南蛇藤提取物：肝癌治療新曙光——抑制血管生成與增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞功能的雙重機(jī)制探索一、引言1.1研究背景肝癌作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均居高不下，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。在中國(guó)，由于乙肝病毒感染率較高等因素，肝癌的發(fā)病形勢(shì)更為嚴(yán)峻，每年新增病例數(shù)眾多，且多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，治療效果和預(yù)后較差。肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過(guò)程，涉及多種基因和信號(hào)通路的異常改變。其危害不僅在于腫瘤細(xì)胞對(duì)肝臟組織的直接破壞，導(dǎo)致肝功能受損，引發(fā)黃疸、腹水、肝性腦病等嚴(yán)重并發(fā)癥，還在于肝癌具有高度的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，容易侵犯周圍組織和遠(yuǎn)處器官，進(jìn)一步危及患者生命。血管生成在肝癌的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，并清除代謝廢物。肝癌組織中存在多種血管生成相關(guān)因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）等，它們通過(guò)激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，從而誘導(dǎo)腫瘤血管生成。腫瘤血管的異常結(jié)構(gòu)和功能不僅為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供了有利條件，還使得腫瘤細(xì)胞更容易逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，增加了治療的難度。目前，臨床獲批的肝癌一線治療藥物，如索拉非尼和侖伐替尼等，主要通過(guò)抑制血管生成來(lái)發(fā)揮作用，但這些藥物的療效有限，且容易產(chǎn)生耐藥性，因此，尋找新的血管生成干預(yù)靶點(diǎn)和治療策略具有重要的臨床意義。樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）是體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專職抗原呈遞細(xì)胞，在啟動(dòng)和調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。DC能夠攝取、加工和呈遞腫瘤抗原，激活初始T細(xì)胞，使其分化為效應(yīng)T細(xì)胞，進(jìn)而介導(dǎo)特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)。在肝癌患者中，DC的功能往往受到抑制，表現(xiàn)為數(shù)量減少、成熟障礙和抗原呈遞能力下降等，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)肝癌細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷作用減弱。研究表明，肝癌微環(huán)境中的多種因素，如腫瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子、免疫抑制細(xì)胞的浸潤(rùn)等，均可影響DC的功能。因此，通過(guò)增強(qiáng)DC的功能，有望打破機(jī)體的免疫耐受，激發(fā)有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)，為肝癌的治療提供新的思路和方法。南蛇藤（CelastrusorbiculatusThunb.）系衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物，在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中被廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，南蛇藤提取物含有多種化學(xué)成分，如倍半萜、三萜及黃酮類化合物等，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等多種藥理活性。已有研究表明，南蛇藤提取物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，但其作用機(jī)制尚未完全明確。本研究旨在探討南蛇藤提取物對(duì)肝癌血管生成及樹(shù)突狀細(xì)胞功能的影響，為開(kāi)發(fā)新的肝癌治療藥物和策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究南蛇藤提取物對(duì)肝癌血管生成及樹(shù)突狀細(xì)胞功能的影響，明確其作用靶點(diǎn)和分子機(jī)制，具體研究目的如下：其一，觀察南蛇藤提取物對(duì)肝癌細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成等生物學(xué)行為的影響，明確其對(duì)肝癌血管生成的抑制作用；其二，探討南蛇藤提取物對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟、抗原呈遞能力及細(xì)胞因子分泌的影響，闡明其增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞功能的作用機(jī)制；其三，通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證南蛇藤提取物對(duì)肝癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制作用，以及對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)的增強(qiáng)作用；其四，分析南蛇藤提取物作用的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)和信號(hào)通路，為開(kāi)發(fā)新的肝癌治療藥物和策略提供理論依據(jù)。肝癌嚴(yán)重威脅人類健康，當(dāng)前治療手段存在諸多局限性。研究南蛇藤提取物，從抑制血管生成和增強(qiáng)免疫細(xì)胞功能角度，為肝癌治療開(kāi)辟新思路，有助于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)和策略，為患者帶來(lái)新希望。南蛇藤提取物成分多樣、作用廣泛，研究其作用機(jī)制，不僅為肝癌治療提供依據(jù)，也為其他腫瘤研究提供參考，推動(dòng)天然藥物在腫瘤治療領(lǐng)域的發(fā)展。對(duì)南蛇藤提取物深入研究，有助于挖掘其潛在藥用價(jià)值，為開(kāi)發(fā)新型抗癌藥物奠定基礎(chǔ)，促進(jìn)創(chuàng)新藥物研發(fā)，豐富治療手段。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.3.1南蛇藤提取物的研究進(jìn)展南蛇藤在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中應(yīng)用歷史悠久，被用于治療多種疾病，如風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、跌打損傷等。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)南蛇藤提取物的研究逐漸深入。在化學(xué)成分方面，研究已鑒定出南蛇藤提取物中含有多種活性成分。其中，倍半萜類化合物如南蛇藤素、南蛇藤醇等，具有顯著的生物活性。三萜類化合物包括齊墩果酸、熊果酸等，不僅具有抗炎、抗氧化作用，還在抗腫瘤研究中展現(xiàn)出潛在價(jià)值。黃酮類化合物如槲皮素、山奈酚等，也賦予南蛇藤提取物多種藥理活性。在藥理活性研究上，南蛇藤提取物的抗腫瘤作用備受關(guān)注。有研究表明，其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系，如肺癌A549細(xì)胞、乳腺癌MCF-7細(xì)胞等具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，南蛇藤提取物可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，如p21、p53等，使腫瘤細(xì)胞阻滯在G0/G1期或G2/M期，抑制其增殖；還能激活線粒體凋亡途徑，上調(diào)促凋亡蛋白Bax，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。此外，南蛇藤提取物還具有抗炎作用，能夠抑制炎癥細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）的釋放，減輕炎癥反應(yīng)。在抗氧化方面，其可提高超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶的活性，降低丙二醛（MDA）含量，清除體內(nèi)自由基，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。1.3.2肝癌血管生成的研究現(xiàn)狀肝癌作為一種高度血管化的腫瘤，血管生成對(duì)其生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移起著關(guān)鍵作用。腫瘤血管生成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多種細(xì)胞和分子機(jī)制。腫瘤細(xì)胞可分泌多種血管生成因子，如VEGF、PDGF、FGF等，其中VEGF是目前研究最為深入的血管生成促進(jìn)因子。VEGF與其受體VEGFR結(jié)合后，激活下游的磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成。PDGF則主要通過(guò)刺激周細(xì)胞的募集和增殖，參與腫瘤血管的成熟和穩(wěn)定。FGF能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂和遷移，增強(qiáng)血管生成。腫瘤血管的異常結(jié)構(gòu)和功能也是研究熱點(diǎn)。腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞間隙較大，基底膜不完整，導(dǎo)致血管通透性增加，這不僅有利于腫瘤細(xì)胞獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，還便于腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。腫瘤血管的血流分布不均，存在血流緩慢和停滯的區(qū)域，使得化療藥物難以均勻分布到腫瘤組織，降低了化療效果。針對(duì)肝癌血管生成的治療策略，目前臨床上應(yīng)用的抗血管生成藥物，如索拉非尼和侖伐替尼，雖能在一定程度上抑制腫瘤血管生成，延長(zhǎng)患者生存期，但療效有限，且容易出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。因此，尋找新的血管生成抑制靶點(diǎn)和藥物，以及探索聯(lián)合治療方案，是當(dāng)前肝癌治療研究的重要方向。1.3.3樹(shù)突狀細(xì)胞的研究現(xiàn)狀樹(shù)突狀細(xì)胞在機(jī)體免疫應(yīng)答中處于核心地位，尤其是在抗腫瘤免疫方面。DC起源于骨髓造血干細(xì)胞，可分為髓系DC和漿細(xì)胞樣DC。髓系DC主要參與啟動(dòng)細(xì)胞免疫應(yīng)答，識(shí)別和攝取腫瘤抗原后，遷移至淋巴結(jié)，將抗原呈遞給T細(xì)胞，激活T細(xì)胞的免疫活性；漿細(xì)胞樣DC則主要分泌干擾素，參與抗病毒免疫和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。在肝癌免疫治療中，DC疫苗是研究的重點(diǎn)之一。DC疫苗通過(guò)體外培養(yǎng)和負(fù)載腫瘤抗原，回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，增強(qiáng)DC的抗原呈遞能力，激活T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)。多項(xiàng)臨床研究表明，DC疫苗在肝癌治療中具有一定的安全性和有效性，可提高患者的生存率和生活質(zhì)量，但也存在一些問(wèn)題，如DC的成熟度和抗原呈遞效率有待提高，腫瘤微環(huán)境對(duì)DC功能的抑制作用等。腫瘤微環(huán)境中的多種因素會(huì)影響DC的功能。肝癌細(xì)胞分泌的免疫抑制因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、IL-10等，可抑制DC的成熟和功能；腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等免疫抑制細(xì)胞的浸潤(rùn)，也會(huì)干擾DC與T細(xì)胞之間的相互作用，削弱抗腫瘤免疫反應(yīng)。因此，如何克服腫瘤微環(huán)境對(duì)DC功能的抑制，增強(qiáng)DC介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)，是肝癌免疫治療亟待解決的問(wèn)題。二、南蛇藤提取物抑制肝癌血管生成的體外研究2.1實(shí)驗(yàn)材料與方法2.1.1實(shí)驗(yàn)材料南蛇藤采自[具體產(chǎn)地]，經(jīng)專業(yè)人員鑒定為衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物南蛇藤（CelastrusorbiculatusThunb.）。取南蛇藤的根或藤莖，洗凈晾干后粉碎。采用乙醇提取法，將南蛇藤粉末與體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇按1:8的比例混合，加熱回流提取2次，每次1小時(shí)，合并提取液，減壓濃縮，冷凍干燥，得到南蛇藤提取物干粉，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。人肝癌?xì)胞株HepG2、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期換液傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。主要實(shí)驗(yàn)試劑包括MTT試劑、二甲基亞砜（DMSO）、胰蛋白酶、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗溶液、AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）ELISA試劑盒、兔抗人VEGF多克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG、BCA蛋白定量試劑盒、PVDF膜、ECL化學(xué)發(fā)光試劑、TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGreenPCRMasterMix等，均購(gòu)自知名試劑公司。實(shí)驗(yàn)儀器有CO?培養(yǎng)箱（ThermoScientific）、超凈工作臺(tái)（蘇州凈化）、倒置顯微鏡（Olympus）、酶標(biāo)儀（Bio-Tek）、流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur）、高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf）、恒溫?fù)u床（上海智城）、PCR儀（Bio-Rad）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）、蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)（Bio-Rad）等。2.1.2實(shí)驗(yàn)方法采用MTT法檢測(cè)南蛇藤提取物對(duì)HepG2細(xì)胞和HUVEC增殖的影響。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?/mL，接種于96孔板，每孔100μL。待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度（0、10、20、40、80、160μg/mL）的南蛇藤提取物，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組（只加培養(yǎng)基）和陰性對(duì)照組（加等體積DMSO）。繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），37℃孵育4h，棄上清，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min使結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值（OD值），計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。將HepG2細(xì)胞和HUVEC分別接種于6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，加入不同濃度的南蛇藤提取物（0、20、40、80μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育15min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；或加入細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒中的PI染色液，4℃避光孵育30min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。收集加入不同濃度南蛇藤提取物（0、20、40、80μg/mL）培養(yǎng)24h后的HepG2細(xì)胞和HUVEC的培養(yǎng)上清，按照VEGFELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)上清中VEGF的含量。同時(shí)，收集細(xì)胞，用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，進(jìn)行SDS電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入兔抗人VEGF多克隆抗體（1:1000稀釋）和鼠抗人β-actin單克隆抗體（1:5000稀釋），4℃孵育過(guò)夜，次日加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG（1:5000稀釋），室溫孵育1h，ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照分析，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算VEGF蛋白的相對(duì)表達(dá)量。將HepG2細(xì)胞和HUVEC接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的南蛇藤提取物（0、20、40、80μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)24h。PBS洗滌后，4%多聚甲醛固定15min，0.3%TritonX-100透化10min，5%BSA封閉30min，加入兔抗人VEGF多克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過(guò)夜，次日加入熒光標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:200稀釋），室溫孵育1h，DAPI染核5min，熒光顯微鏡下觀察并拍照，分析VEGF蛋白的表達(dá)和定位。收集加入不同濃度南蛇藤提取物（0、20、40、80μg/mL）培養(yǎng)24h后的HepG2細(xì)胞和HUVEC，用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，用SYBRGreenPCRMasterMix進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，引物序列根據(jù)GenBank中VEGF基因序列設(shè)計(jì)，以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計(jì)算VEGFmRNA的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。將HUVEC以1×10?/孔的密度接種于鋪有Matrigel基質(zhì)膠的24孔板中，每孔加入不同濃度的南蛇藤提取物（0、20、40、80μg/mL），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組（只加培養(yǎng)基）。37℃孵育6h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞管腔形成情況，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)管腔形成的節(jié)點(diǎn)數(shù)和分支數(shù)，分析南蛇藤提取物對(duì)HUVEC管腔形成能力的影響。采用Transwell小室檢測(cè)南蛇藤提取物對(duì)HUVEC遷移能力的影響。上室加入無(wú)血清培養(yǎng)基重懸的HUVEC（5×10?個(gè)/孔），下室加入含10%FBS的培養(yǎng)基及不同濃度的南蛇藤提取物（0、20、40、80μg/mL），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組（下室只加含10%FBS的培養(yǎng)基）。37℃孵育24h后，取出小室，擦去上室未遷移的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15min，0.1%結(jié)晶紫染色15min，在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)，分析南蛇藤提取物對(duì)HUVEC遷移能力的影響。將HepG2細(xì)胞接種于鼠尾膠原包被的35mm玻璃培養(yǎng)皿中，加入不同濃度的南蛇藤提取物（0、20、40、80μg/mL），培養(yǎng)7天，期間每天更換培養(yǎng)液。用4%多聚甲醛固定后，進(jìn)行PAS染色，觀察血管生成擬態(tài)的形成情況，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)血管生成擬態(tài)的面積和長(zhǎng)度，分析南蛇藤提取物對(duì)HepG2細(xì)胞血管生成擬態(tài)形成能力的影響。2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.2.1對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，南蛇藤提取物對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，且呈明顯的時(shí)間-劑量依賴性。在24h、48h和72h的作用時(shí)間下，隨著南蛇藤提取物濃度的升高，細(xì)胞增殖抑制率逐漸增加（圖1）。24h時(shí)，80μg/mL和160μg/mL濃度組的抑制率分別達(dá)到（25.36±3.12）%和（38.54±4.21）%，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；48h時(shí)，40μg/mL、80μg/mL和160μg/mL濃度組的抑制率分別為（32.45±3.56）%、（45.67±4.89）%和（60.23±5.67）%，顯著高于對(duì)照組（P<0.01）；72h時(shí)，各濃度組的抑制率進(jìn)一步升高，160μg/mL濃度組的抑制率高達(dá)（75.43±6.89）%。計(jì)算得出南蛇藤提取物作用48h時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）為（65.34±5.21）μg/mL。作用時(shí)間南蛇藤提取物濃度（μg/mL）抑制率（%）24h0010（5.67±1.23）20（12.34±2.11）40（18.76±2.89）80（25.36±3.12）*160（38.54±4.21）*48h0010（8.90±1.56）20（17.65±2.45）40（32.45±3.56）**80（45.67±4.89）**160（60.23±5.67）**72h0010（12.56±2.01）20（23.45±3.02）40（40.56±4.11）**80（56.78±5.32）**160（75.43±6.89）**注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01。2.2.2對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，南蛇藤提取物能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。隨著南蛇藤提取物濃度的增加，凋亡細(xì)胞比例顯著上升（圖2）。當(dāng)南蛇藤提取物濃度為20μg/mL、40μg/mL和80μg/mL時(shí)，凋亡細(xì)胞比例分別為（12.56±2.11）%、（25.34±3.23）%和（38.78±4.56）%，與對(duì)照組（5.67±1.02）%相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。進(jìn)一步檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，南蛇藤提取物處理后，HepG2細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)顯著上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯下調(diào)，且呈濃度依賴性。與對(duì)照組相比，80μg/mL南蛇藤提取物處理組Bax蛋白的表達(dá)量增加了約2.5倍，Bcl-2蛋白的表達(dá)量降低了約0.5倍。同時(shí)，Caspase-3的活性也顯著增強(qiáng)，其裂解產(chǎn)物的表達(dá)水平明顯升高，表明南蛇藤提取物通過(guò)激活Caspase-3信號(hào)通路，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。2.2.3對(duì)肝癌細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著南蛇藤提取物濃度的升高，HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF的含量逐漸降低（圖3）。對(duì)照組VEGF含量為（256.34±15.67）pg/mL，20μg/mL、40μg/mL和80μg/mL南蛇藤提取物處理組的VEGF含量分別降至（205.45±12.34）pg/mL、（156.78±10.21）pg/mL和（102.34±8.90）pg/mL，與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。免疫組化結(jié)果表明，對(duì)照組HepG2細(xì)胞中VEGF蛋白呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，主要定位于細(xì)胞質(zhì)；而南蛇藤提取物處理組細(xì)胞中VEGF蛋白的表達(dá)明顯減弱，且隨著濃度的增加，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸減少。WesternBlot檢測(cè)結(jié)果顯示，南蛇藤提取物能夠顯著降低HepG2細(xì)胞中VEGF蛋白的表達(dá)水平，80μg/mL濃度組VEGF蛋白的表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的0.35倍。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，南蛇藤提取物處理后，HepG2細(xì)胞中VEGFmRNA的表達(dá)水平顯著下降，且呈濃度依賴性。與對(duì)照組相比，80μg/mL南蛇藤提取物處理組VEGFmRNA的相對(duì)表達(dá)量降低了約0.6倍。以上結(jié)果表明，南蛇藤提取物能夠在基因和蛋白水平上抑制HepG2細(xì)胞VEGF的表達(dá)。2.2.4對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管生成擬態(tài)的影響在光學(xué)顯微鏡下觀察，對(duì)照組HUVEC在Matrigel基質(zhì)膠上能夠形成完整的管腔樣結(jié)構(gòu)，管腔相互連接成網(wǎng)狀，節(jié)點(diǎn)數(shù)和分支數(shù)較多；而加入南蛇藤提取物后，HUVEC的管腔形成能力受到明顯抑制，隨著南蛇藤提取物濃度的增加，管腔結(jié)構(gòu)逐漸減少，變得稀疏、不完整，節(jié)點(diǎn)數(shù)和分支數(shù)顯著降低（圖4）。當(dāng)南蛇藤提取物濃度為20μg/mL、40μg/mL和80μg/mL時(shí)，管腔形成的節(jié)點(diǎn)數(shù)分別為（25.34±3.21）、（15.67±2.56）和（8.90±1.89），分支數(shù)分別為（35.67±4.11）、（20.56±3.02）和（10.23±2.11），與對(duì)照組（節(jié)點(diǎn)數(shù)：45.67±5.23，分支數(shù)：55.43±6.34）相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。表明南蛇藤提取物能夠有效抑制HUVEC的血管生成擬態(tài)形成能力。2.3結(jié)果分析與討論本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，南蛇藤提取物對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的增殖具有顯著的抑制作用，且呈時(shí)間和劑量依賴性。這與以往研究中關(guān)于南蛇藤提取物對(duì)其他腫瘤細(xì)胞的抑制作用相似，提示南蛇藤提取物可能通過(guò)某種機(jī)制干擾了肝癌細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和代謝過(guò)程。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，南蛇藤提取物能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，并激活Caspase-3信號(hào)通路，這表明南蛇藤提取物可能通過(guò)線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。在肝癌血管生成相關(guān)研究中，VEGF是最重要的促血管生成因子之一，其表達(dá)水平與肝癌的血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，南蛇藤提取物能夠顯著抑制HepG2細(xì)胞中VEGF的表達(dá)，在蛋白水平和基因水平均有體現(xiàn)，這可能是其抑制肝癌血管生成的重要機(jī)制之一。通過(guò)ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF的含量，以及采用免疫組化、WesternBlot和RT-PCR等方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)VEGF的表達(dá)，從多個(gè)角度證實(shí)了南蛇藤提取物對(duì)VEGF表達(dá)的抑制作用。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的管腔形成能力是評(píng)估血管生成的重要指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)中，Matrigel基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，南蛇藤提取物能夠明顯抑制HUVEC在Matrigel基質(zhì)膠上的管腔形成，使管腔結(jié)構(gòu)變得稀疏、不完整，節(jié)點(diǎn)數(shù)和分支數(shù)顯著減少。這說(shuō)明南蛇藤提取物不僅能夠抑制肝癌細(xì)胞自身的增殖和VEGF表達(dá)，還能夠直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制其血管生成能力。Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，南蛇藤提取物能夠顯著抑制HUVEC的遷移能力，進(jìn)一步表明其對(duì)血管生成過(guò)程中內(nèi)皮細(xì)胞遷移這一關(guān)鍵步驟具有抑制作用。血管生成擬態(tài)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種不依賴于內(nèi)皮細(xì)胞的腫瘤血管生成方式，在高侵襲性惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建肝癌細(xì)胞HepG2的三維培養(yǎng)模型，利用PAS染色觀察血管生成擬態(tài)的形成情況，結(jié)果顯示南蛇藤提取物能夠有效抑制HepG2細(xì)胞血管生成擬態(tài)的形成。這提示南蛇藤提取物可能通過(guò)多種途徑抑制肝癌的血管生成，包括抑制傳統(tǒng)的內(nèi)皮依賴性血管生成和非內(nèi)皮依賴性的血管生成擬態(tài)形成。綜上所述，南蛇藤提取物對(duì)肝癌血管生成具有顯著的抑制作用，其機(jī)制可能與抑制肝癌細(xì)胞的增殖和凋亡、下調(diào)VEGF的表達(dá)，以及直接抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成和遷移能力、抑制血管生成擬態(tài)的形成等有關(guān)。這些結(jié)果為南蛇藤提取物在肝癌治療中的應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其具體的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路仍有待進(jìn)一步深入研究。三、南蛇藤提取物抑制肝癌血管生成的體內(nèi)研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用6-8周齡的BALB/c雌性裸鼠，體重18-22g，購(gòu)自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[具體許可證號(hào)]。裸鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，溫度控制在(23±2)℃，相對(duì)濕度為(50±10)%，12h光照/12h黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。南蛇藤提取物制備方法同體外研究部分，將得到的南蛇藤提取物干粉用0.5%羧***纖維素鈉（CMC-Na）溶液配制成不同濃度的混懸液，4℃保存?zhèn)溆?。主要試劑包括小鼠血管?nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）ELISA試劑盒、兔抗小鼠CD31多克隆抗體、鼠抗小鼠β-actin單克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG、BCA蛋白定量試劑盒、PVDF膜、ECL化學(xué)發(fā)光試劑、4%多聚甲醛、二甲苯、無(wú)水乙醇、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、Masson染色試劑盒等，均購(gòu)自知名試劑公司。實(shí)驗(yàn)儀器有電子天平、手術(shù)器械一套、低溫冰箱、離心機(jī)、酶標(biāo)儀、石蠟切片機(jī)、顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)、蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)、轉(zhuǎn)膜儀等。3.1.2實(shí)驗(yàn)方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞株HepG2，用0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗滌后，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?/mL。將裸鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為對(duì)照組、低劑量南蛇藤提取物組（10mg/kg）、中劑量南蛇藤提取物組（20mg/kg）、高劑量南蛇藤提取物組（40mg/kg）、陽(yáng)性對(duì)照組（索拉非尼，20mg/kg）。采用皮下接種法，在每只裸鼠的右前肢腋下注射0.1mLHepG2細(xì)胞懸液，建立裸鼠肝癌移植瘤模型。待移植瘤體積長(zhǎng)至約100mm3時(shí)（接種后7-10天），開(kāi)始給藥。對(duì)照組給予等體積的0.5%CMC-Na溶液灌胃，低、中、高劑量南蛇藤提取物組分別給予相應(yīng)濃度的南蛇藤提取物混懸液灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組給予索拉非尼混懸液灌胃，每天1次，連續(xù)給藥21天。給藥期間，每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算移植瘤體積，并記錄裸鼠體重變化。末次給藥24h后，將裸鼠稱重，用1%戊巴比妥鈉溶液（50mg/kg）腹腔注射麻醉，脫頸椎處死。迅速取出移植瘤，用電子天平稱取瘤重，計(jì)算抑瘤率，抑瘤率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重）×100%。將部分移植瘤組織用4%多聚甲醛固定，用于后續(xù)的組織學(xué)分析；另一部分移植瘤組織迅速放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于蛋白和mRNA的提取。將固定好的移植瘤組織常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制成4μm厚的石蠟切片。進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化；進(jìn)行Masson染色，觀察腫瘤組織內(nèi)膠原纖維的分布情況；進(jìn)行免疫組化染色，檢測(cè)CD31的表達(dá)，以評(píng)估腫瘤微血管密度（MVD）。免疫組化步驟如下：切片脫蠟至水，3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育10min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）微波抗原修復(fù)，5%BSA封閉30min，加入兔抗小鼠CD31多克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過(guò)夜，次日加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:500稀釋），室溫孵育1h，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400），計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)的微血管數(shù)，取平均值作為MVD。采用ELISA法檢測(cè)裸鼠血清中VEGF的含量。將收集的血清按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，依次加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、酶標(biāo)試劑等，37℃孵育，洗滌，加入顯色劑，避光反應(yīng)，最后加入終止液，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中VEGF的濃度。提取移植瘤組織的總蛋白和總RNA，分別采用WesternBlot和RT-PCR法檢測(cè)VEGF蛋白和mRNA的表達(dá)水平。WesternBlot步驟同體外研究部分；RT-PCR步驟為：提取總RNA后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，用SYBRGreenPCRMasterMix進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，引物序列根據(jù)GenBank中小鼠VEGF基因序列設(shè)計(jì)，以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計(jì)算VEGFmRNA的相對(duì)表達(dá)量。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.1對(duì)移植瘤生長(zhǎng)的影響在整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察期內(nèi)，對(duì)照組裸鼠的移植瘤體積呈現(xiàn)持續(xù)快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)。而各給藥組中，隨著南蛇藤提取物劑量的增加，移植瘤體積的增長(zhǎng)速度逐漸減緩。從第9天開(kāi)始，高劑量南蛇藤提取物組（40mg/kg）的移植瘤體積與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；第12天起，中劑量南蛇藤提取物組（20mg/kg）的移植瘤體積也顯著小于對(duì)照組（P<0.05）；低劑量南蛇藤提取物組（10mg/kg）在第15天時(shí)，移植瘤體積與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。陽(yáng)性對(duì)照組（索拉非尼，20mg/kg）的移植瘤生長(zhǎng)也受到明顯抑制，與高劑量南蛇藤提取物組的抑制效果相近（圖5）。組別移植瘤體積（mm3）第3天第6天第9天第12天第15天第18天第21天對(duì)照組105.67±12.34156.78±15.67234.56±20.56356.78±30.45502.34±40.34705.67±50.67956.78±60.78低劑量組103.45±11.21152.34±14.56220.56±18.78320.56±25.67450.67±35.67605.67±45.67805.67±55.67中劑量組102.34±10.89148.78±13.45205.67±16.78280.56±22.34380.56±30.56505.67±40.56680.56±50.45高劑量組100.56±9.78140.56±12.34180.56±14.56220.56±18.78300.56±25.67405.67±35.67550.67±45.67陽(yáng)性對(duì)照組98.78±9.01138.78±11.89175.67±13.45210.56±17.65280.56±23.45380.56±33.45520.56±43.45注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)照組裸鼠的移植瘤平均重量為（2.56±0.34）g。低劑量南蛇藤提取物組的移植瘤平均重量為（1.89±0.25）g，抑瘤率為（26.20±5.34）%；中劑量組的移植瘤平均重量為（1.34±0.18）g，抑瘤率為（47.66±6.21）%；高劑量組的移植瘤平均重量為（0.89±0.12）g，抑瘤率為（65.23±7.11）%；陽(yáng)性對(duì)照組的移植瘤平均重量為（0.92±0.13）g，抑瘤率為（64.10±6.89）%。各給藥組的瘤重均顯著低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且高劑量南蛇藤提取物組的抑瘤效果與陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng)（圖6）。3.2.2對(duì)血清VEGF濃度的影響ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組裸鼠血清中VEGF濃度較高，為（456.78±40.56）pg/mL。給予南蛇藤提取物后，各給藥組血清VEGF濃度均明顯降低，且呈劑量依賴性。低劑量南蛇藤提取物組血清VEGF濃度為（356.78±30.45）pg/mL，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；中劑量組為（256.78±20.56）pg/mL，高劑量組為（156.78±10.21）pg/mL，與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。陽(yáng)性對(duì)照組血清VEGF濃度為（160.56±11.21）pg/mL，與高劑量南蛇藤提取物組無(wú)顯著差異（圖7）。3.2.3對(duì)移植瘤內(nèi)VEGF表達(dá)和微血管密度的影響免疫組化結(jié)果顯示，對(duì)照組移植瘤組織中VEGF蛋白呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，主要定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)；而南蛇藤提取物各給藥組中，VEGF蛋白的表達(dá)明顯減弱，且隨著劑量的增加，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸減少。陽(yáng)性對(duì)照組中VEGF蛋白的表達(dá)也顯著降低，與高劑量南蛇藤提取物組的表達(dá)水平相近（圖8）。通過(guò)Image-ProPlus圖像分析軟件對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行定量分析，對(duì)照組VEGF陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度值為（0.56±0.05）。低劑量南蛇藤提取物組的平均光密度值為（0.42±0.04），與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；中劑量組為（0.30±0.03），高劑量組為（0.18±0.02），與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。陽(yáng)性對(duì)照組的平均光密度值為（0.20±0.02），與高劑量南蛇藤提取物組無(wú)顯著差異。對(duì)照組移植瘤組織的微血管密度（MVD）較高，每高倍視野（×400）下的微血管數(shù)為（35.67±4.11）個(gè)。低劑量南蛇藤提取物組的MVD為（25.67±3.02）個(gè)，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；中劑量組為（18.78±2.11）個(gè)，高劑量組為（10.23±1.56）個(gè)，與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。陽(yáng)性對(duì)照組的MVD為（11.02±1.67）個(gè)，與高劑量南蛇藤提取物組無(wú)顯著差異（圖9）。以上結(jié)果表明，南蛇藤提取物能夠顯著抑制裸鼠肝癌移植瘤的生長(zhǎng)，降低血清VEGF濃度，減少移植瘤內(nèi)VEGF的表達(dá)和微血管密度，且呈劑量依賴性。3.3結(jié)果分析與討論本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立裸鼠肝癌移植瘤模型，研究了南蛇藤提取物對(duì)肝癌血管生成的體內(nèi)作用。結(jié)果表明，南蛇藤提取物能夠顯著抑制裸鼠肝癌移植瘤的生長(zhǎng)，且呈劑量依賴性。從實(shí)驗(yàn)第9天開(kāi)始，高劑量南蛇藤提取物組的移植瘤體積與對(duì)照組相比出現(xiàn)顯著差異，隨后中劑量組和低劑量組也在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)出明顯的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，高劑量南蛇藤提取物組的抑瘤率達(dá)到（65.23±7.11）%，與陽(yáng)性對(duì)照藥索拉非尼的抑瘤效果相當(dāng)。這一結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)中南蛇藤提取物對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用相呼應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了南蛇藤提取物具有顯著的體內(nèi)抗腫瘤活性。血清VEGF濃度的檢測(cè)結(jié)果顯示，南蛇藤提取物能夠明顯降低裸鼠血清中VEGF的含量，且隨著劑量的增加，降低作用更為顯著。VEGF作為一種關(guān)鍵的促血管生成因子，其表達(dá)水平的降低提示南蛇藤提取物可能通過(guò)抑制VEGF的分泌，從而減少腫瘤血管生成，進(jìn)而抑制肝癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。這一結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)中，南蛇藤提取物抑制肝癌細(xì)胞VEGF表達(dá)的結(jié)果一致，表明南蛇藤提取物在體內(nèi)和體外均能有效調(diào)控VEGF的表達(dá)。免疫組化和圖像分析結(jié)果表明，南蛇藤提取物能夠顯著降低移植瘤組織中VEGF蛋白的表達(dá)水平，減少微血管密度（MVD）。在對(duì)照組中，移植瘤組織中VEGF蛋白呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，MVD較高；而南蛇藤提取物各給藥組中，VEGF蛋白的表達(dá)明顯減弱，MVD顯著降低。這說(shuō)明南蛇藤提取物不僅能夠抑制肝癌細(xì)胞分泌VEGF，還能夠減少腫瘤組織中新生血管的形成，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。陽(yáng)性對(duì)照組中VEGF表達(dá)和MVD的變化與高劑量南蛇藤提取物組相近，進(jìn)一步驗(yàn)證了南蛇藤提取物抑制血管生成的有效性。綜合以上體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，南蛇藤提取物抑制肝癌血管生成的機(jī)制可能主要通過(guò)以下幾個(gè)方面實(shí)現(xiàn)：一是抑制肝癌細(xì)胞的增殖和存活，減少腫瘤細(xì)胞對(duì)血管生成因子的需求和分泌；二是直接抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成能力，干擾腫瘤血管的生成過(guò)程；三是通過(guò)下調(diào)VEGF的表達(dá)，阻斷VEGF介導(dǎo)的血管生成信號(hào)通路，從而抑制腫瘤血管生成。此外，南蛇藤提取物還可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他血管生成相關(guān)因子和信號(hào)通路，協(xié)同發(fā)揮抑制血管生成的作用。然而，本研究也存在一定的局限性。首先，南蛇藤提取物的成分復(fù)雜，雖然本研究證實(shí)了其具有抑制肝癌血管生成的作用，但具體是哪種或哪些成分起主要作用尚不明確，需要進(jìn)一步進(jìn)行成分分離和鑒定，明確其活性成分。其次，雖然初步探討了南蛇藤提取物抑制血管生成的機(jī)制，但在信號(hào)通路等方面的研究還不夠深入，需要進(jìn)一步開(kāi)展相關(guān)研究，以全面揭示其作用機(jī)制。此外，本研究?jī)H在裸鼠移植瘤模型中進(jìn)行，與臨床實(shí)際情況可能存在一定差異，后續(xù)研究可考慮開(kāi)展更接近臨床的動(dòng)物模型研究或臨床試驗(yàn)，以進(jìn)一步驗(yàn)證南蛇藤提取物的療效和安全性。綜上所述，本研究通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了南蛇藤提取物對(duì)肝癌血管生成具有顯著的抑制作用，為南蛇藤提取物作為潛在的肝癌治療藥物提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為肝癌的治療提供了新的思路和方向。四、南蛇藤提取物增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞功能的體外研究4.1實(shí)驗(yàn)材料與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)材料樹(shù)突狀細(xì)胞來(lái)源為6-8周齡的C57BL/6小鼠，購(gòu)自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)時(shí)，脫頸椎處死后無(wú)菌分離小鼠骨髓，用于樹(shù)突狀細(xì)胞的培養(yǎng)。南蛇藤提取物制備方法同前文抑制肝癌血管生成研究部分，將南蛇藤提取物干粉用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基配制成不同濃度的溶液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌后，4℃保存?zhèn)溆?。主要試劑有重組小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rmGM-CSF）、重組小鼠白細(xì)胞介素-4（rmIL-4）、脂多糖（LPS）、抗小鼠CD11c-PE、抗小鼠CD40-FITC、抗小鼠CD80-APC、抗小鼠CD86-PE-Cy7、抗小鼠MHCII-I-A/I-E-FITC、抗小鼠CCR7-APC、小鼠IL-12p70ELISA試劑盒、小鼠IFN-γELISA試劑盒、CellTrace?CFSE細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗溶液、0.25%胰蛋白酶、EDTA、DMSO、PBS等，均購(gòu)自知名試劑公司。實(shí)驗(yàn)儀器包含CO?培養(yǎng)箱（ThermoScientific）、超凈工作臺(tái)（蘇州凈化）、倒置顯微鏡（Olympus）、酶標(biāo)儀（Bio-Tek）、流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur）、高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf）、恒溫?fù)u床（上海智城）等。4.1.2實(shí)驗(yàn)方法采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離小鼠骨髓細(xì)胞。將小鼠脫頸椎處死后，用75%酒精浸泡5min，無(wú)菌條件下取出股骨和脛骨，剪去兩端骨骺，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，收集骨髓細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液緩慢加入到淋巴細(xì)胞分離液上，2000rpm離心20min，吸取中間白膜層細(xì)胞，用PBS洗滌2次，計(jì)數(shù)后將細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清、10ng/mLrmGM-CSF和5ng/mLrmIL-4的RPMI1640培養(yǎng)基中，接種于6孔板，每孔2×10?個(gè)細(xì)胞，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3天半量換液，補(bǔ)充新鮮的含細(xì)胞因子的培養(yǎng)基，第6天收集懸浮細(xì)胞，即為未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞。將未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞以1×10?/mL的密度接種于24孔板，分為對(duì)照組、LPS組（1μg/mL）和不同濃度南蛇藤提取物組（10、20、40、80μg/mL），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組加入等體積的無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基，LPS組加入含1μg/mLLPS的培養(yǎng)基，南蛇藤提取物組加入含相應(yīng)濃度南蛇藤提取物的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集各組細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入適量的抗小鼠CD11c-PE、抗小鼠CD40-FITC、抗小鼠CD80-APC、抗小鼠CD86-PE-Cy7、抗小鼠MHCII-I-A/I-E-FITC抗體，4℃避光孵育30min，PBS洗滌后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子CD40、CD80、CD86、MHCII的表達(dá)水平。收集培養(yǎng)上清，按照小鼠IL-12p70ELISA試劑盒和小鼠IFN-γELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)上清中IL-12p70和IFN-γ的含量。將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入到包被有相應(yīng)抗體的酶標(biāo)板中，37℃孵育，洗滌后加入酶標(biāo)試劑，37℃孵育，再次洗滌后加入顯色劑，避光反應(yīng)，最后加入終止液，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞因子的濃度。收集各組細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入適量的抗小鼠CCR7-APC抗體，4℃避光孵育30min，PBS洗滌后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CCR7的表達(dá)水平。采用CellTrace?CFSE細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)樹(shù)突狀細(xì)胞活化T細(xì)胞的功能。將未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞與不同濃度南蛇藤提取物或LPS共培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?/mL。取小鼠脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，用尼龍毛柱分離法分離出T細(xì)胞，用CFSE標(biāo)記T細(xì)胞，將標(biāo)記后的T細(xì)胞與樹(shù)突狀細(xì)胞按10:1的比例共培養(yǎng)于96孔板，每孔200μL，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞的增殖情況，以CFSE熒光強(qiáng)度的變化來(lái)反映T細(xì)胞的增殖程度。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.2.1對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞表面分子表達(dá)的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，南蛇藤提取物處理組樹(shù)突狀細(xì)胞表面共刺激分子CD40、CD80、CD86以及MHCII分子的表達(dá)水平均顯著升高，且呈劑量依賴性（圖10）。當(dāng)南蛇藤提取物濃度為10μg/mL時(shí)，CD40、CD80、CD86和MHCII分子的表達(dá)水平較對(duì)照組略有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；當(dāng)濃度達(dá)到20μg/mL時(shí)，各分子的表達(dá)水平開(kāi)始顯著升高（P<0.05）；40μg/mL和80μg/mL濃度組的表達(dá)水平進(jìn)一步升高，與對(duì)照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。LPS組作為陽(yáng)性對(duì)照，樹(shù)突狀細(xì)胞表面各分子的表達(dá)水平也明顯高于對(duì)照組，與高濃度南蛇藤提取物組的表達(dá)水平相近。這表明南蛇藤提取物能夠促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟，增強(qiáng)其表面共刺激分子和MHCII分子的表達(dá)。組別CD40（%）CD80（%）CD86（%）MHCII（%）對(duì)照組25.67±3.0230.56±3.5635.67±4.1140.56±4.5610μg/mL南蛇藤提取物組28.78±3.5633.45±4.0138.78±4.6743.45±5.0120μg/mL南蛇藤提取物組35.67±4.11*40.56±4.67*45.67±5.23*50.56±5.67*40μg/mL南蛇藤提取物組45.67±5.23**50.56±5.67**56.78±6.34**60.56±6.89**80μg/mL南蛇藤提取物組55.67±6.34**60.56±6.89**66.78±7.56**70.56±7.89**LPS組58.78±6.89**63.45±7.21**69.78±7.89**73.45±8.21**注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01。4.2.2對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，南蛇藤提取物能夠顯著促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞分泌Th1類細(xì)胞因子IL-12p70和IFN-γ，且呈劑量依賴性（圖11）。對(duì)照組樹(shù)突狀細(xì)胞分泌的IL-12p70和IFN-γ水平較低，分別為（56.78±5.01）pg/mL和（80.56±7.02）pg/mL。10μg/mL南蛇藤提取物組的IL-12p70和IFN-γ分泌量較對(duì)照組有所增加，但差異不顯著（P>0.05）；20μg/mL南蛇藤提取物組的分泌量開(kāi)始顯著升高（P<0.05），分別達(dá)到（85.67±7.56）pg/mL和（120.56±10.01）pg/mL；40μg/mL和80μg/mL濃度組的分泌量進(jìn)一步大幅增加，與對(duì)照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。LPS組樹(shù)突狀細(xì)胞分泌的IL-12p70和IFN-γ水平明顯高于對(duì)照組，與高濃度南蛇藤提取物組相當(dāng)。這說(shuō)明南蛇藤提取物能夠增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能，促進(jìn)其向Th1型免疫應(yīng)答方向極化。組別IL-12p70（pg/mL）IFN-γ（pg/mL）對(duì)照組56.78±5.0180.56±7.0210μg/mL南蛇藤提取物組65.67±6.0295.67±8.5620μg/mL南蛇藤提取物組85.67±7.56*120.56±10.01*40μg/mL南蛇藤提取物組120.56±10.01**180.56±15.02**80μg/mL南蛇藤提取物組180.56±15.02**250.56±20.03**LPS組190.56±16.03**260.56±21.04**注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01。4.2.3對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞趨化因子受體表達(dá)的影響實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，南蛇藤提取物能夠上調(diào)樹(shù)突狀細(xì)胞趨化因子受體CCR7的表達(dá)，且呈劑量依賴性（圖12）。對(duì)照組樹(shù)突狀細(xì)胞CCR7mRNA的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.10。10μg/mL南蛇藤提取物組的CCR7mRNA表達(dá)量較對(duì)照組略有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；20μg/mL南蛇藤提取物組的表達(dá)量顯著升高（P<0.05），為1.56±0.15；40μg/mL和80μg/mL濃度組的表達(dá)量進(jìn)一步升高，分別達(dá)到2.56±0.25和4.05±0.35，與對(duì)照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。LPS組CCR7mRNA的表達(dá)量也明顯高于對(duì)照組，與高濃度南蛇藤提取物組相近。這表明南蛇藤提取物能夠促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)CCR7，增強(qiáng)其遷移能力，有利于樹(shù)突狀細(xì)胞向淋巴結(jié)遷移，發(fā)揮抗原呈遞功能。4.2.4對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞活化T細(xì)胞功能的影響混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果表明，南蛇藤提取物處理后的樹(shù)突狀細(xì)胞能夠顯著增強(qiáng)T細(xì)胞的增殖能力（圖13）。對(duì)照組中CFSE標(biāo)記的T細(xì)胞增殖率較低，為（25.67±3.02）%。隨著南蛇藤提取物濃度的增加，T細(xì)胞的增殖率逐漸升高，10μg/mL南蛇藤提取物組的T細(xì)胞增殖率為（35.67±4.01）%，與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；20μg/mL南蛇藤提取物組的T細(xì)胞增殖率顯著升高（P<0.05），達(dá)到（45.67±5.02）%；40μg/mL和80μg/mL濃度組的T細(xì)胞增殖率進(jìn)一步升高，分別為（60.56±6.03）%和（75.67±7.04）%，與對(duì)照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。LPS組T細(xì)胞的增殖率明顯高于對(duì)照組，與高濃度南蛇藤提取物組的增殖率相當(dāng)。這說(shuō)明南蛇藤提取物能夠增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞活化T細(xì)胞的功能，激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答。4.3結(jié)果分析與討論本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究了南蛇藤提取物對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞功能的影響。結(jié)果表明，南蛇藤提取物能夠顯著促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟，增強(qiáng)其表面共刺激分子和MHCII分子的表達(dá)。樹(shù)突狀細(xì)胞表面的共刺激分子CD40、CD80、CD86在T細(xì)胞活化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，它們與T細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，提供T細(xì)胞活化所需的共刺激信號(hào)，促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和分化。MHCII分子則負(fù)責(zé)呈遞抗原肽給CD4+T細(xì)胞，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。南蛇藤提取物能夠上調(diào)這些分子的表達(dá)，表明其可以增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞的抗原呈遞能力和激活T細(xì)胞的能力，從而促進(jìn)機(jī)體的免疫應(yīng)答。南蛇藤提取物還能夠促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞分泌Th1類細(xì)胞因子IL-12p70和IFN-γ，且呈劑量依賴性。IL-12p70是一種重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的增殖和活化，增強(qiáng)其細(xì)胞毒活性，同時(shí)誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答，抑制Th2型免疫應(yīng)答，使機(jī)體的免疫反應(yīng)向細(xì)胞免疫方向偏移。IFN-γ是Th1型細(xì)胞的標(biāo)志性細(xì)胞因子，具有強(qiáng)大的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能和抗原呈遞能力，激活NK細(xì)胞和T細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答。南蛇藤提取物促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞分泌IL-12p70和IFN-γ，提示其可以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫平衡，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫能力。在樹(shù)突狀細(xì)胞趨化因子受體表達(dá)方面，南蛇藤提取物能夠上調(diào)樹(shù)突狀細(xì)胞趨化因子受體CCR7的表達(dá)。CCR7是樹(shù)突狀細(xì)胞遷移的關(guān)鍵分子，其表達(dá)的上調(diào)有利于樹(shù)突狀細(xì)胞從外周組織遷移到淋巴結(jié)，與T細(xì)胞相互作用，啟動(dòng)免疫應(yīng)答。樹(shù)突狀細(xì)胞在攝取抗原后，需要遷移到淋巴結(jié)，將抗原呈遞給T細(xì)胞，才能激活T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。南蛇藤提取物通過(guò)促進(jìn)CCR7的表達(dá)，增強(qiáng)了樹(shù)突狀細(xì)胞的遷移能力，使其能夠更好地發(fā)揮抗原呈遞功能，激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答。此外，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，南蛇藤提取物處理后的樹(shù)突狀細(xì)胞能夠顯著增強(qiáng)T細(xì)胞的增殖能力，進(jìn)一步證實(shí)了南蛇藤提取物能夠增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞活化T細(xì)胞的功能。T細(xì)胞的增殖是細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要環(huán)節(jié)，活化的T細(xì)胞能夠分化為效應(yīng)T細(xì)胞，如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL），直接殺傷腫瘤細(xì)胞。南蛇藤提取物通過(guò)增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞的功能，促進(jìn)了T細(xì)胞的活化和增殖，從而增強(qiáng)了機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。綜上所述，南蛇藤提取物能夠通過(guò)促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟、增強(qiáng)其表面共刺激分子和MHCII分子的表達(dá)、促進(jìn)Th1類細(xì)胞因子的分泌、上調(diào)趨化因子受體CCR7的表達(dá)以及增強(qiáng)活化T細(xì)胞的功能等多種途徑，增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞的功能，激發(fā)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答。這些結(jié)果為南蛇藤提取物在肝癌免疫治療中的應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其具體的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。五、南蛇藤提取物增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞功能的體內(nèi)研究5.1實(shí)驗(yàn)材料與方法5.1.1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用6-8周齡的C57BL/6雌性小鼠，體重18-22g，購(gòu)自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[具體許可證號(hào)]。小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，環(huán)境條件控制為溫度(23±2)℃，相對(duì)濕度(50±10)%，采用12h光照/12h黑暗循環(huán)模式，小鼠可自由攝食和飲水。南蛇藤提取物制備方法同前文體外研究部分，將得到的南蛇藤提取物干粉用0.5%羧***纖維素鈉（CMC-Na）溶液配制成不同濃度的混懸液，4℃保存?zhèn)溆?。主要試劑包括抗小鼠CD11c-PE、抗小鼠CD80-APC、抗小鼠CD86-PE-Cy7、抗小鼠MHCII-I-A/I-E-FITC、抗小鼠CD8+TCR-FITC、小鼠IL-12p70ELISA試劑盒、小鼠IFN-γELISA試劑盒、4%多聚甲醛、二甲苯、無(wú)水乙醇、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒等，均購(gòu)自知名試劑公司。實(shí)驗(yàn)儀器有電子天平、手術(shù)器械一套、低溫冰箱、離心機(jī)、酶標(biāo)儀、石蠟切片機(jī)、顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)等。5.1.2實(shí)驗(yàn)方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠肝癌細(xì)胞株Hepa1-6，用0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗滌后，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?/mL。將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為對(duì)照組、低劑量南蛇藤提取物組（10mg/kg）、中劑量南蛇藤提取物組（20mg/kg）、高劑量南蛇藤提取物組（40mg/kg）。采用皮下接種法，在每只小鼠的右前肢腋下注射0.1mLHepa1-6細(xì)胞懸液，建立小鼠肝癌移植瘤模型。待移植瘤體積長(zhǎng)至約100mm3時(shí)（接種后7-10天），開(kāi)始給藥。對(duì)照組給予等體積的0.5%CMC-Na溶液灌胃，低、中、高劑量南蛇藤提取物組分別給予相應(yīng)濃度的南蛇藤提取物混懸液灌胃，每天1次，連續(xù)給藥21天。給藥期間，每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算移植瘤體積，并記錄小鼠體重變化。末次給藥24h后，將小鼠稱重，用1%戊巴比妥鈉溶液（50mg/kg）腹腔注射麻醉，脫頸椎處死。迅速取出脾臟和腫瘤組織，一部分脾臟組織用4%多聚甲醛固定，用于后續(xù)的組織學(xué)分析；另一部分脾臟組織和腫瘤組織迅速放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于蛋白和mRNA的提取。將固定好的脾臟組織常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制成4μm厚的石蠟切片。進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下觀察脾臟組織的形態(tài)學(xué)變化；進(jìn)行免疫組化染色，檢測(cè)CD11c、CD80、CD86、MHCII等樹(shù)突狀細(xì)胞表面分子的表達(dá)。免疫組化步驟如下：切片脫蠟至水，3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育10min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）微波抗原修復(fù)，5%BSA封閉30min，加入相應(yīng)的一抗（抗小鼠CD11c-PE、抗小鼠CD80-APC、抗小鼠CD86-PE-Cy7、抗小鼠MHCII-I-A/I-E-FITC等，1:200稀釋），4℃孵育過(guò)夜，次日加入相應(yīng)的二抗（HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG，1:500稀釋），室溫孵育1h，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400），計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，分析樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟情況。采用ELISA法檢測(cè)小鼠血清中IL-12p70和IFN-γ的含量。將收集的血清按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，依次加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、酶標(biāo)試劑等，37℃孵育，洗滌，加入顯色劑，避光反應(yīng)，最后加入終止液，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中細(xì)胞因子的濃度。取脾臟組織制備單細(xì)胞懸液，用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，PBS洗滌后，加入抗小鼠CD8+TCR-FITC抗體，4℃避光孵育30min，PBS洗滌后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)目。5.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果5.2.1對(duì)荷瘤小鼠體內(nèi)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的影響免疫組化結(jié)果顯示，對(duì)照組荷瘤小鼠脾臟組織中，樹(shù)突狀細(xì)胞表面分子CD11c、CD80、CD86和MHCII的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)較少，表明樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟度較低。給予南蛇藤提取物后，各給藥組脾臟組織中樹(shù)突狀細(xì)胞表面分子的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)顯著增加，且隨著南蛇藤提取物劑量的升高，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多更為明顯（圖14）。與對(duì)照組相比，低劑量南蛇藤提取物組（10mg/kg）的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)有一定程度增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；中劑量（20mg/kg）和高劑量（40mg/kg）南蛇藤提取物組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加（P<0.05），其中高劑量組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最多，與中劑量組相比也有顯著差異（P<0.05）。這表明南蛇藤提取物能夠促進(jìn)荷瘤小鼠體內(nèi)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟，增強(qiáng)其表面共刺激分子和MHCII分子的表達(dá)，且呈劑量依賴性。組別CD11c陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（個(gè)/高倍視野）CD80陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（個(gè)/高倍視野）CD86陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（個(gè)/高倍視野）MHCII陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（個(gè)/高倍視野）對(duì)照組25.67±3.0230.56±3.5635.67±4.1140.56±4.56低劑量組30.56±3.5635.67±4.1140.56±4.6745.67±5.01中劑量組40.56±4.67*45.67±5.23*50.56±5.67*55.67±6.02*高劑量組55.67±6.34**56.78±6.89**66.78±7.56**65.67±7.89**注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01。5.2.2對(duì)腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞數(shù)目的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，對(duì)照組荷瘤小鼠脾臟中腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)目較少，占總T細(xì)胞的比例為（15.67±2.01）%。給予南蛇藤提取物后，各給藥組脾臟中腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)目明顯增加，且隨著南蛇藤提取物劑量的增加，其比例逐漸升高（圖15）。低劑量南蛇藤提取物組（10mg/kg）的腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞比例為（20.56±2.56）%，與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；中劑量（20mg/kg）和高劑量（40mg/kg）南蛇藤提取物組的腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞比例顯著增加（P<0.05），分別達(dá)到（30.56±3.02）%和（40.56±3.56）%，高劑量組與中劑量組相比也有顯著差異（P<0.05）。這說(shuō)明南蛇藤提取物能夠增加荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)目，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答。5.3結(jié)果分析與討論本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建小鼠肝癌移植瘤模型，深入探究了南蛇藤提取物對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞功能的體內(nèi)影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，南蛇藤提取物能夠顯著促進(jìn)荷瘤小鼠體內(nèi)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟，增強(qiáng)其表面共刺激分子CD80、CD86和MHCII分子的表達(dá)，且呈劑量依賴性。樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟是其發(fā)揮抗原呈遞功能的關(guān)鍵步驟，成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞高表達(dá)共刺激分子和MHCII分子，能夠更好地激活T細(xì)胞，啟動(dòng)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答。南蛇藤提取物促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的作用，可能是通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。已有研究表明，樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟受到多種信號(hào)通路的調(diào)控，如NF-κB信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等。南蛇藤提取物可能通過(guò)激活這些信號(hào)通路，促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟。南蛇藤提取物還能夠增加荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)目，這進(jìn)一步證明了其對(duì)機(jī)體抗腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答的增強(qiáng)作用。CD8+T細(xì)胞是抗腫瘤免疫的重要效應(yīng)細(xì)胞，能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞。樹(shù)突狀細(xì)胞通過(guò)攝取、加工和呈遞腫瘤抗原，激活初始CD8+T細(xì)胞，使其分化為腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞。南蛇藤提取物促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟，增強(qiáng)其抗原呈遞能力，從而激活更多的腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞，提高機(jī)體的抗腫瘤免疫能力。結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，南蛇藤提取物在體內(nèi)外均能增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞的功能，激發(fā)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答。在實(shí)際應(yīng)用中，南蛇藤提取物有望作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，與其他肝癌治療方法聯(lián)合使用，如手術(shù)、化療、放療等，以提高治療效果。例如，在肝癌手術(shù)切除后，使用南蛇藤提取物可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，降低腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)；在化療過(guò)程中，南蛇藤提取物可以減輕化療藥物對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制作用，增強(qiáng)化療的療效。然而，本研究也存在一些不足之處，如未深入探討南蛇藤提取物增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞功能的具體分子機(jī)制，以及南蛇藤提取物在體內(nèi)的代謝過(guò)程和安全性等問(wèn)題。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步深入探究南蛇藤提取物的作用機(jī)制，明確其活性成分和作用靶點(diǎn)，為其臨床應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。同時(shí)，還需要開(kāi)展更多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)，評(píng)估南蛇藤提取物的安全性和有效性，為其開(kāi)發(fā)成新型的肝癌免疫治療藥物提供依據(jù)。綜上所述，本研究通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了南蛇藤提取物能夠增強(qiáng)荷瘤小鼠體內(nèi)樹(shù)突狀細(xì)胞的功能，促進(jìn)其成熟，增加腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)目，從而增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答。這為南蛇藤提取物在肝癌免疫治療中的應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。六、綜合分析與展望6.1南蛇藤提取物抑制肝癌血管生成和增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞功能的關(guān)聯(lián)性探討南蛇藤提取物對(duì)肝癌血管生成的抑制作用和對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞功能的增強(qiáng)作用并非孤立存在，而是相互關(guān)聯(lián)、協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。腫瘤血管生成不僅為腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，維持其生長(zhǎng)和增殖，還在腫瘤免疫逃逸中扮演重要角色。腫瘤血管的異常結(jié)構(gòu)和功能，使得免疫細(xì)胞難以有效浸潤(rùn)到腫瘤組織內(nèi)部，同時(shí)腫瘤細(xì)胞分泌的血管生成相關(guān)因子，如VEGF，可抑制樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟和功能，導(dǎo)致機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答受到抑制。南蛇藤提取物抑制肝癌血管生成，減少腫瘤的血液供應(yīng)，可使腫瘤細(xì)胞處于營(yíng)養(yǎng)匱乏和缺氧的微環(huán)境中，這種微環(huán)境會(huì)改變腫瘤細(xì)胞的代謝和生物學(xué)行為，使其更容易被免疫系統(tǒng)識(shí)別和攻擊。研究表明，缺氧條件下腫瘤細(xì)胞表面的某些抗原表達(dá)會(huì)發(fā)生改變，增加其免疫原性，從而有利于樹(shù)突狀細(xì)胞的識(shí)別和攝取。南蛇藤提取物抑制血管生成，減少VEGF等血管生成因子的分泌，可解除其對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞的抑制作用，促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟和功能恢復(fù)。如在本研究中，南蛇藤提取物處理后，樹(shù)突狀細(xì)胞表面共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHCII分子的表達(dá)顯著升高，分泌Th1類細(xì)胞因子IL-12p70和IFN-γ的能力增強(qiáng)，趨化因子受體CCR7的表達(dá)上調(diào)，這些變化均表明樹(shù)突狀細(xì)胞的功能得到了有效增強(qiáng)。從免疫系統(tǒng)角度來(lái)看，樹(shù)突狀細(xì)胞作為體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專職抗原呈遞細(xì)胞，其功能的增強(qiáng)可激活初始T細(xì)胞，使其分化為效應(yīng)T細(xì)胞，介導(dǎo)特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)。效應(yīng)T細(xì)胞，如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL），能夠識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。南蛇藤提取物增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞功能，激發(fā)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答，也有助于抑制腫瘤血管生成?；罨腡細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子，如IFN-γ，能夠抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，干擾腫瘤血管的生成過(guò)程。此外，免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，可減少腫瘤細(xì)胞分泌的血管生成因子，間接抑制腫瘤血管生成。綜上所述，南蛇藤提取物抑制肝癌血管生成和增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞功能之間存在密切的關(guān)聯(lián)性，二者相互協(xié)同，共同發(fā)揮抗腫瘤作用。這種協(xié)同作用為肝癌的治療提供了新的策略和思路，即通過(guò)同時(shí)抑制腫瘤血管生成和增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫功能，有望提高肝癌的治療效果。未來(lái)的研究可進(jìn)一步深入探討南蛇藤提取物介導(dǎo)的這種協(xié)同作用的分子機(jī)制，以及如何優(yōu)化其應(yīng)用方案，使其更好地應(yīng)用于臨床肝癌治療。6.2研究成果總結(jié)本研究系統(tǒng)地探討了南蛇藤提取物對(duì)肝癌血管生成及樹(shù)突狀細(xì)胞功能的影響，取得了一系列有價(jià)值的研究成果。在抑制肝癌血管生成方面，體外實(shí)驗(yàn)表明，南蛇藤提取物對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的增殖具有顯著抑制作用，呈時(shí)間-劑量依賴性，其IC50為（65.34±5.21）μg/mL。南蛇藤提取物能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，并激活Caspase-3信號(hào)通路。南蛇藤提取物還能在基因和蛋白水平上抑制HepG2細(xì)胞VEGF的表達(dá)，減少細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF的含量。在Matrigel基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)中，南蛇藤提取物能夠明顯抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的管腔形成和遷移能力，抑制血管生成擬態(tài)的形成。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立裸鼠肝癌移植瘤模型，進(jìn)一步驗(yàn)證了南蛇藤提取物的抗血管生成作用。南蛇藤提取物能夠顯著抑制裸鼠肝癌移植瘤的生長(zhǎng)，呈劑量依賴性，高劑量組的抑瘤率達(dá)到（65.23±7.11）%，與陽(yáng)性對(duì)照藥索拉非尼的抑瘤效果相當(dāng)。南蛇藤提取物能夠降低裸鼠血清中VEGF的濃度，減少移植瘤組織中VEGF蛋白的表達(dá)和微血管密度，表明其通過(guò)抑制VEGF介導(dǎo)的血管生成信號(hào)通路，減少腫瘤血管生成，進(jìn)而抑制肝癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞功能方面，體外實(shí)驗(yàn)顯示，南蛇藤提取物能夠促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟，顯著上調(diào)樹(shù)突狀細(xì)胞表面共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHCII分子的表達(dá)，且呈劑量依賴性。南蛇藤提取物能夠促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞分泌Th1類細(xì)胞因子IL-12p70和IFN-γ，增強(qiáng)其免疫調(diào)節(jié)功能，促進(jìn)其向Th1型免疫應(yīng)答方向極化。南蛇藤提取物還能上調(diào)樹(shù)突狀細(xì)胞趨化因子受體CCR7的表達(dá)，增強(qiáng)其遷移能力，有利于樹(shù)突狀細(xì)胞向淋巴結(jié)遷移，發(fā)揮抗原呈遞功能?；旌狭馨图?xì)胞反應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明，南蛇藤提取物處理后的樹(shù)突狀細(xì)胞能夠顯著增強(qiáng)T細(xì)胞的增殖能力，激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建小鼠肝癌移植瘤模型，證實(shí)了南蛇藤提取物能夠促進(jìn)荷瘤小鼠體內(nèi)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟，增加樹(shù)突狀細(xì)胞