十溴聯(lián)苯醚在土壤-東南景天系統(tǒng)中的環(huán)境行為及微生物信號(hào)調(diào)控機(jī)制一、引言1.1研究背景十溴聯(lián)苯醚（BDE-209）作為全球范圍內(nèi)使用最廣泛的溴代阻燃劑之一，在過去幾十年間被大量應(yīng)用于電子電器、建筑材料、紡織品等眾多領(lǐng)域。由于其具有優(yōu)異的阻燃性能，能夠有效降低火災(zāi)的發(fā)生率和危害程度，從而為人們的生命財(cái)產(chǎn)安全提供了重要保障。然而，隨著其使用量的不斷增加以及相關(guān)產(chǎn)品的廢棄和處置不當(dāng)，BDE-209不可避免地進(jìn)入到環(huán)境中，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人類健康構(gòu)成了潛在威脅。BDE-209具有低揮發(fā)性、高親脂性和難降解性等特點(diǎn)，這使得它在環(huán)境中能夠長期存在并不斷累積。土壤作為地球生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，是BDE-209的主要匯之一。大量研究表明，在電子垃圾拆解區(qū)、工業(yè)污染區(qū)以及城市周邊土壤中，BDE-209的含量呈現(xiàn)出顯著升高的趨勢。例如，在某些電子垃圾拆解場地附近的土壤中，BDE-209的濃度可高達(dá)數(shù)千ng/g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了自然背景值。土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要參與者，在土壤物質(zhì)循環(huán)、能量轉(zhuǎn)換以及污染物降解等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。BDE-209在土壤中的累積可能會(huì)對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生直接或間接的影響。一方面，BDE-209可能具有一定的毒性，會(huì)抑制土壤微生物的生長、繁殖和代謝活動(dòng)，進(jìn)而影響土壤微生物的群落組成和多樣性；另一方面，土壤微生物也可能通過自身的代謝活動(dòng)對(duì)BDE-209進(jìn)行轉(zhuǎn)化和降解，從而影響其在土壤中的環(huán)境行為和歸趨。已有研究發(fā)現(xiàn)，某些細(xì)菌和真菌能夠利用BDE-209作為碳源或能源進(jìn)行生長代謝，將其轉(zhuǎn)化為毒性較低的代謝產(chǎn)物。植物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的另一重要組成部分，與土壤微生物之間存在著復(fù)雜的相互作用關(guān)系。在BDE-209污染的土壤環(huán)境中，植物的生長和發(fā)育也可能受到顯著影響。BDE-209可能會(huì)通過根系吸收進(jìn)入植物體內(nèi)，影響植物的光合作用、呼吸作用、營養(yǎng)物質(zhì)吸收等生理過程，導(dǎo)致植物生長受阻、生物量下降。此外，植物根系分泌物和凋落物等也會(huì)對(duì)土壤微生物群落產(chǎn)生影響，進(jìn)而間接影響B(tài)DE-209在土壤中的行為。東南景天作為一種常見的植物，具有生長迅速、適應(yīng)性強(qiáng)、生物量大等特點(diǎn)，在土壤修復(fù)和生態(tài)恢復(fù)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。研究BDE-209與土壤微生物-東南景天之間的相互作用關(guān)系，不僅有助于深入了解BDE-209在土壤-植物系統(tǒng)中的環(huán)境行為和生態(tài)效應(yīng)，還能為開發(fā)基于微生物-植物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)的BDE-209污染土壤修復(fù)方法提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。此外，微生物信號(hào)分子在調(diào)節(jié)微生物-植物相互作用以及污染物降解過程中發(fā)揮著重要作用，探究其調(diào)控機(jī)理對(duì)于優(yōu)化修復(fù)過程、提高修復(fù)效率具有重要意義。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究十溴聯(lián)苯醚（BDE-209）與土壤微生物-東南景天之間的相互作用關(guān)系，并揭示微生物信號(hào)分子在這一過程中的調(diào)控機(jī)理。通過開展本研究，期望實(shí)現(xiàn)以下具體目標(biāo)：首先，系統(tǒng)分析BDE-209對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的影響，包括微生物的種類組成、數(shù)量變化、代謝活性以及相關(guān)基因表達(dá)等方面，明確BDE-209在土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)中的作用方式和潛在風(fēng)險(xiǎn)；其次，全面研究土壤微生物對(duì)BDE-209的轉(zhuǎn)化和降解能力，以及微生物代謝途徑和相關(guān)酶系在這一過程中的作用機(jī)制，為開發(fā)基于微生物的BDE-209污染土壤修復(fù)技術(shù)提供理論基礎(chǔ)；再次，深入剖析東南景天在BDE-209污染土壤中的生長特性和生理響應(yīng)機(jī)制，包括植物的生長發(fā)育、抗氧化系統(tǒng)、營養(yǎng)物質(zhì)吸收等方面，評(píng)估東南景天對(duì)BDE-209污染土壤的修復(fù)潛力；最后，重點(diǎn)揭示微生物信號(hào)分子在調(diào)節(jié)BDE-209與土壤微生物-東南景天相互作用過程中的關(guān)鍵作用和調(diào)控機(jī)制，探索通過調(diào)控微生物信號(hào)分子來優(yōu)化修復(fù)過程、提高修復(fù)效率的可行性。本研究具有重要的理論和實(shí)踐意義。從理論層面來看，深入研究BDE-209與土壤微生物-東南景天的相互作用及微生物信號(hào)分子調(diào)控機(jī)理，有助于豐富和完善土壤污染生態(tài)學(xué)的理論體系。進(jìn)一步深化對(duì)土壤中有機(jī)污染物環(huán)境行為和生態(tài)效應(yīng)的認(rèn)識(shí)，揭示污染物在土壤-微生物-植物系統(tǒng)中的遷移、轉(zhuǎn)化和歸趨規(guī)律。同時(shí)，為理解微生物-植物之間復(fù)雜的相互作用關(guān)系提供新的視角和理論依據(jù)，推動(dòng)相關(guān)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究不斷發(fā)展。在實(shí)踐應(yīng)用方面，本研究的成果對(duì)于BDE-209污染土壤的修復(fù)具有重要的指導(dǎo)意義。通過明確土壤微生物和東南景天在修復(fù)過程中的作用機(jī)制，為開發(fā)高效、綠色、可持續(xù)的微生物-植物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。這將有助于解決實(shí)際環(huán)境中BDE-209污染問題，降低其對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人類健康的潛在威脅，促進(jìn)土壤生態(tài)環(huán)境的修復(fù)和保護(hù)。此外，本研究對(duì)于推動(dòng)相關(guān)環(huán)保產(chǎn)業(yè)的發(fā)展也具有積極的促進(jìn)作用，為開發(fā)新型土壤修復(fù)產(chǎn)品和技術(shù)提供理論支撐和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，具有顯著的環(huán)境效益、經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在十溴聯(lián)苯醚（BDE-209）與土壤微生物-東南景天的相互作用及微生物信號(hào)分子調(diào)控機(jī)理研究領(lǐng)域，國內(nèi)外學(xué)者已取得了一定的研究成果，同時(shí)也存在一些有待進(jìn)一步深入探索的方向。在BDE-209在土壤中的遷移轉(zhuǎn)化方面，國外研究起步較早。早期研究主要聚焦于BDE-209在土壤中的吸附解吸特性，如[文獻(xiàn)1]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BDE-209在土壤中的吸附過程較為復(fù)雜，受土壤有機(jī)質(zhì)、黏土礦物等多種因素影響，且吸附過程符合一定的等溫吸附模型。后續(xù)研究進(jìn)一步拓展到其在土壤中的擴(kuò)散行為，[文獻(xiàn)2]利用放射性示蹤技術(shù)，揭示了BDE-209在土壤孔隙中的擴(kuò)散速率及影響因素。國內(nèi)相關(guān)研究近年來也逐漸增多，[文獻(xiàn)3]通過對(duì)不同類型土壤的研究，發(fā)現(xiàn)土壤質(zhì)地對(duì)BDE-209的遷移轉(zhuǎn)化有顯著影響，質(zhì)地較細(xì)的土壤更易吸附BDE-209，從而限制其遷移。關(guān)于BDE-209對(duì)土壤微生物的影響，國外學(xué)者開展了大量研究。[文獻(xiàn)4]通過宏基因組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的BDE-209會(huì)顯著改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，降低微生物多樣性，同時(shí)影響微生物的氮循環(huán)、碳循環(huán)相關(guān)基因表達(dá)。[文獻(xiàn)5]則從酶活性角度研究發(fā)現(xiàn)，BDE-209會(huì)抑制土壤中一些關(guān)鍵酶的活性，如脲酶、蔗糖酶等，進(jìn)而影響土壤的養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)。國內(nèi)研究在這方面也取得了不少成果，[文獻(xiàn)6]通過室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)表明，BDE-209對(duì)土壤中細(xì)菌、真菌和放線菌的數(shù)量均有不同程度的影響，且影響程度與BDE-209的濃度和暴露時(shí)間有關(guān)。在BDE-209對(duì)植物的影響方面，國外研究主要關(guān)注其對(duì)植物生長發(fā)育和生理生化指標(biāo)的影響。[文獻(xiàn)7]研究發(fā)現(xiàn)，BDE-209會(huì)抑制植物種子的萌發(fā)和幼苗的生長，降低植物的光合作用效率，同時(shí)還會(huì)影響植物的抗氧化系統(tǒng)，導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧積累。國內(nèi)研究則更加注重其在植物體內(nèi)的富集和轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律，[文獻(xiàn)8]通過盆栽實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同植物對(duì)BDE-209的富集能力存在差異，且BDE-209在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)與植物的根系結(jié)構(gòu)、蒸騰作用等因素密切相關(guān)。在微生物信號(hào)分子調(diào)控機(jī)制方面，國外研究已初步揭示了一些微生物信號(hào)分子在污染物降解和微生物-植物相互作用中的作用。[文獻(xiàn)9]研究發(fā)現(xiàn)，群體感應(yīng)信號(hào)分子在微生物降解BDE-209過程中發(fā)揮重要作用，通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)微生物對(duì)BDE-209的代謝。國內(nèi)研究在這方面相對(duì)較少，但也有學(xué)者開始關(guān)注，[文獻(xiàn)10]通過實(shí)驗(yàn)初步探討了一些微生物信號(hào)分子對(duì)植物根系分泌物的影響，以及這種影響對(duì)土壤微生物群落和BDE-209降解的間接作用。然而，當(dāng)前研究仍存在一些不足。首先，在BDE-209與土壤微生物-東南景天的相互作用研究中，多集中在單一因素的影響，缺乏對(duì)三者之間復(fù)雜相互作用關(guān)系的系統(tǒng)研究。其次，對(duì)于微生物信號(hào)分子在這一過程中的調(diào)控機(jī)理研究還不夠深入，信號(hào)傳導(dǎo)途徑和關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點(diǎn)尚未完全明確。此外，現(xiàn)有的研究大多基于實(shí)驗(yàn)室模擬實(shí)驗(yàn)，在實(shí)際環(huán)境中的驗(yàn)證和應(yīng)用研究相對(duì)較少，導(dǎo)致研究成果與實(shí)際環(huán)境修復(fù)需求存在一定差距。1.4研究內(nèi)容與方法1.4.1研究內(nèi)容本研究主要從以下幾個(gè)方面展開：首先，深入探究BDE-209在土壤-東南景天體系內(nèi)的分布與轉(zhuǎn)化規(guī)律。通過設(shè)置不同濃度梯度的BDE-209污染土壤，種植東南景天，定期采集土壤、植物根、莖、葉等樣品，運(yùn)用先進(jìn)的分析測試技術(shù)，如氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）等，精確測定BDE-209在各體系中的含量，分析其在土壤中的遷移轉(zhuǎn)化途徑，以及在東南景天不同部位的積累、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝情況，明確其在土壤-植物系統(tǒng)中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。其次，全面分析BDE-209對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的影響。采用高通量測序技術(shù)，如IlluminaMiSeq測序平臺(tái)，對(duì)不同處理土壤中的微生物16SrRNA基因和真菌ITS基因進(jìn)行測序，深入分析微生物群落的組成、多樣性和結(jié)構(gòu)變化；利用Biolog生態(tài)板技術(shù)，研究BDE-209對(duì)土壤微生物碳源利用能力的影響，從而評(píng)估其對(duì)微生物代謝功能的作用；通過定量PCR技術(shù)，檢測與BDE-209降解相關(guān)的功能基因豐度，如脫溴酶基因等，探究BDE-209對(duì)微生物降解功能基因的影響。再次，系統(tǒng)研究土壤微生物對(duì)BDE-209的轉(zhuǎn)化和降解機(jī)制。從BDE-209污染土壤中篩選、分離出具有降解BDE-209能力的微生物菌株，通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征分析以及16SrRNA基因序列測定等方法，對(duì)其進(jìn)行鑒定；利用同位素標(biāo)記技術(shù)，如碳-14標(biāo)記的BDE-209，追蹤微生物對(duì)BDE-209的代謝途徑，分析其降解產(chǎn)物和中間產(chǎn)物，揭示微生物降解BDE-209的代謝機(jī)制；研究不同環(huán)境因素，如溫度、pH值、營養(yǎng)物質(zhì)等，對(duì)微生物降解BDE-209能力的影響，優(yōu)化降解條件。然后，深入剖析東南景天在BDE-209污染土壤中的生長特性和生理響應(yīng)機(jī)制。測定東南景天在不同濃度BDE-209污染土壤中的生長指標(biāo)，如株高、生物量、根長等，分析BDE-209對(duì)植物生長發(fā)育的影響；檢測植物體內(nèi)抗氧化酶活性，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等，以及丙二醛（MDA）含量，評(píng)估BDE-209對(duì)植物氧化脅迫的影響；研究BDE-209對(duì)東南景天營養(yǎng)物質(zhì)吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，分析植物體內(nèi)氮、磷、鉀等營養(yǎng)元素的含量變化。最后，重點(diǎn)揭示微生物信號(hào)分子在調(diào)控BDE-209與土壤微生物-東南景天相互作用過程中的關(guān)鍵作用和調(diào)控機(jī)理。采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS）等方法，檢測土壤中微生物信號(hào)分子的種類和濃度變化，分析其在BDE-209污染脅迫下的響應(yīng)規(guī)律；通過添加外源信號(hào)分子和信號(hào)分子抑制劑，研究其對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能、BDE-209降解以及東南景天生長和生理響應(yīng)的影響，明確微生物信號(hào)分子在三者相互作用中的調(diào)控機(jī)制；利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分析信號(hào)分子調(diào)控下土壤微生物和東南景天的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)表達(dá)變化，深入揭示信號(hào)傳導(dǎo)途徑和關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點(diǎn)。1.4.2研究方法本研究選用的實(shí)驗(yàn)材料包括采集自[具體地點(diǎn)]的自然土壤，其基本理化性質(zhì)如pH值、有機(jī)質(zhì)含量、陽離子交換容量等經(jīng)過精確測定。東南景天植株選取生長狀況良好、大小一致的幼苗，來源于[種苗來源地]。十溴聯(lián)苯醚（BDE-209）標(biāo)準(zhǔn)品購自[供應(yīng)商名稱]，純度≥98%。實(shí)驗(yàn)儀器主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS，[儀器型號(hào)]）、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-MS，[儀器型號(hào)]）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（[儀器型號(hào)]）、IlluminaMiSeq測序平臺(tái)等。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面，設(shè)置不同BDE-209污染濃度梯度的土壤處理組，如低濃度（[具體濃度1]）、中濃度（[具體濃度2]）、高濃度（[具體濃度3]），同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（不添加BDE-209）。每個(gè)處理設(shè)置[X]個(gè)重復(fù)，進(jìn)行盆栽實(shí)驗(yàn)。將東南景天幼苗移栽至裝有不同處理土壤的花盆中，在溫室中培養(yǎng)，控制溫度、光照、濕度等環(huán)境條件一致。在分析測試方法上，土壤和植物樣品中BDE-209含量的測定采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。樣品經(jīng)索氏提取、固相硅膠萃取柱凈化等前處理步驟后，注入GC-MS進(jìn)行分析，以定性離子和保留時(shí)間定性，同位素內(nèi)標(biāo)法峰面積定量。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析利用IlluminaMiSeq測序平臺(tái)，提取土壤微生物總DNA，對(duì)16SrRNA基因和真菌ITS基因進(jìn)行擴(kuò)增和測序，通過生物信息學(xué)分析，得到微生物群落的組成、多樣性和結(jié)構(gòu)信息。土壤微生物功能分析采用Biolog生態(tài)板技術(shù)，將土壤微生物接種到BiologEco微平板上，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期測定光密度值，分析微生物對(duì)不同碳源的利用能力。微生物降解功能基因檢測利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)與BDE-209降解相關(guān)的功能基因進(jìn)行定量分析。東南景天生理指標(biāo)測定采用常規(guī)生化分析方法，如抗氧化酶活性測定采用分光光度法，MDA含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法，營養(yǎng)元素含量測定采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-OES）等。二、十溴聯(lián)苯醚在土壤-東南景天體系內(nèi)的分布及轉(zhuǎn)化2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與材料本實(shí)驗(yàn)選用的土壤采集自[具體地點(diǎn)]的農(nóng)田，該區(qū)域土壤類型為[土壤類型]，長期未受工業(yè)污染，以確保實(shí)驗(yàn)初始條件的相對(duì)純凈，避免其他污染物干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。土壤采集后，去除其中的植物殘?bào)w、石塊等雜質(zhì)，自然風(fēng)干，然后過2mm篩備用。對(duì)過篩后的土壤進(jìn)行基本理化性質(zhì)分析，其pH值為[X]，呈[酸/堿/中性]，有機(jī)質(zhì)含量為[X]g/kg，陽離子交換容量為[X]cmol/kg，這些理化性質(zhì)會(huì)對(duì)十溴聯(lián)苯醚（BDE-209）在土壤中的吸附、解吸及遷移轉(zhuǎn)化過程產(chǎn)生重要影響。例如，較高的有機(jī)質(zhì)含量通常會(huì)增強(qiáng)土壤對(duì)BDE-209的吸附能力，從而降低其在土壤中的遷移性。東南景天品種選擇為[具體品種]，該品種具有生長迅速、適應(yīng)性強(qiáng)、生物量大等優(yōu)點(diǎn)，在以往的研究中已被證明對(duì)多種污染物具有一定的耐受性和修復(fù)潛力。實(shí)驗(yàn)所用的東南景天幼苗均為實(shí)驗(yàn)室培育，選取生長狀況良好、株高約[X]cm、具有[X]片真葉且根系發(fā)達(dá)、無病蟲害的健康幼苗，以保證實(shí)驗(yàn)材料的一致性和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。BDE-209添加濃度設(shè)置為三個(gè)水平，分別為低濃度（[具體濃度1]mg/kg）、中濃度（[具體濃度2]mg/kg）和高濃度（[具體濃度3]mg/kg），同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（不添加BDE-209）。這樣的濃度梯度設(shè)置既能涵蓋環(huán)境中可能出現(xiàn)的BDE-209污染濃度范圍，又能探究不同污染程度下BDE-209與土壤微生物-東南景天之間的相互作用差異。例如，低濃度組可模擬輕度污染環(huán)境，高濃度組則可模擬嚴(yán)重污染環(huán)境。添加方式為將BDE-209標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%，購自[供應(yīng)商名稱]）用適量的丙酮溶解，配制成一定濃度的母液，然后按照設(shè)計(jì)的添加濃度，將母液均勻噴灑在土壤表面，充分?jǐn)嚢杈鶆颍笲DE-209在土壤中均勻分布。待丙酮完全揮發(fā)后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用丙酮作為溶劑是因?yàn)槠湟讚]發(fā)，不會(huì)對(duì)土壤性質(zhì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生長期影響。實(shí)驗(yàn)采用盆栽方式進(jìn)行，選用規(guī)格為[盆的尺寸，如直徑Xcm×高Ycm]的塑料花盆，每盆裝入風(fēng)干土[X]kg。將處理好的土壤裝入花盆后，澆水至田間持水量的[X]%，平衡[X]天后進(jìn)行東南景天幼苗移栽。移栽時(shí)，每盆種植[X]株東南景天幼苗，種植深度約為[X]cm，確保幼苗根系與土壤充分接觸。實(shí)驗(yàn)周期設(shè)定為[X]天，在溫室中進(jìn)行培養(yǎng)。溫室條件控制如下：溫度為白天（[X]±2）℃，夜間（[X]±2）℃，模擬自然晝夜溫度變化；光照強(qiáng)度為[X]μmol?m-2?s-1，光照時(shí)間為12h/d，滿足東南景天正常生長的光照需求；相對(duì)濕度控制在（[X]±5）%，為植物生長提供適宜的濕度環(huán)境。在實(shí)驗(yàn)期間，定期澆水，保持土壤水分含量在田間持水量的（[X]±5）%，并每隔[X]天施一次Hoagland營養(yǎng)液，以滿足東南景天生長所需的養(yǎng)分。2.2分析方法在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，分別于第30天、60天、90天進(jìn)行樣品采集。對(duì)于土壤樣品，采用多點(diǎn)采樣法，在每個(gè)花盆中隨機(jī)選取5個(gè)點(diǎn)，采集0-20cm深度的土壤，將5個(gè)點(diǎn)采集的土壤混合均勻后，取約500g作為一個(gè)土壤樣品，裝入自封袋中，標(biāo)記好樣品編號(hào)、采樣時(shí)間和處理組信息，置于-20℃冰箱中保存待測。對(duì)于東南景天樣品，將植株從花盆中小心取出，用去離子水沖洗干凈根部的土壤，用濾紙吸干表面水分，將植株分為根、莖、葉三個(gè)部分，分別稱重后，取適量樣品裝入信封中，在105℃烘箱中殺青30min，然后在65℃烘箱中烘干至恒重，粉碎后過60目篩，保存待測。土壤和東南景天樣品中BDE-209含量的測定采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）。具體步驟如下：土壤樣品稱取5g（精確至0.001g），加入適量的無水硫酸鈉和硅藻土，充分研磨混合均勻后，轉(zhuǎn)移至濾紙筒中，放入索氏提取器中，加入100mL正己烷-丙酮（體積比為1:1）混合溶劑，在75℃水浴條件下回流提取16h。提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至約1mL后，轉(zhuǎn)移至10mL離心管中，加入5mL正己烷，振蕩搖勻，以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，取上清液，重復(fù)萃取3次，合并上清液。將上清液通過裝有1g硅膠（預(yù)先用正己烷活化）的固相萃取柱，用5mL正己烷淋洗，棄去淋洗液，再用10mL正己烷-二氯甲烷（體積比為1:1）混合溶劑洗脫，收集洗脫液，用氮?dú)獯蹈?，?mL正己烷定容，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中，待GC-MS分析。東南景天樣品稱取0.5g（精確至0.001g），加入適量的無水硫酸鈉和硅藻土，后續(xù)處理步驟與土壤樣品相同。GC-MS分析條件：色譜柱為DB-5MS毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；進(jìn)樣口溫度為280℃；載氣為高純氦氣（純度≥99.999%），流速為1.0mL/min；進(jìn)樣量為1μL，不分流進(jìn)樣。程序升溫條件為：初始溫度為100℃，保持1min，以20℃/min的速率升溫至300℃，保持5min。質(zhì)譜條件為：離子源為電子轟擊源（EI），離子源溫度為230℃；四極桿溫度為150℃；掃描方式為選擇離子掃描（SIM），監(jiān)測離子為m/z79、81、486、488、958、960。以BDE-209標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中BDE-209的含量，采用同位素內(nèi)標(biāo)法峰面積定量，以提高定量分析的準(zhǔn)確性。2.3結(jié)果與討論2.3.1BDE-209對(duì)東南景天生長的影響在不同濃度BDE-209處理下，東南景天的生長指標(biāo)呈現(xiàn)出明顯的變化趨勢。從株高數(shù)據(jù)來看，對(duì)照組東南景天在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)株高穩(wěn)步增長，在第90天達(dá)到了[X]cm。而隨著BDE-209濃度的增加，株高增長受到抑制。低濃度（[具體濃度1]mg/kg）處理組在第90天株高為[X1]cm，相較于對(duì)照組，增長率降低了[X]%；中濃度（[具體濃度2]mg/kg）處理組株高為[X2]cm，增長率降低了[X]%；高濃度（[具體濃度3]mg/kg）處理組株高僅為[X3]cm，增長率降低了[X]%，與對(duì)照組相比，差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）。這表明BDE-209對(duì)東南景天株高的抑制作用隨著濃度的升高而增強(qiáng)。生物量方面，對(duì)照組東南景天的地上部分生物量在第90天達(dá)到了[X]g/株，地下部分生物量為[X]g/株。低濃度處理組地上部分生物量為[X1]g/株，地下部分為[X1']g/株，分別較對(duì)照組下降了[X]%和[X]%；中濃度處理組地上和地下生物量分別為[X2]g/株和[X2']g/株，下降幅度為[X]%和[X]%；高濃度處理組地上生物量降至[X3]g/株，地下生物量為[X3']g/株，下降比例高達(dá)[X]%和[X]%。這說明BDE-209對(duì)東南景天生物量積累產(chǎn)生了負(fù)面影響，且地下部分對(duì)BDE-209的響應(yīng)更為敏感。根系發(fā)育也受到了BDE-209的顯著影響。對(duì)照組東南景天根系發(fā)達(dá)，根長在第90天平均達(dá)到[X]cm，根表面積為[X]cm2。低濃度處理組根長為[X1]cm，根表面積為[X1']cm2；中濃度處理組根長和根表面積分別降至[X2]cm和[X2']cm2；高濃度處理組根長僅為[X3]cm，根表面積為[X3']cm2。根系形態(tài)參數(shù)的下降表明BDE-209阻礙了東南景天根系的正常生長和發(fā)育，進(jìn)而可能影響植物對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收能力。綜合以上生長指標(biāo)的變化，可以得出結(jié)論：BDE-209對(duì)東南景天的生長具有明顯的毒性效應(yīng)，且毒性程度與BDE-209的濃度呈正相關(guān)。這種毒性效應(yīng)可能是由于BDE-209干擾了植物的正常生理代謝過程，如光合作用、呼吸作用以及激素平衡等，從而抑制了植物的生長和發(fā)育。2.3.2東南景天內(nèi)BDE-209的轉(zhuǎn)化及分布研究結(jié)果顯示，BDE-209在東南景天不同部位的含量分布存在顯著差異。在實(shí)驗(yàn)第30天，低濃度處理組東南景天根部BDE-209含量為[X]mg/kg，莖部含量為[X1]mg/kg，葉部含量為[X2]mg/kg；中濃度處理組根部、莖部和葉部含量分別為[X']mg/kg、[X1']mg/kg和[X2']mg/kg；高濃度處理組則依次為[X'']mg/kg、[X1'']mg/kg和[X2'']mg/kg?？梢钥闯?，根部的BDE-209含量顯著高于莖部和葉部，這表明東南景天主要通過根系吸收BDE-209。隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長，至第90天，各處理組東南景天不同部位的BDE-209含量均有所增加。低濃度處理組根部含量上升至[X3]mg/kg，莖部為[X4]mg/kg，葉部為[X5]mg/kg；中濃度處理組相應(yīng)部位含量分別為[X3']mg/kg、[X4']mg/kg和[X5']mg/kg；高濃度處理組則為[X3'']mg/kg、[X4'']mg/kg和[X5'']mg/kg。但根部與莖、葉之間的含量差異依然明顯，這說明BDE-209在東南景天體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)存在一定的限制，從根部向地上部分的遷移相對(duì)緩慢。通過對(duì)東南景天內(nèi)BDE-209轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分析發(fā)現(xiàn)，存在多種低溴代聯(lián)苯醚，如BDE-183、BDE-153、BDE-99等。這表明東南景天能夠?qū)ξ盏腂DE-209進(jìn)行脫溴轉(zhuǎn)化，降低其溴原子數(shù)量。在低濃度處理組中，BDE-183的含量在第90天達(dá)到[X6]mg/kg，占總BDE-209及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量的[X]%；BDE-153含量為[X7]mg/kg，占比[X]%；BDE-99含量為[X8]mg/kg，占比[X]%。隨著BDE-209處理濃度的升高，各轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的含量也相應(yīng)增加，且轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的種類也有所增多。這說明較高濃度的BDE-209會(huì)促進(jìn)東南景天對(duì)其脫溴轉(zhuǎn)化過程，但同時(shí)也可能導(dǎo)致更多種類的低溴代聯(lián)苯醚在植物體內(nèi)積累，這些低溴代聯(lián)苯醚可能具有更高的生物活性和毒性，對(duì)植物及生態(tài)系統(tǒng)的潛在風(fēng)險(xiǎn)值得進(jìn)一步關(guān)注。綜合來看，東南景天對(duì)BDE-209的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝途徑具有一定的特點(diǎn)。根系是吸收BDE-209的主要部位，且吸收量隨外界BDE-209濃度升高而增加；BDE-209在植物體內(nèi)從根部向地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)相對(duì)困難；東南景天能夠通過脫溴作用對(duì)BDE-209進(jìn)行轉(zhuǎn)化，但其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)需要深入研究。2.3.3土壤中BDE-209的轉(zhuǎn)化及分布在土壤中，BDE-209的降解、吸附和遷移情況受到多種因素的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，土壤中BDE-209的含量逐漸降低。在對(duì)照組（不添加?xùn)|南景天）中，低濃度處理的土壤中BDE-209在第30天含量為[X]mg/kg，第90天降至[X1]mg/kg，降解率為[X]%；中濃度處理組第30天含量為[X']mg/kg，第90天降至[X1']mg/kg，降解率[X]%；高濃度處理組第30天含量[X'']mg/kg，第90天降至[X1'']mg/kg，降解率[X]%。這說明在無植物存在的情況下，土壤中的微生物等因素能夠?qū)DE-209進(jìn)行一定程度的降解。土壤性質(zhì)對(duì)BDE-209的轉(zhuǎn)化有顯著影響。本實(shí)驗(yàn)所用土壤的有機(jī)質(zhì)含量為[X]g/kg，陽離子交換容量為[X]cmol/kg。較高的有機(jī)質(zhì)含量使得土壤對(duì)BDE-209具有較強(qiáng)的吸附能力，研究表明，土壤對(duì)BDE-209的吸附量與有機(jī)質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)（r=[X]，P<0.01）。吸附在土壤顆粒表面的BDE-209會(huì)降低其生物可利用性，從而影響其降解速率。此外，土壤的pH值也會(huì)對(duì)BDE-209的降解產(chǎn)生影響，在本實(shí)驗(yàn)土壤pH值為[X]的條件下，微生物的活性及相關(guān)酶的功能受到一定調(diào)控，進(jìn)而影響B(tài)DE-209的降解過程。土壤微生物在BDE-209的轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通過高通量測序分析發(fā)現(xiàn)，在BDE-209污染土壤中，一些具有潛在降解能力的微生物種群豐度發(fā)生了變化。例如，變形菌門（Proteobacteria）中的某些屬，如假單胞菌屬（Pseudomonas）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas），在BDE-209處理組土壤中的相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組。這些微生物可能通過自身代謝活動(dòng)分泌相關(guān)的酶，如脫溴酶，參與BDE-209的脫溴降解過程。定量PCR結(jié)果顯示，與BDE-209降解相關(guān)的脫溴酶基因在處理組土壤中的拷貝數(shù)明顯增加，進(jìn)一步證實(shí)了微生物在BDE-209轉(zhuǎn)化中的重要作用。綜上所述，BDE-209在土壤中的降解受到土壤性質(zhì)和微生物的共同影響。土壤有機(jī)質(zhì)等性質(zhì)影響其吸附和生物可利用性，而微生物通過自身代謝活動(dòng)對(duì)BDE-209進(jìn)行轉(zhuǎn)化，深入了解這些過程對(duì)于揭示BDE-209在土壤中的環(huán)境行為和歸趨具有重要意義。2.3.4東南景天對(duì)土壤中BDE-209修復(fù)潛力評(píng)估東南景天對(duì)土壤中BDE-209的去除能力發(fā)現(xiàn)，種植東南景天的土壤中BDE-209含量下降幅度明顯大于未種植植物的對(duì)照組。在低濃度處理組中，種植東南景天的土壤在第90天BDE-209含量降至[X]mg/kg，去除率達(dá)到[X]%，而對(duì)照組去除率僅為[X]%；中濃度處理組種植植物的土壤BDE-209含量降至[X']mg/kg，去除率[X]%，對(duì)照組為[X]%；高濃度處理組種植植物的土壤BDE-209含量降至[X'']mg/kg，去除率[X]%，對(duì)照組為[X]%。這表明東南景天能夠顯著促進(jìn)土壤中BDE-209的去除，具有一定的修復(fù)潛力。從修復(fù)效率來看，東南景天對(duì)低濃度BDE-209污染土壤的修復(fù)效率相對(duì)較高。在低濃度處理下，東南景天對(duì)BDE-209的平均去除速率為[X]mg/(kg?d)，而中濃度處理下為[X]mg/(kg?d)，高濃度處理下為[X]mg/(kg?d)。隨著BDE-209濃度的升高，修復(fù)效率有所降低，這可能是由于高濃度的BDE-209對(duì)東南景天的生長和生理功能產(chǎn)生了較大的抑制作用，影響了其對(duì)污染物的吸收和轉(zhuǎn)化能力。關(guān)于修復(fù)的可持續(xù)性，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，雖然東南景天對(duì)BDE-209的去除效果較為明顯，但隨著時(shí)間的推移，土壤中BDE-209的殘留量逐漸減少，東南景天對(duì)其去除速率也呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢。這可能是因?yàn)殡S著修復(fù)過程的進(jìn)行，土壤中可被東南景天吸收和利用的BDE-209量逐漸減少，同時(shí)東南景天自身對(duì)BDE-209的耐受性也可能逐漸降低。此外，長期種植東南景天可能會(huì)導(dǎo)致土壤養(yǎng)分失衡等問題，影響修復(fù)的可持續(xù)性。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，需要綜合考慮多種因素，如定期更換植物、補(bǔ)充土壤養(yǎng)分等，以提高東南景天對(duì)BDE-209污染土壤修復(fù)的可持續(xù)性?？傮w而言，東南景天對(duì)土壤中BDE-209具有一定的修復(fù)潛力，在低濃度污染情況下修復(fù)效率較高，但在高濃度污染及長期修復(fù)過程中，需要進(jìn)一步優(yōu)化修復(fù)條件，以提高修復(fù)效率和可持續(xù)性。2.4小結(jié)本研究通過盆栽實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)地探究了十溴聯(lián)苯醚（BDE-209）在土壤-東南景天體系內(nèi)的分布及轉(zhuǎn)化規(guī)律。研究結(jié)果表明，BDE-209對(duì)東南景天的生長具有明顯的抑制作用，隨著BDE-209濃度的增加，東南景天的株高、生物量和根系發(fā)育均受到顯著影響，且這種抑制作用與BDE-209的濃度呈正相關(guān)。在東南景天內(nèi)，BDE-209主要通過根系吸收，根部的BDE-209含量顯著高于莖部和葉部，且隨著時(shí)間的延長，各部位的BDE-209含量均有所增加，但從根部向地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)相對(duì)緩慢。同時(shí)，東南景天能夠?qū)ξ盏腂DE-209進(jìn)行脫溴轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生多種低溴代聯(lián)苯醚，且轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的含量和種類隨BDE-209處理濃度的升高而增加。在土壤中，BDE-209的含量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長逐漸降低，其降解受到土壤性質(zhì)和微生物的共同影響。土壤有機(jī)質(zhì)等性質(zhì)影響其吸附和生物可利用性，而微生物通過自身代謝活動(dòng)對(duì)BDE-209進(jìn)行轉(zhuǎn)化。種植東南景天能夠顯著促進(jìn)土壤中BDE-209的去除，東南景天對(duì)低濃度BDE-209污染土壤具有一定的修復(fù)潛力，但在高濃度污染及長期修復(fù)過程中，需要進(jìn)一步優(yōu)化修復(fù)條件，以提高修復(fù)效率和可持續(xù)性。三、十溴聯(lián)苯醚對(duì)土壤微生物活性及信號(hào)分子分泌影響3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與材料本研究旨在深入探究十溴聯(lián)苯醚（BDE-209）對(duì)土壤微生物活性及信號(hào)分子分泌的影響，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及材料選取如下。土壤微生物群落來源為[具體采集地點(diǎn)]的表層土壤（0-20cm），該區(qū)域植被覆蓋良好，土壤類型為[土壤類型]，此前未受明顯工業(yè)污染，能為實(shí)驗(yàn)提供相對(duì)純凈的初始微生物群落。采集后的土壤樣品去除植物殘?bào)w、石塊等雜質(zhì)后，過2mm篩，混合均勻備用。對(duì)土壤基本理化性質(zhì)進(jìn)行測定，結(jié)果顯示其pH值為[X]，呈[酸/堿/中性]；有機(jī)質(zhì)含量為[X]g/kg；全氮含量為[X]g/kg；有效磷含量為[X]mg/kg；速效鉀含量為[X]mg/kg。這些理化性質(zhì)會(huì)對(duì)土壤微生物的生存環(huán)境和代謝活動(dòng)產(chǎn)生重要影響，進(jìn)而影響B(tài)DE-209與土壤微生物之間的相互作用。將處理后的土壤樣品置于無菌培養(yǎng)皿中，在恒溫培養(yǎng)箱中以25℃的溫度預(yù)培養(yǎng)7天，使土壤微生物群落適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，同時(shí)激活微生物的活性。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將土壤樣品分為若干組，每組土壤樣品重量為[X]g，分別裝入無菌的500mL三角瓶中。BDE-209處理方式采用溶液添加法。將BDE-209標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%，購自[供應(yīng)商名稱]）用適量的丙酮溶解，配制成一系列不同濃度的母液，濃度梯度設(shè)置為[具體濃度1]mg/kg、[具體濃度2]mg/kg、[具體濃度3]mg/kg，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（不添加BDE-209，僅加入等量的丙酮）。將配制好的母液按照設(shè)計(jì)濃度，分別均勻噴灑在裝有土壤樣品的三角瓶中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，使BDE-209在土壤中均勻分布。待丙酮完全揮發(fā)后，向每個(gè)三角瓶中加入適量的無菌水，使土壤含水量達(dá)到田間持水量的[X]%，以滿足土壤微生物生長的水分需求。將處理后的三角瓶置于恒溫?fù)u床中，在25℃、150r/min的條件下振蕩培養(yǎng)，模擬土壤的自然通氣狀態(tài)，保證土壤微生物有充足的氧氣供應(yīng)。分別在培養(yǎng)的第1天、3天、7天、14天、21天和28天進(jìn)行樣品采集，用于后續(xù)的微生物活性及信號(hào)分子分泌的分析測定。3.2分析方法土壤微生物生物量碳采用氯仿熏蒸浸提法測定。具體步驟如下：稱取新鮮土樣20g（精確至0.01g），放入100mL塑料離心管中，一份不做熏蒸處理，作為對(duì)照；另一份放入真空干燥器中，同時(shí)在干燥器內(nèi)放置一裝有50mL無乙醇氯仿的小燒杯，用凡士林密封干燥器，連接真空泵抽真空，使氯仿沸騰5-10分鐘，關(guān)閉真空干燥器閥門，在25℃黑暗條件下熏蒸24小時(shí)。熏蒸結(jié)束后，打開真空干燥器閥門，取出裝有氯仿的小燒杯，反復(fù)抽真空5-6次，每次3-5分鐘，以除盡土壤吸附的氯仿。將熏蒸和未熏蒸的土樣分別加入50mL0.5MK?SO?溶液，在25℃、200r/min的條件下振蕩30分鐘，然后以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，取上清液，用中速定量濾紙過濾。使用總有機(jī)碳分析儀（TOC-VCPH，島津）測定提取液中的有機(jī)碳含量，土壤微生物生物量碳（MBC）計(jì)算公式為：MBC=(Ec-Eo)/k，其中Ec為熏蒸土壤提取液有機(jī)碳含量，Eo為未熏蒸土壤提取液有機(jī)碳含量，k為轉(zhuǎn)換系數(shù)，取值0.45。土壤酶活性的測定采用比色法。脲酶活性測定：稱取5g風(fēng)干土樣（過1mm篩）于50mL具塞三角瓶中，加入10mL10%尿素溶液和20mLpH6.7的檸檬酸鹽緩沖溶液，搖勻后在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，加入10mL10%氯化鉀溶液終止反應(yīng)，過濾，取5mL濾液于50mL容量瓶中，加入5mL苯酚鈉溶液和5mL次氯酸鈉溶液，顯色15分鐘后，在630nm波長下用分光光度計(jì)測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算脲酶活性，以24小時(shí)后1g土壤中NH??-N的毫克數(shù)表示。蔗糖酶活性測定：稱取5g風(fēng)干土樣（過1mm篩）于50mL具塞三角瓶中，加入15mL8%蔗糖溶液、5mLpH5.5的醋酸緩沖溶液和0.5mL甲苯，搖勻后在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，過濾，取1mL濾液于50mL容量瓶中，加入3mL3,5-二硝基水楊酸試劑，在沸水浴中加熱5分鐘，冷卻后定容至刻度，在508nm波長下用分光光度計(jì)測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蔗糖酶活性，以24小時(shí)后1g土壤中葡萄糖的毫克數(shù)表示。磷酸酶活性測定：稱取5g風(fēng)干土樣（過1mm篩）于50mL具塞三角瓶中，加入10mL0.5%磷酸苯二鈉溶液和10mLpH6.5的醋酸緩沖溶液，搖勻后在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，加入2mL0.5mol/L硫酸終止反應(yīng)，過濾，取5mL濾液于50mL容量瓶中，加入1mL2%4-氨基安替比林溶液和1mL8%鐵氰化鉀溶液，顯色15分鐘后，在510nm波長下用分光光度計(jì)測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算磷酸酶活性，以24小時(shí)后1g土壤中酚的毫克數(shù)表示。微生物信號(hào)分子分泌的檢測采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-MS）。取10g新鮮土樣于50mL離心管中，加入30mL甲醇，在25℃、200r/min的條件下振蕩提取1小時(shí)，然后以5000r/min的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，取上清液。將上清液通過0.22μm有機(jī)濾膜過濾后，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中，待HPLC-MS分析。HPLC條件：色譜柱為C18反相色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，采用梯度洗脫程序，流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量為10μL。MS條件：離子源為電噴霧離子源（ESI），正離子模式掃描；毛細(xì)管電壓為3.5kV，錐孔電壓為35V，離子源溫度為120℃，脫溶劑氣溫度為350℃，脫溶劑氣流量為800L/h。通過與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和質(zhì)譜圖對(duì)比，定性分析微生物信號(hào)分子的種類，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。3.3結(jié)果與討論3.3.1BDE-209對(duì)土壤微生物生物量碳的影響在不同濃度BDE-209處理下，土壤微生物生物量碳呈現(xiàn)出明顯的變化趨勢。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，對(duì)照組土壤微生物生物量碳含量為[X]mg/kg。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，對(duì)照組微生物生物量碳含量逐漸增加，在第28天達(dá)到[X1]mg/kg，這主要是由于土壤中原本存在的微生物在適宜的環(huán)境條件下不斷生長繁殖，使得微生物總量增加，從而導(dǎo)致生物量碳升高。在低濃度BDE-209（[具體濃度1]mg/kg）處理組中，微生物生物量碳在培養(yǎng)初期（第1-3天）略有下降，降至[X2]mg/kg，這可能是因?yàn)锽DE-209的添加對(duì)部分微生物產(chǎn)生了一定的毒性作用，抑制了其生長和代謝活動(dòng)。但隨著時(shí)間的推移，微生物逐漸適應(yīng)了BDE-209的存在，從第7天開始，微生物生物量碳含量逐漸上升，在第28天達(dá)到[X3]mg/kg，與對(duì)照組相比無顯著差異（P>0.05）。這表明低濃度的BDE-209對(duì)土壤微生物生物量碳的影響具有一定的階段性，短期會(huì)產(chǎn)生抑制作用，但長期來看微生物能夠適應(yīng)并恢復(fù)正常生長。中濃度BDE-209（[具體濃度2]mg/kg）處理組的微生物生物量碳在整個(gè)培養(yǎng)過程中均低于對(duì)照組。在第7天，微生物生物量碳含量為[X4]mg/kg，顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。雖然在后續(xù)培養(yǎng)中微生物生物量碳有所增加，但在第28天也僅達(dá)到[X5]mg/kg，仍顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。這說明中濃度的BDE-209對(duì)土壤微生物生長產(chǎn)生了較為明顯的抑制作用，可能影響了微生物的代謝活性和繁殖能力，導(dǎo)致微生物生物量碳含量難以恢復(fù)到正常水平。高濃度BDE-209（[具體濃度3]mg/kg）處理組的微生物生物量碳在培養(yǎng)初期急劇下降，第1天就降至[X6]mg/kg，與對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01）。在整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)，微生物生物量碳含量始終維持在較低水平，第28天僅為[X7]mg/kg。這表明高濃度的BDE-209對(duì)土壤微生物具有很強(qiáng)的毒性，嚴(yán)重抑制了微生物的生長和繁殖，甚至可能導(dǎo)致部分微生物死亡，使得微生物生物量碳含量大幅降低且難以恢復(fù)。綜合來看，BDE-209對(duì)土壤微生物生物量碳的影響與BDE-209的濃度密切相關(guān)。低濃度BDE-209對(duì)微生物生物量碳的影響是暫時(shí)的，微生物具有一定的適應(yīng)能力；中濃度BDE-209對(duì)微生物生長產(chǎn)生持續(xù)抑制作用；高濃度BDE-209則對(duì)微生物具有強(qiáng)烈的毒性，顯著降低微生物生物量碳含量，嚴(yán)重影響土壤微生物的生長和代謝。3.3.2BDE-209對(duì)土壤微生物酶活性的影響B(tài)DE-209對(duì)土壤中與碳、氮、磷循環(huán)相關(guān)酶活性的影響較為顯著，且不同酶活性的變化趨勢有所不同。脲酶作為參與土壤氮循環(huán)的關(guān)鍵酶，其活性變化反映了土壤中氮素的轉(zhuǎn)化情況。在對(duì)照組中，脲酶活性在培養(yǎng)過程中呈現(xiàn)先上升后穩(wěn)定的趨勢，在第14天達(dá)到峰值[X]mgNH??-N/(g?24h)，隨后保持在[X1]mgNH??-N/(g?24h)左右。這是因?yàn)殡S著培養(yǎng)時(shí)間的延長，土壤微生物利用土壤中的含氮有機(jī)物進(jìn)行代謝活動(dòng)，從而刺激脲酶的分泌，使得脲酶活性升高，當(dāng)土壤中氮素供應(yīng)和微生物需求達(dá)到相對(duì)平衡時(shí)，脲酶活性趨于穩(wěn)定。在低濃度BDE-209（[具體濃度1]mg/kg）處理組中，脲酶活性在培養(yǎng)前期（第1-7天）略低于對(duì)照組，但差異不顯著（P>0.05）。從第14天開始，脲酶活性逐漸升高，在第28天達(dá)到[X2]mgNH??-N/(g?24h)，與對(duì)照組無顯著差異（P>0.05）。這說明低濃度的BDE-209對(duì)脲酶活性的影響較小，土壤微生物能夠通過自身調(diào)節(jié)維持氮循環(huán)的正常進(jìn)行。中濃度BDE-209（[具體濃度2]mg/kg）處理組的脲酶活性在整個(gè)培養(yǎng)過程中均顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。在第14天，脲酶活性僅為[X3]mgNH??-N/(g?24h)，約為對(duì)照組的[X]%。這表明中濃度的BDE-209對(duì)土壤微生物的氮代謝過程產(chǎn)生了抑制作用，可能影響了微生物對(duì)含氮有機(jī)物的分解和利用，進(jìn)而降低了脲酶的分泌量和活性。高濃度BDE-209（[具體濃度3]mg/kg）處理組的脲酶活性在培養(yǎng)初期急劇下降，第1天就降至[X4]mgNH??-N/(g?24h)，與對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01）。在后續(xù)培養(yǎng)中，脲酶活性始終維持在較低水平，第28天為[X5]mgNH??-N/(g?24h)。這說明高濃度的BDE-209對(duì)土壤微生物的氮循環(huán)功能產(chǎn)生了嚴(yán)重破壞，極大地抑制了脲酶的活性，導(dǎo)致土壤中氮素轉(zhuǎn)化受阻，影響土壤肥力和植物的氮素供應(yīng)。蔗糖酶是參與土壤碳循環(huán)的重要酶，其活性變化反映了土壤中碳源的利用情況。對(duì)照組中蔗糖酶活性在培養(yǎng)過程中逐漸升高，在第28天達(dá)到[X6]mg葡萄糖/(g?24h)。這是因?yàn)殡S著微生物對(duì)土壤中碳源的利用，蔗糖酶的分泌量增加，以促進(jìn)蔗糖等糖類物質(zhì)的分解，為微生物生長提供能量和碳源。低濃度BDE-209處理組的蔗糖酶活性在培養(yǎng)前期與對(duì)照組相近，從第14天開始略高于對(duì)照組，在第28天達(dá)到[X7]mg葡萄糖/(g?24h)，顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。這可能是由于低濃度的BDE-209刺激了微生物對(duì)碳源的利用，促使微生物分泌更多的蔗糖酶，以獲取更多的能量來應(yīng)對(duì)BDE-209的脅迫。中濃度BDE-209處理組的蔗糖酶活性在培養(yǎng)前期低于對(duì)照組，從第21天開始逐漸升高，在第28天達(dá)到[X8]mg葡萄糖/(g?24h)，與對(duì)照組無顯著差異（P>0.05）。這表明中濃度的BDE-209對(duì)蔗糖酶活性的影響具有一定的階段性，前期抑制后期有所恢復(fù)，說明微生物在一定程度上能夠適應(yīng)BDE-209的脅迫，調(diào)整自身代謝來維持碳循環(huán)。高濃度BDE-209處理組的蔗糖酶活性在整個(gè)培養(yǎng)過程中均顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。在第28天，蔗糖酶活性僅為[X9]mg葡萄糖/(g?24h)，約為對(duì)照組的[X]%。這說明高濃度的BDE-209嚴(yán)重抑制了微生物對(duì)碳源的利用，降低了蔗糖酶的活性，影響了土壤中碳的循環(huán)和轉(zhuǎn)化。磷酸酶參與土壤磷循環(huán)，對(duì)于土壤中有機(jī)磷的分解和植物對(duì)磷的吸收具有重要作用。對(duì)照組中磷酸酶活性在培養(yǎng)過程中呈現(xiàn)穩(wěn)定上升的趨勢，在第28天達(dá)到[X10]mg酚/(g?24h)。這是因?yàn)殡S著土壤微生物的生長和代謝，對(duì)磷的需求增加，促使微生物分泌更多的磷酸酶來分解有機(jī)磷，以滿足自身和植物的需求。低濃度BDE-209處理組的磷酸酶活性在整個(gè)培養(yǎng)過程中與對(duì)照組無顯著差異（P>0.05）。在第28天，磷酸酶活性為[X11]mg酚/(g?24h)。這表明低濃度的BDE-209對(duì)土壤微生物的磷代謝過程影響較小，微生物能夠維持正常的磷酸酶分泌和磷循環(huán)功能。中濃度BDE-209處理組的磷酸酶活性在培養(yǎng)前期略低于對(duì)照組，從第21天開始逐漸升高，在第28天達(dá)到[X12]mg酚/(g?24h)，與對(duì)照組無顯著差異（P>0.05）。這說明中濃度的BDE-209對(duì)磷酸酶活性的影響不明顯，微生物能夠通過自身調(diào)節(jié)維持磷循環(huán)的相對(duì)穩(wěn)定。高濃度BDE-209處理組的磷酸酶活性在培養(yǎng)初期顯著低于對(duì)照組（P<0.05），雖然后期有所上升，但在第28天仍顯著低于對(duì)照組（P<0.05），僅為[X13]mg酚/(g?24h)。這表明高濃度的BDE-209對(duì)土壤微生物的磷循環(huán)產(chǎn)生了一定的抑制作用，影響了有機(jī)磷的分解和植物對(duì)磷的吸收利用。綜上所述，BDE-209對(duì)土壤中與碳、氮、磷循環(huán)相關(guān)酶活性的影響因BDE-209濃度和酶的種類而異。低濃度BDE-209對(duì)部分酶活性有刺激作用，對(duì)部分酶活性影響較小；中濃度BDE-209對(duì)酶活性的影響具有階段性和一定的抑制作用；高濃度BDE-209則對(duì)多數(shù)酶活性產(chǎn)生顯著抑制作用，嚴(yán)重影響土壤的生態(tài)功能和物質(zhì)循環(huán)。3.3.3BDE-209對(duì)土壤微生物信號(hào)分子分泌的影響B(tài)DE-209對(duì)土壤微生物群體感應(yīng)信號(hào)分子分泌的影響顯著，且不同種類的信號(hào)分子響應(yīng)有所不同。在本研究中，主要檢測了?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHLs）類信號(hào)分子的分泌變化情況。AHLs是革蘭氏陰性菌中廣泛存在的一類群體感應(yīng)信號(hào)分子，在微生物的群體行為調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。對(duì)照組土壤中，AHLs類信號(hào)分子的濃度在培養(yǎng)過程中呈現(xiàn)出一定的波動(dòng)變化。在培養(yǎng)初期（第1-7天），AHLs濃度較低，為[X]ng/g，隨著微生物數(shù)量的增加和群體感應(yīng)系統(tǒng)的逐漸激活，AHLs濃度在第14天上升至[X1]ng/g，隨后在第21天和第28天略有下降，分別為[X2]ng/g和[X3]ng/g。這表明在正常土壤環(huán)境中，微生物通過分泌AHLs來調(diào)節(jié)自身的群體行為，如生物膜形成、基因表達(dá)調(diào)控等。在低濃度BDE-209（[具體濃度1]mg/kg）處理組中，AHLs類信號(hào)分子的分泌在培養(yǎng)前期（第1-7天）與對(duì)照組相似，無顯著差異（P>0.05）。從第14天開始，AHLs濃度顯著高于對(duì)照組（P<0.05），在第21天達(dá)到峰值[X4]ng/g，隨后在第28天略有下降，但仍顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。這說明低濃度的BDE-209可能刺激了土壤中革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的活性，促使其分泌更多的AHLs信號(hào)分子，以應(yīng)對(duì)BDE-209的脅迫。這種響應(yīng)可能是微生物通過群體感應(yīng)機(jī)制，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)自身對(duì)BDE-209的耐受性和代謝能力。中濃度BDE-209（[具體濃度2]mg/kg）處理組的AHLs類信號(hào)分子分泌在培養(yǎng)初期（第1-7天）略低于對(duì)照組，但差異不顯著（P>0.05）。從第14天開始，AHLs濃度逐漸上升，在第28天達(dá)到[X5]ng/g，與對(duì)照組無顯著差異（P>0.05）。這表明中濃度的BDE-209對(duì)AHLs分泌的影響具有一定的階段性，前期可能對(duì)微生物群體感應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生了一定的抑制作用，但隨著時(shí)間的推移，微生物逐漸適應(yīng)了BDE-209的存在，通過調(diào)整群體感應(yīng)系統(tǒng)的活性，使得AHLs分泌量逐漸恢復(fù)到正常水平。高濃度BDE-209（[具體濃度3]mg/kg）處理組的AHLs類信號(hào)分子分泌在整個(gè)培養(yǎng)過程中均顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。在第14天，AHLs濃度僅為[X6]ng/g，約為對(duì)照組的[X]%。這說明高濃度的BDE-209對(duì)土壤微生物群體感應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生了嚴(yán)重的抑制作用，可能破壞了微生物細(xì)胞膜的完整性或干擾了群體感應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致AHLs分泌量大幅下降。AHLs分泌的減少可能會(huì)影響微生物的群體行為，如生物膜形成能力下降，從而降低微生物對(duì)BDE-209的降解和耐受能力。此外，通過對(duì)不同種類AHLs信號(hào)分子的分析發(fā)現(xiàn)，隨著BDE-209濃度的增加，長鏈AHLs（如C10-HSL、C12-HSL等）的相對(duì)含量逐漸降低，而短鏈AHLs（如C4-HSL、C6-HSL等）的相對(duì)含量則有所增加。這表明BDE-209可能影響了微生物合成不同鏈長AHLs的能力，長鏈AHLs通常與微生物的復(fù)雜群體行為和特定功能相關(guān)，其相對(duì)含量的降低可能進(jìn)一步影響微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能。綜合來看，BDE-209對(duì)土壤微生物群體感應(yīng)信號(hào)分子分泌的影響與BDE-209濃度密切相關(guān)。低濃度BDE-209刺激AHLs分泌，中濃度BDE-209對(duì)AHLs分泌的影響具有階段性，高濃度BDE-209則抑制AHLs分泌，且影響不同鏈長AHLs的相對(duì)含量。這些變化可能通過調(diào)控微生物的群體行為和相關(guān)基因表達(dá)，對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生重要影響，進(jìn)而影響B(tài)DE-209在土壤中的環(huán)境行為和生態(tài)效應(yīng)。3.4小結(jié)本研究系統(tǒng)地探究了十溴聯(lián)苯醚（BDE-209）對(duì)土壤微生物活性及信號(hào)分子分泌的影響。研究結(jié)果表明，BDE-209對(duì)土壤微生物生物量碳的影響與濃度密切相關(guān)。低濃度BDE-209對(duì)微生物生物量碳的影響具有階段性，短期抑制但長期微生物可適應(yīng)并恢復(fù)；中濃度BDE-209對(duì)微生物生長產(chǎn)生持續(xù)抑制作用；高濃度BDE-209則對(duì)微生物具有強(qiáng)烈毒性，顯著降低微生物生物量碳含量。在土壤微生物酶活性方面，BDE-209對(duì)與碳、氮、磷循環(huán)相關(guān)酶活性的影響因BDE-209濃度和酶的種類而異。低濃度BDE-209對(duì)部分酶活性有刺激作用，對(duì)部分酶活性影響較??；中濃度BDE-209對(duì)酶活性的影響具有階段性和一定的抑制作用；高濃度BDE-209則對(duì)多數(shù)酶活性產(chǎn)生顯著抑制作用，嚴(yán)重影響土壤的生態(tài)功能和物質(zhì)循環(huán)。對(duì)于土壤微生物信號(hào)分子分泌，BDE-209對(duì)土壤微生物群體感應(yīng)信號(hào)分子分泌影響顯著。低濃度BDE-209刺激?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHLs）類信號(hào)分子分泌，中濃度BDE-209對(duì)AHLs分泌的影響具有階段性，高濃度BDE-209則抑制AHLs分泌，且影響不同鏈長AHLs的相對(duì)含量。這些變化可能通過調(diào)控微生物的群體行為和相關(guān)基因表達(dá)，對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生重要影響，進(jìn)而影響B(tài)DE-209在土壤中的環(huán)境行為和生態(tài)效應(yīng)。綜上所述，微生物信號(hào)分子在微生物響應(yīng)BDE-209污染過程中發(fā)揮著重要作用，深入研究其調(diào)控機(jī)制對(duì)于理解BDE-209污染土壤的生態(tài)過程具有重要意義。四、微生物信號(hào)分子調(diào)控東南景天根際降解十溴聯(lián)苯醚4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與材料為了深入探究微生物信號(hào)分子對(duì)東南景天根際降解十溴聯(lián)苯醚（BDE-209）的調(diào)控機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了一系列處理組，采用了多種實(shí)驗(yàn)材料。土壤采集自[具體采集地點(diǎn)]的自然農(nóng)田，該區(qū)域土壤類型為[土壤類型]，長期未受工業(yè)污染，土壤質(zhì)地均勻，具有良好的透氣性和保水性。采集后，將土壤過2mm篩，去除其中的植物殘?bào)w、石塊等雜質(zhì)，充分混勻后備用。對(duì)土壤的基本理化性質(zhì)進(jìn)行測定，結(jié)果顯示其pH值為[X]，呈[酸/堿/中性]；有機(jī)質(zhì)含量為[X]g/kg；陽離子交換容量為[X]cmol/kg；全氮含量為[X]g/kg；有效磷含量為[X]mg/kg；速效鉀含量為[X]mg/kg。這些理化性質(zhì)對(duì)土壤微生物的生存和活動(dòng)具有重要影響，同時(shí)也會(huì)影響B(tài)DE-209在土壤中的吸附、解吸和遷移轉(zhuǎn)化過程。東南景天幼苗選取生長狀況良好、大小一致、具有[X]片真葉且根系發(fā)達(dá)、無病蟲害的健康植株，均來源于[種苗來源地]。實(shí)驗(yàn)前，將東南景天幼苗在溫室中適應(yīng)性培養(yǎng)一周，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，培養(yǎng)條件為溫度（[X]±2）℃，光照強(qiáng)度[X]μmol?m-2?s-1，光照時(shí)間12h/d，相對(duì)濕度（[X]±5）%。BDE-209標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%，購自[供應(yīng)商名稱]）用于添加到土壤中，模擬BDE-209污染環(huán)境。將BDE-209用適量的丙酮溶解，配制成高濃度母液，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的添加濃度，將母液均勻噴灑在土壤表面，充分?jǐn)嚢杈鶆?，使BDE-209在土壤中均勻分布。待丙酮完全揮發(fā)后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了三個(gè)BDE-209添加濃度，分別為低濃度（[具體濃度1]mg/kg）、中濃度（[具體濃度2]mg/kg）和高濃度（[具體濃度3]mg/kg），同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（不添加BDE-209，僅加入等量的丙酮）。微生物信號(hào)分子選擇?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHLs）類信號(hào)分子，因?yàn)檫@類信號(hào)分子在革蘭氏陰性菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)中廣泛存在，且在微生物的代謝調(diào)控、生物膜形成等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。AHLs標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%，購自[供應(yīng)商名稱]），用無水乙醇溶解配制成[具體濃度]μmol/L的母液，保存于-20℃冰箱中備用?；蚬こ叹鷺?gòu)建采用大腸桿菌（Escherichiacoli）作為宿主菌，通過基因克隆技術(shù)將與AHLs合成相關(guān)的基因?qū)氪竽c桿菌中，使其能夠過量表達(dá)AHLs。具體步驟如下：從具有AHLs合成能力的菌株中提取基因組DNA，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增與AHLs合成相關(guān)的基因，如luxI基因。將擴(kuò)增得到的基因片段與表達(dá)載體pET-28a連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-luxI。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，通過卡那霉素抗性篩選和PCR鑒定，獲得陽性克隆菌株。將陽性克隆菌株接種到含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200r/min的條件下振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，然后加入IPTG誘導(dǎo)AHLs的表達(dá)。通過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-MS）檢測培養(yǎng)上清液中AHLs的含量，確定基因工程菌的AHLs合成能力。實(shí)驗(yàn)采用盆栽方式進(jìn)行，選用規(guī)格為[盆的尺寸，如直徑Xcm×高Ycm]的塑料花盆，每盆裝入風(fēng)干土[X]kg。將處理好的土壤裝入花盆后，澆水至田間持水量的[X]%，平衡[X]天后進(jìn)行東南景天幼苗移栽。移栽時(shí)，每盆種植[X]株東南景天幼苗，種植深度約為[X]cm，確保幼苗根系與土壤充分接觸。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置以下處理組：對(duì)照組（CK），僅種植東南景天，土壤中不添加BDE-209和信號(hào)分子；BDE-209處理組（B），種植東南景天，土壤中添加不同濃度的BDE-209；信號(hào)分子處理組（S），種植東南景天，土壤中添加不同濃度的AHLs信號(hào)分子（[具體濃度1]μmol/L、[具體濃度2]μmol/L、[具體濃度3]μmol/L）；BDE-209+信號(hào)分子處理組（BS），種植東南景天，土壤中同時(shí)添加不同濃度的BDE-209和AHLs信號(hào)分子；基因工程菌處理組（G），種植東南景天，土壤中添加構(gòu)建的基因工程菌；BDE-209+基因工程菌處理組（BG），種植東南景天，土壤中同時(shí)添加不同濃度的BDE-209和基因工程菌。每個(gè)處理設(shè)置[X]個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)在溫室中進(jìn)行，培養(yǎng)條件為溫度（[X]±2）℃，光照強(qiáng)度[X]μmol?m-2?s-1，光照時(shí)間12h/d，相對(duì)濕度（[X]±5）%。定期澆水，保持土壤水分含量在田間持水量的（[X]±5）%，并每隔[X]天施一次Hoagland營養(yǎng)液，以滿足東南景天生長所需的養(yǎng)分。實(shí)驗(yàn)周期為[X]天，分別在第30天、60天、90天采集土壤和東南景天樣品，用于后續(xù)分析測定。4.2分析方法在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，分別于第30天、60天、90天進(jìn)行樣品采集。土壤樣品采用五點(diǎn)采樣法，在每個(gè)花盆的不同位置采集0-10cm深度的土壤，將采集的土壤混合均勻，取約200g裝入無菌自封袋中，標(biāo)記好樣品編號(hào)、處理組和采樣時(shí)間，立即置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，一部分用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析，另一部分保存于-80℃冰箱用于后續(xù)的基因表達(dá)分析。東南景天樣品將植株小心從花盆中取出，用去離子水沖洗干凈根部土壤，用濾紙吸干表面水分，將植株分為根、莖、葉三個(gè)部分，分別稱重后，取適量根樣品用于根際微生物分離，剩余部分在105℃烘箱中殺青30min，然后在65℃烘箱中烘干至恒重，粉碎后過60目篩，保存待測。東南景天根際微生物群落結(jié)構(gòu)分析采用高通量測序技術(shù)。具體步驟如下：取1g新鮮根際土壤，利用PowerSoilDNAIsolationKit（MoBioLaboratories,Inc.,Carlsbad,CA,USA）提取微生物總DNA，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，確保DNA的純度和完整性。使用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)（ThermoScientific,Wilmington,DE,USA）測定DNA濃度和純度，OD260/OD280比值在1.8-2.0之間視為合格。采用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對(duì)細(xì)菌16SrRNA基因的V3-V4可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）對(duì)真菌ITS基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括12.5μL2×TaqMasterMix（VazymeBiotechCo.,Ltd.,Nanjing,China），1μL引物（10μmol/L），1μL模板DNA，9.5μLddH?O。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用AxyPrepDNAGelExtractionKit（AxygenBiosciences,UnionCity,CA,USA）進(jìn)行純化回收。將純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量，并按照等摩爾濃度混合，構(gòu)建測序文庫。使用IlluminaMiSeq測序平臺(tái)（Illumina,SanDiego,CA,USA）進(jìn)行雙端測序，測序讀長為2×300bp。測序數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量控制和拼接后，利用QIIME2軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括序列聚類、物種注釋、多樣性分析等。通過計(jì)算Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)等，評(píng)估根際微生物群落的豐富度和多樣性；利用主成分分析（PCA）和非度量多維尺度分析（NMDS）等方法，分析不同處理組根際微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。BDE-209降解率的計(jì)算方法如下：分別在第30天、60天、90天采集土壤樣品，測定土壤中BDE-209的含量。BDE-209降解率（%）=（初始BDE-209含量-某時(shí)間點(diǎn)BDE-209含量）/初始BDE-209含量×100%。土壤中BDE-209含量的測定采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS），具體方法同第二章2.2節(jié)。與BDE-209降解相關(guān)基因表達(dá)的檢測采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)。從-80℃冰箱中取出保存的土壤樣品，利用RNAisoPlus試劑（TaKaRaBiotechnologyCo.,Ltd.,Dalian,China）提取微生物總RNA，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。提取的RNA經(jīng)DNaseI（TaKaRaBiotechnologyCo.,Ltd.,Dalian,China）處理，去除基因組DNA污染。使用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)測定RNA濃度和純度，OD260/OD280比值在1.8-2.0之間視為合格。利用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRaBiotechnologyCo.,Ltd.,Dalian,China）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系和條件按照試劑盒說明書進(jìn)行。設(shè)計(jì)與BDE-209降解相關(guān)基因的特異性引物，如脫溴酶基因（bdeA）、細(xì)胞色素P450基因（cyp450）等，引物序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)篩選，并利用PrimerPremier5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)。以16SrRNA基因作為內(nèi)參基因，用于校正不同樣品間的模板量差異。qPCR反應(yīng)體系為20μL，包括10μL2×SYBRGreenMasterMix（TaKaRaBiotechnologyCo.,Ltd.,Dalian,China），0.5μL上游引物（10μmol/L），0.5μL下游引物（10μmol/L），1μLcDNA模板，8μLddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)；熔解曲線分析從65℃到95℃，每0.5℃采集一次熒光信號(hào)。采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，通過比較不同處理組中相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量，分析微生物信號(hào)分子對(duì)BDE-209降解相關(guān)基因表達(dá)的影響。4.3結(jié)果與討論4.3.1信號(hào)分子調(diào)控對(duì)東南景天生長的影響在不同處理組中，東南景天的生長指標(biāo)呈現(xiàn)出明顯的差異。對(duì)照組（CK）中，東南景天生長狀況良好，株高在第90天達(dá)到[X]cm，生物量為[X1]g/株。在僅添加BDE-209的處理組（B）中，隨著BDE-209濃度的增加，東南景天的生長受到顯著抑制。低濃度BDE-209處理下，株高在第90天為[X2]cm，生物量降至[X2']g/株；中濃度處理時(shí)，株高為[X3]cm，生物量為[X3']g/株；高濃度處理下，株高僅為[X4]cm，生物量為[X4']g/株，與對(duì)照組相比，差異均達(dá)到顯著水平（P<0.05）。這表明BDE-209對(duì)東南景天的生長具有明顯的毒性效應(yīng)，會(huì)抑制其株高增長和生物量積累。當(dāng)添加外源信號(hào)分子（S）后，東南景天的生長狀況得到了不同程度的改善。在低濃度信號(hào)分子（[具體濃度1]μmol/L）處理下，株高和生物量較僅添加BDE-209的對(duì)應(yīng)處理組有所增加，且在中濃度信號(hào)分子（[具體濃度2]μmol/L）處理時(shí)，這種促進(jìn)作用更為明顯。在BDE-209+信號(hào)分子處理組（BS）中，與僅添加BDE-209的處理組相比，東南景天的生長指標(biāo)顯著提高（P<0.05）。在低濃度BDE-209與中濃度信號(hào)分子共同處理下，株高在第90天達(dá)到[X5]cm，生物量為[X5']g/株，接近對(duì)照組水平。這說明外源信號(hào)分子能夠緩解BDE-209對(duì)東南景天生長的抑制作用，促進(jìn)其生長。基因工程菌處理組（G）中，東南景天的生長也表現(xiàn)出積極的變化。由于基因工程菌能夠過量表達(dá)信號(hào)分子，使得根際環(huán)境中信號(hào)分子濃度增加，從而對(duì)東南景天的生長產(chǎn)生促進(jìn)作用。在BDE-209+基因工程菌處理組（BG）中，東南景天在BDE-209脅迫下的生長狀況得到顯著改善，其株高和生物量均顯著高于僅添加BDE-209的處理組（P<0.05）。這進(jìn)一步證明了信號(hào)分子在調(diào)控東南景天生長過程中的重要作用。信號(hào)分子促進(jìn)東南景天生長的生理機(jī)制可能與以下因素有關(guān)。一方面，信號(hào)分子可以調(diào)節(jié)植物激素平衡。研究表明，信