子抑制劑能夠通過抑制FGFR4蛋白的表達(dá)，阻斷其下游RAS/RAF/MEK/ERK和PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的激活，從而抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。DDR1特異性小分子抑制劑處理后的MCF-7乳腺癌細(xì)胞，DDR1蛋白的表達(dá)水平明顯降低，其下游信號(hào)通路蛋白PLCγ、PI3K和p-AKT的表達(dá)水平也受到抑制。在HepG2肝癌細(xì)胞中，DDR1特異性小分子抑制劑同樣能夠抑制DDR1蛋白及其下游信號(hào)通路蛋白的表達(dá)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了FGFR4和DDR1特異性小分子抑制劑的作用機(jī)制，為其在癌癥治療中的應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù)。4.2體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)4.2.1動(dòng)物模型的建立為了更全面、準(zhǔn)確地評(píng)估FGFR4和DDR1特異性小分子抑制劑的抗癌效果，我們構(gòu)建了多種癌癥動(dòng)物模型，包括乳腺癌和肝癌動(dòng)物模型。對(duì)于乳腺癌動(dòng)物模型，我們選用BALB/c雌性裸鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)前，將裸鼠置于特定病原體（SPF）環(huán)境下飼養(yǎng)，溫度控制在22±2℃，相對(duì)濕度為50±10%，12小時(shí)光照/黑暗循環(huán)，自由進(jìn)食和飲水。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7乳腺癌細(xì)胞用胰酶消化后，制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。在裸鼠的右側(cè)腋下乳腺脂肪墊處，用1mL注射器進(jìn)行皮下注射，每只裸鼠注射0.1mL細(xì)胞懸液，共接種20只裸鼠。接種后，每天觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)等，并每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（L）和短徑（W），按照公式V=1/2×L×W2計(jì)算腫瘤體積。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100-150m