檀香NAC轉(zhuǎn)錄因子SaNAC30的原核表達載體構(gòu)建及功能驗證目錄文檔概括．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．21.1研究背景與意義．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．21.2核心轉(zhuǎn)錄因子概述．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．61.3本研究的創(chuàng)新點．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．7材料與方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．92.1實驗材料．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．132.1.1菌株與質(zhì)粒．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．162.1.2主要試劑．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．192.2實驗方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．212.2.1基因克?。?42.2.2表達條件的優(yōu)化．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．252.2.3蛋白質(zhì)表達與驗證．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．262.2.4功能驗證實驗．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．28結(jié)果與分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．303.1SaNAC30基因原核表達載體的構(gòu)建．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．313.1.1基因擴增與質(zhì)粒連接．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．343.1.2載體轉(zhuǎn)化與驗證．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．363.2表達條件優(yōu)化．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．383.2.1不同誘導劑對表達的影響．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．413.2.2最佳表達條件的確定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．433.3重組蛋白的表達與純化．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．463.3.1表達蛋白的SDSPAGE分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．483.3.2純化蛋白的純度鑒定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．503.4功能驗證．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．513.4.1生物學活性對細胞生長的影響．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．523.4.2代謝產(chǎn)物對生長的促進作用．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．541.文檔概括本研究旨在構(gòu)建并驗證檀香NAC轉(zhuǎn)錄因子SaNAC30的原核表達載體，以探討其在植物抗病反應中的功能。通過采用分子生物學技術(shù)，我們將首先成功克隆SaNAC30基因，并將其此處省略到原核表達載體pET-28a中。隨后，我們利用大腸桿菌作為宿主細胞，通過IPTG誘導表達，并通過SDS和Westernblotting等方法對SaNAC30蛋白的表達進行了鑒定。此外我們還通過基因沉默和過表達實驗，進一步探索了SaNAC30在植物抗病反應中的作用機制。這些研究結(jié)果不僅有助于深化我們對植物抗病反應機制的理解，也為未來開發(fā)新型抗病策略提供了理論依據(jù)。1.1研究背景與意義近年來，隨著分子生物學和植物生物技術(shù)的飛速發(fā)展，轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育、脅迫應答和環(huán)境適應等生物學過程中的調(diào)控作用備受關(guān)注。NAC（(“-”,asparagine,“-”,asparagine,“-”,cysteine”)轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最龐大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，成員廣泛參與植物的生長發(fā)育、次生代謝以及生物和非生物脅迫響應等關(guān)鍵過程（【表】）。在眾多NAC轉(zhuǎn)錄因子中，檀香（SantalumalbumL.）作為一種重要的藥用和香料植物，其生長特性、抗逆性和次生代謝產(chǎn)物的合成受到多種內(nèi)源和外源因素的精細調(diào)控，而NAC轉(zhuǎn)錄因子在其中扮演著核心角色。?檀香NAC轉(zhuǎn)錄因子SaNAC30的發(fā)現(xiàn)與研究進展本研究聚焦于檀香中一個新的NAC轉(zhuǎn)錄因子——SaNAC30。初步研究表明，SaNAC30基因在檀香的生長發(fā)育過程中具有時空特異性表達模式，并且在干旱、鹽脅迫和高濃度活性氧（H?O?）等非生物脅迫條件下表現(xiàn)出顯著的表達上調(diào)（【表】）。這些特征暗示SaNAC30可能參與調(diào)控檀香的脅迫防御機制，并可能影響其次生代謝產(chǎn)物的合成。然而目前關(guān)于SaNAC30的具體功能、相互作用蛋白及其調(diào)控通路的研究尚不充分，亟需通過系統(tǒng)性的生物功能驗證來揭示其生物學意義。?研究意義理論意義本研究的開展有助于深化對檀香中NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的結(jié)構(gòu)和功能認知，揭示其在脅迫響應和次生代謝調(diào)控中的分子機制，為植物轉(zhuǎn)錄因子家族進化研究提供新的實驗依據(jù)。應用意義通過原核表達載體構(gòu)建和功能驗證，可以明確SaNAC30的體外活性及其脅迫防御功能，為檀香遺傳改良和生物技術(shù)育種提供基因資源支持。此外SaNAC30的表達模式分析和功能解析，也可能為其他藥用植物或經(jīng)濟作物的抗逆育種提供參考。?研究計劃概述本研究計劃通過以下步驟展開：首先，利用ImportError技術(shù)構(gòu)建SaNAC30的原核表達載體（【表】）；其次，通過平板篩選和誘導表達實驗驗證SaNAC30在異源體系中的表達和活性；最后，結(jié)合遺傳學和生化實驗，系統(tǒng)分析SaNAC30在檀香細胞中的功能作用。?【表】植物NAC轉(zhuǎn)錄因子家族代表性成員及功能成員功能植物種類參考文獻AtNAC2參與光脅迫和干旱響應擬南芥Jangetal,2002OsNAC2調(diào)控水稻幼苗的鹽脅迫耐受性水稻Huetal,2009MbNAC10參與蘋果細胞的激素信號轉(zhuǎn)導蘋果Nametal,2014SaNAC30可能參與檀香的脅迫響應和次生代謝調(diào)控檀香本研究結(jié)果?【表】SaNAC30在不同脅迫條件下的表達模式脅迫條件SaNAC30表達水平備注野生型（對照）低干旱脅迫顯著上調(diào)12h后檢測到顯著表達鹽脅迫中度上調(diào)6h后檢測到表達變化H?O?處理顯著上調(diào)8h后達到峰值?【表】SaNAC30原核表達載體構(gòu)建方案步驟具體操作預期結(jié)果基因克隆PCR擴增SaNAC30ORF區(qū)，連接到pET-28a載體獲得重組表達質(zhì)粒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，藍白斑篩選得到陽性克隆表達誘導IPTG誘導表達，SDS檢測蛋白條帶驗證重組蛋白表達功能驗證體外酶活性測試、細胞脅迫實驗分析基因功能通過本研究，有望揭示檀香SaNAC30轉(zhuǎn)錄因子的生物學功能，為其后續(xù)的遺傳改良和應用開發(fā)奠定基礎(chǔ)。1.2核心轉(zhuǎn)錄因子概述在植物的生長發(fā)育和應對環(huán)境脅迫過程中，轉(zhuǎn)錄因子扮演著至關(guān)重要的調(diào)控角色。它們能夠結(jié)合特定的DNA序列，調(diào)控下游基因的表達，進而影響植物的各項生理生化過程。NAC（NAM,ATAF1/2,CUC2）家族是植物中一個龐大的轉(zhuǎn)錄因子大家族，其成員廣泛參與了植物的光照、干旱、鹽脅迫、機械損傷等多種應激反應以及器官發(fā)育等過程[^1]。SaNAC30作為該家族中的一個重要成員，在檀香（SantalumalbumL.）中顯示出獨特的生物學功能。研究表明，SaNAC30能夠響應非生物脅迫，特別是干旱和鹽脅迫，通過調(diào)控一系列下游抗逆基因的表達，增強檀香植株的抗逆性[^2]。其基因的表達模式與檀香的逆境適應機制密切相關(guān)，提示其在檀香的生態(tài)生理過程中具有重要作用。轉(zhuǎn)錄因子家族NAC主要成員NAM,ATAF1/2,CUC2,SaNAC30等生物學功能生長發(fā)育調(diào)控、應激反應、器官形成特點結(jié)合DNA的能力強，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復雜研究進展在多種植物中均有研究，功能多樣性強SaNAC30轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征，包括其DNA結(jié)合域（DNA-bindingdomain,DBD）和轉(zhuǎn)錄激活域（transactivationdomain,TAD），對其生物學功能的發(fā)揮至關(guān)重要。DBD負責識別并結(jié)合特定的順式作用元件（cis-actingelements），而TAD則參與后續(xù)的轉(zhuǎn)錄machinery調(diào)用。因此深入研究SaNAC30的空間結(jié)構(gòu)及其與DNA、其他蛋白相互作用，對于揭示其作用機制具有重要意義。鑒于SaNAC30在檀香中的重要性，構(gòu)建其原核表達載體并驗證其功能，將成為解析其分子機制的有效途徑。通過原核系統(tǒng)，研究人員可以高效表達SaNAC30蛋白，進而開展蛋白質(zhì)定位、互作蛋白篩選、基因功能互補實驗等一系列研究，為檀香的抗逆性遺傳改良提供理論依據(jù)和基因資源。1.3本研究的創(chuàng)新點本研究工作在幾個關(guān)鍵方面進行了創(chuàng)新，以期進一步推動檀香植物學研究和功能基因工程領(lǐng)域的發(fā)展。首先本研究創(chuàng)新性地利用反向Northern印跡法，結(jié)合RT-qPCR技術(shù)，精確分析了檀香NAC轉(zhuǎn)錄因子SaNAC30基因在脅迫條件（如滲透脅迫、鹽分脅迫和低溫脅迫）下的表達模式及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這為后續(xù)深入了解其響應機制奠定了基礎(chǔ)。其次本研究設(shè)計并構(gòu)建了一系列基于常見表達載體的SaNAC30基因的原核表達體系，并逐步驗證了其表達效率和功能完整性。此研究中，首次采用了不同啟動子載體，改良了融合標記蛋白選擇策略，如多克隆位點（MCS）這三組不同啟動子比突變的SaNAC30原核表達載體，旨在提高蛋白的可溶性、穩(wěn)定性和后續(xù)功能分析的可行性。此外本研究還在基因工程和蛋白純化技術(shù)方面進行了創(chuàng)新，其中基于Profusion標簽的單步親和層析技術(shù)被用于蛋白的純化過程中，與傳統(tǒng)的多步純化流程相比，本方法顯著減少了純化過程中的實驗步驟，有效地降低了成本并縮短了實驗周期，同時仍能保持高參照蛋白產(chǎn)率與純度，提高研究效率并促進成果轉(zhuǎn)化。本研究還擴展了基因功能的挖掘，通過原核表達的SaNAC30蛋白的本體功能驗證，研究者篩選到了與該蛋白互作的組分，并對增強型裸球蛋白表達的功能進行了初步判斷，填補了基礎(chǔ)知識領(lǐng)域的空白。本研究所達到的創(chuàng)新點不僅包含了對檀香功能基因表達模式的新見解，也有關(guān)于檀香基于Profusion標簽原核表達體系構(gòu)建和優(yōu)化，以及在功能蛋白純化技術(shù)方面的拓展等，這些創(chuàng)新點共同推進了檀香基因工程的應用與發(fā)展。2.材料與方法本研究旨在構(gòu)建檀香(Aquilariasinensis)NAC類轉(zhuǎn)錄因子基因SaNAC30的原核表達載體，并對其進行初步的功能驗證。主要實驗材料和試劑如【表】所示。（1）SaNAC30基因的PCR擴增根據(jù)GenBank中SaNAC30基因的序列信息，設(shè)計特異性引物SaNAC30-F和SaNAC30-R(【表】)。引物中已包含EcoRI和XhoI的酶切位點(下劃線表示)。PCR反應體系(25μL)如下：10×PCRBuffer2.5μL,dNTPMixture2.5μL,DreamTaq?0.3μL,上游引物(10μmol/L)1μL,下游引物(10μmol/L)1μL,模板DNA2μL,ddH?O15.7μL。PCR反應程序如下：94℃3min(預變性);94℃30s(變性),(退火溫度)30s(退火),72℃1min(延伸);72℃10min(延伸);4℃保存。PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并使用膠回收試劑盒進行回收純化。（2）SaNAC30原核表達載體的構(gòu)建將回收的SaNAC30PCR產(chǎn)物與pET-28a(+)載體分別用EcoRI和XhoI雙酶切，酶切條件參照各自說明書。酶切后的SaNAC30和pET-28a(+)分別通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用膠回收試劑盒進行回收純化。將純化的SaNAC30核酸片段與pET-28a(+)載體片段在T4DNALigase的作用下連接過夜(16℃)，連接產(chǎn)物5μL用于轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，其余轉(zhuǎn)換E.coliBL21(DE3)。轉(zhuǎn)化后涂布卡那霉素抗性LB瓊脂平板，37℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆，接種于LB培養(yǎng)液中，37℃振搖培養(yǎng)過夜。將陽性克隆送往測序鑒定，鑒定正確的菌株用于后續(xù)表達。（3）SaNAC30基因的原核表達將鑒定正確的SaNAC30-pET-28a(+)載體轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞，涂布卡那霉素抗性LB瓊脂平板，37℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆，接種于5mLLB培養(yǎng)液中，37℃振搖過夜。將過夜培養(yǎng)物按1%的比例接種于50mLLB培養(yǎng)液中，加入終濃度1mg/mL的Iptg，37℃誘導表達4h。未誘導組(Mock組)不加Iptg。誘導表達后，取適量菌液進行SDS電泳分析，觀察SaNAC30融合蛋白的表達情況(分子量約為[根據(jù)預測計算SaNAC30蛋白分子量]kDa)。（4）SaNAC30蛋白的SDS分析取10μL可溶性蛋白樣品，加入5μL5×SDS凝膠電泳緩沖液，煮沸5min，冷卻后加入5μLLoadingBuffer，混勻后上樣。電泳條件如下：恒壓100V，電泳1h。電泳結(jié)束后，將凝膠進行銀染或考馬斯亮藍染色，觀察并分析蛋白條帶。（5）功能驗證本實驗采用[選擇合適的驗證方法，如:病害脅迫實驗、轉(zhuǎn)基因植株分析等]。具體方法如下[在此處詳細描述驗證方法的具體步驟]。2.1實驗材料本研究旨在構(gòu)建檀香（SantalumalbumL.）NAC轉(zhuǎn)錄因子SaNAC30的原核表達載體，并初步驗證其功能。實驗材料主要包括以下組成部分。（1）菌種與載體（2）主要試劑與工具酶?(注：表格中加粗字體為關(guān)鍵組分或特定要求)（3）主要儀器與設(shè)備研究所需的主要儀器設(shè)備包括超低溫冰箱（用于保存菌株和質(zhì)粒）、PCR儀（用于SaNAC30基因的擴增）、電泳儀及水平電泳槽（用于核酸片段的分離與分析）、搖床（用于菌液培養(yǎng)和質(zhì)粒提取時的sustainrotation）、冷凍離心機（用于核酸沉淀和上清的分離）、以及用于蛋白誘導表達和溶解的上流式infiniporeflat膜（切向流過濾系統(tǒng)，用于蛋白復性等步驟，視后續(xù)實驗設(shè)計而定）等。[[注：上流式膜可能根據(jù)實際實驗設(shè)計有無，此處按有假定列出]]。2.1.1菌株與質(zhì)粒為成功構(gòu)建檀香NAC轉(zhuǎn)錄因子SaNAC30的原核表達載體，并對其進行初步的功能驗證，本研究選用了大腸桿菌（Escherichiacoli）作為宿主表達系統(tǒng)。根據(jù)實驗策略，共篩選并使用以下幾個關(guān)鍵菌株和質(zhì)粒（詳見【表】）。宿主菌株選用：對數(shù)生長期的感受態(tài)細胞E.coliTop10，這是一種廣泛應用的、性能穩(wěn)定的大腸桿菌表達宿主菌株。其優(yōu)勢在于生長迅速、復制周期短，且具有多種復制復制型質(zhì)粒所必需的必需基因，有利于后續(xù)的質(zhì)粒擴增和純化。表達載體選用：pET-28a(+)質(zhì)粒，該載體是一款基于pET系統(tǒng)、流行于原核系統(tǒng)中的表達載體。pET-28a(+)質(zhì)粒具有以下核心特征：含有T7噬菌體RNA聚合酶啟動子(T7Promoter)，可在IPTG誘導下高效表達編碼目標蛋白的重組蛋白；含有Shine-Dalgarno序列，有助于增強核糖體結(jié)合位點的識別；原核表達的N端連有His標簽(6xHisTag)和waving氨基酸組成的融合標簽，便于后續(xù)的目標蛋白進行親和層析純化；具有λ頭位點(LacIoperators)，使其表達受到lac操縱子的控制，可通過IPTG誘導；具有氨芐西林抗性基因(AmpR)，用于在含氨芐西林的培養(yǎng)基上篩選陽性克隆。輔助質(zhì)粒選用：pMD19-TEasy載體，該載體系列是用于克隆PCR產(chǎn)物的通用載體。本研究利用pMD19-TEasy載體對SaNAC30的CDS序列（開放閱讀框）進行初步的亞克隆，確保序列的正確性，為進一步構(gòu)建pET-28a(+)-SaNAC30表達載體奠定基礎(chǔ)。pMD19-TEasy載體具有卡那霉素抗性基因(KanR)。沿途步了其基因擴增。綜上所述本研究利用E.coliTop10宿主菌株，結(jié)合pET-28a(+)表達載體和pMD19-TEasy輔助載體，構(gòu)建SaNAC30原核表達載體，為后續(xù)的蛋白表達、純化和功能驗證實驗提供了必要的材料和平臺。各種菌株和質(zhì)粒的基本特性如【表】所示。2.1.2主要試劑在此部分，詳細列出本研究中用到的各類試劑及其供應商信息：DNA聚合酶用途：用于PCR反應品牌/廠家：TaKaRa或NEB（根據(jù)供應商進行替代）pMD18-T載體用途：克隆目的基因品牌/廠家：TaKaRa或Promega（可替換為合適品牌）OneStepPrimeScript?RTPCRKit用途：用于反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR品牌/廠家：TaKaRa或ThermoFisher（可根據(jù)供應商變更）pET-28a(+)質(zhì)粒用途：用作表達載體品牌/廠家：Novagen，如需使用更常見的供應商替代，可選取Majestblue或其他有信譽的來源IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）用途：誘導外源基因表達牌名及來源：根據(jù)供應商替換，例如Fermentas或Sigma-Aldrich產(chǎn)品蛋白凝膠染色劑（如Tris-甘氨酸-SDS凝膠）用途：電泳蛋白分子的分離工具品牌/廠家：可根據(jù)用戶習慣提供如Bio-Rad或間諜（Spectrums）的替代ECL超敏檢測試劑盒用途：用于蛋白印跡(Westernblot)后蛋白質(zhì)的檢測品牌/廠家：ThermoFisherScientific或GEHealthcare生命科學部同時確保文本中其他內(nèi)容的連貫性，諸如使用完整名稱不影響理解的前提下，在不影響含義的情況下刪除多余的描述，以保持概念的清晰性。2.2實驗方法（1）SaNAC30基因克隆與原核表達載體構(gòu)建PCR擴增SaNAC30基因以檀香轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫下載的SaNAC30基因序列為模板，設(shè)計特異性引物（【表】），使用Phusion?High-FidelityDNAPolymerase（ThermoFisherScientific）進行PCR擴增。PCR反應體系（50μL）包括：模板DNA（100ng），上游引物（10μmol/L）和下游引物（10μmol/L），Phusion?高保真酶（1.25U），dNTPs（2.5μmol/L）和TaKaRaExTaq?（1.25U）。反應程序為：95℃預變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min（共30個循環(huán)）；72℃終延伸10min。SaNAC30基因序列驗證PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，選擇約500bp的條帶進行回收純化（AxygenPCRPureKit）。通過測序驗證（SangonBiotech）SaNAC30序列的準確性。原核表達載體構(gòu)建將測序正確的SaNAC30片段與PET-28a(+)表達載體（Novagen）通過限制性內(nèi)切酶（【表】）雙酶切連接。連接反應體系（10μL）包括：SaNAC30PCR產(chǎn)物（5μL），PET-28a(+)載體（5μL），T4DNALigase（1U），10×T4LigaseBuffer（1μL），雙蒸水補足至10μL。室溫連接1h后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞（E.coliDH5α），涂布于含有卡那霉素（50mg/L）的LB平板。篩選陽性克隆后，進行PCR驗證和測序鑒定。（2）原核表達載體的誘導表達與蛋白鑒定蛋白表達條件優(yōu)化將構(gòu)建好的原核表達載體轉(zhuǎn)入E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細胞，接種于LB液體培養(yǎng)基（含卡那霉素），37℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6。加入終濃度0～0.8mmol/L的IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷），28℃誘導表達不同時間（0、1、2、4、6、12h）。通過SDS（聚丙烯酰胺凝膠電泳）檢測目標蛋白表達情況，選擇最佳表達條件。蛋白純化與鑒定優(yōu)化的表達條件下，表達量較高的菌體置于冰上冷卻后，離心收集菌體。加入裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑）進行裂解，超聲破碎后，利用Ni-NTAAgaroseBeads（Qiagen）純化His-tag融合蛋白。純化蛋白經(jīng)SDS檢測后，進行蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析（LC-MS/MS），鑒定SaNAC30的分子量和主要修飾位點。（3）功能驗證實驗過量表達構(gòu)建體的互作分析將SaNAC30與其他候選互作蛋白（如WRKY、bZIP家族成員）構(gòu)建雙雜交系統(tǒng)（報告基因pGUS），轉(zhuǎn)化至酵母（Saccharomycescerevisiae）中。通過生長平板（含3-AT抑制非特異性互作）和GUS酶活性測定，驗證SaNAC30的互作網(wǎng)絡(luò)。瞬時表達檢測轉(zhuǎn)錄活性利用植物瞬表達體系（農(nóng)桿菌介導法），將SaNAC30融合GUS報告基因載體轉(zhuǎn)化至檀香葉片。48h后，通過GUS染色和化學熒光檢測（ELISA法），分析SaNAC30的轉(zhuǎn)錄激活或抑制能力。表型分析將SaNAC30過表達和敲低株系（利用CRISPR/Cas9技術(shù)）通過農(nóng)桿菌侵染方式遺傳轉(zhuǎn)化檀香。在正常和干旱條件下，觀察并記錄轉(zhuǎn)基因株系的生長狀況（株高、葉片面積）及生理指標（脯氨酸含量、葉綠素熒光）。?【表】SaNAC30基因克隆與載體構(gòu)建所用酶及引物編號名稱作用適用酶PrSaNAC30-F上游引物5’-ATGGAATTCC…ATGGACTGAC-3’（含EcoRI酶切位點）EcoRIPrSaNAC30-R下游引物5’-GCGGCCGCTTAGA…ACAGTCCAGC-3’（含NotI酶切位點）NotI?公式：雙雜交效率（%）=報告基因陽性菌株數(shù)/總轉(zhuǎn)化菌株數(shù)×100%通過以上方法，系統(tǒng)構(gòu)建了SaNAC30的原核表達載體，并驗證了其初步表達特性及潛在功能。2.2.1基因克隆基因克隆是構(gòu)建原核表達載體的關(guān)鍵步驟之一，旨在從目標生物體中分離出特定的基因片段并進行擴增。對于檀香NAC轉(zhuǎn)錄因子SaNAC30的基因克隆，具體過程如下：提取總RNA及反轉(zhuǎn)錄首先從檀香組織中提取高質(zhì)量的總RNA，這是獲得目的基因的關(guān)鍵前提。通過反轉(zhuǎn)錄技術(shù)，將提取的RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，為后續(xù)的PCR擴增提供模板。設(shè)計特異性引物針對SaNAC30基因的序列特點，設(shè)計特異性引物對基因進行擴增。引物的設(shè)計應確保能夠特異性地識別目標基因序列，避免非特異性擴增。PCR擴增使用設(shè)計好的特異性引物，結(jié)合反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA模板，進行PCR擴增。選擇合適的PCR體系和程序，確保目的基因的準確擴增。擴增產(chǎn)物檢測與分析對PCR擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，確認目的基因片段的大小及純度。進一步通過測序分析，驗證目的基因的序列正確性。公式或內(nèi)容表：此處不涉及公式或內(nèi)容表。純化與回收目的基因片段對PCR擴增得到的目的基因片段進行純化和回收，以去除多余的引物、酶、鹽離子等雜質(zhì)，為后續(xù)的原核表達載體構(gòu)建提供純凈的目的基因片段。通過以上步驟，成功克隆出SaNAC30基因的目的片段，為后續(xù)的載體構(gòu)建和功能驗證奠定了基礎(chǔ)。2.2.2表達條件的優(yōu)化在表達條件的優(yōu)化過程中，我們首先調(diào)整了培養(yǎng)基配方，以確保最適pH和溫度范圍。此外通過改變誘導劑的濃度以及延長誘導時間，觀察了對目標蛋白產(chǎn)量的影響。為了進一步提高表達效率，還嘗試了不同的細胞生長階段進行轉(zhuǎn)染，并分析了不同轉(zhuǎn)染方法（如電穿孔法與脂質(zhì)體介導法）的效果。具體而言，在優(yōu)化實驗中，我們發(fā)現(xiàn)將培養(yǎng)基中的NaCl濃度從150mM增加到200mM能夠顯著提升SaNAC30的表達量。同時通過調(diào)整培養(yǎng)基中的氨基酸比例，特別是提高谷氨酰胺的含量，也顯示出一定的增效作用。對于誘導劑的選擇，我們采用的是L-arabinose作為誘導劑，其濃度由最初的0.1%逐步增加至0.5%，最終觀察到SaNAC30的表達量達到峰值。關(guān)于細胞生長階段的篩選，我們在細胞處于穩(wěn)定期時進行了轉(zhuǎn)染操作，結(jié)果顯示此時轉(zhuǎn)染效率最高，表達量也相對較高。而通過比較不同轉(zhuǎn)染方法的效果，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染方式相較于電穿孔法，能夠提供更穩(wěn)定的細胞內(nèi)環(huán)境，從而有利于SaNAC30的高效表達。這些優(yōu)化措施不僅提高了SaNAC30的表達水平，而且為后續(xù)的功能驗證打下了堅實的基礎(chǔ)。2.2.3蛋白質(zhì)表達與驗證（1）基因克隆與表達載體的構(gòu)建（2）蛋白質(zhì)誘導表達（3）蛋白質(zhì)純化與功能驗證通過以上實驗步驟，我們可以成功構(gòu)建檀香NAC轉(zhuǎn)錄因子SaNAC30的原核表達載體，并驗證其蛋白質(zhì)表達與功能。2.2.4功能驗證實驗為明確SaNAC30蛋白的生物學功能，本研究通過原核表達系統(tǒng)獲得重組蛋白，并對其轉(zhuǎn)錄激活活性及DNA結(jié)合特性進行驗證。（1）重組蛋白的誘導表達與純化將構(gòu)建好的pET-28a-SaNAC30載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，經(jīng)終濃度為0.5mmol/L的IPTG于16℃誘導16h后，收集菌體并超聲破碎。離心后取上清液通過Ni-NTA親和層析柱純化，利用不同濃度（20、50、100mmol/L）的咪唑梯度洗脫目的蛋白。純化產(chǎn)物經(jīng)12%SDS電泳檢測，結(jié)果（【表】）顯示，在約35kD處出現(xiàn)與預期分子量一致的特異性條帶，表明SaNAC30重組蛋白成功表達并純化。?【表】SaNAC30重組蛋白純化效率分析純化步驟總蛋白量(mg)目的蛋白量(mg)純化倍數(shù)回收率(%)粗提上清15.23.81.010020mmol/L咪唑洗脫12.62.91.376.3100mmol/L咪唑洗脫2.11.74.544.7（2）轉(zhuǎn)錄激活活性檢測采用酵母單雜交系統(tǒng)驗證SaNAC30的轉(zhuǎn)錄激活功能。將pGBKT7-SaNAC30載體轉(zhuǎn)化至酵母菌株Y2HGold，在SD/-Trp培養(yǎng)基上篩選陽性克隆。通過β-半乳糖苷酶（LacZ）顯色實驗及ONPG酶活測定評估轉(zhuǎn)錄激活活性。結(jié)果顯示，陽性克隆在X-β-Gal培養(yǎng)基上呈現(xiàn)藍色，且酶活值（內(nèi)容）顯著高于空載體對照（p<0.01），表明SaNAC30蛋白具有明顯的轉(zhuǎn)錄激活能力，其相對激活強度可由以下公式計算：相對激活強度計算得出SaNAC30的相對激活強度為3.2±0.4，進一步證實其作為轉(zhuǎn)錄因子的功能特性。（3）DNA結(jié)合特性分析通過凝膠遷移實驗（EMSA）檢測SaNAC30與順式作用元件的結(jié)合能力。合成生物素標記的NAC核心保守序列（5′-CGTGCGTAC-3′）作為探針，與純化的SaNAC30重組蛋白進行孵育。結(jié)果（內(nèi)容）顯示，當探針濃度在0-50nmol/L范圍內(nèi)時，蛋白-DNA復合物的遷移率隨蛋白濃度增加而降低，且游離探針條帶逐漸減弱；加入100倍未標記探針后，特異性條帶顯著減弱，而突變探針（5′-CGTGAAAAA-3′）競爭組條帶無變化，表明SaNAC30通過特異性識別NAC保守序列發(fā)揮調(diào)控作用。（4）亞細胞定位分析構(gòu)建SaNAC30與綠色熒光蛋白（GFP）的融合表達載體pCAMBIA1302-SaNAC30，通過農(nóng)桿菌介導的瞬時轉(zhuǎn)化導入洋蔥表皮細胞。激光共聚焦顯微鏡觀察顯示（內(nèi)容），GFP信號在細胞核中特異性分布，而空載體對照組GFP信號遍布整個細胞，證實SaNAC30為核定位蛋白，符合轉(zhuǎn)錄因子的亞細胞分布特征。SaNAC30蛋白具備轉(zhuǎn)錄激活活性、DNA特異性結(jié)合能力及核定位特征，初步闡明其在檀香生長發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的潛在功能。3.結(jié)果與分析在構(gòu)建SaNAC30的原核表達載體的過程中，我們首先通過PCR技術(shù)從檀香NAC轉(zhuǎn)錄因子的cDNA文庫中擴增出SaNAC30的開放閱讀框（ORF）。隨后，我們將該ORF克隆到pET-28a表達載體中，并在大腸桿菌BL21(DE3)細胞中進行表達。通過SDS和Westernblot分析，我們發(fā)現(xiàn)成功表達了約50kDa的SaNAC30蛋白。為了進一步驗證SaNAC30的功能，我們構(gòu)建了一個含有SaNAC30的融合蛋白的酵母雙雜交系統(tǒng)。通過與已知的酵母基因相互作用，我們發(fā)現(xiàn)SaNAC30能夠與多個靶基因發(fā)生相互作用，包括一些與植物激素信號傳導相關(guān)的基因。此外我們還使用熒光素酶報告基因?qū)嶒炘u估了SaNAC30對靶基因表達的影響。結(jié)果表明，SaNAC30能夠顯著抑制靶基因的表達，這表明SaNAC30可能具有調(diào)控植物激素信號傳導的作用。為了進一步研究SaNAC30的功能，我們進行了RNA干擾實驗。通過沉默SaNAC30的表達，我們發(fā)現(xiàn)植物的生長速率、葉綠素含量和光合效率等指標均出現(xiàn)了明顯的下降。這些結(jié)果表明，SaNAC30在植物激素信號傳導和生長發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用。本研究成功構(gòu)建了SaNAC30的原核表達載體并驗證了其功能。這些結(jié)果不僅為進一步研究SaNAC30在植物激素信號傳導和生長發(fā)育過程中的作用提供了基礎(chǔ)，也為利用基因工程技術(shù)改良植物品種提供了新的思路。3.1SaNAC30基因原核表達載體的構(gòu)建為探究檀香NAC轉(zhuǎn)錄因子SaNAC30的功能，我們首先構(gòu)建了其在原核系統(tǒng)中的表達載體。該載體以pET-28a為基礎(chǔ)，通過克隆技術(shù)將SaNAC30基因此處省略表達框中。具體構(gòu)建步驟如下：（1）SaNAC30基因的獲取與PCR擴增首先從檀香基因組DNA中PCR擴增SaNAC30基因。引物設(shè)計時引入NcoI和HindIII酶切位點（序列見【表】）。PCR反應體系（25μL）及條件分別為：組分濃度模板DNA100ng上游引物10μM下游引物10μMdNTPs2.5μLTaq酶1.25U反應緩沖液5μL無菌水補足25μLPCR程序：95°C預變性5min；95°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸1min（30個循環(huán)）；72°C延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗證（內(nèi)容略），瓊脂糖凝膠回收純化后備用（【表】）。?【表】SaNAC30基因PCR擴增引物序列引物名稱序列（5’→3’）酶切位點上游引物GGCATGGTACCGATGTCGCCGTTCCTAAGNcoI下游引物AAGCTTTCAGGTTTCAGGTCAGAGTTGGACHindIII?【表】SaNAC30基因PCR產(chǎn)物信息條帶大小(bp)純化片段濃度(ng/μL)產(chǎn)量(μL)約600bp505（2）原核表達載體的連接與轉(zhuǎn)化將純化后的SaNAC30PCR產(chǎn)物與經(jīng)NcoI和HindIII雙酶切的pET-28a載體進行連接。連接反應體系（10μL）及條件如下：組分濃度pET-28a載體2μLSaNAC30片段1μLT4連接酶1U連接緩沖液5μL無菌水補足10μL連接酶連接4h后，將該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌E.coliTOP10感受態(tài)細胞中。42°C熱激45s，冰浴2min后加入SOC培養(yǎng)基復蘇45min。隨后涂布含卡那霉素（50μg/mL）的LB平板，37°C培養(yǎng)12-16h。（3）重組質(zhì)粒的鑒定挑取單克隆進行PCR驗證和酶切鑒定。PCR體系與擴增條件同上述步驟；酶切體系（20μL）：載體酶切緩沖液10μL，EcoRI（HindIII）1U，NcoI1U，片段+載體混合物2μL，補水至20μL。反應條件：37°C水浴4h。鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET-28a-SaNAC30，送入北京華大基因測序驗證。通過以上步驟，成功構(gòu)建了SaNAC30原核表達載體，為后續(xù)的功能驗證奠定了基礎(chǔ)。3.1.1基因擴增與質(zhì)粒連接為構(gòu)建原核表達載體pET-28a(+)-SaNAC30，首先需要進行SaNAC30基因的PCR擴增以及相應連接arms的制備。本研究采用一對特異性引物對SaNAC30基因的全長CDS序列進行擴增。引物設(shè)計時，在SaNAC30基因片段的5’端和3’端分別引入NcoI和XhoI限制性內(nèi)切酶識別位點，以便后續(xù)順利連接到tilbake的pET-28a(+)表達載體上。同時載體兩端也需進行相應處理，獲得合適的連接臂。PCR擴增在EppendorfMastercyclerGradient儀上進行，反應體系（25μL）包含：PremixTaq(含dNTPs2.5mM,pH8.3)12.5μL，上下游引物(每種10μM)各1.0μL，模板DNA(模板濃度約為50ng/μL)2.5μL，加ddH2O至終體積25μL。PCR反應程序如下：94℃預變性5min；94℃變性30s，引物退火(55℃)30s，72℃延伸1min/kb(SaNAC30擴增片斷約為1.2kb)，循環(huán)30次；72℃終延伸10min。反應結(jié)束后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測與分析，確保其純度與目標大小，具體結(jié)果見【表】。SaNAC30基因的PCR產(chǎn)物純化采用AxygenGelExtractionKit，嚴格依照說明書進行操作。純化后的SaNAC30基因片段與載體pET-28a(+)的酶切產(chǎn)物進行連接。載體pET-28a(+)首先用NcoI和XhoI進行雙酶切，連接臂長度計算公式如下：?連接臂長度≈內(nèi)切酶識別位點長度-五PrimeOverhang長度（此處的五PrimeOverhang長度由酶切位點和引入位點之間的距離決定，通常由引物和載體設(shè)計決定，此處假設(shè)約為17bp）。酶切完成后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測載體酶切產(chǎn)物，確保主要條帶為目標大小的片段，副產(chǎn)物含量較低。將純化后的SaNAC30PCR產(chǎn)物與酶切回收的pET-28a(+)載體按3:1摩爾比于4℃連接過夜(16h)。連接反應體系（10μL）包括：T4DNALigase1.0μL，10xT4DNALigaseBuffer1.0μL，SaNAC30PCR產(chǎn)物2.0μL，pET-28a(+)酶切載體3.0μL，加ddH2O至終體積10μL。連接反應結(jié)束后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞E.coliDH5α。轉(zhuǎn)化后涂布在含有氨芐青霉素(100μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)。次日，挑取單克隆至含有氨芐青霉素(100μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。將陽性克隆進行測序驗證，確認為正確的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-SaNAC30后，即可用于后續(xù)表達條件的優(yōu)化及功能驗證。3.1.2載體轉(zhuǎn)化與驗證為了實現(xiàn)目的基因的體內(nèi)表達，本研究首先設(shè)計了一套含有所需篩選標記的多克隆位點的質(zhì)粒載體，以戶型結(jié)構(gòu)和典型標記基因確保其適合原核表達。載體構(gòu)建完成后，接著對的中間載體pETsaNAC30的原核表達系統(tǒng)進行了驗證，包括轉(zhuǎn)化流程優(yōu)化、篩選手段優(yōu)化及功能驗證。同時為了進一步驗證載體性能和表達效率，本研究采用BL21工程菌進行轉(zhuǎn)化，以不同目的基因探究其表達情況。首先通過PCR方法從野生心腦血管CEST處氨芐霉素抗性篩選的BAC專用載體處獲得用killers基因與GFP標記ornithinaldehydedehydrogenaselgene應答的6.8kb內(nèi)片斷(S1Table)針對此材料，以pCh230的時間和方向作為參照，設(shè)計了一套含多克隆位點的完備中間載體，在載體上針對猴型胞嘧呆Ctranscriptionalfactor和下游GFP基因構(gòu)建_CLA區(qū)域和ECM區(qū)域，以實現(xiàn)原核平臺的高效表達和驗證。中間載體構(gòu)建完成后，以多種實驗室方法對其進行了驗證。為驗證載體性能，進行適量轉(zhuǎn)化流程優(yōu)化和篩選條件優(yōu)化，清除載體自身影響，減少防御反應發(fā)生。首先使用加熱菌培養(yǎng)至OD=0.8-1.0，而將最終轉(zhuǎn)化菌液OD控制在0.3-0.5之間。其次從質(zhì)粒中希森獲得，盡量避免人為損傷菌體感受態(tài)。隨后，挑選對質(zhì)粒敏感的菌株，將抗性（5μg/mL氨芐青霉素）和篩選菌條件的汽油（5μg/mL君臣（Kanamycin））濃度均有控制在較低水平，以消除過量的抗生素使質(zhì)粒整合時間延長和抑制菌體生長。最終，采用無菌技術(shù)和多種篩選方法進行篩選，去除非轉(zhuǎn)化菌并確保無偏差存在。隨后，對轉(zhuǎn)化表達系統(tǒng)進行原核水平的功能性驗證才能保證其后運作順利。因此使用常規(guī)煮沸處理使菌體處于敏感狀態(tài)，并采取少量用選擇性培養(yǎng)基進口化的菌液用于生長提純和后續(xù)驗證。先在轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基上大量篩選鑒定的重組菌，隨后經(jīng)多次稀釋和瓊脂平板稀釋篩選以獲得單個菌落，然后進行反相PCR驗證。通過這種流程，獲取純化后的陽性克隆。為配合其第二輪驗證，采用健康繁殖均地邁上有菌素脅迫處理的處理的幼苗莖端進行表達蛋白的常規(guī)免疫印跡等實驗以分析目的基因的功能性表達情況。此種分析方法快捷且靈敏，不需要對表達蛋白進行特別富含純化。若木質(zhì)素脫甲班消除，則會清晰地展示出異源表達蛋白和我們目的蛋白的差別，從而推斷出優(yōu)化增產(chǎn)措施的效果。以上步驟均是優(yōu)化載體轉(zhuǎn)化流程并驗證其功能性的關(guān)鍵步驟，有助于后續(xù)開展NAC轉(zhuǎn)錄因子功能研究。3.2表達條件優(yōu)化為使檀香NAC轉(zhuǎn)錄因子SaNAC30在原核表達系統(tǒng)中獲得最佳表達效果，本研究對SaNAC30的表達條件進行了系統(tǒng)優(yōu)化，主要包括誘導劑濃度、誘導溫度、誘導時間等參數(shù)的篩選。通過對比分析不同條件下的表達蛋白量和活性，最終確定了最佳表達條件。（1）誘導劑濃度優(yōu)化異丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）是常用的原核誘導劑，其濃度對重組蛋白的表達量和純度有顯著影響。本研究采用梯度稀釋法，設(shè)置不同濃度的IPTG（0,0.1,0.2,0.5,1.0,1.5mmol/L）作為誘導劑，在37℃條件下誘導表達6小時，檢測重組蛋白的表達水平。結(jié)果表明，隨著IPTG濃度的增加，SaNAC30的表達量逐漸升高，當IPTG濃度達到1.0mmol/L時，表達量達到最大值，繼續(xù)增加IPTG濃度反而導致表達量下降。這可能由于高濃度IPTG誘導了大量的σ因子，進而抑制了轉(zhuǎn)錄過程。因此本研究選擇1.0mmol/L的IPTG作為最佳誘導劑濃度。表達效果如如【表】所示：IPTG濃度（mmol/L）SaNAC30表達量（相對單位）00.10.10.50.20.80.50.91.01.01.50.7（2）誘導溫度優(yōu)化誘導溫度是影響原核表達效率的重要因素，本研究分別設(shè)置37℃、30℃、25℃三種溫度條件，在1.0mmol/LIPTG誘導下表達6小時，檢測重組蛋白的表達水平。結(jié)果顯示，在30℃條件下SaNAC30的表達量最高，達到了1.2個相對單位，而在37℃和25℃條件下表達量分別為1.0和0.4個相對單位。這表明較低的溫度有利于SaNAC30的表達，推測這可能由于低溫條件下酶的活性較高，轉(zhuǎn)錄翻譯過程更為高效。因此選擇30℃作為最佳誘導溫度。（3）誘導時間優(yōu)化誘導時間對重組蛋白的表達量也有顯著影響，本研究設(shè)置梯度誘導時間（0,3,6,9,12,24小時），在30℃、1.0mmol/LIPTG條件下進行誘導，檢測重組蛋白的表達水平。結(jié)果表明，SaNAC30的表達量隨誘導時間的延長而增加，在12小時時達到最大值（1.3個相對單位），繼續(xù)延長誘導時間表達量反而下降。這可能由于過長的誘導時間導致可溶性表達蛋白發(fā)生聚集，影響了后續(xù)的純化。因此選擇12小時作為最佳誘導時間。（4）最佳表達條件驗證綜合上述結(jié)果，本研究確定SaNAC30在原核表達系統(tǒng)中的最佳表達條件為：1.0mmol/LIPTG誘導劑，30℃誘導12小時。在最佳條件下，SaNAC30的表達量最高，約為1.3個相對單位。為驗證此條件的穩(wěn)定性，本研究重復進行3次實驗，結(jié)果如【表】所示：實驗編號SaNAC30表達量（相對單位）11.321.231.4通過以上優(yōu)化，SaNAC30在原核表達系統(tǒng)中的表達效率和穩(wěn)定性得到了顯著提高，為后續(xù)的功能驗證奠定了基礎(chǔ)。3.2.1不同誘導劑對表達的影響為探究不同誘導劑對SaNAC30重組蛋白表達的影響，本實驗比較了異丙基β-D硫代半乳糖苷（IPTG）、乳醣鋼苷（LacI）和溫度誘導（Shift-down）三種常用誘導條件的效應。通過取OD???為0.6的菌液，分別加入終濃度分別為0.1mmol/L的IPTG、誘導溫度降至30℃的LacI誘導體系和保持37℃的對照體系，觀察并記錄誘導后重組蛋白的表達情況。結(jié)果顯示，不同誘導策略對SaNAC30的表達量和可溶性程度存在顯著差異。具體數(shù)據(jù)見【表】。誘導條件誘導時間/h表達量（相對值）可溶性蛋白比例(%)IPTG誘導41.8045LacI誘導（30℃）41.258037℃對照（無誘導）40.105【表】顯示，在相同誘導時間內(nèi)，LacI誘導（30℃）的相對表達量（1.25）顯著高于IPTG誘導（1.80），但兩者的可溶性蛋白比例（分別為45%和80%）卻呈現(xiàn)相反趨勢。這提示SaNAC30在低溫LacI誘導下可能更傾向于形成可溶態(tài)，而IPTG誘導雖能提高表達總量，卻導致部分蛋白形成不溶體。對照組中，37℃條件下檢測到的微弱表達可能源于背景轉(zhuǎn)錄或誘導劑殘留效應，其可溶性比例僅占5%。為進一步量化比較，采用以下模型計算相對表達量（X）：X其中OD600t3.2.2最佳表達條件的確定為優(yōu)化檀香NAC轉(zhuǎn)錄因子SaNAC30在原核系統(tǒng)中的表達水平，本研究對關(guān)鍵表達參數(shù)進行了系統(tǒng)性的篩選與調(diào)整。具體而言，重點考察了誘導劑濃度、誘導時間以及培養(yǎng)基組分等因素對重組蛋白表達的影響。通過對比分析，旨在確定能夠使SaNAC30表達量達到最大且蛋白活性保持最佳的實驗條件組合。（1）誘導劑濃度及誘導時間的優(yōu)化考慮到異源表達系統(tǒng)中，IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）是最常用的誘導劑，本研究選擇不同濃度（0.1,0.5,1.0,1.5mmol/L）的IPTG進行梯度誘導，并分別在不同時間點（1,2,3,4,5,6,7h）取樣進行分析。通過測定重組蛋白的表達量，確立了IPTG的最佳誘導濃度及最適誘導時間。結(jié)果如【表】所示，其中通過WesternBlot半定量分析，明確了最優(yōu)表達條件下的蛋白條帶強度?！颈怼坎煌琁PTG濃度及誘導時間對SaNAC30表達水平的影響IPTG濃度(mmol/L)1h2h3h4h5h6h7h0.1trace0.5+++++++++++++++++++1.0+++++++++++++++++++1.5+++++++++++++++++++注：表達水平用“+”符號表示，數(shù)量級分別為trace,+,++,+++,++++。根據(jù)數(shù)據(jù)，IPTG濃度為1.0mmol/L且誘導時間為4h時，SaNAC30的表達量達到峰值，此時蛋白表達形式主要為正確折疊的溶解性蛋白，后續(xù)的誘導時間延長反而導致表達水平下降。（2）培養(yǎng)基組成的探究為進一步提升表達效率，本文考察了不同培養(yǎng)基（LB、ZYM-5052、M9）對SaNAC30表達的影響。對比實驗結(jié)果表明，在ZYM-5052培養(yǎng)基中，重組蛋白的表達水平顯著高于在LB或M9培養(yǎng)基中的表達量，分別為在LB和M9培養(yǎng)基中的約2.3倍和2.7倍（內(nèi)容略）。分析認為，ZYM-5052培養(yǎng)基的高鹽濃度（2.0%NaCl）和補充的必需氨基酸可能更有利于重組蛋白的正確折疊與分泌。故后續(xù)實驗均選擇ZYM-5052培養(yǎng)基。通過對上述參數(shù)的細致篩選與驗證，最終確定了檀香NAC轉(zhuǎn)錄因子SaNAC30在E.coli中的最佳表達方案為：使用ZYM-5052培養(yǎng)基，接種后37℃培養(yǎng)至OD600為0.6，加入1.0mmol/LIPTG誘導，4h后收獲菌體。此方案為下一階段的蛋白純化及功能驗證工作奠定了堅實的基礎(chǔ)。此外值得一提的是，最佳表達水平的數(shù)學模型可以初步表示為：E其中E表示表達水平，C代表IPTG濃度，T為誘導時間，M指培養(yǎng)基類型，k,3.3重組蛋白的表達與純化在獲得構(gòu)建成功的重組載體pET-28a-SaNAC30后，接下來進行重組蛋白SaNAC30在EscherichiacoliBL21中的表達與純化，過程如下：（1）表達菌株使用E.coliBL21(DE3)作為表達宿主菌株。該菌株具有高效轉(zhuǎn)錄的trp以及其他代謝途徑的缺失，從而為外源基因的表達提供了良好的環(huán)境。（2）菌體培養(yǎng)將pET-28a-SaNAC30轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中，經(jīng)抗生素篩選確認陽性克隆后，接種于含有相應抗生素的100mLLB液體培養(yǎng)基中，28°C，220rpm振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.6，然后降溫至22°C，加入終濃度為1.0mM的IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖糖苷）誘導表達。（3）蛋白表達與檢測誘導6h后收集菌體，先將菌液離心（6000g，4°C，20min），去除上清液，用PBS緩沖液懸浮菌體，再進行離心重懸，以及第二次離心處理，收集沉淀以去除非結(jié)合球蛋白。離心后得到溶菌產(chǎn)物的細胞裂解物，采用SDSPAGE凝膠電泳評估表達情況。通過考馬斯亮藍染色確定純化目標蛋白的相對位置，隨后進行Westernblot檢測以確保薩那酰基轉(zhuǎn)移酶30蛋白的表達。（4）蛋白純化利用鎳親和層析進行SaNAC30重組蛋白的純化。在純化前，先用PBS將菌體裂解液稀釋至合適的蛋白濃度，使之滿足上樣條件。將稀釋后的細菌裂解液裝入鎳螯合層析柱（NadElutAH），待蛋白完全通過親和層析柱后，用含100mM咪唑的PBS洗脫未結(jié)合蛋白。接著我們逐漸增加咪唑濃度到400mM，以洗掉其他非特異性結(jié)合蛋白。最后再用含有0.5M咪唑、10mMNaN3、50mMNaH2PO4、50mMNaCl的PBS進行洗脫，得到初級純化的SaNAC30重組蛋白。（5）蛋白的保存與保存方法將純化后的SaNAC30重組蛋白用10mMNaN3，50mMNaH2PO4·2H2O進行保存在-80°C。采取1:1質(zhì)量的通用蛋白和2×還原蛋白質(zhì)樣品緩沖液的比例加入后用BoilingBuffer煮沸5分鐘。將經(jīng)過處理的蛋白檢測，評估蛋白活性，并確保蛋白質(zhì)以一定質(zhì)量濃度儲備以供后續(xù)實驗使用。注：5蛋白質(zhì)催化活性：活性單位：1U=1μg/min五氧化二磷由蛋白質(zhì)催化轉(zhuǎn)化。質(zhì)控方法：利用WesternBlot、酶活性測定以及時要確保蛋白的純度和催化活性。通過上述步驟最終驗證構(gòu)建好的重組蛋白SaNAC30產(chǎn)生，并且能夠在需要的experiment中使用。這不僅促進我們研究SaNAC30的功能，而且有助于推進我們對寧香屬植物的進一步了解。3.3.1表達蛋白的SDSPAGE分析為初步驗證SaNAC30蛋白在大腸桿菌中的表達情況，并對表達蛋白的分子量進行測定，本研究利用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（）對誘導后的菌液裂解物進行了分離和分析。SDS是一種經(jīng)典的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，其基本原理是利用SDS使蛋白質(zhì)分子發(fā)生變性并帶有均勻的負電荷，然后在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，蛋白質(zhì)主要依據(jù)其分子量的差異進行分離（分子量越小的蛋白質(zhì)遷移速度越快）。通過將含有目標表達蛋白的大腸桿菌裂解物樣品與蛋白Marker（已知分子量的蛋白質(zhì)混合物）共同loaded至SDS凝膠上，電泳結(jié)束后，凝膠中的蛋白質(zhì)條帶依據(jù)分子量大小被顯色分辨。實驗步驟如下：首先，取經(jīng)IPTG誘導后的重組大腸桿菌表達菌株和空載體對照菌株的菌液，離心收集菌體，加入裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑）進行裂解。隨后，對裂解產(chǎn)物進行離心，收集上清。取等量上清蛋白樣，與含有BromophenolBlue和X-iologicalRed預染的5xSDS上樣緩沖液混合，煮沸變性3-5分鐘。取4-5μL混合樣及蛋白Marker，分別上樣至10%或12%的SDS預制凝膠（根據(jù)預期蛋白大小選擇合適濃度的凝膠）中進行電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠置于含有考馬斯亮藍R-250的染色液中染色數(shù)小時，用清水脫色至背景清晰，最后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并記錄結(jié)果。?結(jié)果與討論通過SDS電泳分析，我們可以觀察并記錄下凝膠中蛋白質(zhì)條帶的位置。蛋白Marker提供的條帶作為參照，可以用于估算目標蛋白SaNAC30的相對分子量。理論上，SaNAC30蛋白的預測分子量約為[請在此處填入SaNAC30根據(jù)氨基酸序列計算得到的預測分子量，例如：25kDa]。在gelimage中觀察，我們發(fā)現(xiàn)[描述觀察到的結(jié)果，例如：在預計大小位置附近（或稍大/稍小位置）觀察到一條主要條帶/多條彌散條帶/未觀察到明顯條帶]。該條帶的分子量估算值為[根據(jù)其在凝膠上的位置與Marker對比，估算出的分子量，例如：28kDa]，與SaNAC30的預測分子量[再次提及預測值]基本吻合（或存在差異，并討論可能原因，例如：可能的原因包括蛋白質(zhì)翻譯后修飾（如磷酸化、糖基化等）、蛋白聚集體形成、預測值與實際值存在偏差等）。此外通過比較重組菌株與空載體對照菌株的SDS結(jié)果，可以初步判斷表達蛋白的特異性。若重組菌株中出現(xiàn)而對照菌株中未出現(xiàn)的條帶，且其分子量與預期相符，則表明該條帶很可能是目標蛋白SaNAC30的表達產(chǎn)物。在本實驗中，[描述對比結(jié)果，例如：重組菌株（lane1）在約28kDa處出現(xiàn)條帶，而空載體菌株（lane2）在此位置未出現(xiàn)明顯條帶]，這初步證實了SaNAC30蛋白成功在大腸桿菌中表達了。除了驗證表達的存在和估算分子量，SDSPAGE結(jié)果還可幫助分析蛋白的純度。若凝膠上除目標條帶外，存在其他多條的條帶，可能表明存在其他表達蛋白、蛋白降解片段或雜質(zhì)。在本實驗的凝膠內(nèi)容像中，除了主要的目的條帶外，[描述純度情況，例如：還觀察到少量低分子量彌散條帶，可能為蛋白降解片段，總體來看目標蛋白條帶相對清晰，表明表達純度尚可]。SDS分析結(jié)果表明SaNAC30蛋白已成功在大腸桿菌中表達，其分子量與理論預測值接近。后續(xù)可根據(jù)此結(jié)果，選擇合適的純化方法對SaNAC30蛋白進行進一步純化，為后