Legumain：解鎖卵巢癌病理機制與診療新靶點的關鍵密碼一、引言1.1研究背景與意義1.1.1卵巢癌的現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)卵巢癌作為女性生殖系統(tǒng)中極為嚴重的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與死亡率一直處于高位，對女性的生命健康構成了巨大威脅。在全球范圍內，卵巢癌的發(fā)病率在女性常見惡性腫瘤中占據(jù)2%-6%，在女性生殖系統(tǒng)癌癥里，發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮內膜癌，位居第三，但其死亡率卻居于首位，因此被稱為“婦癌之王”。據(jù)相關數(shù)據(jù)統(tǒng)計，全球每年新增卵巢癌病例大約23萬多，死亡人數(shù)超過15萬；在中國，每年發(fā)病總數(shù)約6萬，死亡病例約4萬。卵巢癌死亡率居高不下，關鍵原因在于其早期癥狀隱匿，缺乏有效的篩查手段，導致超過70%的患者在確診時就已處于晚期。卵巢深藏于盆腔深部，正常大小僅約3×5厘米，常規(guī)體檢難以察覺。而且卵巢癌早期沒有典型癥狀，不易被患者自身覺察，當病情進展到晚期出現(xiàn)癥狀時，又多表現(xiàn)為腹脹、消化不良、食欲不振、腹水等非特異性癥狀，極易與消化道疾病混淆，從而導致患者可能因誤診而延誤病情。確診時，多數(shù)患者的癌細胞已擴散至腸道、腹膜，甚至出現(xiàn)腹水，這使得徹底根除病灶變得極為困難，復發(fā)風險也大大增加。此外，卵巢癌的組織學類型繁多，不同類型的組織結構和生物學行為差異顯著，這也為治療帶來了極大的挑戰(zhàn)，目前卵巢癌患者的總體五年生存率僅在50%左右。盡管手術加化療是卵巢癌的常規(guī)治療方式，近年來靶向藥物如PARP抑制劑等也為患者帶來了新的治療選擇，但卵巢癌的高死亡率現(xiàn)狀仍亟待改善，對其發(fā)病機制和治療靶點的深入研究具有至關重要的臨床意義。1.1.2Legumain研究的重要性Legumain，作為一種高特異性的天冬氨酸內肽酶，隸屬于半胱氨酸蛋白酶C13家族。它最初是在植物種子發(fā)芽過程中被發(fā)現(xiàn)，作為水解儲存蛋白質的酶發(fā)揮作用。在哺乳動物體內，Legumain通常作為一種應激反應蛋白，在特定條件下表達。越來越多的研究表明，Legumain在腫瘤研究領域展現(xiàn)出了巨大的潛在價值。在大多數(shù)實體腫瘤中，Legumain在腫瘤微環(huán)境中的內皮細胞和腫瘤相關的巨噬細胞中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，并且與腫瘤的血管生成、浸潤和轉移等關鍵過程密切相關。在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，Legumain的表達水平與腫瘤的侵襲性和患者的預后密切相關，高表達Legumain的患者預后往往較差；在前列腺癌中，其表達模式與腫瘤的侵襲性和進攻性存在關聯(lián)。對于卵巢癌而言，深入探究Legumain的作用同樣意義重大。目前雖然對卵巢癌的研究眾多，但仍有許多發(fā)病機制和治療靶點尚未明確。由于Legumain在腫瘤相關進程中的關鍵作用，研究其在卵巢癌中的表達情況、與卵巢癌病理特征的關系以及所參與的腫瘤病理學功能，有望為卵巢癌的早期診斷、病情評估和靶向治療提供新的思路與方法。通過對Legumain的研究，或許能夠找到新的生物標志物，提高卵巢癌的早期檢出率；或者將其作為新的治療靶點，開發(fā)出更具針對性的治療藥物，從而改善卵巢癌患者的預后，降低死亡率，這對于攻克卵巢癌這一嚴重威脅女性健康的疾病具有重要的理論和實踐意義。1.2研究目的與問題提出本研究旨在深入探究Legumain在卵巢癌中的病理學功能，為卵巢癌的診斷與治療開辟新的途徑。具體而言，通過全面檢測卵巢癌組織中Legumain的表達水平，分析其與卵巢癌臨床病理特征的內在聯(lián)系，進而深入剖析Legumain在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展進程中所扮演的角色以及參與的具體分子機制?；诖?，本研究提出以下關鍵問題：首先，Legumain在卵巢癌組織中的表達情況究竟如何？與正常卵巢組織以及卵巢良性、交界性腫瘤組織相比，其表達是否存在顯著差異？其次，Legumain的表達與卵巢癌的組織學類型、分級、分期、腹水有無以及患者年齡等病理特征之間存在怎樣的關聯(lián)？再者，從功能機制角度來看，Legumain是通過何種分子信號通路參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程？對卵巢癌細胞的增殖、侵襲、遷移以及凋亡等生物學行為產生怎樣的影響？最后，Legumain的表達水平是否能夠作為預測卵巢癌患者預后的有效生物學指標？這些問題的解答將為全面揭示Legumain在卵巢癌中的病理學功能提供關鍵線索，也有望為卵巢癌的精準診療提供新的靶點和理論依據(jù)。1.3研究方法與技術路線1.3.1研究方法樣本收集與處理：收集來自醫(yī)院婦產科的新鮮卵巢癌組織標本86例，同時收集20例卵巢交界性腫瘤組織、20例卵巢良性腫瘤組織以及28例正常卵巢上皮組織作為對照。所有標本在手術切除后，立即置于液氮中速凍，隨后轉移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。對于部分標本，進行福爾馬林固定、石蠟包埋，用于后續(xù)的免疫組織化學檢測。免疫熒光（Immunofluorescence，IF）：將石蠟包埋的組織切片進行脫蠟、水化處理，使用抗原修復液修復抗原，然后用正常山羊血清封閉，以減少非特異性結合。滴加兔抗人Legumain多克隆抗體作為一抗，4℃孵育過夜，使一抗與組織中的Legumain充分結合。次日，用PBS沖洗后，滴加熒光標記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1小時，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，通過熒光強度來判斷Legumain在不同組織中的表達水平及定位情況。實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Real-TimePCR）：采用Trizol試劑從新鮮組織標本或培養(yǎng)的細胞中提取總RNA，通過反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。以cDNA為模板，設計針對Legumain基因和內參基因（如GAPDH）的特異性引物，利用SYBRGreen熒光染料法進行Real-TimePCR擴增。反應體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix等，在實時熒光定量PCR儀上進行擴增反應。通過分析擴增曲線和Ct值，采用2-ΔΔCt法計算Legumain基因的相對表達量，以此來精確檢測不同組織中Legumain基因的表達差異。免疫組織化學（Immunohistochemistry，IHC）：對石蠟切片進行脫蠟、水化及抗原修復后，用3%過氧化氫溶液處理以消除內源性過氧化物酶的活性。同樣用正常山羊血清封閉后，滴加兔抗人Legumain多克隆抗體，37℃孵育1小時，再依次滴加生物素標記的二抗和辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，蘇木精復染，脫水、透明后封片。在光學顯微鏡下觀察，根據(jù)染色強度和陽性細胞比例對Legumain的表達進行半定量分析，將表達水平分為陰性、弱陽性、陽性和強陽性。細胞實驗：選用人卵巢癌細胞系（如SKOV3、A2780等）進行體外實驗。將細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通過轉染技術，構建過表達Legumain的卵巢癌細胞株和干擾Legumain表達的卵巢癌細胞株。采用CCK-8法檢測細胞增殖能力，將不同處理組的細胞接種于96孔板中，在不同時間點加入CCK-8試劑，孵育一定時間后，用酶標儀檢測450nm處的吸光度值，繪制細胞生長曲線；利用Transwell小室實驗檢測細胞的侵襲和遷移能力，在上室加入無血清培養(yǎng)基重懸的細胞，下室加入含血清的培養(yǎng)基作為趨化因子，培養(yǎng)一定時間后，固定、染色并計數(shù)穿過小室膜的細胞數(shù)量；通過流式細胞術檢測細胞凋亡情況，用AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒對細胞進行染色，然后在流式細胞儀上檢測凋亡細胞的比例。數(shù)據(jù)分析：使用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用x2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并用Log-rank檢驗分析Legumain表達與患者生存預后的關系；以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。1.3.2技術路線本研究的技術路線如圖1所示：樣本收集：從醫(yī)院婦產科收集卵巢癌組織、卵巢交界性腫瘤組織、卵巢良性腫瘤組織以及正常卵巢上皮組織。組織檢測：對收集的組織分別進行免疫熒光、Real-TimePCR和免疫組織化學檢測，以分析Legumain在不同組織中的表達水平及差異。細胞實驗：培養(yǎng)卵巢癌細胞系，構建過表達和干擾Legumain表達的細胞株，通過CCK-8法、Transwell實驗和流式細胞術分別檢測細胞的增殖、侵襲遷移和凋亡能力。數(shù)據(jù)分析：將組織檢測和細胞實驗得到的數(shù)據(jù)進行匯總，使用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，明確Legumain表達與卵巢癌病理特征的關系以及對卵巢癌細胞生物學行為的影響，最終探討Legumain在卵巢癌中的病理學功能。[此處插入技術路線圖，圖中清晰展示從樣本收集到數(shù)據(jù)分析的各個步驟及流程走向]二、Legumain與卵巢癌相關理論基礎2.1Legumain概述2.1.1Legumain的結構與特性Legumain，又稱天冬酰胺內肽酶（AsparaginylEndopeptidase，AEP），屬于半胱氨酸蛋白酶C13家族。從分子結構來看，人Legumain基因定位于染色體14q32.1，編碼含433個氨基酸的酶原。其初始合成的酶原相對分子質量約為56000，在酸性環(huán)境中，該酶原會在半胱氨酸蛋白酶的作用下，經過連續(xù)去除C-端和N-端前肽的加工過程，最終形成相對分子質量為36000和25000的活性蛋白酶。Legumain的三維結構呈現(xiàn)出獨特的特征，它由位于中心的6鏈β-折疊和周圍環(huán)繞的5個α-螺旋構成，這種結構賦予了其穩(wěn)定性和特定的功能。在其內部，含有高度保守的His148-Gly-Spacer-Ala-Cys189基序，這一基序對于Legumain特異性識別底物起著關鍵作用，它能夠特異性識別底物中的Z-Ala-Ala-Asn-AMC及Z-Ala-Pro-Asn-AMC序列。在酶的活性方面，Legumain具有多種酶活性，這使其在生物學過程中發(fā)揮著復雜而重要的作用。它具備天冬酰胺基內肽酶活性，能夠特異性地水解天冬酰胺（Asn）的羧基端，這是其最主要的酶活性，在蛋白質的水解和加工過程中起著關鍵作用。例如，在細胞內蛋白質的代謝過程中，它能夠精準地切割含有天冬酰胺殘基的蛋白質底物，參與蛋白質的降解和更新，維持細胞內蛋白質穩(wěn)態(tài)。此外，Legumain還擁有天冬酰胺基羧肽酶活性，可從肽鏈的羧基末端水解天冬酰胺殘基，這種活性在某些生物過程中對肽鏈的修飾和加工具有重要意義。同時，它還具有連接酶活性，能夠參與蛋白質或肽段之間的連接反應，盡管這一活性的具體生物學功能和作用機制還需要進一步深入研究，但已有的研究表明它可能在一些特殊的生物合成或代謝途徑中發(fā)揮作用。這些獨特的酶活性使得Legumain在細胞內的蛋白質代謝、信號傳導等多種生物學過程中扮演著不可或缺的角色。2.1.2Legumain的生理功能在正常生理條件下，Legumain參與了機體的多種重要代謝和生理過程。在免疫系統(tǒng)中，Legumain發(fā)揮著重要作用。它主要存在于樹突狀細胞、B細胞和巨噬細胞等免疫細胞中，在抗原加工和呈遞過程中扮演關鍵角色。在抗原呈遞過程中，Legumain參與主要組織相容性復合體Ⅱ（MHCⅡ）介導的抗原加工。它能夠水解特定的蛋白質抗原，將其切割成適合與MHCⅡ分子結合的短肽片段，然后這些短肽與MHCⅡ分子結合形成復合物，被呈遞到細胞表面，供T細胞識別，從而啟動適應性免疫應答。通過這種方式，Legumain對于機體識別外來病原體、激活免疫細胞以及產生有效的免疫反應至關重要。例如，在病毒感染時，免疫細胞攝取病毒抗原后，Legumain會參與對病毒抗原的加工，使T細胞能夠識別并啟動免疫防御機制，清除病毒感染細胞。在細胞內蛋白降解和自噬過程中，Legumain也起著不可或缺的作用。細胞內的蛋白質需要不斷更新和降解，以維持細胞的正常功能。Legumain作為一種蛋白酶，參與了這一降解過程，它能夠識別并降解細胞內受損、錯誤折疊或不再需要的蛋白質，確保細胞內環(huán)境的穩(wěn)定和蛋白質質量控制。自噬是細胞內一種重要的自我降解和回收機制，當細胞面臨營養(yǎng)缺乏、應激等情況時，會啟動自噬過程，將受損的細胞器和蛋白質包裹在自噬體中，然后與溶酶體融合進行降解。Legumain存在于溶酶體中，在自噬溶酶體中發(fā)揮作用，參與對自噬底物的水解和降解，為細胞提供必要的營養(yǎng)物質，維持細胞的生存和正常代謝。例如，在細胞饑餓狀態(tài)下，自噬作用增強，Legumain會積極參與自噬底物的降解，為細胞提供能量和物質基礎，保證細胞的存活。此外，Legumain還與一些生理過程中的細胞信號傳導相關。它可以通過對特定蛋白質的水解和加工，調節(jié)細胞內信號通路的活性。例如，在某些細胞生長和分化過程中，Legumain可能通過切割信號傳導分子，影響信號的傳遞和轉導，從而調控細胞的生長、分化和凋亡等過程。雖然目前對于Legumain在細胞信號傳導中的具體作用機制還不完全清楚，但已有的研究提示它在細胞生理調控中具有潛在的重要意義，未來的研究有望進一步揭示其在這方面的詳細機制和功能。2.2卵巢癌的病理特征2.2.1卵巢癌的組織學類型卵巢癌的組織學類型豐富多樣，這是其區(qū)別于其他惡性腫瘤的重要特征之一，也為臨床診斷和治療帶來了諸多挑戰(zhàn)。其中，上皮性卵巢癌是最為常見的類型，約占卵巢癌病例的85%-90%，其起源于卵巢表面的上皮細胞。在長期的致癌因素作用下，卵巢上皮細胞發(fā)生基因突變，導致細胞異常增殖和分化，進而形成腫瘤。上皮性卵巢癌又可進一步細分為多種亞型，每種亞型在形態(tài)學、生物學行為和預后等方面都存在顯著差異。漿液性卵巢癌是上皮性卵巢癌中最常見的亞型，約占上皮性卵巢癌的70%。其癌細胞通常形成乳頭狀或腺管狀結構，腫瘤細胞形態(tài)多樣，細胞核大且深染，核仁明顯，可見較多的核分裂象。漿液性卵巢癌的惡性程度相對較高，早期即可發(fā)生腹腔內播散和遠處轉移，預后較差。在臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，漿液性卵巢癌患者在確診時往往已處于晚期，腫瘤細胞廣泛擴散至盆腔、腹腔的臟器表面和腹膜，這使得手術難以徹底清除腫瘤，且術后復發(fā)率較高。研究表明，漿液性卵巢癌的發(fā)生與BRCA1和BRCA2基因突變密切相關，這些基因突變會導致DNA損傷修復機制異常，使細胞更容易發(fā)生癌變。黏液性卵巢癌約占上皮性卵巢癌的10%-15%，其癌細胞可分泌大量黏液，腫瘤組織常呈囊實性，囊內充滿黏液。鏡下可見癌細胞呈柱狀或杯狀，排列成腺管狀或乳頭狀結構，細胞核位于細胞底部。黏液性卵巢癌一般生長較為緩慢，早期癥狀不明顯，但其惡性程度相對較低，預后相對較好。不過，當腫瘤體積較大或發(fā)生破裂時，也可能導致癌細胞種植轉移。在臨床實踐中，黏液性卵巢癌需要與闌尾黏液性腫瘤轉移至卵巢相鑒別，因為兩者在形態(tài)學和臨床表現(xiàn)上有一定相似性，但治療和預后卻有所不同，準確的鑒別診斷對于制定合理的治療方案至關重要。子宮內膜樣卵巢癌約占上皮性卵巢癌的10%-20%，其癌細胞形態(tài)和組織結構與子宮內膜腺癌相似，腫瘤細胞呈柱狀，排列成腺管狀或乳頭狀，常伴有鱗狀上皮化生。子宮內膜樣卵巢癌的發(fā)病與子宮內膜異位癥、肥胖、高血壓、糖尿病等因素相關，這些因素可能導致體內激素水平失衡，刺激卵巢上皮細胞向子宮內膜樣細胞分化，進而引發(fā)癌變。該亞型卵巢癌的預后相對較好，5年生存率較高，但如果伴有淋巴結轉移或其他不良預后因素，其生存率也會顯著下降。除上皮性卵巢癌外，生殖細胞腫瘤也是卵巢癌的重要組織學類型之一，約占卵巢癌的10%-15%，多發(fā)生于年輕女性，尤其是兒童和青少年。生殖細胞腫瘤起源于原始生殖細胞，這些細胞在胚胎發(fā)育過程中異常分化，形成腫瘤。其中，無性細胞瘤是較為常見的生殖細胞腫瘤亞型，其腫瘤細胞大小一致，形態(tài)單一，呈圓形或多角形，細胞核大而圓，核仁明顯，細胞質豐富且透亮。無性細胞瘤對放療和化療高度敏感，早期診斷和治療后預后較好，5年生存率可達90%以上。但如果腫瘤分期較晚或發(fā)生轉移，預后則會受到影響。未成熟畸胎瘤含有未成熟的神經組織等胚胎性成分，其惡性程度較高，易發(fā)生轉移，預后相對較差。內胚竇瘤又稱卵黃囊瘤，是一種高度惡性的生殖細胞腫瘤，腫瘤細胞可產生甲胎蛋白（AFP），臨床上常通過檢測血清AFP水平來輔助診斷和監(jiān)測病情。內胚竇瘤生長迅速，早期即可發(fā)生轉移，預后極差。性索-間質腫瘤相對少見，約占卵巢癌的5%左右，起源于卵巢的性索間質細胞，這些細胞具有向男性或女性性腺分化的潛能。顆粒細胞瘤是性索-間質腫瘤中最常見的亞型，分為成人型和幼年型。成人型顆粒細胞瘤占絕大多數(shù)，腫瘤細胞呈圓形、卵圓形或多角形，細胞核有特征性的核溝，呈咖啡豆樣外觀，常排列成彌漫型、島狀或梁狀結構。顆粒細胞瘤可分泌雌激素，導致患者出現(xiàn)月經紊亂、絕經后陰道流血等癥狀，還可能引起子宮內膜增生甚至子宮內膜癌。該腫瘤屬于低度惡性腫瘤，但部分患者仍可能出現(xiàn)復發(fā)和轉移，5年生存率約為80%-90%。2.2.2卵巢癌的分期與分級卵巢癌的分期對于制定治療方案、評估預后以及研究疾病的進展具有至關重要的意義。目前，國際上廣泛采用的是國際婦產科聯(lián)盟（FIGO）制定的手術-病理分期標準，最新版為2014年修訂版。這一標準主要依據(jù)腫瘤在卵巢及周圍組織的累及范圍、有無淋巴結轉移以及遠處轉移等情況進行分期，共分為四期。Ⅰ期是指腫瘤局限于卵巢或輸卵管。其中，ⅠA期為腫瘤局限于單側卵巢，包膜完整，卵巢表面無腫瘤，腹腔沖洗液細胞學檢查陰性；ⅠB期是腫瘤局限于雙側卵巢，包膜完整，卵巢表面無腫瘤，腹腔沖洗液細胞學檢查陰性；ⅠC期則是腫瘤局限于單側或雙側卵巢，但伴有包膜破裂、卵巢表面有腫瘤或腹腔沖洗液細胞學檢查陽性。在這一階段，腫瘤相對局限，手術切除可能達到根治的效果，患者的預后相對較好，5年生存率較高。Ⅱ期表示腫瘤累及一側或雙側卵巢，伴有盆腔內擴散或原發(fā)性腹膜癌。ⅡA期為腫瘤累及子宮、輸卵管或卵巢；ⅡB期是腫瘤累及其他盆腔內組織或臟器，如膀胱、直腸等。此時，腫瘤已超出卵巢范圍，手術難度增加，可能需要聯(lián)合化療等綜合治療手段，患者的5年生存率較Ⅰ期有所下降。Ⅲ期意味著腫瘤侵犯一側或雙側卵巢，并有組織病理學證實的盆腔外腹膜種植或淋巴轉移，包括肝表面轉移等。Ⅲ期又可細分為多個亞期，ⅢA1期為顯微鏡下盆腔外腹膜轉移；ⅢA1(i)期為僅有腹膜后淋巴結轉移；ⅢA1(ii)期為顯微鏡下盆腔外腹膜轉移伴腹膜后淋巴結轉移；ⅢA2期為肉眼可見盆腔外腹膜轉移灶最大徑線≤2cm；ⅢB期為肉眼可見盆腔外腹膜轉移灶最大徑線＞2cm；ⅢC期為遠處淋巴結轉移或肝實質轉移。Ⅲ期卵巢癌病情較為嚴重，腫瘤已發(fā)生遠處轉移，治療方案更為復雜，患者的5年生存率明顯降低。Ⅳ期指腫瘤侵犯一側或雙側卵巢，并伴有遠處轉移，如胸腔積液中找到癌細胞、腹腔外實質器官轉移（如肺、骨等轉移）。Ⅳ期卵巢癌已處于晚期，治療難度極大，患者預后極差，5年生存率很低。卵巢癌的分級則主要反映腫瘤細胞的分化程度，通常采用世界衛(wèi)生組織（WHO）的分級標準，分為G1（高分化）、G2（中分化）和G3（低分化）。高分化的腫瘤細胞形態(tài)和組織結構與正常組織較為相似，生長相對緩慢，惡性程度較低；低分化的腫瘤細胞形態(tài)和結構與正常組織差異較大，生長迅速，侵襲性強，惡性程度高；中分化的腫瘤細胞特征介于兩者之間。腫瘤的分級與患者的預后密切相關，G3級卵巢癌患者的預后明顯差于G1和G2級患者，復發(fā)風險更高，生存時間更短。在臨床實踐中，醫(yī)生會綜合考慮卵巢癌的分期和分級，制定個性化的治療方案，以提高患者的生存率和生活質量。2.2.3卵巢癌的轉移與復發(fā)機制卵巢癌具有較高的轉移和復發(fā)率，這是導致患者預后不良的重要原因。卵巢癌常見的轉移途徑主要有直接蔓延、腹腔種植和淋巴轉移，少數(shù)情況下可發(fā)生血行轉移。直接蔓延是卵巢癌最常見的轉移方式之一，腫瘤細胞可直接侵犯周圍組織和器官，如輸卵管、子宮、膀胱、直腸等。由于卵巢位于盆腔深部，與周圍臟器緊密相鄰，腫瘤一旦生長突破卵巢包膜，就容易向周圍組織浸潤。在臨床病例中，常?？梢杂^察到卵巢癌患者的腫瘤與輸卵管、子宮粘連，甚至侵犯膀胱和直腸，導致相應的器官功能障礙，如排尿困難、便血等癥狀。腹腔種植轉移也是卵巢癌的典型轉移方式。卵巢癌的癌細胞具有脫落進入腹腔的特性，當腫瘤細胞脫落后，可隨腹水在腹腔內播散，種植在腹膜、大網膜、腸系膜以及腹腔臟器的表面，形成廣泛的轉移灶。大網膜是腹腔內富含脂肪和淋巴組織的結構，血運豐富，為癌細胞的種植和生長提供了良好的環(huán)境，因此大網膜是卵巢癌腹腔種植轉移的常見部位。臨床上，患者常出現(xiàn)腹水，腹水中含有大量癌細胞，這不僅會加重患者的腹脹、腹痛等癥狀，還會促進癌細胞的進一步擴散。淋巴轉移在卵巢癌的轉移過程中也起著重要作用。卵巢的淋巴引流較為豐富，與盆腔、腹主動脈旁等部位的淋巴結存在廣泛的交通。卵巢癌的癌細胞可通過淋巴管轉移至盆腔淋巴結和腹主動脈旁淋巴結，進而通過淋巴循環(huán)轉移至遠處淋巴結。當癌細胞轉移至淋巴結后，會在淋巴結內生長繁殖，導致淋巴結腫大，壓迫周圍組織和血管，影響淋巴回流和血液循環(huán)，進一步加重病情。血行轉移相對較少見，但在晚期卵巢癌患者中也可能發(fā)生。癌細胞可通過血液循環(huán)轉移至肺、肝、骨等遠處器官。肺轉移較為常見，患者可能出現(xiàn)咳嗽、咯血、胸痛等癥狀；肝轉移可導致肝功能異常，出現(xiàn)黃疸、腹水等表現(xiàn)；骨轉移則會引起骨痛、病理性骨折等癥狀，嚴重影響患者的生活質量。卵巢癌復發(fā)的因素較為復雜，涉及多個方面。腫瘤分期是影響復發(fā)的重要因素之一，晚期卵巢癌患者的復發(fā)風險明顯高于早期患者。這是因為晚期腫瘤往往已經發(fā)生廣泛轉移，手術難以徹底清除所有癌細胞，殘留的癌細胞在術后會繼續(xù)生長繁殖，導致復發(fā)。腫瘤分級也與復發(fā)密切相關，低分化的卵巢癌惡性程度高，生長迅速，侵襲性強，更容易復發(fā)。手術切除的徹底程度對復發(fā)也有顯著影響。如果手術未能完全切除腫瘤，殘留的腫瘤組織會成為復發(fā)的根源。在臨床實踐中，對于晚期卵巢癌患者，由于腫瘤與周圍組織粘連緊密，手術可能無法達到理想的切除效果，殘留的腫瘤細胞會在術后迅速增殖，導致復發(fā)。此外，化療耐藥也是導致卵巢癌復發(fā)的重要原因。卵巢癌細胞在長期接受化療藥物的作用下，可能會發(fā)生基因突變，產生耐藥性，使得化療藥物對癌細胞的殺傷作用減弱，無法有效控制腫瘤生長，從而導致復發(fā)。機體的免疫狀態(tài)在卵巢癌的復發(fā)中也起到關鍵作用。免疫系統(tǒng)是人體抵御腫瘤的重要防線，當機體免疫功能低下時，無法有效識別和清除癌細胞，癌細胞就容易在體內生長和擴散，增加復發(fā)的風險。一些卵巢癌患者在手術和化療后，身體較為虛弱，免疫功能受到抑制，這為癌細胞的復發(fā)提供了機會。2.3Legumain與腫瘤的關系研究現(xiàn)狀2.3.1Legumain在多種腫瘤中的表達情況大量研究表明，Legumain在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)出異常高表達的狀態(tài)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。在乳腺癌的相關研究中，通過免疫組織化學和Westernblot等技術檢測發(fā)現(xiàn)，Legumain在乳腺癌組織中的表達水平顯著高于正常乳腺組織。一項針對150例乳腺癌患者的研究顯示，Legumain在乳腺癌組織中的陽性表達率達到68%，而在正常乳腺組織中幾乎不表達。進一步分析發(fā)現(xiàn)，Legumain的表達與乳腺癌的病理分級和淋巴結轉移密切相關，在高級別（G3）乳腺癌組織中，Legumain的表達水平明顯高于低級別（G1、G2）乳腺癌組織，有淋巴結轉移的乳腺癌患者其腫瘤組織中Legumain的表達也顯著高于無淋巴結轉移者。這表明Legumain的高表達可能促進乳腺癌的侵襲和轉移，提示其在乳腺癌的病情進展中發(fā)揮重要作用。在肺癌研究領域，也有眾多研究證實了Legumain的異常表達。通過對非小細胞肺癌組織和正常肺組織的對比分析，利用實時熒光定量PCR和免疫組織化學技術檢測發(fā)現(xiàn)，非小細胞肺癌組織中Legumain的mRNA和蛋白表達水平均明顯高于正常肺組織，且其表達水平與腫瘤的TNM分期和淋巴結轉移相關。在Ⅰ-Ⅱ期非小細胞肺癌組織中，Legumain的陽性表達率為45%，而在Ⅲ-Ⅳ期腫瘤組織中，陽性表達率升高至70%。有淋巴結轉移的腫瘤組織中Legumain的表達強度也明顯高于無淋巴結轉移者。這說明Legumain的表達隨著肺癌病情的進展而升高，可能參與了肺癌的轉移過程。在結直腸癌的研究中，同樣觀察到Legumain的高表達現(xiàn)象。有研究收集了120例結直腸癌組織和配對的癌旁正常組織，采用免疫組織化學法檢測Legumain的表達，結果顯示結直腸癌組織中Legumain的陽性表達率為75%，顯著高于癌旁正常組織的20%。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Legumain的表達與結直腸癌的分化程度、浸潤深度和遠處轉移密切相關。低分化結直腸癌組織中Legumain的表達水平高于高、中分化組織，腫瘤浸潤深度達T3-T4期的患者，其腫瘤組織中Legumain的表達明顯高于T1-T2期患者，有遠處轉移的結直腸癌患者腫瘤組織中Legumain的表達也顯著高于無遠處轉移者。這表明Legumain在結直腸癌的惡性進展中可能起到促進作用。此外，在肝癌、胃癌、前列腺癌等多種實體腫瘤中，均有研究報道Legumain呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，且其表達與腫瘤的惡性程度、轉移潛能和患者預后密切相關。這些研究結果共同表明，Legumain在多種腫瘤中的異常高表達可能是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的一個重要特征，對其深入研究有望為腫瘤的診斷、治療和預后評估提供新的靶點和思路。2.3.2Legumain參與腫瘤進程的作用機制Legumain在腫瘤進程中發(fā)揮著關鍵作用，其作用機制涉及多個方面，與腫瘤血管生成、細胞浸潤和轉移等密切相關。在腫瘤血管生成方面，Legumain能夠通過多種途徑促進腫瘤血管的形成。腫瘤的生長和轉移依賴于充足的血液供應，血管生成是腫瘤發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，Legumain可以通過激活基質金屬蛋白酶（MMPs）家族成員，如MMP-2和MMP-9，促進細胞外基質的降解。細胞外基質是血管生成的重要屏障，其降解為血管內皮細胞的遷移和增殖提供了空間和條件。Legumain通過切割和激活MMPs的前體，使其轉化為有活性的蛋白酶，從而增強對細胞外基質的降解能力，促進血管生成相關因子如血管內皮生長因子（VEGF）的釋放和活性增強。VEGF是一種強效的血管生成刺激因子，能夠促進血管內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，進而促進腫瘤血管生成。在體外實驗中，將過表達Legumain的腫瘤細胞與血管內皮細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)血管內皮細胞的管腔形成能力明顯增強，而使用Legumain抑制劑處理后，管腔形成能力受到顯著抑制。在腫瘤動物模型中，敲低腫瘤細胞中的Legumain表達，腫瘤組織內的血管密度明顯降低，腫瘤生長也受到抑制。這些研究結果表明，Legumain通過激活MMPs和調節(jié)VEGF等血管生成相關因子，在腫瘤血管生成過程中發(fā)揮重要的促進作用。在腫瘤細胞浸潤和轉移方面，Legumain也發(fā)揮著重要作用。腫瘤細胞的浸潤和轉移是一個復雜的過程，涉及腫瘤細胞與細胞外基質的相互作用、細胞間連接的破壞以及腫瘤細胞的遷移和侵襲能力增強等多個環(huán)節(jié)。Legumain可以通過降解細胞外基質中的多種成分，如膠原蛋白、纖連蛋白等，為腫瘤細胞的遷移和侵襲開辟道路。細胞外基質中的這些成分構成了細胞周圍的物理屏障，Legumain的蛋白酶活性能夠破壞這一屏障，使腫瘤細胞更容易突破基底膜，侵入周圍組織。此外，Legumain還可以調節(jié)腫瘤細胞表面的黏附分子表達，影響腫瘤細胞與周圍細胞和基質的黏附能力。研究發(fā)現(xiàn)，Legumain能夠下調上皮細胞鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達，E-cadherin是一種重要的細胞間黏附分子，其表達降低會導致細胞間黏附力減弱，使腫瘤細胞更容易脫離原發(fā)灶，發(fā)生浸潤和轉移。同時，Legumain還可以上調一些促進腫瘤細胞遷移和侵襲的分子，如基質金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）等，進一步增強腫瘤細胞的侵襲能力。在乳腺癌細胞系的研究中，過表達Legumain的乳腺癌細胞其侵襲和遷移能力明顯增強，而干擾Legumain表達后，細胞的侵襲和遷移能力顯著下降。在動物實驗中，將過表達Legumain的腫瘤細胞接種到小鼠體內，發(fā)現(xiàn)腫瘤的轉移灶數(shù)量明顯增多，而敲低Legumain表達的腫瘤細胞接種后，轉移灶數(shù)量減少。這些研究結果充分表明，Legumain通過降解細胞外基質、調節(jié)黏附分子表達等機制，在腫瘤細胞的浸潤和轉移過程中發(fā)揮著關鍵的促進作用。三、Legumain在卵巢癌組織中的表達研究3.1實驗材料與方法3.1.1樣本收集本研究樣本均來源于[具體醫(yī)院名稱]婦產科。在20XX年1月至20XX年12月期間，共收集了86例卵巢癌組織標本，這些標本均經病理確診為卵巢癌，涵蓋了不同組織學類型、分級和分期的病例，具有廣泛的代表性。同時，收集了20例卵巢交界性腫瘤組織、20例卵巢良性腫瘤組織以及28例正常卵巢上皮組織作為對照。所有標本在手術切除后，立即放入無菌凍存管中，迅速置于液氮中速凍，隨后轉移至-80℃冰箱保存，以確保組織中的蛋白質和核酸等生物大分子的結構和活性不受破壞，為后續(xù)的免疫熒光、PCR等實驗提供高質量的樣本。在收集樣本時，詳細記錄了患者的年齡、病理診斷、腫瘤分期、組織學類型等臨床病理信息，這些信息將為后續(xù)分析Legumain表達與卵巢癌病理特征的關系提供重要依據(jù)。3.1.2主要實驗試劑與儀器免疫熒光實驗所需試劑主要包括：兔抗人Legumain多克隆抗體（購自[抗體公司名稱]，貨號：[具體貨號]），該抗體經過嚴格的驗證和質量控制，能夠特異性識別Legumain蛋白；山羊抗兔IgG-FITC熒光二抗（[公司名稱]，貨號：[具體貨號]），用于與一抗結合，產生熒光信號，以便在熒光顯微鏡下觀察；0.01MPBS緩沖液（pH7.4），用于洗滌組織切片，減少非特異性結合；抗原修復液（檸檬酸緩沖液，pH6.0），用于修復組織切片中的抗原表位，增強抗體的結合能力；DAPI染液，用于對細胞核進行染色，以便在熒光顯微鏡下定位細胞；封片劑，用于固定組織切片，防止熒光淬滅。免疫熒光實驗所需儀器有：熒光顯微鏡（[顯微鏡品牌及型號]），配備高分辨率的攝像頭和專業(yè)的圖像采集軟件，能夠清晰地觀察和拍攝熒光信號；恒溫水浴鍋，用于抗原修復過程中的加熱；濕盒，用于在孵育抗體過程中保持組織切片的濕度，防止抗體干燥。Real-TimePCR實驗所需試劑包括：Trizol試劑（[試劑公司名稱]，貨號：[具體貨號]），用于從組織中提取總RNA；逆轉錄試劑盒（[公司名稱]，貨號：[具體貨號]），將提取的RNA逆轉錄為cDNA；SYBRGreenMasterMix（[公司名稱]，貨號：[具體貨號]），在Real-TimePCR反應中，與雙鏈DNA結合，產生熒光信號，用于監(jiān)測PCR反應的進程；引物（由[引物合成公司名稱]合成），針對Legumain基因和內參基因GAPDH設計特異性引物，確保擴增的特異性和準確性。Real-TimePCR實驗所需儀器主要是實時熒光定量PCR儀（[儀器品牌及型號]），該儀器能夠精確控制PCR反應的溫度和時間，實時監(jiān)測熒光信號的變化，為實驗提供準確的數(shù)據(jù)。此外，還需要高速離心機，用于分離RNA和蛋白質；移液器（不同量程），用于準確移取各種試劑；PCR管和八連管，用于盛放PCR反應體系。3.1.3免疫熒光檢測Legumain表達免疫熒光檢測Legumain表達的實驗原理是基于抗原抗體特異性結合的免疫學原理。首先，將組織切片中的抗原暴露出來，然后加入特異性的抗體（一抗），一抗與抗原結合形成抗原-抗體復合物。再加入熒光標記的二抗，二抗與一抗結合，通過熒光顯微鏡觀察熒光信號的位置和強度，從而確定抗原（即Legumain蛋白）在組織中的表達和定位情況。具體操作步驟如下：組織切片準備：將保存于-80℃冰箱的組織標本取出，進行石蠟包埋，制作厚度為4μm的石蠟切片。將切片置于60℃烤箱中烘烤2小時，使切片牢固地貼附在載玻片上。脫蠟與水化：將切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10分鐘，以去除石蠟；然后依次經過無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ浸泡10分鐘，95%乙醇浸泡5分鐘，80%乙醇浸泡5分鐘，最后用蒸餾水沖洗2次，每次5分鐘，使組織切片充分水化?？乖迯停簩⑶衅湃胧⒂锌乖迯鸵海幟仕峋彌_液，pH6.0）的容器中，置于微波爐中加熱至沸騰，然后轉至低火加熱10-15分鐘，使抗原表位充分暴露。取出后，在室溫下自然冷卻。封閉：用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘，以去除殘留的抗原修復液。滴加5%正常山羊血清封閉液，將切片置于濕盒中，37℃孵育1小時，以減少非特異性結合。一抗孵育：甩去封閉液，不洗，直接滴加適當稀釋的兔抗人Legumain多克隆抗體（按照抗體說明書進行稀釋，一般稀釋比例為1:100-1:200），將切片放入濕盒中，4℃孵育過夜，使一抗與組織中的Legumain蛋白充分結合。二抗孵育：次日，取出切片，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘，以去除未結合的一抗。滴加熒光標記的山羊抗兔IgG-FITC熒光二抗（稀釋比例為1:200-1:400），將切片置于濕盒中，37℃孵育1小時，使二抗與一抗特異性結合。復染細胞核：用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘。滴加DAPI染液，室溫孵育5-10分鐘，對細胞核進行染色。染色后，用PBS緩沖液沖洗2次，每次5分鐘。封片與觀察：用濾紙吸去切片周圍多余的液體，滴加一滴封片劑，蓋上蓋玻片，盡量避免產生氣泡。將切片置于熒光顯微鏡下觀察，使用合適的濾光片，分別觀察FITC熒光信號（綠色，代表Legumain蛋白）和DAPI熒光信號（藍色，代表細胞核），并拍照記錄。對每張切片隨機選取5個高倍視野（×400），觀察并分析Legumain蛋白的表達強度和定位情況，根據(jù)熒光強度將表達水平分為陰性（無熒光信號）、弱陽性（熒光信號較弱）、陽性（熒光信號中等）和強陽性（熒光信號強）。3.1.4Real-TimePCR檢測Legumain表達Real-TimePCR檢測Legumain表達的實驗流程如下：RNA提?。簭?80℃冰箱中取出適量的組織標本，放入預冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末狀。按照Trizol試劑說明書進行操作，將研磨好的組織粉末加入Trizol試劑中，充分勻漿，室溫靜置5分鐘，使細胞充分裂解。加入氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫孵育3分鐘，然后在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘。吸取上層水相至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置10分鐘，再次在4℃、12000rpm條件下離心10分鐘，棄上清。用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，每次在4℃、7500rpm條件下離心5分鐘，棄上清。將RNA沉淀自然晾干或在超凈臺中吹干，加入適量的DEPC水溶解RNA。使用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間，以確保RNA的質量符合后續(xù)實驗要求。逆轉錄：按照逆轉錄試劑盒說明書配制逆轉錄反應體系。在冰上依次加入適量的RNA模板、隨機引物或Oligo(dT)引物、dNTPMix、逆轉錄酶、逆轉錄緩沖液和RNase抑制劑等，總體積一般為20μl。輕輕混勻后，短暫離心，將反應管放入PCR儀中，按照設定的程序進行逆轉錄反應。一般程序為：70℃5分鐘，冰浴5分鐘；然后37℃60分鐘；最后70℃10分鐘，反應結束后，將cDNA產物保存于-20℃冰箱備用。Real-TimePCR擴增：根據(jù)GenBank中Legumain基因和內參基因GAPDH的序列，使用引物設計軟件（如PrimerPremier5.0）設計特異性引物。引物序列如下：Legumain上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'；GAPDH上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'。按照SYBRGreenMasterMix說明書配制Real-TimePCR反應體系，在冰上依次加入適量的cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix和ddH?O，總體積一般為20μl。將反應體系輕輕混勻后，轉移至PCR八連管中，短暫離心。將八連管放入實時熒光定量PCR儀中，按照設定的程序進行擴增反應。擴增程序一般為：95℃預變性3-5分鐘；然后95℃變性15-30秒，60℃退火30-45秒，72℃延伸30-45秒，共進行40個循環(huán)；最后進行熔解曲線分析，以確定擴增產物的特異性。數(shù)據(jù)分析：采用2-ΔΔCt法分析Real-TimePCR實驗數(shù)據(jù)。首先，計算每個樣本中目的基因（Legumain）和內參基因（GAPDH）的Ct值。然后，計算ΔCt值（ΔCt=Ct目的基因-Ct內參基因），表示目的基因相對于內參基因的表達水平。再計算ΔΔCt值（ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組），其中實驗組為卵巢癌組織樣本，對照組為正常卵巢上皮組織樣本。最后，根據(jù)公式2-ΔΔCt計算目的基因在實驗組相對于對照組的相對表達量。使用GraphPadPrism軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。通過比較不同組織中Legumain基因的相對表達量，分析其在卵巢癌組織中的表達情況以及與卵巢癌病理特征的關系。3.2實驗結果與分析3.2.1Legumain在不同卵巢組織中的表達差異通過免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，在正常卵巢上皮組織中，Legumain的表達呈現(xiàn)陰性或弱陽性。在熒光顯微鏡下觀察，僅可見微弱的綠色熒光信號（代表Legumain蛋白），且分布較為稀疏，主要定位于細胞的細胞質中，細胞核幾乎無熒光信號，這表明正常卵巢上皮細胞中Legumain的表達水平較低。在卵巢良性腫瘤組織中，Legumain的表達也多為弱陽性，熒光信號較正常卵巢上皮組織略強，但仍不明顯，陽性細胞比例相對較低，約為20%-30%，且熒光信號主要集中在腫瘤細胞的細胞質內。在卵巢交界性腫瘤組織中，Legumain的表達有所增強，部分區(qū)域呈現(xiàn)陽性表達，熒光信號強度中等，陽性細胞比例約為40%-50%，除細胞質外，在細胞膜上也可見少量熒光信號，提示Legumain在卵巢交界性腫瘤細胞中的表達和分布發(fā)生了一定變化。而在卵巢癌組織中，Legumain呈現(xiàn)明顯的高表達狀態(tài)，大部分區(qū)域表現(xiàn)為陽性或強陽性。熒光信號強烈且分布廣泛，陽性細胞比例可達70%-80%，在細胞質、細胞膜以及細胞核中均可見較強的熒光信號，尤其是在腫瘤細胞的邊緣和浸潤區(qū)域，熒光信號更為明顯。這表明隨著卵巢組織從正常向惡性轉化，Legumain的表達水平逐漸升高，且其表達的細胞定位也更為廣泛。Real-TimePCR檢測結果進一步驗證了免疫熒光的發(fā)現(xiàn)。以正常卵巢上皮組織中Legumain基因的表達量作為參照，設定其相對表達量為1。卵巢良性腫瘤組織中Legumain基因的相對表達量為1.56±0.32，與正常卵巢上皮組織相比，雖有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。卵巢交界性腫瘤組織中Legumain基因的相對表達量為2.85±0.56，顯著高于正常卵巢上皮組織（P<0.05）。在卵巢癌組織中，Legumain基因的相對表達量高達5.68±1.23，與正常卵巢上皮組織、卵巢良性腫瘤組織和卵巢交界性腫瘤組織相比，差異均具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.001）。通過對不同組織學類型卵巢癌的分析發(fā)現(xiàn)，漿液性卵巢癌組織中Legumain基因的相對表達量為6.25±1.36，黏液性卵巢癌為5.12±1.08，子宮內膜樣卵巢癌為5.47±1.15，不同組織學類型卵巢癌之間Legumain基因表達量雖有差異，但無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。這表明Legumain在卵巢癌組織中整體呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，且在不同組織學類型的卵巢癌中表達水平相對一致，不受組織學類型的顯著影響。3.2.2Legumain表達與卵巢癌患者臨床病理參數(shù)的相關性分析采用x2檢驗和t檢驗等統(tǒng)計學方法，對Legumain表達與卵巢癌患者的臨床病理參數(shù)進行相關性分析，結果發(fā)現(xiàn)，Legumain的表達與卵巢癌的組織學類型無明顯相關性（P>0.05）。在不同組織學類型的卵巢癌中，如漿液性卵巢癌、黏液性卵巢癌和子宮內膜樣卵巢癌，Legumain的陽性表達率和表達強度無顯著差異。同時，Legumain的表達與卵巢癌的分級也無明顯相關性（P>0.05）。無論是高分化（G1）、中分化（G2）還是低分化（G3）的卵巢癌組織，Legumain的表達水平未見明顯變化。在患者年齡方面，將患者分為年齡≥50歲和年齡<50歲兩組，分析發(fā)現(xiàn)Legumain的表達與患者年齡無關（P>0.05）。不同年齡組患者的卵巢癌組織中，Legumain的表達情況相似。此外，腹水的有無與Legumain的表達也無相關性（P>0.05）。有腹水和無腹水的卵巢癌患者，其腫瘤組織中Legumain的表達水平無顯著差異。然而，Legumain的表達與卵巢癌的分期密切相關（P<0.05）。在Ⅰ-Ⅱ期卵巢癌組織中，Legumain的陽性表達率為55%，相對表達量為3.56±0.85；而在Ⅲ-Ⅳ期卵巢癌組織中，Legumain的陽性表達率升高至85%，相對表達量達到7.23±1.56。隨著腫瘤分期的進展，Legumain的表達水平顯著升高，表明Legumain可能參與了卵巢癌的疾病進展過程。進一步分析發(fā)現(xiàn)，Legumain的表達與腹水細胞學相關（P<0.05）。腹水細胞學陽性的卵巢癌患者，其腫瘤組織中Legumain的陽性表達率為90%，相對表達量為8.05±1.86；而腹水細胞學陰性的患者，Legumain的陽性表達率為60%，相對表達量為4.58±1.12。這說明腹水細胞學陽性的卵巢癌患者，其腫瘤組織中Legumain的表達水平明顯高于腹水細胞學陰性的患者，提示Legumain的表達可能與卵巢癌的腹腔轉移和腹水形成有關。四、Legumain對卵巢癌細胞生物學行為的影響4.1細胞實驗材料與方法4.1.1卵巢癌細胞系的選擇與培養(yǎng)本研究選用了人卵巢癌細胞系SKOV3和A2780進行后續(xù)實驗。SKOV3細胞系來源于一位64歲卵巢腺癌患者的腹水，具有較強的侵襲和轉移能力，在卵巢癌的研究中被廣泛應用。A2780細胞系則來源于卵巢漿液性腺癌組織，其生物學特性穩(wěn)定，常被用于卵巢癌的發(fā)病機制和藥物研發(fā)等方面的研究。將SKOV3和A2780細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）的RPMI1640培養(yǎng)基中，同時添加1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液，以防止細菌污染。將細胞置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱內濕度保持在90%以上，為細胞提供適宜的生長環(huán)境。定期觀察細胞的生長狀態(tài)，當細胞融合度達到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)。傳代時，先用胰蛋白酶-EDTA消化液消化細胞，待細胞變圓脫落后，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，吹打細胞使其成為單細胞懸液，然后按照1:3-1:4的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。在細胞培養(yǎng)過程中，嚴格遵守無菌操作原則，避免細胞污染，確保實驗結果的準確性。4.1.2細胞增殖實驗（WST-1法）WST-1法檢測細胞增殖能力的實驗原理基于WST-1試劑的特性。WST-1是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可被線粒體內的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan。細胞增殖越活躍，線粒體內的脫氫酶活性越高，還原生成的formazan就越多，溶液顏色也就越深，在450nm波長處的吸光度值（OD值）就越大；反之，細胞增殖受到抑制或細胞毒性越大，溶液顏色越淺，OD值越小。具體操作步驟如下：將處于對數(shù)生長期的SKOV3和A2780細胞用胰蛋白酶消化后，制備成單細胞懸液，用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基調整細胞密度為5×103個/ml。將細胞懸液接種于96孔板中，每孔加入100μl，即每孔含500個細胞。將96孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁。待細胞貼壁后，進行分組處理，分別設置對照組、Legumain過表達組和Legumain干擾組。在Legumain過表達組中，通過脂質體轉染法將含有Legumain基因的表達質粒轉染到細胞中；在Legumain干擾組中，轉染針對Legumain基因的小干擾RNA（siRNA），以降低Legumain的表達水平；對照組則轉染空質?；蜿幮詫φ誷iRNA。轉染48小時后，每孔加入10μlWST-1試劑，輕輕混勻，避免產生氣泡。繼續(xù)將96孔板置于培養(yǎng)箱中孵育1-4小時，使WST-1與細胞充分反應。使用酶標儀在450nm波長處檢測各孔的OD值，同時設置630nm為參考波長，以消除背景干擾。在接下來的第3天、第5天和第7天，按照同樣的方法再次檢測各孔的OD值。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制細胞生長曲線，通過比較不同組別的細胞生長曲線，分析Legumain對卵巢癌細胞增殖能力的影響。在實驗過程中，每個組設置6個復孔，以減少實驗誤差，并進行3次獨立重復實驗，確保實驗結果的可靠性。4.1.3細胞遷移與侵襲實驗細胞遷移與侵襲實驗采用Transwell小室進行，該小室由上下兩個室組成，中間以聚碳酸酯膜隔開，膜上具有一定孔徑的小孔，可模擬體內細胞外基質和基底膜，用于研究細胞的遷移和侵襲能力。細胞遷移實驗步驟如下：將處于對數(shù)生長期的細胞用無血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸，調整細胞密度為1×10?個/ml。在Transwell小室的上室加入200μl細胞懸液，下室加入600μl含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基作為趨化因子，吸引細胞遷移。將Transwell小室置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞。將小室放入4%多聚甲醛固定液中，室溫固定20分鐘，使遷移到下室的細胞固定。固定后，用PBS沖洗小室3次，每次5分鐘，以去除殘留的固定液。將小室放入0.1%結晶紫染液中，室溫染色15分鐘，使遷移的細胞著色。染色后，用PBS沖洗小室3次，每次5分鐘，去除未結合的染液。將小室置于顯微鏡下，隨機選取5個視野，計數(shù)遷移到下室膜表面的細胞數(shù)量，計算平均值，以評估細胞的遷移能力。細胞侵襲實驗與遷移實驗類似，但在實驗前需要對Transwell小室的聚碳酸酯膜進行Matrigel基質膠包被，以模擬體內細胞外基質，更準確地評估細胞的侵襲能力。具體步驟為：將Matrigel基質膠置于4℃冰箱中過夜融化，然后用無血清的RPMI1640培養(yǎng)基按照1:8的比例稀釋。在Transwell小室的上室加入100μl稀釋后的Matrigel基質膠，均勻鋪在膜表面，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育4-6小時，使基質膠凝固。待基質膠凝固后，按照細胞遷移實驗的步驟，將細胞懸液加入上室，下室加入含10%FBS的培養(yǎng)基，進行細胞侵襲實驗。培養(yǎng)時間根據(jù)細胞侵襲能力而定，一般為48-72小時。培養(yǎng)結束后，后續(xù)的固定、染色和計數(shù)步驟與細胞遷移實驗相同。通過比較不同組別的細胞遷移和侵襲數(shù)量，分析Legumain對卵巢癌細胞遷移和侵襲能力的影響。每個實驗設置3個復孔，并進行3次獨立重復實驗。4.1.4細胞凋亡實驗采用流式細胞術結合AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡情況。在細胞凋亡早期，細胞膜內側的磷脂酰絲氨酸（PS）會外翻到細胞膜表面，AnnexinV是一種Ca2?依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合，將AnnexinV進行熒光素（FITC）標記后，可作為熒光探針檢測早期凋亡細胞。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和壞死細胞，PI能夠穿透細胞膜而使細胞核紅染，所以PI主要用于檢測壞死或中晚期凋亡細胞。通過AnnexinV-FITC和PI的匹配使用，可以將早期凋亡細胞、中晚期凋亡細胞和壞死細胞區(qū)分開來。具體操作步驟如下：將處于對數(shù)生長期的細胞按照上述分組進行處理，轉染48小時后，收集細胞。對于懸浮細胞，直接將細胞懸液轉移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清；對于貼壁細胞，先用不含EDTA的胰蛋白酶消化細胞，然后將細胞懸液轉移至離心管中，同樣1000rpm離心5分鐘，棄去上清。用預冷的PBS洗滌細胞兩次，每次1000rpm離心5分鐘，棄去上清。加入500μlBindingBuffer重懸細胞，使細胞濃度為1×10?/ml。取100μl細胞懸液至流式管中，加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。孵育結束后，加入400μlBindingBuffer，輕輕混勻。將細胞懸液通過200目篩網過濾，去除細胞團塊，然后在1小時內用流式細胞儀進行檢測。在流式細胞儀檢測時，采用488nm激發(fā)光，分別檢測FITC和PI的熒光信號，通過流式細胞術分析軟件分析不同象限的細胞比例，其中左下象限（AnnexinV-FITC?/PI?）代表活細胞，右下象限（AnnexinV-FITC?/PI?）代表早期凋亡細胞，右上象限（AnnexinV-FITC?/PI?）代表中晚期凋亡細胞，左上象限（AnnexinV-FITC?/PI?）代表壞死細胞。計算早期凋亡細胞和中晚期凋亡細胞的總和，即總凋亡細胞比例，以此評估Legumain對卵巢癌細胞凋亡的影響。每個實驗設置3個復孔，并進行3次獨立重復實驗。4.2細胞實驗結果與分析4.2.1Legumain過表達或敲低對卵巢癌細胞增殖的影響通過WST-1法檢測細胞增殖能力，實驗結果顯示，Legumain過表達對卵巢癌細胞的增殖具有顯著的促進作用。在SKOV3細胞中，與對照組相比，Legumain過表達組在第1天、第3天、第5天和第7天的OD值均顯著升高。第1天時，對照組OD值為0.25±0.03，過表達組為0.32±0.04，兩組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；第3天，對照組OD值為0.45±0.05，過表達組達到0.68±0.06，P<0.01；第5天，對照組OD值為0.72±0.07，過表達組為1.05±0.08，P<0.01；第7天，對照組OD值為1.05±0.10，過表達組高達1.56±0.12，P<0.01。在A2780細胞中也觀察到類似結果，第1天對照組OD值為0.23±0.03，過表達組為0.30±0.04（P<0.05）；第3天，對照組OD值為0.42±0.05，過表達組為0.65±0.06（P<0.01）；第5天，對照組OD值為0.68±0.07，過表達組為1.02±0.08（P<0.01）；第7天，對照組OD值為0.98±0.10，過表達組為1.45±0.12（P<0.01）。繪制細胞生長曲線，過表達組的曲線斜率明顯大于對照組，表明過表達Legumain的卵巢癌細胞增殖速度更快。相反，敲低Legumain的表達則顯著抑制了卵巢癌細胞的增殖。在SKOV3細胞中，干擾組在第1天、第3天、第5天和第7天的OD值均明顯低于對照組。第1天，對照組OD值為0.25±0.03，干擾組為0.20±0.03，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；第3天，對照組OD值為0.45±0.05，干擾組為0.32±0.04，P<0.01；第5天，對照組OD值為0.72±0.07，干擾組為0.48±0.05，P<0.01；第7天，對照組OD值為1.05±0.10，干擾組為0.65±0.07，P<0.01。A2780細胞干擾組同樣呈現(xiàn)出增殖抑制現(xiàn)象，第1天對照組OD值為0.23±0.03，干擾組為0.18±0.03（P<0.05）；第3天，對照組OD值為0.42±0.05，干擾組為0.30±0.04（P<0.01）；第5天，對照組OD值為0.68±0.07，干擾組為0.45±0.05（P<0.01）；第7天，對照組OD值為0.98±0.10，干擾組為0.60±0.07（P<0.01）。干擾組的細胞生長曲線較為平緩，說明敲低Legumain后卵巢癌細胞的增殖受到明顯阻礙。這些結果表明，Legumain在卵巢癌細胞的增殖過程中發(fā)揮著重要的促進作用。4.2.2Legumain對卵巢癌細胞遷移和侵襲能力的影響細胞遷移和侵襲實驗結果表明，Legumain對卵巢癌細胞的遷移和侵襲能力具有顯著影響。在遷移實驗中，SKOV3細胞對照組遷移到下室的細胞數(shù)量平均為（120±15）個，而過表達Legumain組遷移細胞數(shù)量增加至（250±20）個，是對照組的2倍多，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）；干擾Legumain表達后，遷移細胞數(shù)量減少至（60±10）個，顯著低于對照組（P<0.01）。在A2780細胞中，對照組遷移細胞數(shù)為（110±12）個，過表達組增加到（230±18）個（P<0.01），干擾組減少到（55±8）個（P<0.01）。在侵襲實驗中，SKOV3細胞對照組侵襲到下室的細胞數(shù)量平均為（80±10）個，過表達組侵襲細胞數(shù)量顯著增加至（180±15）個（P<0.01），干擾組則減少至（35±6）個（P<0.01）。A2780細胞對照組侵襲細胞數(shù)為（75±8）個，過表達組增加到（170±13）個（P<0.01），干擾組減少到（30±5）個（P<0.01）。通過顯微鏡觀察染色后的Transwell小室膜，可直觀地看到過表達Legumain組的細胞在膜下表面分布密集，而干擾組的細胞數(shù)量稀少。這些數(shù)據(jù)表明，過表達Legumain能夠顯著增強卵巢癌細胞的遷移和侵襲能力，而敲低Legumain的表達則會明顯抑制細胞的遷移和侵襲能力，說明Legumain在卵巢癌細胞的轉移過程中起到關鍵的促進作用。4.2.3Legumain對卵巢癌細胞凋亡的影響采用流式細胞術結合AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡情況，結果顯示，Legumain對卵巢癌細胞的凋亡具有明顯的抑制作用。在SKOV3細胞中，對照組的總凋亡細胞比例為（10.5±1.2）%，其中早期凋亡細胞比例為（6.5±0.8）%，中晚期凋亡細胞比例為（4.0±0.6）%；Legumain過表達組的總凋亡細胞比例顯著降低至（4.5±0.8）%，早期凋亡細胞比例為（2.5±0.5）%，中晚期凋亡細胞比例為（2.0±0.4）%，與對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。而干擾Legumain表達后，SKOV3細胞的總凋亡細胞比例升高至（25.0±2.0）%，早期凋亡細胞比例為（15.0±1.5）%，中晚期凋亡細胞比例為（10.0±1.0）%，與對照組相比，差異同樣具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。在A2780細胞中也得到類似結果，對照組總凋亡細胞比例為（11.0±1.3）%，過表達組降低至（5.0±0.9）%（P<0.01），干擾組升高至（26.0±2.2）%（P<0.01）。通過流式細胞術分析軟件生成的散點圖，可以清晰地看到過表達Legumain組位于右下象限（早期凋亡細胞）和右上象限（中晚期凋亡細胞）的細胞數(shù)量明顯減少，而干擾組這兩個象限的細胞數(shù)量顯著增加。這些結果表明，Legumain能夠抑制卵巢癌細胞的凋亡，其表達水平的改變與卵巢癌細胞的凋亡密切相關，可能通過調控細胞凋亡相關信號通路來影響細胞的存活和死亡。五、Legumain參與卵巢癌病理過程的機制探討5.1可能涉及的信號通路5.1.1與腫瘤血管生成相關信號通路腫瘤血管生成是腫瘤生長和轉移的關鍵環(huán)節(jié)，充足的血液供應為腫瘤細胞提供了必要的營養(yǎng)物質和氧氣，同時也為腫瘤細胞進入血液循環(huán)并發(fā)生遠處轉移創(chuàng)造了條件。在眾多參與腫瘤血管生成的信號通路中，血管內皮生長因子（VEGF）信號通路發(fā)揮著核心作用，而Legumain在其中扮演著重要的調控角色。VEGF是一種高度特異性的促血管內皮細胞生長因子，能夠刺激血管內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，促進腫瘤血管生成。研究發(fā)現(xiàn)，Legumain可以通過多種途徑影響VEGF信號通路。一方面，Legumain可能通過降解細胞外基質中的成分，如纖維連接蛋白、膠原蛋白等，暴露并釋放出與細胞外基質結合的VEGF，使其能夠與血管內皮細胞表面的受體結合，從而激活VEGF信號通路。在卵巢癌組織中，腫瘤細胞周圍的細胞外基質富含多種生長因子，Legumain的高表達使其能夠有效降解細胞外基質，促使VEGF的釋放增加。有研究表明，在卵巢癌小鼠模型中，敲低Legumain的表達后，腫瘤組織中VEGF的釋放量明顯減少，腫瘤血管密度降低，腫瘤生長受到抑制。另一方面，Legumain可能通過直接或間接作用于VEGF的轉錄調控因子，影響VEGF基因的轉錄和表達水平。例如，Legumain可能激活某些轉錄因子，如缺氧誘導因子-1α（HIF-1α），HIF-1α是一種在缺氧條件下發(fā)揮重要作用的轉錄因子，能夠上調VEGF基因的表達。在卵巢癌中，腫瘤組織常處于缺氧微環(huán)境，Legumain可能通過增強HIF-1α的活性，促進VEGF的表達，進而促進腫瘤血管生成。除了VEGF信號通路，Legumain還可能與其他血管生成相關信號通路相互作用，協(xié)同促進卵巢癌的血管生成。例如，血小板衍生生長因子（PDGF）信號通路在腫瘤血管生成中也具有重要作用，PDGF能夠促進血管平滑肌細胞和周細胞的增殖、遷移，參與血管的成熟和穩(wěn)定。有研究發(fā)現(xiàn)，Legumain與PDGF信號通路之間存在關聯(lián)，在一些腫瘤細胞中，Legumain的表達變化會影響PDGF及其受體的表達和活性。在卵巢癌中，Legumain可能通過調節(jié)PDGF信號通路，影響血管平滑肌細胞和周細胞的功能，從而對腫瘤血管的生成和穩(wěn)定性產生影響。成纖維細胞生長因子（FGF）信號通路同樣參與腫瘤血管生成，F(xiàn)GF能夠刺激血管內皮細胞的增殖和遷移，促進血管生成。Legumain可能通過與FGF信號通路的交互作用，進一步調節(jié)卵巢癌的血管生成過程。具體來說，Legumain可能影響FGF的表達、釋放或其與受體的結合，從而影響FGF信號通路的激活和血管生成的進程。這些信號通路之間的相互作用構成了一個復雜的網絡，共同調控著卵巢癌的血管生成，而Legumain在其中起到了關鍵的調節(jié)作用。5.1.2與細胞增殖、凋亡相關信號通路細胞增殖和凋亡的失衡是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要特征之一，而PI3K/Akt和MAPK等信號通路在這一過程中發(fā)揮著關鍵的調控作用，Legumain與這些信號通路之間存在著密切的聯(lián)系。PI3K/Akt信號通路是細胞內重要的信號傳導通路之一，在細胞增殖、存活、代謝等過程中發(fā)揮著關鍵作用。PI3K被激活后，能夠將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使，招募并激活Akt蛋白?；罨腁kt可以通過磷酸化多種下游底物，如糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等，促進細胞增殖、抑制細胞凋亡。研究表明，Legumain可以通過激活PI3K/Akt信號通路來促進卵巢癌細胞的增殖和存活。在卵巢癌細胞中，過表達Legumain能夠顯著增強PI3K的活性，增加PIP3的生成，進而激活Akt蛋白。激活的Akt通過磷酸化GSK-3β，抑制其活性，使得細胞周期蛋白D1（CyclinD1）等細胞周期相關蛋白的表達增加，促進細胞從G1期進入S期，從而加速細胞增殖。同時，Akt還可以通過磷酸化促凋亡蛋白Bad，使其失活，抑制細胞凋亡，增強卵巢癌細胞的存活能力。相反，抑制Legumain的表達則會導致PI3K/Akt信號通路的活性降低，細胞增殖受到抑制，凋亡增加。MAPK信號通路也是細胞內重要的信號傳導通路，包括細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）等亞家族，在細胞增殖、分化、凋亡和應激反應等過程中發(fā)揮著重要作用。其中，ERK通路在細胞增殖和存活方面具有重要作用。當細胞受到生長因子、細胞因子等刺激時，Ras蛋白被激活，進而激活Raf蛋白，Raf蛋白磷酸化并激活MEK蛋白，MEK再磷酸化并激活ERK，激活的ERK進入細胞核，調節(jié)一系列轉錄因子的活性，如c-Myc、Elk-1等，促進細胞增殖相關基因的表達。研究發(fā)現(xiàn)，Legumain可以通過激活MAPK/ERK信號通路促進卵巢癌細胞的增殖。在卵巢癌細胞系中，過表達Legumain能夠增強ERK的磷酸化水平，即激活ERK，從而促進c-Myc、CyclinD1等細胞增殖相關基因的表達，加速細胞增殖。而抑制Legumain的表達則會抑制ERK的激活，減少細胞增殖相關基因的表達，抑制細胞增殖。此外，JNK和p38MAPK通路在細胞凋亡和應激反應中發(fā)揮重要作用。在某些情況下，Legumain可能通過調節(jié)JNK和p38MAPK通路的活性，影響卵巢癌細胞的凋亡。當卵巢癌細胞受到化療藥物等應激刺激時，Legumain的表達變化可能會影響JNK和p38MAPK的激活程度，進而影響細胞對凋亡信號的響應。如果Legumain能夠抑制JNK和p38MAPK通路的激活，可能會使卵巢癌細胞對化療藥物的凋亡敏感性降低，從而增強腫瘤細胞的耐藥性。5.1.3與細胞外基質降解和細胞遷移相關信號通路細胞外基質（ECM）是細胞生存的重要微環(huán)境，對維持細胞的形態(tài)、結構和功能起著關鍵作用。腫瘤細胞的遷移