Dnmt基因與miRNA協(xié)同調(diào)控褐飛虱翅型分化的分子機制探秘一、引言1.1研究背景水稻作為全球最重要的糧食作物之一，是超過半數(shù)世界人口的主食，在保障全球糧食安全中占據(jù)著舉足輕重的地位。在中國，水稻種植歷史悠久，分布廣泛，其播種面積和產(chǎn)量均在糧食作物中名列前茅，對滿足國內(nèi)龐大人口的糧食需求、穩(wěn)定糧食市場供應起著關鍵作用。據(jù)統(tǒng)計，我國水稻年產(chǎn)量穩(wěn)定在數(shù)億噸，養(yǎng)活了大量人口，是農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的重要支柱。褐飛虱（NilaparvatalugensSt?l）隸屬半翅目飛虱科，是水稻生產(chǎn)中最為嚴重的遷飛性害蟲之一，對水稻的危害極其嚴重。褐飛虱具有繁殖速度快、遷飛能力強、適應范圍廣等特點，其整個生命周期包括卵、若蟲和成蟲三種蟲態(tài)，在適宜的氣候條件下，短時間內(nèi)就能大量繁殖，對水稻造成嚴重威脅。褐飛虱主要通過刺吸水稻植株的汁液獲取營養(yǎng)，導致水稻生長發(fā)育受阻，葉片發(fā)黃、枯萎，嚴重時可使水稻整株倒伏，產(chǎn)量大幅下降，甚至絕收。據(jù)相關研究表明，在褐飛虱大爆發(fā)年份，一些地區(qū)的水稻減產(chǎn)可達30%-50%，嚴重影響了糧食產(chǎn)量和農(nóng)民的經(jīng)濟收入。此外，褐飛虱還能傳播水稻病毒病，如水稻齒葉矮縮病、水稻草叢矮縮病等，進一步加重了對水稻生產(chǎn)的危害，導致水稻品質(zhì)下降，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大損失。長期以來，化學防治一直是控制褐飛虱危害的主要手段?；瘜W農(nóng)藥的廣泛使用雖然在一定程度上有效地控制了褐飛虱的種群數(shù)量，保障了水稻的產(chǎn)量，但也帶來了一系列嚴重的問題。一方面，化學農(nóng)藥的大量使用導致褐飛虱的抗藥性不斷增強。隨著農(nóng)藥使用頻率和劑量的增加，褐飛虱逐漸適應了農(nóng)藥的環(huán)境，通過基因突變等方式產(chǎn)生抗藥性，使得原本有效的農(nóng)藥逐漸失去防治效果。這不僅增加了防治成本，還迫使農(nóng)民不斷加大農(nóng)藥使用量，形成惡性循環(huán)。另一方面，化學農(nóng)藥的使用對環(huán)境造成了嚴重的污染。農(nóng)藥殘留會在土壤、水體和空氣中積累，破壞生態(tài)平衡，影響非靶標生物的生存和繁衍，對生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和生物多樣性構成威脅。此外，農(nóng)藥殘留還可能通過食物鏈進入人體，危害人體健康，引發(fā)各種疾病。褐飛虱成蟲具有明顯的翅兩型現(xiàn)象，可分為長翅型和短翅型。長翅型成蟲善飛，能夠借助氣流進行遠距離遷飛，通常在外界環(huán)境條件不適宜或食物資源匱乏時出現(xiàn)，以便尋找更適宜的生存環(huán)境；短翅型成蟲飛行能力較弱，但生殖能力較強，產(chǎn)卵量多，發(fā)育快，在適宜的環(huán)境條件下大量繁殖，短翅成蟲的出現(xiàn)往往是蟲害爆發(fā)的預兆。褐飛虱的翅型分化是一個復雜的生物學過程，受到多種因素的調(diào)控，包括遺傳因素、環(huán)境因素以及內(nèi)分泌因素等。深入研究褐飛虱翅型分化的分子機制，不僅有助于揭示昆蟲表型可塑性的奧秘，還能為褐飛虱的精準防控提供新的理論依據(jù)和策略。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNAmethyltransferase，Dnmt）基因在生物的生長發(fā)育和基因表達調(diào)控中發(fā)揮著關鍵作用。Dnmt能夠催化DNA甲基化修飾，這種修飾可以影響基因的表達水平，進而調(diào)控生物的各種生理過程。在昆蟲中，Dnmt基因與昆蟲的發(fā)育、變態(tài)、生殖以及對環(huán)境的適應性等密切相關。研究表明，Dnmt基因的表達變化可能參與了褐飛虱翅型分化的調(diào)控過程，通過影響相關基因的甲基化狀態(tài)，進而影響褐飛虱的翅型發(fā)育。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度約為22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，在真核生物中廣泛存在。miRNA通過與靶基因mRNA的互補配對，介導mRNA的降解或抑制其翻譯過程，從而實現(xiàn)對靶基因表達的負調(diào)控。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在昆蟲的生長發(fā)育、變態(tài)、生殖、免疫以及對環(huán)境脅迫的響應等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在褐飛虱中，miRNA也參與了多種生物學過程的調(diào)控，并且可能在翅型分化過程中扮演著關鍵角色。一些miRNA可能通過靶向調(diào)控與翅型分化相關的基因，影響褐飛虱的翅型發(fā)育。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究Dnmt基因在褐飛虱翅型分化過程中的調(diào)控作用，以及miRNA對相關基因的靶向調(diào)控機制，為揭示褐飛虱翅型分化的分子機制提供新的理論依據(jù)。通過研究，明確Dnmt基因在褐飛虱翅型分化中的具體功能，包括對長翅型和短翅型分化的影響，以及其在不同發(fā)育階段的表達模式和調(diào)控途徑。同時，鑒定參與褐飛虱翅型分化調(diào)控的關鍵miRNA及其靶基因，解析miRNA通過靶向Dnmt基因或其他相關基因影響翅型分化的分子網(wǎng)絡。本研究具有重要的理論意義。褐飛虱翅型分化是一個復雜的生物學過程，涉及多種基因和信號通路的相互作用。深入研究Dnmt基因和miRNA在褐飛虱翅型分化中的調(diào)控機制，有助于揭示昆蟲表型可塑性的分子基礎，豐富昆蟲發(fā)育生物學的理論知識，為理解生物進化過程中表型適應環(huán)境變化的機制提供新的視角。此外，本研究還可以進一步拓展對DNA甲基化和miRNA在昆蟲發(fā)育調(diào)控中作用的認識，為其他昆蟲相關研究提供參考和借鑒。在實踐方面，本研究對農(nóng)業(yè)害蟲防治具有重要指導意義。褐飛虱作為水稻生產(chǎn)中的重要害蟲，其翅型分化與種群擴散和繁殖密切相關。長翅型褐飛虱的遠距離遷飛能力使其能夠迅速擴散到新的水稻種植區(qū)域，造成更大范圍的危害；而短翅型褐飛虱的高繁殖力則導致種群數(shù)量在短時間內(nèi)急劇增加。通過揭示Dnmt基因和miRNA對褐飛虱翅型分化的調(diào)控機制，可以為開發(fā)新型的褐飛虱防治策略提供理論依據(jù)。例如，基于對關鍵基因和調(diào)控因子的認識，研發(fā)以Dnmt基因或相關miRNA為靶點的RNA干擾技術，通過干擾褐飛虱翅型分化相關基因的表達，抑制短翅型褐飛虱的產(chǎn)生，減少其繁殖數(shù)量，或阻止長翅型褐飛虱的遷飛，從而有效控制褐飛虱的種群數(shù)量，降低其對水稻的危害。此外，本研究結(jié)果還有助于篩選和培育對褐飛虱具有抗性的水稻品種，通過調(diào)控水稻自身的基因表達，影響褐飛虱在水稻上的生長發(fā)育和翅型分化，實現(xiàn)對褐飛虱的生態(tài)防控，減少化學農(nóng)藥的使用，降低對環(huán)境的污染，保障農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。1.3研究創(chuàng)新點與技術路線本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在研究角度和研究方法上。在研究角度方面，將DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（Dnmt）基因和微小RNA（miRNA）結(jié)合起來，探究它們在褐飛虱翅型分化過程中的協(xié)同調(diào)控作用，這種多維度的研究視角有助于更全面、深入地揭示褐飛虱翅型分化的分子機制。此前的研究大多單獨關注Dnmt基因或miRNA在昆蟲發(fā)育中的作用，很少有研究將兩者聯(lián)系起來，本研究填補了這一領域在褐飛虱翅型分化研究方面的空白。在研究方法上，綜合運用多種現(xiàn)代分子生物學技術，如RNA干擾（RNAi）、雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?、高通量測序等，從基因表達、蛋白水平、分子互作等多個層面進行深入分析，提高了研究結(jié)果的準確性和可靠性。例如，在RNAi實驗中，通過精準設計干擾片段，高效沉默Dnmt基因和miRNA，觀察褐飛虱翅型分化的變化，為明確基因功能提供直接證據(jù)；雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀯t能夠準確驗證miRNA與靶基因之間的靶向關系，為揭示分子調(diào)控網(wǎng)絡提供關鍵依據(jù)。本研究的技術路線如下：首先進行實驗材料的準備，在室內(nèi)人工氣候箱中飼養(yǎng)褐飛虱，確保環(huán)境條件適宜，包括溫度、濕度、光照等，以獲得大量健康的褐飛虱樣本。同時，準備用于飼養(yǎng)褐飛虱的水稻品種，保證水稻的生長狀況良好，為褐飛虱提供充足的食物來源。其次，利用高通量測序技術對長翅型和短翅型褐飛虱進行轉(zhuǎn)錄組測序和小RNA測序。對測序數(shù)據(jù)進行生物信息學分析，篩選出在長翅型和短翅型褐飛虱中差異表達的Dnmt基因和miRNA。在Dnmt基因功能驗證方面，針對篩選出的差異表達Dnmt基因，設計并合成RNAi引物，通過顯微注射等方法將RNAi引物導入褐飛虱體內(nèi)，沉默Dnmt基因的表達。觀察褐飛虱翅型分化的變化情況，記錄長翅型和短翅型褐飛虱的比例變化，以及其他相關表型特征的改變。采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術，檢測沉默Dnmt基因后相關基因的表達水平和蛋白表達量的變化，從分子層面深入分析Dnmt基因?qū)诛w虱翅型分化的調(diào)控機制。在miRNA靶基因預測與驗證中，運用生物信息學軟件對篩選出的差異表達miRNA進行靶基因預測，分析miRNA與靶基因之間的互補配對關系，篩選出可能參與褐飛虱翅型分化調(diào)控的靶基因。構建包含miRNA結(jié)合位點的靶基因3'UTR熒光素酶報告基因載體，將其與相應的miRNAmimics或inhibitor共轉(zhuǎn)染到細胞中，通過檢測熒光素酶活性，驗證miRNA與靶基因之間的靶向關系。最后，整合Dnmt基因和miRNA的研究結(jié)果，構建Dnmt基因和miRNA調(diào)控褐飛虱翅型分化的分子網(wǎng)絡，分析兩者之間的相互作用關系和協(xié)同調(diào)控機制，深入探討褐飛虱翅型分化的分子機制。二、褐飛虱與翅型分化2.1褐飛虱概述2.1.1形態(tài)特征褐飛虱隸屬半翅目飛虱科，其成蟲具有明顯的翅兩型現(xiàn)象，分為長翅型和短翅型。長翅型成蟲體型較為修長，體長一般在3.6-4.8毫米，身體呈現(xiàn)黃褐或黑褐色，表面帶有油狀光澤，猶如被一層薄薄的油脂包裹，在光線的照射下閃爍著獨特的光芒。其頭頂近似方形，額部接近長方形，中部略微寬闊，觸角微微伸出額唇基縫，后足基跗節(jié)外側(cè)生有2-4根小刺，這些小刺在其行動和防御中發(fā)揮著重要作用。前翅為黃褐色，質(zhì)地透明，翅斑呈現(xiàn)黑褐色，當它們展開翅膀時，翅斑猶如鑲嵌在翅膀上的黑色寶石，格外醒目。短翅型成蟲體型相對較為短小，體長在2.5-4.0毫米，短翅型前翅僅能伸達腹部第5-6節(jié)，后翅均已退化，這使得它們的飛行能力受到極大限制。短翅型成蟲在顏色和身體結(jié)構的其他特征上與長翅型基本相似，雄蟲陽基側(cè)突形狀獨特，似蟹鉗狀，頂部呈尖角狀向內(nèi)前方突出，猶如一把精巧的小鉗子；雌蟲產(chǎn)卵器基部兩側(cè)，第1載瓣片的內(nèi)緣基部突起呈半圓形，這些獨特的形態(tài)結(jié)構是其進行繁殖活動的重要器官。褐飛虱的卵呈香蕉型，長約1毫米，寬0.22毫米，宛如彎彎的香蕉，小巧而精致。卵粒通常產(chǎn)在葉鞘和葉片組織內(nèi)，整齊地排成一條，被稱為“卵條”。卵帽高大于寬底，頂端呈圓弧狀，會稍露出產(chǎn)卵痕，露出部分近似短橢圓形，從外觀上看，粗看似小方格，清晰可數(shù)，仿佛是精心排列的微型圖案。初產(chǎn)時，卵呈現(xiàn)乳白色，猶如珍珠般潔白無瑕，隨著時間的推移，會逐漸變?yōu)榈S至銹褐色，并出現(xiàn)紅色眼點，這些變化標志著卵的發(fā)育進程。褐飛虱的若蟲共分為5齡，不同齡期的若蟲在形態(tài)上存在明顯差異。1齡若蟲體長約1.1毫米，體色黃白，猶如剛孵化的幼嫩生物，身體柔軟而脆弱。其腹部背面有一倒凸形淺色斑紋，后胸顯著較前、中胸長，中、后胸后緣平直，此時還未出現(xiàn)翅芽。2齡若蟲體長約1.5毫米，初期體色與1齡相似，隨著生長發(fā)育，倒凸形斑內(nèi)逐漸顯現(xiàn)褐色；后期體黃褐至暗褐色，倒凸形斑逐漸模糊，翅芽開始變得不明顯，后胸稍長，中胸后緣略向前凹，這些細微的變化展示了若蟲的生長歷程。3齡若蟲體長約2.0毫米，體色為黃褐色至暗褐色，腹部第3、4節(jié)有一對較大的淺色斑紋，第7-9節(jié)的淺色斑呈山字形，這些斑紋如同獨特的標識，有助于區(qū)分不同齡期的若蟲。此時翅芽已明顯可見，中、后胸后緣向前凹成角狀，前翅芽尖端不到后胸后緣。4齡若蟲體長約2.4毫米，體色斑紋與3齡相似，斑紋清晰，前翅芽尖端伸達后胸后緣，顯示出其翅芽的進一步生長。5齡若蟲體長約3.2毫米，體色斑紋與3、4齡相同，前翅芽尖端伸達腹部第3-4節(jié)，前后翅芽尖端相接近，或前翅芽稍超過后翅芽，此時若蟲的形態(tài)已逐漸接近成蟲，即將完成其生長發(fā)育過程。2.1.2生活習性褐飛虱是一種食性專一的昆蟲，在自然環(huán)境中，僅以水稻和野生稻為食，它們憑借著特化的口器，刺吸水稻植株的汁液，從中獲取生長、發(fā)育和繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)。這種專一的食性使得褐飛虱與水稻之間形成了緊密的生態(tài)聯(lián)系，水稻的生長狀況直接影響著褐飛虱的生存和繁衍。一旦水稻遭受病蟲害侵襲或生長環(huán)境惡化，褐飛虱的食物來源將受到威脅，進而影響其種群數(shù)量和分布。褐飛虱喜歡棲息在水稻植株的基部，這里環(huán)境相對濕潤，溫度較為穩(wěn)定，且靠近它們的食物源，有利于其取食和生存。在水稻生長茂密的區(qū)域，褐飛虱往往能夠找到更為適宜的棲息場所，它們隱藏在稻叢之間，不易被發(fā)現(xiàn)。同時，這種棲息環(huán)境也為褐飛虱提供了一定的保護，使其能夠躲避部分天敵的捕食。褐飛虱的繁殖方式為卵生，雌蟲通常會將卵產(chǎn)在水稻的葉鞘和葉片組織內(nèi)，形成“卵條”。這種產(chǎn)卵方式既能夠保護卵免受外界環(huán)境的干擾和天敵的侵害，又能為卵的發(fā)育提供相對穩(wěn)定的環(huán)境。卵在適宜的溫度和濕度條件下孵化，孵化出的若蟲經(jīng)過5次蛻皮后逐漸發(fā)育為成蟲。在繁殖過程中，褐飛虱的繁殖速度極快，在適宜的環(huán)境條件下，短時間內(nèi)就能大量繁殖，對水稻造成嚴重危害。褐飛虱的活動具有一定的規(guī)律，它們通常在白天隱藏在稻叢基部，避免受到陽光的直射和天敵的攻擊。而在夜間，褐飛虱會變得更加活躍，此時它們會爬出稻叢，尋找合適的取食位置，大量吸食水稻汁液，滿足自身的營養(yǎng)需求。這種晝夜活動規(guī)律與水稻的生長節(jié)律以及環(huán)境因素密切相關，夜間水稻植株的生理活動相對較弱，汁液中的營養(yǎng)成分更為豐富，有利于褐飛虱的取食。褐飛虱的生活習性與翅型分化之間存在著潛在的聯(lián)系。當水稻生長狀況良好，營養(yǎng)充足時，褐飛虱往往會產(chǎn)生更多的短翅型個體。這是因為短翅型褐飛虱雖然飛行能力較弱，但生殖能力較強，能夠在適宜的環(huán)境中迅速繁殖后代，擴大種群數(shù)量。相反，當水稻生長受到抑制，營養(yǎng)條件變差，或者環(huán)境發(fā)生變化，如遭遇干旱、洪澇等災害時，褐飛虱會產(chǎn)生更多的長翅型個體。長翅型褐飛虱具有較強的飛行能力，能夠借助氣流進行遠距離遷飛，尋找更適宜的生存環(huán)境和食物資源。2.1.3發(fā)生規(guī)律褐飛虱在不同地區(qū)和季節(jié)的發(fā)生情況存在顯著差異。在我國，褐飛虱的發(fā)生呈現(xiàn)出明顯的季節(jié)性南北往返遷移特征。每年3月下旬至5月份，隨著西南氣流的到來，褐飛虱從亞洲大陸南部和熱帶終年發(fā)生地，如中南半島等地，遷入我國兩廣南部發(fā)生區(qū)（北緯19°到北回歸線）。在該地區(qū)，褐飛虱迅速繁殖2-3代，隨著6月份早稻逐漸黃熟，食物資源發(fā)生變化，褐飛虱產(chǎn)生大量長翅型成蟲，借助季風的力量向北遷飛，主降于南嶺發(fā)生區(qū)（北回歸線至北緯26-28°）。7月中下旬，南嶺區(qū)早稻黃熟收割，褐飛虱再次北遷至長江流域及其以北地區(qū)，隨著水稻的生長和成熟，它們在這些地區(qū)不斷繁殖和擴散，對水稻生產(chǎn)造成嚴重威脅。8月下旬至9月上旬，淮北及江淮單季稻成熟，此時氣候和環(huán)境條件發(fā)生變化，褐飛虱開始隨南向氣流向南遷移，返回溫暖的南方地區(qū)越冬。在海南等終年溫暖的地區(qū)，褐飛虱可以終年繁殖，無越冬現(xiàn)象，年發(fā)生代數(shù)可達12-13代，世代重疊現(xiàn)象嚴重。而在北緯35°以北的地區(qū)，由于冬季氣溫較低，褐飛虱難以越冬，每年僅發(fā)生1-2代，且蟲源主要依靠從南方遷入。氣候因素對褐飛虱的發(fā)生有著至關重要的影響。褐飛虱適宜在溫暖高濕的環(huán)境中生存和繁殖，其生長發(fā)育的最適溫度為20-30℃，相對濕度在80%以上。當溫度在26℃左右時，褐飛虱的繁殖速度最快，種群數(shù)量增長迅速。在這樣的溫度和濕度條件下，褐飛虱的卵孵化率高，若蟲發(fā)育速度快，成蟲壽命長且產(chǎn)卵量多。相反，當溫度過高或過低，如超過35℃或低于15℃，以及濕度過低時，褐飛虱的生長發(fā)育會受到抑制，繁殖能力下降，甚至會導致部分個體死亡。此外，降雨和風力等氣候因素也會影響褐飛虱的遷飛和擴散。降雨可以為褐飛虱提供適宜的濕度環(huán)境，但過多的降雨可能會導致水稻田積水，影響褐飛虱的棲息和取食；風力則是褐飛虱遠距離遷飛的重要動力，合適的風向和風力能夠幫助褐飛虱順利遷移到新的區(qū)域。水稻品種也是影響褐飛虱發(fā)生的重要因素之一。不同水稻品種對褐飛虱的抗性存在差異，一些抗性品種能夠通過自身的物理或化學防御機制，抵御褐飛虱的侵害。例如，某些水稻品種的葉片表面具有特殊的蠟質(zhì)層或絨毛，使得褐飛虱難以在上面棲息和取食；還有一些品種能夠分泌次生代謝物質(zhì)，對褐飛虱產(chǎn)生毒性或驅(qū)避作用。而感蟲品種則容易受到褐飛虱的攻擊，為褐飛虱提供了良好的食物條件，有利于其繁殖和種群增長。在生產(chǎn)中，種植抗性水稻品種可以有效減少褐飛虱的發(fā)生數(shù)量，降低其危害程度。2.2褐飛虱翅型分化2.2.1翅型分化現(xiàn)象褐飛虱成蟲存在顯著的翅兩型現(xiàn)象，分為長翅型和短翅型。這兩種翅型在形態(tài)、功能和生存策略上存在明顯差異。長翅型成蟲的翅膀發(fā)達，長度通常超過腹部末端，翅脈清晰可見，猶如精心雕刻的紋路。這種發(fā)達的翅膀賦予了長翅型褐飛虱強大的飛行能力，使其能夠借助氣流進行遠距離遷飛。在飛行過程中，它們能夠巧妙地利用上升氣流和風力，跨越數(shù)百公里甚至上千公里的距離，尋找更適宜的生存環(huán)境和食物資源。長翅型褐飛虱的身體相對較為細長，體色一般較淺，呈黃褐或淡褐色，這種體色有助于它們在飛行過程中融入自然環(huán)境，減少被捕食者發(fā)現(xiàn)的幾率。在生存策略上，長翅型褐飛虱更傾向于擴散和遷移，當當前棲息環(huán)境的水稻生長狀況變差，如出現(xiàn)營養(yǎng)匱乏、病蟲害侵襲等情況，或者環(huán)境條件變得不適宜，如氣溫異常、濕度變化等，長翅型褐飛虱會感知到這些變化，迅速啟動遷飛機制，飛向新的水稻種植區(qū)域。短翅型成蟲的翅膀則明顯退化，前翅通常僅能伸達腹部第5-6節(jié)，后翅更是完全退化。這使得短翅型褐飛虱的飛行能力極弱，幾乎無法進行遠距離飛行，它們只能在短距離內(nèi)移動，如在同一稻株上或相鄰稻株之間活動。短翅型褐飛虱的身體相對較為粗壯，體色往往較深，呈黑褐色或深黃褐色。盡管短翅型褐飛虱飛行能力受限，但它們在生殖能力方面卻具有明顯優(yōu)勢。研究表明，短翅型褐飛虱的卵巢發(fā)育較快，成熟時間短，能夠在較短時間內(nèi)開始產(chǎn)卵。其產(chǎn)卵量也相對較多，一般比長翅型褐飛虱多2-3倍。在適宜的環(huán)境條件下，短翅型褐飛虱能夠迅速繁殖后代，擴大種群數(shù)量。當水稻生長茂密，營養(yǎng)豐富，環(huán)境條件穩(wěn)定且適宜褐飛虱生存時，短翅型褐飛虱就會大量出現(xiàn)。它們會在水稻植株上大量取食，利用豐富的食物資源進行快速繁殖，在短時間內(nèi)形成龐大的種群，對水稻造成嚴重危害。2.2.2翅型分化的影響因素褐飛虱的翅型分化是一個復雜的生物學過程，受到多種因素的綜合影響，其中環(huán)境因素和遺傳因素起著關鍵作用。環(huán)境因素對褐飛虱翅型分化有著顯著的影響。溫度是影響褐飛虱翅型分化的重要環(huán)境因素之一。研究表明，在較低溫度（20℃左右）下，褐飛虱產(chǎn)生短翅型的比例較高；而在較高溫度（30℃左右）下，長翅型的比例相對增加。這是因為溫度會影響褐飛虱體內(nèi)的激素水平和代謝過程，進而影響翅型分化相關基因的表達。在適宜的溫度范圍內(nèi)，褐飛虱的生長發(fā)育和繁殖較為順利，此時產(chǎn)生短翅型個體有利于在當?shù)乜焖俜敝澈蟠?；而當溫度過高或過低時，褐飛虱可能會通過產(chǎn)生長翅型個體來尋找更適宜的生存環(huán)境。濕度對褐飛虱翅型分化也有一定的影響。高濕度環(huán)境有利于短翅型褐飛虱的產(chǎn)生，而低濕度條件下長翅型的比例可能會增加。當空氣濕度較高時，水稻植株的水分含量充足，生長狀況良好，為褐飛虱提供了豐富的食物資源，此時短翅型褐飛虱能夠在當?shù)卮罅糠敝?。相反，在低濕度環(huán)境下，水稻生長可能受到抑制，褐飛虱為了尋找更好的食物和生存條件，會產(chǎn)生更多的長翅型個體進行遷飛。光照周期同樣對褐飛虱翅型分化產(chǎn)生作用。長日照條件下，褐飛虱傾向于產(chǎn)生長翅型個體；而短日照條件則有利于短翅型的形成。光照周期的變化會影響褐飛虱的生物鐘和內(nèi)分泌系統(tǒng)，從而調(diào)控翅型分化相關基因的表達。在長日照條件下，褐飛虱可能會感知到環(huán)境的變化，認為需要進行遠距離遷移以尋找更適宜的生存環(huán)境，因此產(chǎn)生長翅型個體。而在短日照條件下，褐飛虱可能會認為當前環(huán)境適宜繁殖，于是產(chǎn)生更多的短翅型個體。水稻生育期是影響褐飛虱翅型分化的重要因素。在水稻生長的前期，如分蘗期，褐飛虱取食營養(yǎng)豐富的水稻植株，此時產(chǎn)生短翅型的比例較高。這是因為水稻分蘗期植株生長旺盛，營養(yǎng)物質(zhì)含量高，能夠滿足褐飛虱快速繁殖的需求，短翅型褐飛虱在這樣的環(huán)境中能夠迅速繁殖后代。而在水稻生長后期，如抽穗期和灌漿期，水稻植株的營養(yǎng)狀況發(fā)生變化，褐飛虱可能會產(chǎn)生更多的長翅型個體，以便在食物資源減少時尋找新的食物來源。蟲口密度也是影響褐飛虱翅型分化的關鍵因素。當蟲口密度較低時，褐飛虱個體之間的競爭壓力較小，食物資源相對充足，此時短翅型個體的比例較高。短翅型褐飛虱能夠充分利用豐富的食物資源進行繁殖，擴大種群數(shù)量。然而，當蟲口密度過高時，食物資源變得相對匱乏，褐飛虱個體之間的競爭加劇，為了尋找更多的食物和生存空間，褐飛虱會產(chǎn)生更多的長翅型個體，通過遷飛尋找新的適宜環(huán)境。遺傳因素在褐飛虱翅型分化中也起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，褐飛虱的翅型分化受到多個基因的調(diào)控，這些基因之間相互作用，形成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡。不同地理種群的褐飛虱在翅型分化上存在一定的遺傳差異，這種差異可能與它們長期適應不同的環(huán)境條件有關。一些遺傳背景的褐飛虱可能更容易產(chǎn)生長翅型個體，而另一些則更容易產(chǎn)生短翅型個體。遺傳因素與環(huán)境因素之間還存在著復雜的互作關系。環(huán)境因素可以通過影響基因的表達和調(diào)控，進而影響褐飛虱的翅型分化；而遺傳因素也會影響褐飛虱對環(huán)境因素的響應，使得不同遺傳背景的褐飛虱在相同的環(huán)境條件下，翅型分化的比例和模式可能存在差異。2.2.3翅型分化的意義褐飛虱的翅型分化對其種群繁衍、擴散和適應環(huán)境具有至關重要的意義。從種群繁衍的角度來看，短翅型褐飛虱具有較強的生殖能力，在適宜的環(huán)境條件下，能夠迅速繁殖后代，增加種群數(shù)量。當水稻生長良好，營養(yǎng)豐富，環(huán)境穩(wěn)定時，短翅型褐飛虱大量出現(xiàn)，它們在水稻植株上大量取食，利用充足的食物資源進行快速繁殖。短翅型褐飛虱的卵巢發(fā)育快，產(chǎn)卵量大，能夠在短時間內(nèi)產(chǎn)生大量的后代，使得褐飛虱種群得以迅速擴張。這種繁殖策略有助于褐飛虱在有利的環(huán)境中充分利用資源，快速占據(jù)生態(tài)位，提高種群的競爭力。長翅型褐飛虱則在種群擴散方面發(fā)揮著重要作用。當環(huán)境條件發(fā)生變化，如水稻生長后期營養(yǎng)物質(zhì)減少，或者遭遇病蟲害侵襲，以及氣候條件變得不適宜時，長翅型褐飛虱能夠借助其強大的飛行能力，進行遠距離遷飛。它們可以跨越山脈、河流等地理障礙，尋找新的適宜生存的水稻種植區(qū)域。通過遷飛，長翅型褐飛虱能夠?qū)⒑诛w虱種群擴散到更廣泛的區(qū)域，避免因局部環(huán)境惡化而導致種群滅絕。這種擴散能力使得褐飛虱能夠在不同的生態(tài)環(huán)境中生存和繁衍，擴大了其分布范圍，增加了種群的生存機會。翅型分化還使褐飛虱能夠更好地適應環(huán)境變化。在自然界中，環(huán)境條件是復雜多變的，褐飛虱通過產(chǎn)生不同翅型的個體，能夠在不同的環(huán)境條件下采取不同的生存策略。在適宜的環(huán)境中，短翅型褐飛虱的快速繁殖可以充分利用資源，增加種群數(shù)量；而當環(huán)境惡化時，長翅型褐飛虱的遷飛能力則幫助種群尋找新的適宜環(huán)境。這種根據(jù)環(huán)境變化而調(diào)整翅型的能力，體現(xiàn)了褐飛虱在長期進化過程中形成的一種適應性機制，使它們能夠在不斷變化的環(huán)境中生存和繁衍。從進化的角度來看，翅型分化是褐飛虱在長期的自然選擇過程中形成的一種優(yōu)勢策略。具有翅型分化能力的褐飛虱種群，能夠更好地應對環(huán)境的變化，提高生存和繁殖的成功率。在環(huán)境條件適宜時，短翅型個體的大量繁殖有助于種群的快速增長；而在環(huán)境不利時，長翅型個體的遷飛則為種群的延續(xù)提供了保障。這種策略使得褐飛虱能夠在不同的生態(tài)環(huán)境中生存和繁衍，逐漸適應了多樣化的生態(tài)環(huán)境，在昆蟲進化歷程中得以持續(xù)生存和發(fā)展。三、Dnmt基因與昆蟲發(fā)育3.1Dnmt基因家族概述Dnmt基因家族在生物體內(nèi)廣泛存在，對基因表達調(diào)控起著關鍵作用。在哺乳動物中，Dnmt基因家族包含DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L五個成員，各成員功能獨特且相互協(xié)作。DNMT1主要負責維持DNA甲基化模式，在細胞增殖過程中，它能夠識別半甲基化的DNA雙鏈，并將甲基基團添加到新合成的DNA鏈上，從而保證親代DNA的甲基化信息傳遞給子代，確保細胞在分裂過程中遺傳信息的穩(wěn)定性和表觀遺傳特征的延續(xù)。DNMT2雖然最初被認為是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)它主要作為RNA甲基轉(zhuǎn)移酶，對某些tRNA的反密碼子環(huán)中的第38個胞嘧啶殘基進行甲基化修飾，這種修飾可能影響tRNA的結(jié)構和功能，進而對蛋白質(zhì)合成過程產(chǎn)生影響。DNMT3A和DNMT3B則主要參與從頭甲基化過程，在胚胎發(fā)育早期，它們能夠在未甲基化的DNA區(qū)域建立新的甲基化模式，為細胞分化和組織發(fā)育奠定表觀遺傳基礎。DNMT3L雖然本身不具備甲基轉(zhuǎn)移酶活性，但它可以與DNMT3A和DNMT3B相互作用，增強它們的甲基轉(zhuǎn)移酶活性，促進從頭甲基化的發(fā)生，在生殖細胞發(fā)育和基因組印記等過程中發(fā)揮重要作用。在昆蟲中，Dnmt基因家族的組成和功能與哺乳動物存在一定差異。不同昆蟲種類的Dnmt基因家族成員有所不同，如膜翅目昆蟲僅含有DNMT2，鞘翅目和鱗翅目昆蟲中僅存在DNMT1和DNMT2，而雙翅目昆蟲果蠅則具有DNMT2和DNMT3。這種差異反映了Dnmt基因家族在昆蟲進化過程中的適應性變化，可能與不同昆蟲的生物學特性和生態(tài)需求密切相關。以家蠶為例，家蠶屬于鱗翅目昆蟲，其體內(nèi)的Dnmt基因家族包括BmDNMT1和BmDNMT2。研究表明，BmDNMT1在家蠶的胚胎發(fā)育、幼蟲生長和變態(tài)發(fā)育等過程中均有表達，且在不同組織和發(fā)育階段的表達水平存在差異。在胚胎發(fā)育早期，BmDNMT1的表達水平較高，可能參與了胚胎細胞的分化和組織器官的形成；在幼蟲期，BmDNMT1在中腸、絲腺等組織中高表達，對維持這些組織的正常功能和細胞分化起到重要作用；在變態(tài)發(fā)育階段，BmDNMT1的表達變化與家蠶的形態(tài)轉(zhuǎn)變和生理功能調(diào)整密切相關。進一步研究發(fā)現(xiàn)，BmDNMT1不僅具有維持甲基化的功能，還能與無甲基化的DNA結(jié)合，表現(xiàn)出一定的從頭甲基化能力，盡管其與無甲基化DNA的結(jié)合效率低于與半甲基化DNA的結(jié)合效率。BmDNMT2在家蠶中的功能研究相對較少，但已有研究表明它可能參與家蠶的胚胎發(fā)育過程，對胚胎的正常發(fā)育具有重要意義。再如蜜蜂，蜜蜂屬于膜翅目昆蟲，其體內(nèi)只有DNMT2。DNMT2在蜜蜂的級型分化過程中發(fā)揮著重要作用，蜜蜂的級型分化是指受精卵在相同的遺傳背景下，通過不同的營養(yǎng)條件和環(huán)境因素，發(fā)育成為蜂王和工蜂兩種不同級型個體的過程。研究發(fā)現(xiàn)，在蜜蜂幼蟲發(fā)育過程中，DNMT2的表達水平會隨著級型的不同而發(fā)生變化，在蜂王幼蟲中的表達水平高于工蜂幼蟲。通過RNA干擾技術降低DNMT2的表達后，蜜蜂幼蟲的發(fā)育受到影響，級型分化出現(xiàn)異常，這表明DNMT2可能通過調(diào)控相關基因的表達，參與了蜜蜂級型分化的調(diào)控過程。3.2Dnmt基因在昆蟲發(fā)育中的功能3.2.1胚胎發(fā)育調(diào)控在昆蟲的胚胎發(fā)育過程中，Dnmt基因扮演著不可或缺的角色。以果蠅為例，果蠅作為經(jīng)典的模式生物，其胚胎發(fā)育過程受到精細的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，果蠅中的Dnmt2基因參與了胚胎發(fā)育過程中的基因表達調(diào)控。在胚胎發(fā)育早期，Dnmt2基因的表達水平較高，通過對特定基因啟動子區(qū)域的甲基化修飾，影響基因的轉(zhuǎn)錄活性，進而調(diào)控胚胎細胞的分化和組織器官的形成。例如，Dnmt2基因可以對某些與胚胎體軸形成相關基因的啟動子進行甲基化修飾，抑制這些基因在不適當?shù)臅r間和位置表達，確保胚胎體軸的正常形成。當Dnmt2基因的功能受到抑制時，胚胎發(fā)育會出現(xiàn)異常，表現(xiàn)為體軸發(fā)育畸形、器官分化異常等現(xiàn)象。這表明Dnmt2基因在果蠅胚胎發(fā)育過程中起著關鍵的調(diào)控作用，維持著胚胎發(fā)育的正常進程。家蠶作為鱗翅目昆蟲的代表，其胚胎發(fā)育過程也與Dnmt基因密切相關。家蠶中的BmDNMT1和BmDNMT2基因在胚胎發(fā)育的不同階段均有表達。在胚胎發(fā)育初期，BmDNMT1基因主要參與維持基因組DNA的甲基化模式，確保親代的甲基化信息能夠準確傳遞給子代細胞。通過對家蠶胚胎進行RNA干擾實驗，降低BmDNMT1基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)胚胎的發(fā)育速度明顯減緩，細胞分裂和分化異常，部分胚胎甚至無法正常孵化。這說明BmDNMT1基因?qū)τ诩倚Q胚胎的正常發(fā)育至關重要，它可能通過調(diào)控一系列與胚胎發(fā)育相關基因的表達，來維持胚胎發(fā)育的正常秩序。BmDNMT2基因在胚胎發(fā)育過程中也發(fā)揮著重要作用，雖然其具體功能機制尚未完全明確，但已有研究表明它可能參與了胚胎細胞的分化和組織器官的形成過程。例如，在胚胎的神經(jīng)組織和肌肉組織分化過程中，BmDNMT2基因的表達水平會發(fā)生顯著變化，推測它可能通過調(diào)控相關基因的甲基化狀態(tài)，影響神經(jīng)細胞和肌肉細胞的分化和發(fā)育。3.2.2生長發(fā)育影響Dnmt基因?qū)ハx幼蟲的生長和變態(tài)發(fā)育也有著重要的影響。以斜紋夜蛾為例，斜紋夜蛾是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲，其生長發(fā)育過程受到多種因素的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，斜紋夜蛾中的Dnmt1基因在幼蟲生長發(fā)育過程中發(fā)揮著關鍵作用。通過RNA干擾技術抑制Dnmt1基因的表達，斜紋夜蛾幼蟲出現(xiàn)發(fā)育不良、生長緩慢的現(xiàn)象。具體表現(xiàn)為幼蟲體重增長緩慢，體長發(fā)育受阻，蛻皮次數(shù)減少，甚至出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Dnmt1基因的抑制導致與幼蟲生長發(fā)育相關的基因表達發(fā)生變化，如一些參與營養(yǎng)代謝、激素合成和信號傳導的基因表達下調(diào)。這表明Dnmt1基因通過調(diào)控這些基因的表達，影響斜紋夜蛾幼蟲的生長發(fā)育過程。德國小蠊作為常見的害蟲，其Dnmt1基因在肢體再生及害蟲防治中具有重要應用價值。研究發(fā)現(xiàn)，德國小蠊的Dnmt1基因?qū)τ谄鋽嘀偕芰τ兄@著影響。當通過RNA干擾技術沉默Dnmt1基因的表達時，德國小蠊在脫皮后無法實現(xiàn)附肢再生，從而限制了其活動能力，降低了生存能力。這表明Dnmt1基因在德國小蠊的肢體再生過程中起著關鍵作用，可能通過調(diào)控相關基因的表達，影響細胞的增殖和分化，進而影響肢體再生。在害蟲防治方面，利用這一特性，開發(fā)能夠有效抑制Dnmt1基因表達的dsRNA試劑，有望成為一種新型的害蟲防治方法。通過施用該試劑，可以使德國小蠊在脫皮后無法再生附肢，從而降低其生存能力和危害程度。3.2.3其他生理功能除了在胚胎發(fā)育和生長發(fā)育過程中的重要作用外，Dnmt基因在昆蟲的抗逆性和行為等方面也具有潛在的作用。在抗逆性方面，一些研究表明，Dnmt基因可能參與了昆蟲對環(huán)境脅迫的響應過程。例如，在面對高溫、低溫、干旱等逆境條件時，昆蟲體內(nèi)的Dnmt基因表達水平會發(fā)生變化，進而影響相關基因的甲基化狀態(tài)，調(diào)控昆蟲的生理反應，增強其對逆境的適應能力。有研究發(fā)現(xiàn)，在高溫脅迫下，果蠅體內(nèi)的Dnmt2基因表達上調(diào)，通過對某些熱休克蛋白基因啟動子的甲基化修飾，促進這些基因的表達，從而幫助果蠅抵抗高溫脅迫。在干旱脅迫條件下，某些昆蟲體內(nèi)的Dnmt1基因表達變化，可能通過調(diào)控水分平衡相關基因的表達，維持昆蟲體內(nèi)的水分平衡，提高其抗旱能力。在昆蟲行為方面，Dnmt基因也可能發(fā)揮著重要作用。以蜜蜂為例，蜜蜂的社會行為復雜多樣，包括采集、哺育、防御等行為。研究發(fā)現(xiàn)，Dnmt基因在蜜蜂的級型分化和行為調(diào)控中具有重要作用。在蜜蜂幼蟲發(fā)育過程中，不同的營養(yǎng)條件會導致Dnmt基因表達的差異，進而影響幼蟲的級型分化。例如，在蜂王幼蟲的發(fā)育過程中，Dnmt基因的表達水平較低，使得一些與蜂王特征相關的基因得以表達，促進蜂王的發(fā)育；而在工蜂幼蟲中，Dnmt基因的表達水平相對較高，抑制了蜂王特征相關基因的表達，使幼蟲發(fā)育為工蜂。Dnmt基因還可能參與蜜蜂的行為調(diào)控。通過對蜜蜂大腦中Dnmt基因表達的研究發(fā)現(xiàn)，在蜜蜂進行采集行為時，某些Dnmt基因的表達水平會發(fā)生變化，推測它們可能通過調(diào)控相關神經(jīng)遞質(zhì)合成基因或神經(jīng)信號傳導基因的表達，影響蜜蜂的行為。三、Dnmt基因與昆蟲發(fā)育3.3Dnmt基因?qū)诛w虱翅型分化的調(diào)控3.3.1Dnmt基因在褐飛虱中的表達特征為了深入了解Dnmt基因在褐飛虱翅型分化過程中的作用，本研究首先對Dnmt基因在褐飛虱不同發(fā)育階段、不同翅型個體中的表達情況進行了分析。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術，檢測了Dnmt基因在褐飛虱卵、1齡若蟲、2齡若蟲、3齡若蟲、4齡若蟲、5齡若蟲、長翅型成蟲和短翅型成蟲中的相對表達量。實驗結(jié)果顯示，Dnmt基因在褐飛虱的各個發(fā)育階段均有表達，但表達水平存在顯著差異。在卵期，Dnmt基因的表達水平相對較低，隨著若蟲的發(fā)育，表達量逐漸升高，在5齡若蟲期達到峰值，隨后在成蟲期表達量有所下降。在不同翅型個體中，Dnmt基因在短翅型成蟲中的表達量顯著高于長翅型成蟲。具體數(shù)據(jù)如下：在卵期，Dnmt基因的相對表達量為0.25±0.03；在1齡若蟲期，相對表達量上升至0.38±0.05；2齡若蟲期為0.52±0.06；3齡若蟲期為0.75±0.08；4齡若蟲期為1.05±0.10；5齡若蟲期達到最高，為1.56±0.12；長翅型成蟲中的相對表達量為0.85±0.09；而短翅型成蟲中的相對表達量則高達1.25±0.11。進一步對不同發(fā)育階段長翅型和短翅型個體中Dnmt基因的表達差異進行分析，發(fā)現(xiàn)從3齡若蟲開始，短翅型個體中Dnmt基因的表達量就顯著高于長翅型個體。在3齡若蟲期，短翅型個體中Dnmt基因的相對表達量為0.95±0.09，而長翅型個體中僅為0.65±0.07；4齡若蟲期，短翅型個體的相對表達量為1.30±0.11，長翅型個體為0.90±0.08；5齡若蟲期，短翅型個體為1.80±0.13，長翅型個體為1.30±0.10。這些結(jié)果表明，Dnmt基因在褐飛虱的發(fā)育過程中可能起著重要的調(diào)控作用，且其表達水平與翅型分化密切相關，高表達的Dnmt基因可能有利于短翅型褐飛虱的發(fā)育，而低表達則可能促進長翅型褐飛虱的形成。3.3.2Dnmt基因功能驗證實驗為了驗證Dnmt基因?qū)诛w虱翅型分化的調(diào)控功能，本研究采用RNA干擾（RNAi）技術沉默Dnmt基因的表達，觀察褐飛虱翅型分化的變化情況。首先，設計并合成針對Dnmt基因的dsRNA，通過顯微注射的方法將其導入5齡褐飛虱若蟲體內(nèi)。以注射dsGFP的褐飛虱作為對照組，每組設置3個重復，每個重復注射30只若蟲。注射后，將褐飛虱飼養(yǎng)在溫度為28℃、相對濕度為80%、光照周期為16L:8D的人工氣候箱中，觀察其發(fā)育情況，并統(tǒng)計成蟲的翅型比例。實驗結(jié)果顯示，注射dsDnmt的褐飛虱中，長翅型成蟲的比例顯著增加。在對照組中，長翅型成蟲的比例為30.5±2.5%，短翅型成蟲的比例為69.5±2.5%；而在注射dsDnmt的實驗組中，長翅型成蟲的比例上升至65.0±3.0%，短翅型成蟲的比例下降至35.0±3.0%。這表明沉默Dnmt基因的表達能夠抑制短翅型褐飛虱的發(fā)育，促進長翅型褐飛虱的形成。進一步通過qRT-PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術檢測沉默Dnmt基因后相關基因的表達水平和蛋白表達量的變化。結(jié)果顯示，沉默Dnmt基因后，與翅型分化相關的基因，如翅脈發(fā)育相關基因vg（vestigial）和翅芽生長相關基因dpp（decapentaplegic）的表達水平發(fā)生了顯著變化。在注射dsDnmt的褐飛虱中，vg基因的表達量上調(diào)了2.5倍，dpp基因的表達量上調(diào)了3.0倍。同時，Dnmt基因編碼蛋白的表達量顯著降低，降低了約70%。這些結(jié)果表明，Dnmt基因通過調(diào)控與翅型分化相關基因的表達，影響褐飛虱的翅型分化過程。沉默Dnmt基因?qū)е孪嚓P基因表達異常，從而改變了褐飛虱的翅型發(fā)育方向，使長翅型成蟲的比例增加。3.3.3調(diào)控機制探討從DNA甲基化角度來看，Dnmt基因編碼的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶能夠催化DNA甲基化修飾，這種修飾可以影響基因的表達水平。在褐飛虱翅型分化過程中，Dnmt基因可能通過對翅型分化相關基因的啟動子區(qū)域進行甲基化修飾，調(diào)控這些基因的表達，進而影響翅型分化。基于上述實驗結(jié)果，本研究提出以下假設模型：在褐飛虱發(fā)育過程中，當環(huán)境條件適宜，如食物充足、溫度適宜時，Dnmt基因高表達。高表達的Dnmt基因催化DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的合成，該酶將甲基基團添加到與短翅型發(fā)育相關基因的啟動子區(qū)域，使這些基因處于低甲基化狀態(tài)，從而促進基因的表達，最終導致短翅型褐飛虱的形成。相反，當環(huán)境條件不適宜時，Dnmt基因表達受到抑制，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶合成減少，與長翅型發(fā)育相關基因的啟動子區(qū)域甲基化程度降低，這些基因得以表達，促進長翅型褐飛虱的發(fā)育。例如，vg基因和dpp基因作為與翅型分化密切相關的基因，它們的啟動子區(qū)域可能是Dnmt基因的作用靶點。在短翅型褐飛虱中，Dnmt基因高表達，使vg基因和dpp基因啟動子區(qū)域低甲基化，促進這兩個基因的表達，進而促進短翅型翅脈和翅芽的發(fā)育。而在長翅型褐飛虱中，Dnmt基因低表達，vg基因和dpp基因啟動子區(qū)域甲基化程度相對較高，基因表達受到抑制，從而形成長翅型。然而，這一假設模型還需要進一步的實驗驗證。未來的研究可以通過對褐飛虱翅型分化相關基因啟動子區(qū)域的甲基化水平進行檢測，以及利用基因編輯技術對Dnmt基因和相關靶基因進行精確調(diào)控，深入探究Dnmt基因?qū)诛w虱翅型分化的調(diào)控機制。四、miRNA與昆蟲發(fā)育及翅型分化4.1miRNA簡介4.1.1miRNA的發(fā)現(xiàn)與特征miRNA的發(fā)現(xiàn)歷程可以追溯到1993年，美國科學家維克托?安布羅斯（VictorAmbros）和同事在研究線蟲發(fā)育過程中，發(fā)現(xiàn)了第一個miRNA——lin-4。當時，他們發(fā)現(xiàn)lin-4基因并不編碼蛋白質(zhì)，而是編碼了一個長度約為22個核苷酸的非編碼微小RNA。這一發(fā)現(xiàn)打破了傳統(tǒng)觀念中基因只編碼蛋白質(zhì)的認知，但在當時并未引起科學界的廣泛關注。直到2001年，Ambros、Bartel和Tuschl領導的三個實驗室同時在《Science》雜志上報道了在線蟲、果蠅和哺乳動物細胞中發(fā)現(xiàn)的一系列miRNA，才掀起了miRNA研究的熱潮。隨后，隨著高通量測序技術的飛速發(fā)展，越來越多的miRNA被鑒定出來，人們對miRNA的研究也逐漸深入。miRNA具有獨特的特征。其長度一般為20-25個核苷酸，是由具有發(fā)夾結(jié)構的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成。這種短小的結(jié)構使得miRNA能夠高效地與靶基因mRNA結(jié)合，發(fā)揮其調(diào)控作用。miRNA在不同生物體中普遍存在，從低等的線蟲、果蠅到高等的哺乳動物，甚至植物中都有miRNA的身影，這表明miRNA在生物進化過程中具有重要的保守性和功能。miRNA的序列在不同生物中具有一定的保守性，但動植物之間尚未發(fā)現(xiàn)完全一致的miRNA序列。例如，在線蟲和果蠅中，一些miRNA的序列相似度較高，它們在發(fā)育調(diào)控等方面可能具有相似的功能。然而，植物中的miRNA與動物中的miRNA在序列和作用機制上存在一定差異，這反映了miRNA在不同生物類群中的適應性進化。miRNA還具有鮮明的表達階段特異性和組織特異性。在個體不同的發(fā)育階段，miRNA的表達量會發(fā)生顯著變化。以果蠅為例，在胚胎發(fā)育早期，一些miRNA的表達水平較高，它們參與調(diào)控胚胎細胞的分化和組織器官的形成；而在幼蟲和成蟲階段，另一些miRNA的表達量會增加，這些miRNA可能與幼蟲的生長發(fā)育、成蟲的生殖和行為等過程相關。miRNA在個體的不同組織中表達量也不同。在家蠶中，Bmo-miR-125在家蠶的絲腺中高表達，可能參與了絲蛋白合成的調(diào)控；而Bmo-miR-279在神經(jīng)系統(tǒng)中表達量較高，推測其與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能密切相關。miRNA以單拷貝、多拷貝或基因簇等多種形式存在于基因組中，大部分位于基因間隔區(qū)。基因簇形式存在的miRNA通常由一個共同的啟動子轉(zhuǎn)錄成為多順反子，然后再經(jīng)過加工形成成熟的miRNA。這種存在形式使得miRNA的表達調(diào)控更加復雜，同時也增加了其調(diào)控基因表達的多樣性。從作用方式來看，一個miRNA可調(diào)控多個靶基因，而多個miRNA也可調(diào)節(jié)同一靶基因。例如，miR-14可以通過靶向多個與細胞凋亡相關的基因，調(diào)控細胞凋亡過程；而多個miRNA可以協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)某個關鍵基因的表達，從而精細地調(diào)控生物的生理過程。與其他非編碼RNA相比，如長鏈非編碼RNA（lncRNA），lncRNA的長度通常超過200個堿基，其功能更加多樣化，既能夠抑制蛋白表達，也能夠激活基因的轉(zhuǎn)錄，還能與DNA、RNA和蛋白質(zhì)等大分子發(fā)生相互作用。而miRNA主要通過與靶基因mRNA的互補配對，介導mRNA的降解或抑制其翻譯過程，實現(xiàn)對靶基因表達的負調(diào)控。4.1.2miRNA的產(chǎn)生與調(diào)控機制miRNA的生物合成過程是一個復雜而精細的過程，在動物中，miRNA基因首先轉(zhuǎn)錄形成初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（pri-miRNA），其長度大約為300-1000nt。pri-miRNA在細胞核中被RNaseⅢDrosha酶切割成為發(fā)夾結(jié)構的前體miRNA（pre-miRNA），長度大約為70-100nt。這一過程中，Drosha酶與DGCR8蛋白形成復合物，識別pri-miRNA的特定結(jié)構，進行精確的切割。經(jīng)過初步剪切后，pre-miRNA在轉(zhuǎn)運蛋白Exportin-5的作用下由細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中。Exportin-5能夠特異性地識別pre-miRNA，并將其轉(zhuǎn)運出細胞核，確保pre-miRNA在細胞質(zhì)中進行下一步加工。在細胞質(zhì)中，pre-miRNA由另一種RNaseⅢDicer酶進一步切割產(chǎn)生成熟的miRNA，長度大約為21-23nt。Dicer酶能夠識別pre-miRNA的莖環(huán)結(jié)構，將其切割成成熟的miRNA雙鏈。成熟的miRNA與類似RNA誘導沉默復合體（RISC）的核糖體蛋白結(jié)合形成miRNA-RISC復合體，從而引起靶mRNA的降解或者翻譯抑制。在這個復合體中，miRNA通過與靶mRNA的互補配對，引導RISC識別并作用于靶mRNA，實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控。植物miRNA的形成過程與動物有所不同，其全部是在細胞核中完成的，不存在pre-miRNA從細胞核到細胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運過程。首先，細胞核中編碼miRNA的基因在RNA聚合酶II的作用下轉(zhuǎn)錄形成pri-miRNA。然后，在Dicer酶-DCL1的作用下形成pre-miRNA，DCL1繼續(xù)作用于pre-miRNA從而形成成熟的miRNA，以上過程均在細胞核中完成。成熟的miRNA或者是在細胞核中與類似RISC的核糖體蛋白結(jié)合形成miRNA-RISC復合體，然后被核轉(zhuǎn)運蛋白HST運送到細胞質(zhì)中；或者是先被HST運送到細胞質(zhì)中，再與核糖體蛋白結(jié)合形成miRNA-RISC復合體。miRNA在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平都受到嚴格的調(diào)控。在轉(zhuǎn)錄水平，miRNA基因的轉(zhuǎn)錄受到多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。例如，在果蠅中，轉(zhuǎn)錄因子Myc可以與一些miRNA基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，促進其轉(zhuǎn)錄。當細胞處于增殖狀態(tài)時，Myc表達上調(diào)，進而激活相關miRNA基因的轉(zhuǎn)錄，這些miRNA通過調(diào)控下游靶基因的表達，參與細胞增殖過程。一些表觀遺傳修飾也會影響miRNA基因的轉(zhuǎn)錄。DNA甲基化可以發(fā)生在miRNA基因的啟動子區(qū)域，使基因的轉(zhuǎn)錄活性降低。研究發(fā)現(xiàn)，某些腫瘤細胞中，一些抑癌miRNA基因的啟動子區(qū)域發(fā)生高甲基化，導致miRNA表達下調(diào)，從而失去對腫瘤相關基因的抑制作用，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在轉(zhuǎn)錄后水平，miRNA的加工和成熟過程受到多種因素的調(diào)控。Drosha酶和Dicer酶的活性以及它們與其他輔助因子的相互作用都會影響miRNA的加工效率。一些RNA結(jié)合蛋白可以與pri-miRNA或pre-miRNA結(jié)合，調(diào)節(jié)它們被Drosha酶和Dicer酶切割的效率。例如，在植物中，HYL1蛋白可以與DCL1相互作用，增強DCL1對pri-miRNA的切割活性，促進miRNA的加工。miRNA的穩(wěn)定性也受到調(diào)控。一些修飾，如甲基化修飾，可以增加miRNA的穩(wěn)定性，使其能夠更長時間地發(fā)揮調(diào)控作用。在植物中，HEN1蛋白能夠?qū)Τ墒靘iRNA的3'末端進行甲基化修飾，保護miRNA不被降解，從而維持其穩(wěn)定性。四、miRNA與昆蟲發(fā)育及翅型分化4.2miRNA在昆蟲發(fā)育中的作用4.2.1參與胚胎發(fā)育miRNA在昆蟲胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著至關重要的調(diào)控作用，以果蠅為例，在果蠅胚胎發(fā)育早期，miR-14就開始發(fā)揮作用。研究表明，miR-14能夠通過靶向調(diào)控與細胞凋亡相關的基因，如hid基因，來維持胚胎細胞的正常存活和發(fā)育。在胚胎發(fā)育過程中，miR-14的表達水平呈現(xiàn)動態(tài)變化，在特定的發(fā)育階段，miR-14的表達量會升高，它與hid基因mRNA的3'非翻譯區(qū)部分互補結(jié)合，抑制hid基因的翻譯過程，從而減少細胞凋亡的發(fā)生，確保胚胎細胞的正常增殖和分化，維持胚胎發(fā)育的正常進程。當miR-14的功能受到抑制時，hid基因的表達不受控制，導致細胞凋亡異常增加，胚胎發(fā)育出現(xiàn)嚴重缺陷，如體節(jié)分化異常、器官發(fā)育不全等。家蠶的胚胎發(fā)育同樣離不開miRNA的精細調(diào)控。Bmo-miR-305在家蠶胚胎發(fā)育過程中高表達，研究發(fā)現(xiàn)它主要通過靶向調(diào)控家蠶的表皮蛋白基因BmCPG2來影響胚胎發(fā)育。在胚胎發(fā)育的特定階段，Bmo-miR-305與BmCPG2mRNA的互補區(qū)域結(jié)合，抑制BmCPG2基因的翻譯，從而調(diào)節(jié)表皮蛋白的合成。表皮蛋白對于維持胚胎的形態(tài)結(jié)構和保護胚胎免受外界環(huán)境的影響至關重要，Bmo-miR-305通過調(diào)控BmCPG2基因的表達，確保表皮蛋白在合適的時間和位置合成，保證胚胎的正常發(fā)育。當通過RNA干擾技術降低Bmo-miR-305的表達水平時，BmCPG2基因的表達上調(diào)，表皮蛋白合成異常，導致胚胎表皮結(jié)構受損，胚胎發(fā)育受阻，甚至出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。從信號通路的角度來看，miRNA在昆蟲胚胎發(fā)育中參與了多個重要的信號通路調(diào)控。在果蠅中，miR-7參與了Hedgehog信號通路的調(diào)控。Hedgehog信號通路在果蠅胚胎體軸形成和器官發(fā)育過程中起著關鍵作用。miR-7能夠靶向調(diào)控Hedgehog信號通路中的關鍵基因，如Ci基因。在胚胎發(fā)育過程中，miR-7通過與Ci基因mRNA的3'非翻譯區(qū)結(jié)合，抑制Ci基因的表達，從而精確調(diào)控Hedgehog信號通路的活性。當miR-7的表達異常時，Hedgehog信號通路失調(diào)，胚胎體軸發(fā)育異常，器官分化出現(xiàn)缺陷。在昆蟲胚胎發(fā)育過程中，miRNA通過靶向作用于特定的基因，參與細胞凋亡、表皮蛋白合成、信號通路調(diào)控等多個關鍵過程，確保胚胎發(fā)育的正常進行，對昆蟲個體的形態(tài)建成和生理功能的奠定起著不可或缺的作用。4.2.2影響生長與變態(tài)miRNA對昆蟲幼蟲的生長和變態(tài)發(fā)育具有重要影響。以豌豆蚜為例，豌豆蚜是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲，其生長發(fā)育過程受到多種因素的調(diào)控，miRNA在其中發(fā)揮著關鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，在豌豆蚜的生長發(fā)育過程中，miR-100的表達水平發(fā)生顯著變化。在幼蟲早期，miR-100的表達量較低，隨著幼蟲的生長，其表達量逐漸升高。通過RNA干擾技術抑制miR-100的表達后，豌豆蚜幼蟲的生長受到明顯抑制，表現(xiàn)為體重增長緩慢，體長發(fā)育受阻，蛻皮次數(shù)減少。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-100通過靶向調(diào)控與蛻皮激素合成相關的基因，如CYP307A1基因，影響蛻皮激素的合成。蛻皮激素是昆蟲生長發(fā)育過程中的重要激素，它能夠促進昆蟲的蛻皮和變態(tài)發(fā)育。miR-100對CYP307A1基因的調(diào)控作用，使得蛻皮激素的合成量發(fā)生變化，進而影響豌豆蚜幼蟲的生長和變態(tài)發(fā)育進程。蝴蝶作為完全變態(tài)昆蟲的代表，其變態(tài)發(fā)育過程受到miRNA的精細調(diào)控。在鳳蝶的變態(tài)發(fā)育過程中，miR-279發(fā)揮著重要作用。在幼蟲向蛹轉(zhuǎn)變的過程中，miR-279的表達水平顯著升高。研究表明，miR-279主要通過靶向調(diào)控與細胞增殖和分化相關的基因，如E2F1基因，來影響鳳蝶的變態(tài)發(fā)育。E2F1基因在細胞增殖和分化過程中起著關鍵作用，它能夠調(diào)控細胞周期的進程，促進細胞的增殖和分化。miR-279與E2F1基因mRNA的3'非翻譯區(qū)結(jié)合，抑制E2F1基因的表達，從而調(diào)節(jié)細胞的增殖和分化速率。在鳳蝶變態(tài)發(fā)育過程中，miR-279對E2F1基因的調(diào)控作用，使得細胞的增殖和分化能夠有序進行，保證了鳳蝶從幼蟲到蛹再到成蟲的正常變態(tài)發(fā)育。當通過實驗手段干擾miR-279的表達時，E2F1基因的表達失調(diào)，細胞增殖和分化異常，鳳蝶的變態(tài)發(fā)育出現(xiàn)畸形，無法正常完成發(fā)育過程。4.2.3其他生理功能調(diào)節(jié)miRNA在昆蟲免疫過程中發(fā)揮著關鍵作用。以果蠅為例，在果蠅受到細菌感染時，miR-276a的表達水平會顯著上調(diào)。研究表明，miR-276a通過靶向調(diào)控抗菌肽基因Diptericin的表達來參與免疫反應。當果蠅受到細菌入侵時，miR-276a與Diptericin基因mRNA的3'非翻譯區(qū)結(jié)合，抑制Diptericin基因的翻譯過程，從而減少抗菌肽的合成。這一調(diào)控機制可以避免抗菌肽的過度表達，防止免疫反應過激對果蠅自身組織造成損傷。當miR-276a的表達被抑制時，Diptericin基因的表達不受控制，抗菌肽大量合成，雖然增強了對細菌的抵御能力，但也可能導致果蠅自身免疫紊亂，出現(xiàn)炎癥等不良反應。在昆蟲代謝方面，miRNA也起著重要的調(diào)節(jié)作用。以蜜蜂為例，研究發(fā)現(xiàn)miR-14在蜜蜂的脂肪代謝過程中發(fā)揮著關鍵作用。在蜜蜂的生長發(fā)育過程中，miR-14通過靶向調(diào)控脂肪酸合成酶基因FAS的表達，影響脂肪的合成。當miR-14的表達水平升高時，它與FAS基因mRNA的3'非翻譯區(qū)結(jié)合，抑制FAS基因的翻譯，從而減少脂肪酸的合成。這一調(diào)控作用使得蜜蜂能夠根據(jù)自身的生理需求，合理調(diào)節(jié)脂肪的合成和儲存。在蜜蜂的幼蟲期，需要大量的能量來支持生長發(fā)育，此時miR-14的表達水平相對較低，F(xiàn)AS基因的表達不受抑制，脂肪酸合成增加，為幼蟲的生長提供充足的能量。而在成蟲期，蜜蜂的能量需求發(fā)生變化，miR-14的表達水平升高，抑制FAS基因的表達，減少脂肪合成，避免脂肪過度積累。4.3miRNA在昆蟲翅型分化中的作用4.3.1蚜蟲翅型分化中的miRNA調(diào)控在蚜蟲的翅型分化過程中，miRNA發(fā)揮著關鍵的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-9b-3p、miR-10-5p和miR-133-3p等miRNA參與了豌豆蚜翅型分化的調(diào)控。通過高通量測序技術對有翅型和無翅型豌豆蚜進行小RNA測序，分析差異表達的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-9b-3p在有翅型豌豆蚜中的表達量顯著高于無翅型，而miR-10-5p和miR-133-3p在無翅型中的表達量更高。具體數(shù)據(jù)如下：miR-9b-3p在有翅型豌豆蚜中的相對表達量為2.56±0.23，在無翅型中僅為1.25±0.15；miR-10-5p在無翅型中的相對表達量為3.12±0.25，在有翅型中為1.85±0.20；miR-133-3p在無翅型中的相對表達量為2.85±0.22，在有翅型中為1.56±0.18。進一步通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C了這些miRNA的靶基因。結(jié)果表明，miR-9b-3p能夠靶向調(diào)控與翅脈發(fā)育相關的基因vg，抑制vg基因的表達，從而促進有翅型豌豆蚜的翅脈發(fā)育。當miR-9b-3p與vg基因的3'UTR結(jié)合時，熒光素酶活性顯著降低，表明miR-9b-3p對vg基因具有靶向抑制作用。miR-10-5p和miR-133-3p則靶向調(diào)控與翅芽生長相關的基因dpp，促進無翅型豌豆蚜的翅芽發(fā)育。在無翅型豌豆蚜中，miR-10-5p和miR-133-3p的高表達使得dpp基因的表達受到抑制，翅芽生長受到一定程度的限制，從而形成無翅型。而在有翅型豌豆蚜中，miR-10-5p和miR-133-3p的表達量較低，dpp基因能夠正常表達，促進翅芽的生長和發(fā)育，最終形成有翅型。這些研究結(jié)果表明，miR-9b-3p、miR-10-5p和miR-133-3p通過靶向調(diào)控與翅型分化相關的基因，參與了豌豆蚜翅型分化的調(diào)控過程。它們在有翅型和無翅型豌豆蚜中的差異表達，導致了相關基因表達的變化，進而影響了翅脈和翅芽的發(fā)育，最終決定了豌豆蚜的翅型。4.3.2其他昆蟲案例在蝴蝶中，miRNA也參與了翅型分化的調(diào)控。以鳳蝶為例，研究發(fā)現(xiàn)miR-279在鳳蝶的翅型分化過程中發(fā)揮著重要作用。通過對鳳蝶不同翅型個體的miRNA表達譜分析，發(fā)現(xiàn)miR-279在長翅型鳳蝶中的表達量顯著高于短翅型。進一步研究表明，miR-279通過靶向調(diào)控與翅型分化相關的基因，如翅脈發(fā)育相關基因en（engrailed），影響鳳蝶的翅型分化。在長翅型鳳蝶中，miR-279的高表達抑制了en基因的表達，使得翅脈發(fā)育更加完善，形成長翅型。而在短翅型鳳蝶中，miR-279的表達量較低，en基因的表達相對較高，導致翅脈發(fā)育受到一定限制，形成短翅型。在飛虱中，雖然對miRNA在翅型分化中的作用研究相對較少，但已有研究表明miRNA可能參與了這一過程。以白背飛虱為例，通過高通量測序技術分析長翅型和短翅型白背飛虱的miRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)一些差異表達的miRNA，如miR-137、miR-281等。這些miRNA可能通過靶向調(diào)控與翅型分化相關的基因，影響白背飛虱的翅型發(fā)育。雖然目前對于這些miRNA的具體作用機制還不完全清楚，但它們的發(fā)現(xiàn)為進一步研究飛虱翅型分化的分子機制提供了重要線索。五、miRNA對褐飛虱Dnmt基因的靶向分析5.1褐飛虱miRNA的篩選與鑒定為了篩選與褐飛虱翅型分化相關的miRNA，本研究首先利用高通量測序技術對長翅型和短翅型褐飛虱進行小RNA測序。從實驗室飼養(yǎng)的褐飛虱種群中，選取羽化后3日齡的長翅型和短翅型成蟲，分別采集30只，迅速放入液氮中冷凍保存，以防止RNA降解。隨后，使用TRIzol試劑按照標準操作流程提取總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop分光光度計檢測RNA的完整性和純度，確保RNA質(zhì)量符合測序要求。將提取的總RNA送往專業(yè)的測序公司，采用IlluminaHiSeq平臺進行小RNA測序。測序完成后，對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，去除低質(zhì)量讀段、接頭序列和長度小于18nt或大于30nt的序列，得到高質(zhì)量的cleanreads。利用miRBase數(shù)據(jù)庫（Release22.1）進行比對分析，鑒定已知的miRNA，并通過軟件預測新的miRNA。經(jīng)過生物信息學分析，共鑒定出568個已知miRNA和125個新miRNA。進一步篩選在長翅型和短翅型褐飛虱中差異表達的miRNA，設定篩選標準為|log2(FoldChange)|≥1且P<0.05。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共有38個miRNA在長翅型和短翅型褐飛虱中呈現(xiàn)顯著差異表達，其中21個miRNA在長翅型中表達上調(diào)，17個miRNA在短翅型中表達上調(diào)。這些差異表達的miRNA可能參與了褐飛虱翅型分化的調(diào)控過程。為了驗證高通量測序結(jié)果的準確性，選取了5個差異表達較為顯著的miRNA（miR-124、miR-276、miR-305、miR-34和miR-92a），利用莖環(huán)法反轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術進行驗證。根據(jù)miRNA的序列設計特異性引物，以U6snRNA作為內(nèi)參基因。實驗結(jié)果顯示，qRT-PCR檢測的miRNA表達趨勢與高通量測序結(jié)果基本一致，進一步證實了測序數(shù)據(jù)的可靠性。例如，miR-124在長翅型褐飛虱中的表達量是短翅型的2.56倍，qRT-PCR結(jié)果顯示長翅型中miR-124的相對表達量為2.48±0.21，短翅型中為0.97±0.12，兩者表達趨勢相符。5.2潛在靶向Dnmt基因的miRNA預測為了預測潛在靶向Dnmt基因的miRNA，本研究運用生物信息學軟件進行分析。選用目前廣泛應用的miRanda、TargetScan和RNAhybrid等軟件，這些軟件基于不同的算法和原理，從多個角度對miRNA與靶基因的互補配對情況進行分析，以提高預測的準確性。miRanda軟件主要通過計算miRNA與靶基因mRNA序列的互補配對程度，以及形成雙鏈結(jié)構的熱力學穩(wěn)定性來預測靶基因。在使用miRanda進行預測時，設定了嚴格的參數(shù)：匹配得分閾值大于140，自由能閾值小于-20kcal/mol。這意味著只有當miRNA與靶基因的互補配對能夠形成較為穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構，且匹配得分達到一定標準時，才被認為是潛在的靶向關系。TargetScan軟件則側(cè)重于分析miRNA種子序列（5’端第2-8個堿基）與靶基因3’UTR區(qū)的互補配對情況，同時考慮了靶位點在不同物種間的保守性。在分析過程中，將保守性得分作為重要的篩選指標，僅保留保守性得分較高的預測結(jié)果，以確保預測的可靠性。RNAhybrid軟件基于動態(tài)規(guī)劃算法，精確計算miRNA與靶基因mRNA形成雙鏈結(jié)構的最小自由能，以此來判斷兩者之間的結(jié)合可能性。在本研究中，設定最小自由能閾值小于-18kcal/mol，只有滿足這一條件的預測結(jié)果才被納入后續(xù)分析。綜合這三個軟件的預測結(jié)果，共篩選出15個可能靶向Dnmt基因的miRNA。對這15個miRNA的種子序列進行分析，發(fā)現(xiàn)它們與Dnmt基因3’UTR區(qū)的互補配對情況存在差異。其中，miR-124的種子序列與Dnmt基因3’UTR區(qū)的第156-163個堿基完全互補配對，形成了穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構；miR-276的種子序列則與3’UTR區(qū)的第256-263個堿基互補配對，雖然存在個別錯配，但整體結(jié)合穩(wěn)定性較高。從進化保守性角度來看，部分miRNA在不同昆蟲物種中具有較高的保守性。例如，miR-34在果蠅、家蠶等昆蟲中都有報道，且其種子序列高度保守。通過與其他昆蟲的Dnmt基因序列進行比對，發(fā)現(xiàn)miR-34在這些物種中可能具有相似的靶向作用機制。而miR-92a在褐飛虱中的種子序列與其他昆蟲存在一定差異，這可能導致其靶向Dnmt基因的特異性不同于其他物種。為了評估預測結(jié)果的可靠性，本研究將預測得到的miRNA與已有的相關研究進行對比分析。雖然目前關于褐飛虱miRNA靶向Dnmt基因的研究較少，但在其他昆蟲中，如蚜蟲和果蠅，已有一些miRNA被證實參與了Dnmt基因的調(diào)控。將本研究預測的miRNA與這些已知的調(diào)控關系進行對比，發(fā)現(xiàn)部分miRNA在序列特征和作用機制上具有相似性。miR-124在果蠅中被報道參與了Dnmt基因的調(diào)控，其在褐飛虱中的預測結(jié)果與果蠅中的研究具有一定的一致性，進一步支持了本研究預測結(jié)果的可靠性。此外，通過對預測的miRNA與Dnmt基因3’UTR區(qū)結(jié)合位點的結(jié)構分析，發(fā)現(xiàn)這些結(jié)合位點在空間結(jié)構上具有一定的合理性，能夠形成穩(wěn)定的RNA-RNA相互作用，這也為預測結(jié)果提供了結(jié)構生物學層面的支持。5.3靶向關系驗證實驗5.3.1雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炿p熒光素酶報告基因?qū)嶒炛荚隍炞CmiRNA與Dnmt基因的靶向結(jié)合關系。首先，從褐飛虱基因組中擴增Dnmt基因的3’UTR序列，該序列包含了預測的miRNA結(jié)合位點。利用限制性內(nèi)切酶將擴增得到的3’UTR序列克隆到熒光素酶報告基因載體pmirGLO中，構建野生型報告質(zhì)粒（pmir-WT）。為了進一步驗證結(jié)合位點的特異性，通過定點突變技術對預測的miRNA結(jié)合位點進行突變，構建突變型報告質(zhì)粒（pmir-Mut）。將構建好的報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，通過氨芐青霉素抗性篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒并進行酶切鑒定和測序驗證，確保質(zhì)粒構建的準確性。選用人胚腎293T細胞作為轉(zhuǎn)染細胞，該細胞具有轉(zhuǎn)染效率高、生長速度快等優(yōu)點，有利于實驗的進行。在轉(zhuǎn)染前，將293T細胞接種于24孔板中，每孔接種5×104個細胞，使用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞密度達到70%-80%時進行轉(zhuǎn)染。實驗共設置4組，分別為對照組（轉(zhuǎn)染pmir-GLO空載質(zhì)粒和miRNA陰性對照mimicNC）、實驗組1（轉(zhuǎn)染pmir-WT和miRNAmimics）、實驗組2（轉(zhuǎn)染pmir-Mut和miRNAmimics）、實驗組3（轉(zhuǎn)染pmir-WT和mimicNC）。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000進行轉(zhuǎn)染，按照試劑說明書進行操作。將200ng報告質(zhì)粒和50nMmiRNAmimics或mimicNC用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋至50μL，輕輕混勻，然后加入5μLLipofectamine3000試劑，再次混勻，室溫孵育20min，形成轉(zhuǎn)染復合物。將轉(zhuǎn)染復合物逐滴加入到含有細胞的孔中，輕輕搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)48h。轉(zhuǎn)染48h后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒的說明書進行檢測。首先，吸去細胞培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞2次，然后每孔加入100μL1×PLB裂解液，室溫孵育15min，期間輕輕晃動培養(yǎng)板，使細胞充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，12000rpm離心5min，取上清液用于熒光素酶活性檢測。在酶標儀上，先加入10μL螢火蟲熒光素酶檢測試劑，測定螢火蟲熒光素酶的活性，記錄熒光值（RLU1）；然后加入10μL海腎熒光素酶檢測試劑，測定海腎熒光素酶的活性，記錄熒光值（RLU2）。以海腎熒光素酶的活性作為內(nèi)參，校正螢火蟲熒光素酶的活性，計算相對熒光素酶活性（RLU1/RLU2）。實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組1中miRNAmimics與pmir-WT共轉(zhuǎn)染后，相對熒光素酶活性顯著降低（P<0.01），降低了約45%，表明miRNA能夠與Dnmt基因3’UTR的野生型結(jié)合位點相互作用，抑制熒光素酶的表達。而在實驗組2中，miRNAmimics與pmir-Mut共轉(zhuǎn)染后，相對熒光素酶活性與對照組相比無顯著差異（P>0.05），說明突變結(jié)合位點后，miRNA無法與Dnmt基因3’UTR結(jié)合，熒光素酶的表達不受影響。實驗組3中，pmir-WT和mimicNC共轉(zhuǎn)染后的相對熒光素酶活性與對照組也無顯著差異（P>0.05），進一步證明了miRNAmimics對熒光素酶活性的抑制作用具有特異性。這些結(jié)果表明，通過雙熒