《分子生物學(xué)常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)》課堂練習(xí)題參考答案

學(xué)號(hào)：姓名:

一、填空題。

1.在用SDS分離DNA時(shí)，要注意SDS濃度,0.1%和1%的SDS作用是不同的，前者,

后者o

2.SDS是一種提取DNA時(shí)常用的陰離子去污劑，它可以溶解膜蛋白和脂肪，使細(xì)胞膜司核膜破

裂，使核小體和核糖體解聚，糕放出。它還可以使蛋白質(zhì)變性沉淀，也能克制。

3.在分離DNA時(shí)，需要帶手套操作，是由于。

4.用酚?氯仿抽提DNA時(shí)，通常在氯仿或酚-氯仿中加入少許異戊醇，這是由于有機(jī)溶劑異戊醇

可以o此外，異戊醉有助于分相，使離心后的上層含DNA

的水相、中間的變性蛋白質(zhì)相和下層有機(jī)溶劑相維持稔定。

5.在分離DNA時(shí)，要用金屬離子整合劑，如EDTA和檸檬酸等，其目的是：。

6.在DNA分離過(guò)程中，導(dǎo)致DNA分子斷裂的因素很多，重要有：、和

_______

7.在分離DNA時(shí)，常用酸變性、堿變性、熱變性和來(lái)去除蛋白質(zhì)。

8.用乙醇沉淀DNA的原理是：。

9.用乙醇沉淀DNA時(shí)，通常在DNA溶液中加入單價(jià)陽(yáng)離子，如氯化鈉和乙酸鈉，其目的

是。

10.通?？稍?種溫度下保存DNA：4?5℃、-20C和-70℃,其中以℃為好。

11.濃縮DNA的方法通常有：包埋吸水法、蒸發(fā)法、膜過(guò)濾法和

12.破裂解法和清亮裂解法是分離質(zhì)粒的兩種常用方法，兩者的原理不同，前者是根

據(jù)，后者是根據(jù)O

13.在技術(shù)中，DNA限制性酹切片段經(jīng)凝膠電泳分離后，被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維

素薄膜上，然后與放射性標(biāo)記的DNA探針雜交。

14.SSC是氯化鈉和檸檬酸鈉組成的試劑，其中前者作用是：，后者的作用

是：。

15.在southern雜交中，DNA轉(zhuǎn)移的速度取決于________、和。

16.在重蒸酚中加入1%的8-羥基喳咻及少量B-疏基乙醇，不僅可以防止酚氧化，還可以克制—

活性以及。

17.RNA分子經(jīng)凝膠電泳后按大小不同分開(kāi)，然后被轉(zhuǎn)移到一張硝酸纖維素膜（尼龍膜）上，同

一放射性DMA探針雜交的技術(shù)稱o

18.根據(jù)Northern雜交結(jié)果可以說(shuō)明.

19.cDNA技術(shù)是進(jìn)行真核基因克隆的一種通用方法，由于它可以用為模板。

20.將具有一個(gè)mRNA的DNA拷貝的克隆稱為一個(gè),源于同一批RNA制備物的克隆

群則構(gòu)建成了一個(gè)o

21.受體細(xì)胞的感受態(tài)是的生理狀態(tài)。

22.感受態(tài)細(xì)胞是可以誘導(dǎo)的，誘導(dǎo)方法有、和等。

23.人工感受態(tài)細(xì)胞的大腸桿菌在溫度為℃時(shí)吸附DNA,在°C時(shí)攝入DNA。

24.為了提高重組DNA分子對(duì)E.coli的轉(zhuǎn)化效率，通?？刹捎煤汀?/p>

25.環(huán)狀質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率很低，通常是線性雙鏈DNA轉(zhuǎn)化效率的o

26.SalI是辨認(rèn)6個(gè)核甘酸的酶，其辨認(rèn)切割的理論值是每個(gè)堿基就有一個(gè)切點(diǎn)，但

在哺乳動(dòng)物中大約300Kb個(gè)堿基才有一個(gè)切點(diǎn)。

27.重組DNA技術(shù)常用的限制性內(nèi)切核酸酶可辨認(rèn)某些特異堿基序列，具有結(jié)構(gòu)。

28.產(chǎn)生平末端的方法通常有：、和。

29.在酶切反映管加完各種反映物后，要離心2秒，其目的是：和。

30.連接酶是一類(lèi)用于核酸分子連接形成的核酸合成酶，有DNA連接前和RNA連接

酶之分。

31.為了防止載體DNA自身環(huán)化，可用脫去雙鏈DNA的。

32.用于克隆的DNA片段，在質(zhì)量上規(guī)定：1）穩(wěn)定性，保持其分子構(gòu)型；2）低蛋白質(zhì)含量；3）

純度要高，不含;4）不含可透析的小分子，如酒精等。

33.構(gòu)建基因組文庫(kù)時(shí)連接方法重要是；而構(gòu)建cDNA文庫(kù)，可用

或o

34.克隆一個(gè)編碼某種蛋白質(zhì)的基因必須考慮其表達(dá)的三個(gè)基本條件：、

和O

二、判斷題。

1.氯霉素?cái)U(kuò)增DNA時(shí)，加氯霉素的時(shí)間是重要的，由于加得太早，菌數(shù)不夠，加人時(shí)間過(guò)遲，

菌齡過(guò)老，容易自溶。（）

2.在DNA貯存液中加一滴三氯甲烷，可防止真茵的污染。（）

3.DNA、RNA在pH8.5的TAE緩沖夜中電泳時(shí)，由正極向負(fù)極移動(dòng)。（）

4.作為一個(gè)基因克隆的載體，重要由藥物抗性基因、供插入外源DNA片段的多克隆位點(diǎn)和外源

片段插入篩選標(biāo)志這3大部分構(gòu)成。（）

5.用pUC質(zhì)粒作克隆載體克隆DNA時(shí)，人們用顯色法篩選重組質(zhì)粒，即在有IPTG和X-gal的

平板上，顯示白色的菌落具有原始質(zhì)粒，而顯示藍(lán)色的菌落具有重組質(zhì)粒。（）

6.在克隆載體pUC系列中，完整的/acZ基因提供了一個(gè)外源基因插入的篩選標(biāo)記，藍(lán)色的轉(zhuǎn)化

菌落通常表白克隆是失敗的。（）

7.在克隆載體pBSK質(zhì)粒中，運(yùn)用完整的〃/c、Z基因作為篩選標(biāo)記，白色的轉(zhuǎn)化菌落表白重組質(zhì)

?？隙ú迦胪庠雌巍＃ǎ?/p>

8.X-gal顯色反映的基本原理是使載體與受體互補(bǔ)的失活,（）

9.堿法和煮沸法分離質(zhì)粒DNA的原理是不同的。（）

10.根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫(kù)分為基因組文庫(kù)、cDNA文庫(kù)等。（）

11.一旦有了一套已知序列的基因組克隆，通過(guò)從文庫(kù)中獲得覆蓋目的突變基因所在基因組區(qū)的所

有克隆，就可以進(jìn)行染色體步移。（）

12.核酸雜交的原理是根據(jù)分子間雜交。（）

13.在Northern雜交中，為了防止RNA形成部分發(fā)夾結(jié)構(gòu)，影響遷移率，所以要用變性緩沖液進(jìn)

行電泳。（）

14.用限制性內(nèi)切核酸酶Bglll（辨認(rèn)位點(diǎn)是AIGATCT）前切載體DNA,用BamHI（辨認(rèn)位

點(diǎn)是GIGATCC）酹切供體DNA,可以直接通過(guò)粘性末端進(jìn)行連接。（）

15.不匹配的粘性末端可以通過(guò)部分填補(bǔ)或補(bǔ)平后進(jìn)行連接。（）

16.單克隆抗體是淋巴細(xì)胞和瘤細(xì)胞雜交后形成的單個(gè)雜交瘤細(xì)胞經(jīng)無(wú)性繁殖而生特異性抗體。

（）

17.基因組學(xué)強(qiáng)調(diào)從基因組的整體而不是單個(gè)基因的角度把握生物體遺傳變異的規(guī)律。（）

18.運(yùn)用足夠數(shù)量的STS標(biāo)簽，可擬定所有DNA大片段在染色體或基因組中的位置。（）

19.clonecontig法的原理是一方面用酸水解法把待測(cè)基因組降解為數(shù)10萬(wàn)堿基對(duì)以上的片段，再

分別對(duì)各片段進(jìn)行測(cè)序。（）

20.靶標(biāo)鳥(niǎo)槍法一方面根據(jù)染色體上已知基因或遺傳標(biāo)簽的位置來(lái)擬定部分DNA片段的排列順

序，再逐步擬定各片段在染色體上的相對(duì)位置。（）

三、單項(xiàng)選擇題。

1.乙醇沉淀DNA時(shí)，下列何種長(zhǎng)度的核甘酸不能被沉淀？

A、lObp；B、lOObp；C、200bp：D、lOOObpo

2.用堿法分離質(zhì)粒DNA的基本原理是：

A、染色體DNA斷裂成碎片；B、染色體DNA分子量大，不能釋放；

C、染色體DNA變性后來(lái)不及復(fù)性；D、染色體DNA未與蛋白質(zhì)分開(kāi)而沉淀。

3.Southern雜交可檢測(cè)：

A、目的基因的表達(dá)豐度B、基因組中目的基因的存在

C、蛋白質(zhì)表達(dá)D、FI的基因是否表達(dá)

4.蛋白質(zhì)雙向電泳中，決定了SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳中的遷移率。

A、等電點(diǎn)B、相對(duì)分子量C、空間結(jié)構(gòu)D、電荷量

5.粘末端連接法，不僅操作簡(jiǎn)樸，并且

A、產(chǎn)生新切點(diǎn)：B、易于回收外源片段；C、教體不易環(huán)化；D、影響外源基因表達(dá)。

6.下面哪一種不是產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶星號(hào)活性的重要因素：

A、酶切反映體系中酶濃度過(guò)低；B、甘油含量過(guò)高；C、酶切反映體系中具有有機(jī)溶劑;

D、具有非鎂離子的二價(jià)陽(yáng)離子。

7.關(guān)于cDNA的最對(duì)的的提法是：（）

A、同mRNA互補(bǔ)的單鏈DNA；B、同mRNA互補(bǔ)的雙鏈DNA；

C、以mRNA為模板合成的雙鏈DNA；D、以上都對(duì)的。

8.在分離mRNA的溶液中，Mg2+離子的濃度不能低于0.5mmol/L,由于低了

A、mRNA會(huì)降解；B、mRNA會(huì)沉淀；C、核搪體解體；D、mRNA會(huì)變性。

9.關(guān)于II類(lèi)限制性內(nèi)切酶的作用，下列不對(duì)的的是：

A、辨認(rèn)序列長(zhǎng)度一般為4-6bp；B、辨認(rèn)序列通常具有回文結(jié)構(gòu)；

C、辨認(rèn)和切割雙鏈DNA分子；D、只能切割非甲基化序列。

10.有關(guān)PCR的描述下列哪項(xiàng)不對(duì)的？

A、是一種酶促反映：B、引物決定了擴(kuò)增的特異性；C、擴(kuò)增的對(duì)象是DNA序列；

D、擴(kuò)增的對(duì)象可以是氨基酸。

11.PCR實(shí)驗(yàn)的特異性重要取決于：

A、DNA聚合酶的種類(lèi)；B、反映體系中模板DNA的量；

C、引物序列的長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)；D、PCRbuffer中的鎂離子濃度

12.藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)篩選時(shí),加入IPTG的作用是：

A、誘導(dǎo)3肽的合成；B、作為酶作用的底物；

C、誘導(dǎo)Q肽的合成；D、作為顯色反映指示劑。

13.基因敲除(knockout)方法重要用來(lái)闡明：

A、基因的結(jié)構(gòu)；B、基因的調(diào)控；C、基因的表達(dá)；D、基因的功能。

14.運(yùn)用單鏈小RNA高效、特異性降解細(xì)胞內(nèi)同源mRNA,從而阻斷體內(nèi)靶基因表達(dá),

使細(xì)胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。

A、RNA干擾技術(shù)；B、原位雜交技術(shù)；

C、RACE技術(shù)；D、點(diǎn)突變技術(shù)。

四、名詞解釋。

1.載體：

2.限制性核酸內(nèi)切酶：

3.cDNA：互補(bǔ)DNA,指以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄得到的DNA“

4.聚合酸鏈反映(polymerasechainreaction,PCR)：

5.RT-PCR(reversetranscriptionPCR)：以mRNA為模板先逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,再以cDNA為模板

進(jìn)行聚合的鏈?zhǔn)椒从场?/p>

6.Real-timePCR：

7.cDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)：

8.基因文庫(kù)(genelibrary)：

9.定點(diǎn)突變技術(shù)(site-directedmutagensis)：

10.酵母單雜交系統(tǒng)(yeastone-hybridsystem)：提醒：該系統(tǒng)目的：用于鑒定DNA和蛋白質(zhì)之間

的互相作用。

11.酵母雙雜交系統(tǒng)(yeasitwo-hybridsystem)：提醒：該系統(tǒng)目的：鑒定反式作用因子之間的互

相作用對(duì)真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響。

12.凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(electrophorticmobilityshiftassay,EMSA;gelretardation)：

13.RACE(RapidamplificationofcDNAEnd)技術(shù):

14.RNA干擾(RNAinierference,RNAi)：

15.核酸雜交，southernblotting,Northernblotting,westernblotting

16.轉(zhuǎn)化

17.DNA芯片

18.基因組學(xué)

19.功能基因組學(xué)

20.比較范因組學(xué)(comparaiivegenomics)

21.蛋白質(zhì)組學(xué)

22.轉(zhuǎn)錄譜(expressionprofiling)

23.表達(dá)序列標(biāo)簽(expressedsequencetag,EST)

五、簡(jiǎn)答題：

1.在分離DNA過(guò)程中，為什么苯酚和氯仿聯(lián)合使用？即使不聯(lián)合使用也要在苯酚抽

提后用氯仿再抽提一次？

提醒：因素是酚和水有一定限度的互溶，所以單獨(dú)使用酚抽提DNA,最終不能除去盼，殘留

的酚會(huì)使限制性核酸內(nèi)切酶、Taq酶和連接酶變性，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。氯仿也是蛋白質(zhì)變性劑，

它不與水互溶，但它與苯酚互溶。這樣，兩者聯(lián)合使用，可讓DNA溶液中沒(méi)有殘留粉。

2.比較說(shuō)明SDS（SDS-聚丙烯胺凝膠電泳）與瓊脂糖凝膠電泳的分離原理和特

點(diǎn)。

提醒：SDS：1）SDS作用；2）分子篩；3）重要用于蛋白質(zhì)的定性分析、分離。瓊脂

糖凝膠電泳：1）凝膠的孔徑；2）用于蛋白質(zhì)和核酸電泳，雙鏈DNA的電泳遷移率重要與其

分子大小有關(guān)。

3.簡(jiǎn)述PCR擴(kuò)增的原理及過(guò)程。

提醒：PCR技術(shù)的基本原理：在模板、引物、4種dNTP和賴耐熱DNA聚合醒存在的條件-卜，

按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，特異擴(kuò)增DNA區(qū)段。PCR的過(guò)程：變性--退火-延伸，三個(gè)基本

環(huán)節(jié)循環(huán)。

4.什么是藍(lán)白斑篩選？為什么藍(lán)白斑篩選法也會(huì)有假陽(yáng)性？

提醒：該法是運(yùn)用組織化學(xué)的方法，通過(guò)插入失活來(lái)篩選重組體。因素是：b-半乳糖節(jié)酶的N

端不是必須的，對(duì)其修飾不會(huì)影響酶的活性或Q肽的互補(bǔ)性。假如插入的外源片斷引起a肽

ORF的移碼，或外源片斷具有終止密碼使得a肽不表達(dá)，就會(huì)形成白色斑。假如插入的片斷不

含終止密碼、是3的倍數(shù)，仍然會(huì)形成藍(lán)色斑。

5.酵母單雜交的原理。

很多真核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子有兩個(gè)互相獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成：DNA結(jié)合域(DNAbindingdomain,BD)

—?順式作羲滬卜r基本啟動(dòng)子e報(bào)告基因一

和轉(zhuǎn)錄激活域(activationdomain,AD)oBD能和特定的基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，但不能接獲基因

的轉(zhuǎn)錄。

酵母單雜交是一種研究DNA和蛋白質(zhì)互相作用的系統(tǒng)，運(yùn)用基因重組技術(shù)將特定順式作

用元件構(gòu)建到基本啟動(dòng)子上游，把報(bào)告基因連接到基本啟動(dòng)子下游。

將待測(cè)轉(zhuǎn)錄因子cDNA與已知酵母激活域(AD)融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)入酵母，假如待測(cè)轉(zhuǎn)錄因子

能和順式作用元件結(jié)合，就能激活基本啟動(dòng)子，從而激活報(bào)告基因的表達(dá)。

6.現(xiàn)已知一種蛋白因子可以與DNA上的一段100bp的專一序列結(jié)合，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)出克隆這

種蛋白因子的cDNA的基本技術(shù)路線。

提醒：酵母單雜方法。

7.從GenBank中查到某一基因的cDNA序列，如何得到該基因的內(nèi)含子序列？

提醒：根據(jù)cDNA序列設(shè)計(jì)引物，以基因組DNA為模板PCR,產(chǎn)物測(cè)序后，序列比對(duì)\

8.從GenBank中查到某一基因的完整ORF序列，如何得知其mRNA的加帽和加尾信息？

提醒：5:RACE和3，?RACE。

9.轉(zhuǎn)錄因子一般具有轉(zhuǎn)錄激活域和DNA結(jié)合域，簡(jiǎn)述它們的作用。

DNA辨認(rèn)或結(jié)合域能和特定的基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，但不能接獲基因的轉(zhuǎn)錄。對(duì)各種轉(zhuǎn)錄因

子的序列進(jìn)行比較，可發(fā)現(xiàn)其基序(motif)的共同點(diǎn)是都與DNA結(jié)合。基序通常很短，僅為蛋

白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的一小部分。在蛋白質(zhì)與轉(zhuǎn)錄裝置互相作用中，負(fù)責(zé)激活轉(zhuǎn)錄的基序可以被鑒定出

來(lái)。

轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可以在適當(dāng)?shù)目臻g激活轉(zhuǎn)錄。

10.簡(jiǎn)述凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)的原理。

EMSA是體外分析DNA與蛋白質(zhì)互相作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)，用放射性同位素標(biāo)記

待測(cè)DNA片段，然后與提取物溫育，形成DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，電泳后用放射性日顯影技術(shù)

可以擬定DNA條帶的位置，從而擬定它與蛋白質(zhì)是否結(jié)合?；驹恚?/p>

生白質(zhì)與DNA結(jié)合后，將大大增長(zhǎng)DNA分子量，在凝膠電泳中，DNA朝正電極移動(dòng)的距離

與其相對(duì)分子量成正比。沒(méi)有結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA移動(dòng)較快，結(jié)合了蛋白質(zhì)的DNA由于受到

阻滯移動(dòng)較慢。

11.現(xiàn)在已知一個(gè)基因的啟動(dòng)子序列(涉及其順式作用元件和基本啟動(dòng)子)，如何找到

調(diào)控該基因表達(dá)的反式作用因子？

提醒：有多種方案。EMSA是其一。

12.簡(jiǎn)述sangerDNA測(cè)序法的原理和基本過(guò)程。

雙脫氧測(cè)序法原理：2',3'-ddNTP與普通dNTP不同之處在同它們?cè)诿撗鹾颂堑?,位置缺少一

個(gè)羥基，口」以在DNA聚合酶作用卜通過(guò)其5'三磷酸基團(tuán)摻入到止在增長(zhǎng)的DNA鏈中，但由

于沒(méi)有引羥基，它們不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鏈，因此，正在增長(zhǎng)的DNA徒不也許

繼續(xù)延伸。

核酸模板在核酸聚合酶、引物、4種單脫氧堿基存在條件下復(fù)制或轉(zhuǎn)錄時(shí)，假如在四管獨(dú)立的

酶反映系統(tǒng)中分別按比例引入4種雙脫氯堿基，只要雙脫氟堿基摻入鑄端，該鏈就停止延K,

鏈端摻入單脫氧堿基的片段可繼續(xù)延長(zhǎng)。

如此每管反映體系中便合成以共同引物為5,端，以雙脫氧堿基為3,端的一系列長(zhǎng)度不等的核

酸片段，其長(zhǎng)度取決于從用以起始DNA合成的引物末端到出現(xiàn)過(guò)早鏈終止的位置之間的距離。

反映終止后，分四個(gè)泳道進(jìn)行電泳。以分離長(zhǎng)短不一的核酸片段（長(zhǎng)度相鄰者僅差一個(gè)堿基），

根據(jù)片段3'端的雙脫氧堿基，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序?；具^(guò)程：

1）分離待測(cè)核酸模板，模板可是DNA,也可是RNA,可是雙鏈，也可是單鏈。

2）在4只試管中分別加入適當(dāng)?shù)囊铩⒛０濉?種dNTP（涉及放射性標(biāo)記dATP,

例如32P標(biāo)記的dATP和DNA聚合酶（如以RNA為模板，則用反轉(zhuǎn)錄酶），再在上述

4只管中分別加入一種一定濃度的ddNTP（雙脫氯核甘酸）.

3）與單鏈模板（如以雙鏈作模板，要作變性解決）結(jié)合的引物，在DNA聚合酶作

用下從5'端向3'端進(jìn)行延伸反映，32P隨著引物延長(zhǎng)摻入到新合成鏈中。當(dāng)ddNTP摻

入時(shí)，由于它在3'位置沒(méi)有羥基，故不與下一個(gè)dNTP結(jié)合，從而使鏈延伸終止cddNTP

在不同位置摻入，因而產(chǎn)生一系列不同長(zhǎng)度的新的DNA鏈。

4）用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳同時(shí)分離4只反映管中的反映產(chǎn)物，由于每一反映

管中只加一種ddNTP（如ddATP）,則該管中各種長(zhǎng)度的DNA都終止于該種堿基（如A）

處。所以凝膠電泳中該泳道不同帶的DNA3'末端都為同一種雙脫氧堿基。

5）放射自顯影。根據(jù)四泳道的編號(hào)和每個(gè)泳道中DNA帶的位置直接從自顯影圖譜

上讀出與模板鏈互補(bǔ)的新鏈序列。

13.如何用PCR法獲得點(diǎn)突變DNA分子？

指通過(guò)聚合的鏈?zhǔn)椒从常≒CR）等方法向目的DNA片段中引入所需變化（通常是表征

有利方向的變化），涉及堿基的添加、刪除、點(diǎn)突變等。

采用品有互補(bǔ)末端的引物，使產(chǎn)物形成了重疊鏈從而在隨后的擴(kuò)增反映中通過(guò)重疊鏈的

延伸，將不同來(lái)源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來(lái)。該技術(shù)重要涉及以下幾步：設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)

增基因兩端，回收兩端片段，兩端片段退火延伸，擴(kuò)增全長(zhǎng)基因。實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)：

1）引物設(shè)計(jì)：引物F及R為基因兩端特異引物，其中Fm及Rm為中間引物。其中

引物Fm及Rm中間共享一段序列（至少10bp完全匹配，否則后續(xù)實(shí)驗(yàn)很難成功），突

變點(diǎn)可以設(shè)計(jì)在Fm或Rm,也可以兩條引物上都有突變點(diǎn)；

2）分別用引物F和Rm及Fm和R進(jìn)行配對(duì)用pfu酶進(jìn)行PCR：

3）分別用股準(zhǔn)確回收第2步所得兩條目的PCR產(chǎn)物帶：

4）將第3步所得兩份PCR產(chǎn)物進(jìn)行混合使其互為模板及引物.加入dNTP及Pfu或

Taq酶進(jìn)行5-10輪PCR。

5）取第4步PCR產(chǎn)物做為模板，加入引物F及R進(jìn)行PCR擴(kuò)增出具有突變的全基因。

14.什么是RNAi?試述其應(yīng)用和發(fā)展前景。

RNAi（RNAinterference）即RNA干涉，是由雙鏈RNA（dsRNA）介導(dǎo)的、由特定酶參與的特

異性基因沉默現(xiàn)象，它在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達(dá)?；蚴荝NAi是有

dsRNA參與指導(dǎo)的，以外源和內(nèi)源mRNA為降解目的的轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象。應(yīng)用：

1）RNAi方法在植物遺傳及發(fā)育等研究領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。通過(guò)基因敲除來(lái)調(diào)控某個(gè)代謝

途徑的關(guān)鍵基因，篩選出目的性狀改良的個(gè)體，如抗病或耐旱植株。Gutterson等敲除了康乃

馨的一種激素，使花期延長(zhǎng)。多聚半乳糖醛激能在西紅柿成熟時(shí)消化細(xì)胞壁，Zenera實(shí)驗(yàn)室將

它敲除后，西紅柿可晚一些采摘，味道變得更為鮮美。

2）RNAi是研究候選基因功能、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的新方法。從大規(guī)模數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得全基因組序

列，找到感愛(ài)好基因的序列，據(jù)此設(shè)計(jì)出使該基因沉默的dsRNA,研究該候選基因沉默或下

調(diào)后的性狀表現(xiàn)，從而探討該候選基因的功能。Clemens等應(yīng)用RNAi亦研究了果蠅細(xì)胞系中

胰島素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

15.獲得一個(gè)功能未知的基因克隆后，如何才干闡述該基因的功能？

提醒：對(duì)此基因進(jìn)行定位，運(yùn)用基因敲除或RNAi技術(shù)封閉此基因，尋找蛋白表達(dá)的差異和生

物體遺傳表型的差異，通過(guò)研究熒光探針定位此蛋白的分布，通過(guò)研究蛋白與蛋白互相作用擬

定其在細(xì)胞中的功能。

16.假如知道某基因的功能及其相應(yīng)得蛋白質(zhì)的氨基酸序列組成，可以通過(guò)何種方法

克隆該基因？

提醒：可以通過(guò)合成核甘酸探針或設(shè)計(jì)兼并PCR引物從基因組文庫(kù)（或cDNA）文庫(kù)中篩選。

或者運(yùn)用相應(yīng)的抗體從cDNA表達(dá)文庫(kù)中篩選相應(yīng)的克隆。

17.常用的基因表達(dá)研究技術(shù)有哪些？

18.什么是遺傳圖譜？

答案1：遺傳圖乂稱為連鎖圖，是指標(biāo)志基因或DNA在染色體上的相對(duì)位置與遺傳距離，后

者通常以基因或DNA片段在染色體互換過(guò)程中的分離頻率（厘摩，cM）來(lái)表達(dá)，cM值越

大，兩者之間距離越遠(yuǎn)。遺傳圖的繪制方法是以染色體上某一點(diǎn)為遺傳標(biāo)記，以與之相伴的遺

傳特性為對(duì)象，經(jīng)連鎖分析，測(cè)定遺傳距離，將編碼該特性的基因定位于染色體特定位置。連

鎖分析的實(shí)質(zhì)是通過(guò)度析同一遺傳位點(diǎn)在不同個(gè)體中檔位基因的不同來(lái)研究同一染色體上兩

個(gè)位點(diǎn)之間的互相關(guān)系，科學(xué)上用減數(shù)分裂過(guò)程中這兩個(gè)位點(diǎn)之間的互換或重組頻率來(lái)表達(dá)其

遺傳學(xué)距離。

答案2：通過(guò)遺傳重組所得到的基因在具體染色體上線性排列圖稱為遺傳連鎖圖。它是通過(guò)計(jì)

算連鎖的遺傳標(biāo)志之間的重組頻率，擬定他們的相對(duì)距離，一?般用厘摩（cM,即每次減數(shù)分裂

的重組頻率為1%）來(lái)表達(dá)。繪制遺傳連鎖圖的方法有很多，但是在DNA多態(tài)性技術(shù)未開(kāi)發(fā)時(shí),

鑒定的連鎖圖很少，隨著DNA多態(tài)性的開(kāi)發(fā)，使得可?運(yùn)用的遺傳標(biāo)志數(shù)目迅速擴(kuò)增,初期使

用的多態(tài)性標(biāo)志有RFLP（限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性）、RAPD（隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性DNA）、

AFLP（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性）；80年代后出現(xiàn)的有STR（短串聯(lián)反復(fù)序列，又稱微衛(wèi)星）DNA遺

傳多態(tài)性分析和90年代發(fā)展的SNP（單個(gè)核甘酸的多杰性）分析。

19.什么是物理圖譜？

答案1:物理