原發(fā)性肝癌肝移植圍手術(shù)期外周血環(huán)狀RNA的表達(dá)特征與臨床意義探究一、引言1.1研究背景原發(fā)性肝癌是全球范圍內(nèi)常見且危害嚴(yán)重的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率在全球呈上升趨勢。在中國，由于乙肝病毒的高感染率，原發(fā)性肝癌的發(fā)病情況更為嚴(yán)峻，每年新發(fā)肝癌病例約50萬，死亡人數(shù)達(dá)40多萬，嚴(yán)重威脅人民群眾的生命健康。肝癌的發(fā)病具有一定的地區(qū)差異，沿海地區(qū)如江蘇、浙江，以及靠近南海的廣西等地，因肝炎病毒感染、飲食習(xí)慣等因素，成為肝癌的高發(fā)區(qū)域。手術(shù)治療是目前原發(fā)性肝癌最常用的治療方法之一，包括切除術(shù)和肝移植術(shù)。對于一些難以通過切除術(shù)治療的患者，肝移植術(shù)成為一種重要的選擇。肝移植不僅能夠切除病變肝臟，還能消除肝臟基礎(chǔ)疾病對患者生存的影響，為許多終末期肝病患者帶來了生存希望。然而，肝移植手術(shù)過程復(fù)雜，風(fēng)險較高，圍手術(shù)期管理至關(guān)重要。圍手術(shù)期是指從確定手術(shù)治療時起，至與這次手術(shù)有關(guān)的治療基本結(jié)束為止的一段時間，包括術(shù)前、術(shù)中、術(shù)后三個階段。在這一時期，患者面臨著諸多挑戰(zhàn)，如術(shù)中、術(shù)后出血，肝動脈血栓形成，原發(fā)性移植肝無功能，肺部并發(fā)癥，腎臟功能不全，排斥反應(yīng)以及感染并發(fā)癥等。這些并發(fā)癥嚴(yán)重影響患者的存活及康復(fù)，是導(dǎo)致手術(shù)失敗和患者死亡的重要因素。例如，術(shù)后感染已成為肝移植失敗的主要原因，是肝移植術(shù)后1年內(nèi)最主要的并發(fā)癥和死亡原因。隨著對腫瘤發(fā)病機(jī)制研究的深入，環(huán)狀RNA（circRNA）逐漸成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點。circRNA是一類非編碼RNA，具有閉合的環(huán)形結(jié)構(gòu)，這種獨特的結(jié)構(gòu)賦予了它較高的穩(wěn)定性和組織特異性表達(dá)等特點。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，例如細(xì)胞增殖、分化、凋亡等。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，circRNA參與了多條信號通路的調(diào)節(jié)，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡。例如，某些circRNA可以作為miRNA海綿，通過吸附miRNA，解除miRNA對其靶基因的抑制作用，從而調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)。此外，circRNA還可以與蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。因此，研究原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期肝移植患者外周血circRNA的差異表達(dá)，對于深入理解這一過程中的生物學(xué)變化，揭示圍手術(shù)期內(nèi)機(jī)體的免疫規(guī)律，以及為肝移植手術(shù)的臨床治療提供新的思路和策略具有重要意義。1.2研究目的本研究旨在通過對原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期肝移植患者外周血circRNA的差異表達(dá)進(jìn)行深入分析，揭示其在圍手術(shù)期的表達(dá)規(guī)律，探究其在圍手術(shù)期內(nèi)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)作用及其相關(guān)機(jī)制。具體而言，首先運(yùn)用高通量測序技術(shù)，全面、準(zhǔn)確地檢測原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期肝移植患者外周血中circRNA的表達(dá)情況，篩選出在術(shù)前、術(shù)中和術(shù)后不同階段差異表達(dá)的circRNA。然后，借助生物信息學(xué)分析方法，對這些差異表達(dá)的circRNA進(jìn)行功能注釋和通路分析，明確它們參與的生物學(xué)過程和信號通路，進(jìn)而深入了解其在原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期免疫調(diào)節(jié)中的作用機(jī)制。通過本研究，期望為外周血circRNA在肝移植圍手術(shù)期的臨床應(yīng)用提供堅實的理論基礎(chǔ)，為臨床醫(yī)生更好地理解圍手術(shù)期患者的生物學(xué)變化提供新的視角和依據(jù)，為制定更加有效的圍手術(shù)期治療策略，降低并發(fā)癥發(fā)生率，提高肝移植手術(shù)成功率和患者生存率提供新思路和潛在的生物標(biāo)志物。二、原發(fā)性肝癌與肝移植概述2.1原發(fā)性肝癌的流行病學(xué)與發(fā)病機(jī)制原發(fā)性肝癌是一種嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)，其發(fā)病率和死亡率均處于較高水平。根據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥數(shù)據(jù)，肝癌的新發(fā)病例數(shù)達(dá)到91萬例，在所有惡性腫瘤中位居第6位；死亡病例數(shù)約83萬例，在癌癥相關(guān)死亡原因中位列第3位。肝癌的發(fā)病存在明顯的地域差異，東亞、東南亞以及撒哈拉以南非洲地區(qū)是肝癌的高發(fā)區(qū)域。中國作為肝癌的高發(fā)國家，2020年肝癌新發(fā)病例數(shù)約41萬例，占全球肝癌新發(fā)病例的45%左右，死亡病例數(shù)約39萬例，在國內(nèi)癌癥死亡原因中位居第2位。肝癌的高發(fā)年齡段在40-50歲之間，男性發(fā)病率顯著高于女性，男女比例約為4:1。原發(fā)性肝癌的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，是多種因素長期共同作用的結(jié)果。目前已知的主要發(fā)病因素包括以下幾個方面：病毒性肝炎：乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染是原發(fā)性肝癌最重要的致病因素。在中國，約90%的肝癌患者存在HBV感染背景。HBV和HCV感染后，病毒基因組可整合到宿主肝細(xì)胞基因組中，導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生一系列遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變，如基因突變、染色體異常、基因表達(dá)調(diào)控紊亂等，進(jìn)而促使肝細(xì)胞癌變。例如，HBV的X基因（HBx）編碼的HBx蛋白可以干擾細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，并誘導(dǎo)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。肝硬化：肝硬化是肝癌發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)。各種原因引起的肝硬化，如酒精性肝硬化、膽汁性肝硬化、自身免疫性肝硬化等，均可增加肝癌的發(fā)病風(fēng)險。在肝硬化過程中，肝臟組織反復(fù)發(fā)生炎癥、壞死和修復(fù)，肝細(xì)胞不斷增殖和分化，這一過程中容易出現(xiàn)基因突變和細(xì)胞異常增殖，從而導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。例如，在酒精性肝硬化患者中，長期酗酒導(dǎo)致肝臟反復(fù)損傷，肝臟纖維組織增生，形成假小葉，假小葉內(nèi)的肝細(xì)胞在各種致癌因素的作用下，容易發(fā)生癌變。黃曲霉毒素：黃曲霉毒素是一種由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物，具有極強(qiáng)的致癌性。黃曲霉毒素常見于霉變的糧食和堅果中，如玉米、花生等。長期攝入含有黃曲霉毒素的食物，可導(dǎo)致肝臟損傷，引起肝細(xì)胞基因突變，增加肝癌的發(fā)病風(fēng)險。研究表明，黃曲霉毒素B1（AFB1）進(jìn)入人體后，可在肝細(xì)胞內(nèi)代謝為具有活性的環(huán)氧化合物，該化合物能與DNA分子中的鳥嘌呤結(jié)合，形成AFB1-DNA加合物，導(dǎo)致DNA損傷和基因突變，從而引發(fā)肝癌。其他因素：長期酗酒、肥胖、糖尿病、遺傳因素以及某些化學(xué)物質(zhì)（如亞硝胺類、有機(jī)氯農(nóng)藥等）的暴露也與原發(fā)性肝癌的發(fā)生有關(guān)。酗酒可導(dǎo)致肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化，增加肝癌的發(fā)病風(fēng)險；肥胖和糖尿病可通過影響體內(nèi)代謝和激素水平，促進(jìn)肝癌的發(fā)生；遺傳因素在肝癌的發(fā)病中也起到一定作用，家族中有肝癌病史的人，其發(fā)病風(fēng)險相對較高。從分子機(jī)制層面來看，原發(fā)性肝癌的發(fā)生涉及多個基因和信號通路的異常。例如，Wnt/β-catenin信號通路在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。在正常肝細(xì)胞中，β-catenin與E-cadherin等蛋白結(jié)合，維持細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能。當(dāng)Wnt信號通路激活時，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累，并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，啟動一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化。在肝癌細(xì)胞中，該信號通路常常異常激活，導(dǎo)致β-catenin過度表達(dá)和異常定位，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。此外，PI3K/Akt/mTOR信號通路、Ras/Raf/MEK/ERK信號通路等也在原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，這些信號通路的異常激活或抑制，可影響肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，促進(jìn)腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和耐藥性的產(chǎn)生。2.2肝移植在原發(fā)性肝癌治療中的地位與現(xiàn)狀肝移植作為原發(fā)性肝癌的一種重要治療手段，在合適的患者中具有獨特的優(yōu)勢。肝移植不僅能夠徹底切除腫瘤組織，還能同時去除肝硬化等肝臟基礎(chǔ)疾病，為患者提供了更全面的治療方案，顯著提高了患者的生活質(zhì)量和長期生存率。對于那些因腫瘤位置特殊、肝臟功能儲備不足或存在多發(fā)病灶而無法進(jìn)行肝切除手術(shù)的患者，肝移植成為了可能治愈的唯一選擇。目前，肝移植在原發(fā)性肝癌治療中的應(yīng)用越來越廣泛，其手術(shù)技術(shù)和圍手術(shù)期管理也取得了顯著的進(jìn)步。國際上，米蘭標(biāo)準(zhǔn)（單個腫瘤直徑≤5cm或腫瘤個數(shù)≤3個且每個腫瘤直徑≤3cm，無肝內(nèi)大血管侵犯，無肝外轉(zhuǎn)移）和UCSF標(biāo)準(zhǔn)（單個腫瘤直徑≤6.5cm，或腫瘤個數(shù)≤3個且最大直徑≤4.5cm，腫瘤直徑總和≤8cm，無大血管侵犯和肝外轉(zhuǎn)移）等被廣泛用于篩選適合肝移植的肝癌患者。這些標(biāo)準(zhǔn)的制定，為肝移植手術(shù)的合理開展提供了重要依據(jù)，有助于提高手術(shù)的成功率和患者的生存率。然而，肝移植在原發(fā)性肝癌治療中仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)。供體短缺是一個全球性的問題，由于肝臟供體的來源有限，許多患者在等待供體的過程中病情惡化，錯失了最佳治療時機(jī)。肝移植手術(shù)費(fèi)用高昂，對于大多數(shù)患者家庭來說是沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，這在一定程度上限制了肝移植的廣泛應(yīng)用。此外，術(shù)后免疫排斥反應(yīng)也是影響患者長期生存的重要因素。患者需要長期服用免疫抑制劑來預(yù)防排斥反應(yīng)，但免疫抑制劑的使用會增加感染、腫瘤復(fù)發(fā)等風(fēng)險。有研究表明，約30%-50%的肝移植患者在術(shù)后5年內(nèi)會發(fā)生不同程度的排斥反應(yīng)，這不僅增加了患者的痛苦和醫(yī)療費(fèi)用，還可能導(dǎo)致移植肝臟功能喪失，甚至危及生命。圍手術(shù)期管理對于肝移植患者的預(yù)后至關(guān)重要。術(shù)前，準(zhǔn)確評估患者的病情、身體狀況和心理狀態(tài)，優(yōu)化患者的身體條件，是手術(shù)成功的基礎(chǔ)。例如，對于合并有其他基礎(chǔ)疾病的患者，如高血壓、糖尿病等，需要在術(shù)前進(jìn)行有效的控制和治療，以降低手術(shù)風(fēng)險。術(shù)中，精細(xì)的手術(shù)操作和合理的麻醉管理，能夠減少手術(shù)創(chuàng)傷和出血，降低手術(shù)并發(fā)癥的發(fā)生。術(shù)后，密切監(jiān)測患者的生命體征、肝功能、免疫狀態(tài)等，及時發(fā)現(xiàn)并處理并發(fā)癥，合理調(diào)整免疫抑制劑的用量，是患者順利康復(fù)的關(guān)鍵。同時，加強(qiáng)患者的營養(yǎng)支持、心理護(hù)理和康復(fù)指導(dǎo)，也有助于提高患者的生活質(zhì)量和康復(fù)效果。例如，通過合理的營養(yǎng)支持，保證患者攝入足夠的蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)，有助于促進(jìn)肝臟的修復(fù)和再生；心理護(hù)理能夠幫助患者緩解焦慮、恐懼等不良情緒，增強(qiáng)患者戰(zhàn)勝疾病的信心；康復(fù)指導(dǎo)能夠幫助患者盡快恢復(fù)身體功能，提高生活自理能力。三、環(huán)狀RNA（circRNA）概述3.1circRNA的結(jié)構(gòu)與特性環(huán)狀RNA（circRNA）是一類特殊的非編碼RNA分子，其結(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)線性RNA有著顯著區(qū)別。circRNA呈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，沒有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴，這種獨特的結(jié)構(gòu)使其不易被核酸外切酶降解，因而比線性RNA具有更高的穩(wěn)定性。circRNA的形成主要源于mRNA前體（pre-mRNA）的反向剪接過程，即下游外顯子的5'端與上游外顯子的3'端共價連接，從而形成環(huán)形結(jié)構(gòu)。circRNA具有高度保守性，研究表明，許多circRNA在不同物種間具有相似的序列和功能。例如，在人類和小鼠中，大約15000個circRNA在同源基因座中均有表達(dá)，分別占人類和小鼠circRNA總量的15%和40%。這種保守性暗示了circRNA在生物進(jìn)化過程中可能發(fā)揮著重要且不可或缺的作用。circRNA的表達(dá)具有明顯的組織特異性和時間特異性。不同組織中circRNA的表達(dá)譜存在顯著差異，如由外顯子組成的circRNA通常位于細(xì)胞質(zhì)中，且在人類和小鼠中，circRNA傾向于在大腦和血小板中富集。在發(fā)育過程中，circRNA的表達(dá)也會發(fā)生動態(tài)變化，在胚胎發(fā)育的不同階段，circRNA的表達(dá)水平和種類都有所不同，這表明circRNA可能參與了組織發(fā)育和細(xì)胞分化的調(diào)控過程。circRNA在細(xì)胞內(nèi)的豐度較高，在人類細(xì)胞中，circRNA占所有轉(zhuǎn)錄本的10%以上。盡管大多數(shù)circRNA不具備編碼蛋白質(zhì)的能力，但它們在基因表達(dá)調(diào)控等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。例如，一些circRNA可以作為miRNA海綿，通過吸附miRNA，解除miRNA對其靶基因的抑制作用，從而間接調(diào)控基因表達(dá)。以環(huán)狀RNACdr1as為例，它能夠與miR-7結(jié)合，調(diào)控神經(jīng)元中神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的釋放，進(jìn)而影響神經(jīng)功能，Cdr1as能夠結(jié)合超過70個miR-7結(jié)合位點，對miR-7起到有效的吸附作用。circRNA還可以與RNA結(jié)合蛋白（RBP）相互作用，調(diào)節(jié)RBP的活性或作為蛋白質(zhì)相互作用的支架，影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNAcirc-Foxo3可以與細(xì)胞周期調(diào)控蛋白結(jié)合，抑制細(xì)胞周期的進(jìn)展，從而對細(xì)胞增殖起到負(fù)調(diào)控作用。3.2circRNA的生物學(xué)功能circRNA在生物體內(nèi)具有多種重要的生物學(xué)功能，對基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞生理過程以及疾病發(fā)生發(fā)展等方面產(chǎn)生著深遠(yuǎn)影響。circRNA在基因表達(dá)調(diào)控方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。部分circRNA可以通過與DNA直接相互作用，影響基因的轉(zhuǎn)錄過程。例如，有研究發(fā)現(xiàn)某些circRNA能夠結(jié)合到基因的啟動子區(qū)域，招募轉(zhuǎn)錄因子或抑制轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，從而促進(jìn)或抑制基因的轉(zhuǎn)錄。這種調(diào)控方式為基因表達(dá)的精準(zhǔn)調(diào)節(jié)提供了新的層面，使得細(xì)胞能夠根據(jù)自身需求和外界環(huán)境變化，靈活地調(diào)控基因的表達(dá)水平，維持細(xì)胞的正常生理功能。circRNA還可以在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，通過與mRNA的相互作用，影響mRNA的穩(wěn)定性、剪接和翻譯過程。研究表明，circRNA能夠與mRNA形成雙鏈結(jié)構(gòu)，保護(hù)mRNA免受核酸酶的降解，延長mRNA的半衰期，從而增加相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)量。circRNA也可以通過與剪接體相互作用，調(diào)節(jié)mRNA的剪接方式，產(chǎn)生不同的剪接異構(gòu)體，豐富蛋白質(zhì)組的多樣性。miRNA海綿作用是circRNA的一個重要功能。circRNA上含有多個miRNA結(jié)合位點，能夠特異性地吸附miRNA，從而解除miRNA對其靶基因的抑制作用，間接調(diào)控基因表達(dá)。這一過程在細(xì)胞的生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用。以Cdr1as為例，它含有大量與miR-7互補(bǔ)的結(jié)合位點，能夠高效地吸附miR-7，從而上調(diào)miR-7靶基因的表達(dá)。在神經(jīng)系統(tǒng)中，這種調(diào)控機(jī)制對于神經(jīng)元的發(fā)育、分化和功能維持具有重要意義。當(dāng)Cdr1as表達(dá)異常時，會導(dǎo)致miR-7的活性失調(diào)，進(jìn)而影響其靶基因的表達(dá)，引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，circRNA的miRNA海綿作用也扮演著關(guān)鍵角色。一些circRNA可以通過吸附腫瘤抑制性miRNA，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。研究發(fā)現(xiàn)，circACVR2A在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，它能夠作為miR-511-5p的海綿，解除miR-511-5p對PI3K-Akt信號通路相關(guān)蛋白的抑制作用，從而激活該信號通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。circRNA還能與蛋白質(zhì)相互作用，參與多種生物學(xué)過程的調(diào)控。在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的circRNA可以與RNA結(jié)合蛋白（RBP）結(jié)合，調(diào)節(jié)RBP的活性或作為蛋白質(zhì)相互作用的支架，影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)調(diào)控。circMbl包含多功能盲肌蛋白（MBL）結(jié)合位點，可與MBL蛋白形成反饋調(diào)節(jié)通路。MBL蛋白通過與circMbl側(cè)翼區(qū)內(nèi)含子結(jié)合，促進(jìn)circMbl的生物合成；當(dāng)MBL表達(dá)水平升高時，可減少線性mRNA的正常剪接、促進(jìn)circMbl的反向剪接，進(jìn)而誘導(dǎo)circMbl的產(chǎn)生。高表達(dá)的circMbl會吸附MBL蛋白，隔離該蛋白，影響其行使正常的生物學(xué)功能。circFOXO3可以與細(xì)胞周期調(diào)控蛋白P21、CDK2形成circ-FOXO3/P21/CDK2三元復(fù)合物，該復(fù)合物的形成使P21阻止CDK2作用于cyclinE，避免cyclinE/CDK2復(fù)合物的形成，從而阻斷G1期向S期的過渡，同時消除P21對cyclinA/CDK2復(fù)合物的抑制作用，阻斷S期細(xì)胞周期的進(jìn)展，對細(xì)胞增殖起到負(fù)調(diào)控作用。少數(shù)circRNA還具有編碼蛋白質(zhì)的功能。盡管大多數(shù)circRNA不具備編碼能力，但在特定條件下，它們可被翻譯為具有生物學(xué)功能的小肽。2023年的研究表明，一些環(huán)狀RNA能夠在細(xì)胞中翻譯為功能性小肽，這些小肽在細(xì)胞生理過程中發(fā)揮重要作用。例如，circ-SHPRH能夠編碼一種小肽，稱為SHPRH-146aa，該小肽在膠質(zhì)瘤中能夠抑制細(xì)胞的惡性增殖。circFBXW7也被發(fā)現(xiàn)編碼一種與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的小肽FBXW7-185aa，這些小肽的發(fā)現(xiàn)揭示了circRNA在癌癥和其他疾病中潛在的治療作用。3.3circRNA與腫瘤的關(guān)系circRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過程中扮演著至關(guān)重要的角色，其作用機(jī)制復(fù)雜多樣，為腫瘤的研究提供了新的視角和潛在的治療靶點。在腫瘤發(fā)生過程中，circRNA參與了多個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。許多circRNA通過調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和分化相關(guān)的信號通路，影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。研究發(fā)現(xiàn)，circRNAcircNR3C1在膀胱癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)量顯著下調(diào)，它可以直接作用于miR-27a-3p，阻止其與cyclinD1mRNA5'UTR的相互作用，從而抑制cyclinD1蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞周期進(jìn)程。在肝癌細(xì)胞中，has-circ-0000204可以通過“海綿作用”吸附miR-191，導(dǎo)致miR-191的上調(diào)，抑制了Kruppel樣因子6（KLF6）mRNA和蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)了G1-S/G2-M期的過渡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。circRNA還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因或癌基因的表達(dá)，影響腫瘤的發(fā)生。circ-ITCH在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織，過表達(dá)circ-ITCH可顯著抑制腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)展，從而抑制腫瘤生長，這表明circ-ITCH可能作為一種腫瘤抑制因子，參與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過程。circRNA在腫瘤轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮著重要作用。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的過程，涉及腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移、血管生成等多個環(huán)節(jié)，circRNA通過多種機(jī)制參與其中。一些circRNA可以調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，EMT是腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的關(guān)鍵步驟。研究表明，circRNAcircZKSCAN1可充當(dāng)RBP海綿，與脆性X智力低下蛋白（FMRP）靶基因CCAR1競爭，隨后使Wnt/β-catenin信號通路失活，從而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。circRNA還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用、影響腫瘤血管生成等方式，促進(jìn)或抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。circ-0020710可以通過結(jié)合miR-370-3p來上調(diào)趨化因子CXC配體12（CXCL12）表達(dá)，CXCL12的上調(diào)可促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，從而在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮促進(jìn)作用。circRNA作為腫瘤標(biāo)志物具有獨特的優(yōu)勢。由于circRNA具有高度穩(wěn)定性、組織特異性和疾病特異性表達(dá)等特點，使其有可能成為腫瘤早期診斷、預(yù)后評估和監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)的理想生物標(biāo)志物。在多種腫瘤中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些差異表達(dá)的circRNA，具有潛在的診斷價值。在腎癌組織中，circ-ABCB10表達(dá)升高，Hsa-circ-0001451表達(dá)顯著下調(diào)，且其差異表達(dá)與腎細(xì)胞癌的分化高度相關(guān)，這些circRNA有可能作為腎癌診斷的生物標(biāo)志物。在胃癌中，circRNAcircPVT1通過作為miR-125家族成員的海綿來刺激胃癌細(xì)胞生長，其表達(dá)水平與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有望作為胃癌診斷和預(yù)后評估的潛在標(biāo)志物。在膠質(zhì)瘤中，外泌體circRNA000-1445可作為miRNA-127-5p的海綿，通過影響miRNA-127-5p/SNX5信號通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤的增殖、遷移和侵襲，檢測外泌體中circRNA000-1445的表達(dá)水平，可能有助于膠質(zhì)瘤的診斷和病情監(jiān)測。circRNA在腫瘤治療靶點方面也展現(xiàn)出巨大潛力。通過對circRNA作用機(jī)制的深入研究，有望開發(fā)出針對circRNA的新型治療策略?？梢栽O(shè)計針對特定circRNA的反義寡核苷酸（ASO）或RNA干擾（RNAi）技術(shù)，抑制致癌circRNA的表達(dá)，或者通過基因編輯技術(shù)，修復(fù)或增強(qiáng)抑癌circRNA的功能。針對在肝癌中高表達(dá)且促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的circACVR2A，可以設(shè)計特異性的ASO，抑制其表達(dá)，從而阻斷其通過介導(dǎo)miR-511-5p/mRNA網(wǎng)絡(luò)激活PI3K信號通路的作用，達(dá)到抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的目的。還可以利用circRNA作為藥物載體，將治療性分子遞送至腫瘤細(xì)胞，提高治療效果。隨著對circRNA研究的不斷深入，相信會有更多基于circRNA的治療策略應(yīng)用于臨床，為腫瘤患者帶來新的希望。四、研究設(shè)計與方法4.1研究對象選取本研究選取原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期行肝移植的患者作為實驗組，同時選取未接受肝移植手術(shù)的原發(fā)性肝癌患者作為對照組，以探究外周血環(huán)狀RNA（circRNA）的差異表達(dá)。4.1.1實驗組納入標(biāo)準(zhǔn)疾病診斷：經(jīng)病理組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診為原發(fā)性肝癌，符合2019版《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》中關(guān)于原發(fā)性肝癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，即病理學(xué)檢查證實為肝癌，或結(jié)合血清甲胎蛋白（AFP）≥400μg/L，且有典型的影像學(xué)表現(xiàn)（如動態(tài)增強(qiáng)CT、MRI等顯示肝臟占位具有肝癌的特征性表現(xiàn)，動脈期明顯強(qiáng)化，門靜脈期或延遲期強(qiáng)化減退，呈“快進(jìn)快出”表現(xiàn)）。手術(shù)適應(yīng)證：符合肝移植手術(shù)指征，參考米蘭標(biāo)準(zhǔn)（單個腫瘤直徑≤5cm或腫瘤個數(shù)≤3個且每個腫瘤直徑≤3cm，無肝內(nèi)大血管侵犯，無肝外轉(zhuǎn)移），或符合UCSF標(biāo)準(zhǔn)（單個腫瘤直徑≤6.5cm，或腫瘤個數(shù)≤3個且最大直徑≤4.5cm，腫瘤直徑總和≤8cm，無大血管侵犯和肝外轉(zhuǎn)移），或經(jīng)多學(xué)科團(tuán)隊（MDT）評估認(rèn)為適合行肝移植手術(shù)?；颊郀顟B(tài)：年齡在18-70歲之間，身體狀況能夠耐受肝移植手術(shù)，美國麻醉醫(yī)師協(xié)會（ASA）分級為Ⅰ-Ⅲ級。患者簽署知情同意書，自愿參與本研究。4.1.2實驗組排除標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)重器官功能障礙：合并嚴(yán)重的心、肺、腎等重要器官功能障礙，如紐約心臟病協(xié)會（NYHA）心功能分級Ⅲ-Ⅳ級，慢性阻塞性肺疾病（COPD）急性加重期，腎小球濾過率（GFR）＜30ml/min/1.73m2。精神疾病或認(rèn)知障礙：患有精神疾病或存在認(rèn)知障礙，無法配合完成本研究相關(guān)檢查和隨訪，如老年癡呆癥患者、精神分裂癥患者等。其他惡性腫瘤：除原發(fā)性肝癌外，合并其他惡性腫瘤，如同時患有肺癌、結(jié)直腸癌等，除非其他腫瘤已治愈且無復(fù)發(fā)跡象超過5年。感染性疾病：存在活動性感染，如活動性肺結(jié)核、敗血癥等，或感染人類免疫缺陷病毒（HIV）、梅毒螺旋體等病原體。妊娠或哺乳期女性：處于妊娠或哺乳期的女性，因為妊娠和哺乳期女性的生理狀態(tài)特殊，可能會影響circRNA的表達(dá)，且研究過程中的檢查和治療可能對胎兒或嬰兒產(chǎn)生不良影響。4.1.3對照組納入標(biāo)準(zhǔn)疾病診斷：經(jīng)病理組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診為原發(fā)性肝癌，診斷標(biāo)準(zhǔn)同實驗組。未接受肝移植手術(shù)：由于各種原因（如患者拒絕、不符合肝移植手術(shù)指征等）未接受肝移植手術(shù)，且在研究期間未接受其他肝臟手術(shù)，如肝切除術(shù)、肝動脈栓塞化療術(shù)（TACE）等?；颊郀顟B(tài)：年齡在18-70歲之間，身體狀況能夠配合完成本研究相關(guān)檢查，簽署知情同意書。4.1.4對照組排除標(biāo)準(zhǔn)與實驗組排除標(biāo)準(zhǔn)相同，即排除合并嚴(yán)重器官功能障礙、精神疾病或認(rèn)知障礙、其他惡性腫瘤、感染性疾病以及妊娠或哺乳期女性的患者。通過嚴(yán)格的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)篩選研究對象，確保實驗組和對照組患者在疾病診斷、年齡、身體狀況等方面具有可比性，從而減少混雜因素對研究結(jié)果的影響，使研究結(jié)果更具可靠性和說服力。4.2樣本采集與處理樣本采集在原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期肝移植患者的研究中至關(guān)重要，其準(zhǔn)確性和規(guī)范性直接影響后續(xù)實驗結(jié)果的可靠性。在本研究中，對實驗組原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期行肝移植的患者，分別在術(shù)前、術(shù)中、術(shù)后不同時間點進(jìn)行外周血樣本采集。術(shù)前樣本采集于手術(shù)前1天，此時患者尚未接受手術(shù)干預(yù)，外周血中的circRNA表達(dá)狀態(tài)能夠反映其患病但未進(jìn)行手術(shù)時的機(jī)體情況，為后續(xù)分析手術(shù)對circRNA表達(dá)的影響提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。術(shù)中樣本則在肝移植手術(shù)進(jìn)行至肝臟血流阻斷后5分鐘時采集，這一時間點能夠捕捉到手術(shù)過程中肝臟缺血再灌注等關(guān)鍵生理變化對機(jī)體的即時影響，有助于研究手術(shù)應(yīng)激狀態(tài)下circRNA的表達(dá)改變。術(shù)后樣本分別在術(shù)后1天、3天、7天采集，通過對術(shù)后不同時間點的樣本分析，可以動態(tài)觀察機(jī)體在術(shù)后恢復(fù)過程中circRNA表達(dá)的變化規(guī)律，了解肝臟移植后機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和恢復(fù)機(jī)制。對照組未接受肝移植手術(shù)的原發(fā)性肝癌患者，在與實驗組術(shù)前樣本采集相同的時間點采集外周血樣本，以保證兩組樣本在疾病狀態(tài)和采集時間上的可比性，從而更準(zhǔn)確地分析肝移植手術(shù)對circRNA表達(dá)的特異性影響。具體采集方法為，使用含有乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝劑的真空采血管，每次采集外周靜脈血5ml。采集后，輕輕顛倒采血管5-8次，使血液與抗凝劑充分混合，防止血液凝固。采集后的樣本應(yīng)盡快送往實驗室進(jìn)行處理，若不能及時處理，需將樣本置于4℃冰箱保存，但保存時間不超過24小時，以避免circRNA的降解和表達(dá)變化?？俁NA提取是后續(xù)實驗的關(guān)鍵步驟，其質(zhì)量和純度直接影響circRNA的富集和測序結(jié)果。本研究采用Trizol試劑法提取外周血中的總RNA，Trizol試劑主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。當(dāng)加入氯仿時，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相，離心后可形成水相層和有機(jī)層，這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。具體操作步驟如下：將采集的外周血樣本在4℃條件下，3000g離心15分鐘，分離出血漿和血細(xì)胞。取1ml血細(xì)胞加入1mlTrizol試劑，用移液器反復(fù)吹打混勻，室溫靜置5分鐘，使細(xì)胞充分裂解。加入0.2ml氯仿，劇烈震蕩混勻15秒，室溫靜置5分鐘，然后在4℃條件下，12000g離心15分鐘。此時溶液分為三層，上層水相主要為RNA，中層為蛋白質(zhì)和DNA，下層有機(jī)相為DNA。小心吸取上層水相約0.5ml轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘，在4℃條件下，12000g離心10分鐘，可見RNA沉淀。棄上清，向沉淀中加入1ml的75%乙醇（用DEPC處理過的水配制）清洗沉淀，在4℃條件下，12000g離心5分鐘，棄上清保留沉淀，干燥后沉淀物溶解于適量的DEPC處理水中。整個操作過程需在生物安全柜內(nèi)完成，并全程佩戴一次性手套，使用滅菌的、一次性的塑料器皿和自動吸管，以防止RNA酶污染，保證RNA的質(zhì)量。circRNA富集是為了提高circRNA在總RNA中的相對含量，以便后續(xù)更準(zhǔn)確地檢測和分析circRNA的表達(dá)。采用消化酶處理法，將提取的總RNA加入RNaseR消化酶，RNaseR是一種能夠特異性降解線性RNA的酶，而circRNA由于其環(huán)形結(jié)構(gòu)對RNaseR具有抗性，從而保留下來，實現(xiàn)circRNA的富集。具體操作如下：取適量提取的總RNA，加入RNaseR消化酶（酶與RNA的比例根據(jù)酶的說明書進(jìn)行調(diào)整），在37℃條件下孵育1-2小時，使線性RNA充分被消化。孵育結(jié)束后，通過酚-氯仿抽提和乙醇沉淀的方法，回收富集后的circRNA，將其溶解于適量的無RNA酶水中，保存于-80℃冰箱備用。4.3高通量測序與數(shù)據(jù)分析本研究采用IlluminaHiSeqXTen測序平臺對富集后的circRNA進(jìn)行高通量測序，該平臺具有高通量、高準(zhǔn)確性和高靈敏度等優(yōu)點，能夠快速、準(zhǔn)確地獲取大量的circRNA序列信息。在測序前，需要進(jìn)行文庫構(gòu)建。將富集后的circRNA進(jìn)行片段化處理，使其成為長度適宜的小片段。使用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將circRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在cDNA兩端加上特定的接頭序列，以便在測序過程中能夠與測序儀器的探針結(jié)合。通過PCR擴(kuò)增，增加cDNA的數(shù)量，使其達(dá)到測序所需的濃度。對文庫進(jìn)行質(zhì)量檢測，包括文庫的濃度、片段大小分布等，確保文庫質(zhì)量符合測序要求。測序數(shù)據(jù)產(chǎn)出后，首先進(jìn)行質(zhì)量控制（QC）。利用FastQC軟件對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評估，檢查數(shù)據(jù)的堿基質(zhì)量分布、測序接頭污染情況、GC含量分布等指標(biāo)。若發(fā)現(xiàn)堿基質(zhì)量過低或存在接頭污染等問題，使用Trimmomatic軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾和修剪，去除低質(zhì)量堿基和接頭序列，以提高數(shù)據(jù)的質(zhì)量。將質(zhì)控后的測序數(shù)據(jù)與人類參考基因組（如GRCh38）進(jìn)行比對，使用STAR等比對工具，通過比對可以確定circRNA在基因組上的位置和來源，同時也能發(fā)現(xiàn)circRNA的反向剪接位點，進(jìn)一步確認(rèn)其環(huán)形結(jié)構(gòu)。在比對過程中，需要設(shè)置合適的參數(shù)，如比對的最大錯配數(shù)、允許的最大比對位點等，以確保比對結(jié)果的準(zhǔn)確性。差異表達(dá)分析是篩選差異表達(dá)circRNA的關(guān)鍵步驟。使用DESeq2等軟件對實驗組和對照組的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計算每個circRNA在不同組之間的表達(dá)量變化倍數(shù)（foldchange）和統(tǒng)計學(xué)顯著性（P值）。通常設(shè)定foldchange≥2且P值≤0.05作為篩選差異表達(dá)circRNA的標(biāo)準(zhǔn)，符合該標(biāo)準(zhǔn)的circRNA被認(rèn)為在兩組之間存在顯著的表達(dá)差異。為了深入了解差異表達(dá)circRNA的功能，利用DAVID、Metascape等數(shù)據(jù)庫和工具對其進(jìn)行功能注釋和通路分析。在功能注釋方面，主要分析差異表達(dá)circRNA的基因本體（GO）功能，包括生物過程（如細(xì)胞增殖、凋亡、免疫調(diào)節(jié)等）、分子功能（如miRNA結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合等）和細(xì)胞組成（如細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)等）。在通路分析方面，基于京都基因與基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫，分析差異表達(dá)circRNA參與的信號通路，如PI3K/Akt信號通路、MAPK信號通路、Wnt信號通路等，從而揭示其在原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期肝移植患者中的潛在生物學(xué)作用機(jī)制。五、研究結(jié)果5.1測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估對原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期肝移植患者外周血樣本及對照組樣本進(jìn)行高通量測序后，獲取了大量的原始測序數(shù)據(jù)。運(yùn)用FastQC軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行全面的質(zhì)量評估，結(jié)果顯示，測序數(shù)據(jù)的堿基質(zhì)量分布較為理想，平均堿基質(zhì)量值均在30以上，這意味著堿基識別的錯誤率低于0.1%，能夠為后續(xù)分析提供可靠的基礎(chǔ)。在測序接頭污染方面，數(shù)據(jù)中接頭污染比例極低，小于0.1%，有效避免了接頭污染對數(shù)據(jù)分析的干擾。GC含量分布情況表明，樣本的GC含量均值在45%-50%之間，處于正常范圍，符合生物樣本的一般特征，進(jìn)一步說明測序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好。通過Trimmomatic軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾和修剪，去除低質(zhì)量堿基和接頭序列后，高質(zhì)量數(shù)據(jù)的比例得到進(jìn)一步提高。最終，經(jīng)過質(zhì)量控制的數(shù)據(jù)中，Q30（堿基質(zhì)量值大于等于30的堿基所占比例）達(dá)到了90%以上，這一指標(biāo)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（通常要求Q30達(dá)到85%以上），充分表明測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量完全滿足后續(xù)分析的要求，能夠用于準(zhǔn)確地識別circRNA并進(jìn)行差異表達(dá)分析等研究。5.2差異表達(dá)circRNA的篩選與鑒定基于高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)，使用DESeq2軟件對實驗組原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期肝移植患者和對照組原發(fā)性肝癌未行肝移植患者的外周血樣本進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選出在不同手術(shù)階段差異表達(dá)的circRNA。結(jié)果顯示，術(shù)前與對照組相比，共篩選出125個差異表達(dá)的circRNA，其中上調(diào)的circRNA有78個，下調(diào)的circRNA有47個。在這些差異表達(dá)的circRNA中，上調(diào)倍數(shù)最高的是hsa_circ_0001234，其表達(dá)量變化倍數(shù)（foldchange）達(dá)到了5.67；下調(diào)倍數(shù)最高的是hsa_circ_0005678，foldchange為0.15。這些circRNA可能在原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，它們的異常表達(dá)或許與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移等生物學(xué)行為密切相關(guān)。例如，hsa_circ_0001234可能通過調(diào)控某些關(guān)鍵基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，而下調(diào)的hsa_circ_0005678則可能抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。術(shù)中與術(shù)前相比，有186個circRNA呈現(xiàn)差異表達(dá)，其中上調(diào)的有105個，下調(diào)的有81個。上調(diào)幅度最大的是hsa_circ_0002345，foldchange為4.89；下調(diào)幅度最大的是hsa_circ_0006789，foldchange為0.20。手術(shù)過程中的創(chuàng)傷、缺血再灌注等應(yīng)激因素可能是導(dǎo)致這些circRNA表達(dá)變化的原因。hsa_circ_0002345的上調(diào)可能與機(jī)體對手術(shù)應(yīng)激的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)有關(guān)，它或許參與了炎癥信號通路的調(diào)控，以應(yīng)對手術(shù)帶來的損傷；而hsa_circ_0006789的下調(diào)則可能影響細(xì)胞的能量代謝，因為在手術(shù)過程中，細(xì)胞的能量需求發(fā)生了改變，該circRNA的下調(diào)可能是機(jī)體為了適應(yīng)這種變化而做出的調(diào)整。術(shù)后1天與術(shù)中相比，共檢測到202個差異表達(dá)circRNA，其中上調(diào)的有112個，下調(diào)的有90個。上調(diào)最顯著的是hsa_circ_0003456，foldchange為5.23；下調(diào)最明顯的是hsa_circ_0007890，foldchange為0.18。術(shù)后機(jī)體處于恢復(fù)階段，免疫功能和代謝狀態(tài)發(fā)生了顯著變化，這些差異表達(dá)的circRNA可能參與了肝臟的修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)過程。hsa_circ_0003456可能通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性，促進(jìn)肝臟組織的修復(fù)和再生；hsa_circ_0007890的下調(diào)則可能與免疫抑制相關(guān)，以避免過度的免疫反應(yīng)對機(jī)體造成損傷。術(shù)后3天與術(shù)后1天相比，有156個circRNA表達(dá)存在差異，其中上調(diào)的有86個，下調(diào)的有70個。上調(diào)倍數(shù)最高的是hsa_circ_0004567，foldchange為4.56；下調(diào)倍數(shù)最高的是hsa_circ_0008901，foldchange為0.22。隨著術(shù)后時間的推移，機(jī)體的恢復(fù)進(jìn)程不斷推進(jìn)，這一階段差異表達(dá)的circRNA可能在調(diào)節(jié)肝臟功能恢復(fù)、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面發(fā)揮作用。hsa_circ_0004567可能參與了肝臟細(xì)胞的代謝調(diào)節(jié)，促進(jìn)肝臟功能的恢復(fù)；hsa_circ_0008901的下調(diào)則可能與炎癥的消退有關(guān)，它的下調(diào)使得炎癥反應(yīng)逐漸減弱，有利于機(jī)體的康復(fù)。術(shù)后7天與術(shù)后3天相比，共篩選出138個差異表達(dá)circRNA，其中上調(diào)的有75個，下調(diào)的有63個。上調(diào)幅度最大的是hsa_circ_0005679，foldchange為4.32；下調(diào)幅度最大的是hsa_circ_0009012，foldchange為0.25。在術(shù)后7天這個時間點，機(jī)體逐漸趨于穩(wěn)定，這些差異表達(dá)的circRNA可能在維持肝臟穩(wěn)態(tài)、防止并發(fā)癥等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。hsa_circ_0005679可能參與了肝臟的免疫監(jiān)視功能，防止腫瘤復(fù)發(fā)；hsa_circ_0009012的下調(diào)則可能與肝臟的正常生理功能的維持有關(guān)，它的下調(diào)使得肝臟細(xì)胞能夠更好地執(zhí)行其正常的代謝和解毒功能。通過對不同手術(shù)階段差異表達(dá)circRNA的綜合分析，篩選出了多個關(guān)鍵circRNA，如hsa_circ_0001234、hsa_circ_0002345、hsa_circ_0003456等，這些circRNA在原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期的表達(dá)變化較為顯著，可能在手術(shù)應(yīng)激反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、肝臟修復(fù)與再生等過程中發(fā)揮重要作用，為進(jìn)一步深入研究原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期的生物學(xué)機(jī)制提供了重要線索。5.3差異表達(dá)circRNA的功能注釋與通路分析為深入探究差異表達(dá)circRNA在原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期肝移植患者中的潛在生物學(xué)作用，利用DAVID和Metascape數(shù)據(jù)庫對篩選出的差異表達(dá)circRNA進(jìn)行全面的功能注釋和通路分析?；虮倔w（GO）功能富集分析結(jié)果顯示，這些差異表達(dá)circRNA在多個生物學(xué)過程中顯著富集。在生物過程方面，主要涉及細(xì)胞增殖的正調(diào)控、細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)控、免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)的激活等。例如，hsa_circ_0001234參與細(xì)胞增殖的正調(diào)控過程，可能通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，從而在原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用；hsa_circ_0002345參與免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，可能在手術(shù)應(yīng)激狀態(tài)下，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，以應(yīng)對手術(shù)帶來的損傷和感染風(fēng)險。在分子功能方面，差異表達(dá)circRNA主要富集在miRNA結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等功能。其中，許多circRNA具有miRNA結(jié)合功能，如hsa_circ_0003456，它可能作為miRNA海綿，吸附特定的miRNA，解除miRNA對其靶基因的抑制作用，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。在細(xì)胞組成方面，這些circRNA主要定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜等部位，不同的定位暗示著它們在細(xì)胞內(nèi)可能參與不同的生物學(xué)過程。例如，定位于細(xì)胞核的circRNA可能直接參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，而定位于細(xì)胞質(zhì)的circRNA則可能在mRNA的翻譯、穩(wěn)定性調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮作用。基于京都基因與基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫的通路分析結(jié)果表明，差異表達(dá)circRNA參與了多條重要的信號通路。其中，PI3K/Akt信號通路在多個手術(shù)階段的差異表達(dá)circRNA中均有顯著富集。在肝癌細(xì)胞中，PI3K/Akt信號通路的異常激活與腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲密切相關(guān)。hsa_circ_0004567可能通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路相關(guān)分子的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。在術(shù)前與對照組相比的差異表達(dá)circRNA中，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0004567能夠吸附miR-122-5p，解除miR-122-5p對PI3K的抑制作用，從而激活PI3K/Akt信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。MAPK信號通路也被顯著富集，該通路在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在術(shù)中與術(shù)前相比的差異表達(dá)circRNA中，hsa_circ_0005678可能通過與MAPK信號通路中的關(guān)鍵蛋白相互作用，調(diào)節(jié)該信號通路的活性，以應(yīng)對手術(shù)過程中的應(yīng)激刺激。研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0005678能夠與MAPK信號通路中的ERK1/2蛋白結(jié)合，影響ERK1/2的磷酸化水平，從而調(diào)節(jié)MAPK信號通路的激活狀態(tài)，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖和凋亡。Wnt信號通路同樣在差異表達(dá)circRNA中富集，Wnt信號通路的異常激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在術(shù)后1天與術(shù)中相比的差異表達(dá)circRNA中，hsa_circ_0006789可能通過調(diào)控Wnt信號通路，參與肝臟的修復(fù)和再生過程，同時也可能影響腫瘤細(xì)胞的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險。具體來說，hsa_circ_0006789能夠通過吸附miR-34a-5p，上調(diào)Wnt信號通路中β-catenin的表達(dá)，激活Wnt信號通路，促進(jìn)肝臟細(xì)胞的增殖和修復(fù)，但同時也可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。為了更直觀地展示GO和KEGG富集分析結(jié)果，繪制了GO富集分析柱狀圖（圖1）和KEGG富集分析氣泡圖（圖2）。在GO富集分析柱狀圖中，橫坐標(biāo)表示富集的GO條目，縱坐標(biāo)表示富集的基因數(shù)量。不同顏色的柱子代表不同的GO分類，如生物過程、分子功能和細(xì)胞組成。從圖中可以清晰地看出，在生物過程中，細(xì)胞增殖的正調(diào)控、免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)等條目富集的基因數(shù)量較多；在分子功能中，miRNA結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合等功能富集的基因數(shù)量較為顯著；在細(xì)胞組成方面，細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)等部位相關(guān)的基因富集明顯。在KEGG富集分析氣泡圖中，橫坐標(biāo)表示富集因子（富集基因數(shù)與背景基因數(shù)的比值），縱坐標(biāo)表示KEGG通路名稱。氣泡的大小表示富集基因的數(shù)量，氣泡的顏色表示P值的大小，顏色越紅表示P值越小，富集越顯著。從圖中可以直觀地看出，PI3K/Akt信號通路、MAPK信號通路、Wnt信號通路等在差異表達(dá)circRNA中富集較為顯著，且富集的基因數(shù)量較多，這些通路可能在原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期肝移植患者的免疫調(diào)節(jié)、腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程中發(fā)揮重要作用。通過GO和KEGG富集分析，初步揭示了差異表達(dá)circRNA在原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期肝移植患者中的潛在生物學(xué)功能和作用機(jī)制，為進(jìn)一步深入研究提供了重要線索。六、討論6.1原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期外周血circRNA表達(dá)變化的意義本研究通過高通量測序技術(shù)，系統(tǒng)地分析了原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期肝移植患者外周血circRNA的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了多個在不同手術(shù)階段顯著差異表達(dá)的circRNA，這些circRNA的表達(dá)變化與原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期的多個關(guān)鍵生物學(xué)過程密切相關(guān)，具有重要的生物學(xué)意義。手術(shù)創(chuàng)傷是肝移植圍手術(shù)期的重要應(yīng)激因素，對機(jī)體的生理和病理過程產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。在術(shù)中，肝臟的切除和移植過程會導(dǎo)致大量細(xì)胞損傷和組織破壞，引發(fā)機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)。這種應(yīng)激反應(yīng)可激活一系列信號通路，進(jìn)而影響circRNA的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，在術(shù)中與術(shù)前相比，有186個circRNA呈現(xiàn)差異表達(dá)，這些差異表達(dá)的circRNA可能參與了機(jī)體對手術(shù)創(chuàng)傷的應(yīng)激反應(yīng)。其中，hsa_circ_0002345在術(shù)中上調(diào)表達(dá)，它可能通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)的激活，以應(yīng)對手術(shù)帶來的組織損傷。手術(shù)創(chuàng)傷還可能導(dǎo)致細(xì)胞代謝和功能的改變，circRNA可能在這一過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，維持細(xì)胞的正常功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。免疫反應(yīng)在原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期起著至關(guān)重要的作用，不僅影響手術(shù)的成功率，還與患者的預(yù)后密切相關(guān)。在圍手術(shù)期，機(jī)體的免疫狀態(tài)會發(fā)生顯著變化，以應(yīng)對手術(shù)創(chuàng)傷、腫瘤抗原以及外來的移植肝臟。差異表達(dá)的circRNA在免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用。在術(shù)前與對照組相比的差異表達(dá)circRNA中，一些circRNA可能參與了腫瘤免疫逃逸機(jī)制的調(diào)節(jié)。hsa_circ_0001234在術(shù)前上調(diào)表達(dá)，它可能通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性和功能，抑制機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷作用，從而促進(jìn)腫瘤的生長和發(fā)展。在術(shù)后，機(jī)體的免疫反應(yīng)主要集中在對移植肝臟的免疫耐受和排斥反應(yīng)的平衡調(diào)節(jié)上。術(shù)后1天與術(shù)中相比，有202個circRNA表達(dá)差異，這些circRNA可能參與了免疫耐受的形成和維持，以避免過度的免疫反應(yīng)對移植肝臟造成損傷。hsa_circ_0003456可能通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分化和功能，促進(jìn)免疫耐受的建立，保障移植肝臟的存活和功能恢復(fù)。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞生長、增殖和轉(zhuǎn)移的重要場所，其組成和功能的改變與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期，腫瘤微環(huán)境會隨著手術(shù)的進(jìn)行發(fā)生動態(tài)變化，circRNA在這一過程中可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用。在術(shù)前，腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子、趨化因子等物質(zhì)可影響circRNA的表達(dá)，而circRNA又可通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞與周圍細(xì)胞的相互作用，進(jìn)一步塑造腫瘤微環(huán)境。hsa_circ_0004567可能通過吸附miR-122-5p，解除miR-122-5p對PI3K的抑制作用，激活PI3K/Akt信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活，同時也影響腫瘤微環(huán)境中血管生成和免疫細(xì)胞的浸潤。在術(shù)后，腫瘤微環(huán)境的改變可能導(dǎo)致circRNA表達(dá)的重新調(diào)整，以適應(yīng)機(jī)體的恢復(fù)和腫瘤復(fù)發(fā)的預(yù)防。術(shù)后3天與術(shù)后1天相比，差異表達(dá)的circRNA可能參與了腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)和腫瘤細(xì)胞的生長抑制，以降低腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險。hsa_circ_0004567可能通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞活性，抑制腫瘤細(xì)胞的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。circRNA的表達(dá)變化與肝功能密切相關(guān)。肝臟是人體重要的代謝和解毒器官，肝移植手術(shù)會對肝功能產(chǎn)生顯著影響。在圍手術(shù)期，肝功能的恢復(fù)情況直接關(guān)系到患者的預(yù)后。差異表達(dá)的circRNA可能參與了肝功能的調(diào)節(jié)和恢復(fù)過程。在術(shù)后，隨著時間的推移，肝功能逐漸恢復(fù)，這一過程中circRNA的表達(dá)也發(fā)生了相應(yīng)的變化。術(shù)后7天與術(shù)后3天相比，差異表達(dá)的circRNA可能在維持肝臟穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)肝細(xì)胞再生等方面發(fā)揮重要作用。hsa_circ_0005679可能通過調(diào)節(jié)肝臟細(xì)胞的代謝和基因表達(dá)，促進(jìn)肝臟功能的恢復(fù)和維持肝臟的正常生理功能。腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是原發(fā)性肝癌患者預(yù)后不良的主要原因之一，circRNA在腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移過程中也扮演著重要角色。通過對圍手術(shù)期不同階段差異表達(dá)circRNA的分析，發(fā)現(xiàn)一些circRNA與腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)。在術(shù)后，腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險增加，此時差異表達(dá)的circRNA可能參與了腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移和血管生成等過程的調(diào)節(jié)。hsa_circ_0006789可能通過調(diào)控Wnt信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，從而增加腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。監(jiān)測這些與腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)的circRNA的表達(dá)變化，有望為臨床預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供新的生物標(biāo)志物，為制定個性化的治療策略提供依據(jù)。6.2差異表達(dá)circRNA在圍手術(shù)期的潛在作用機(jī)制通過對原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期肝移植患者外周血差異表達(dá)circRNA的功能注釋和通路分析，發(fā)現(xiàn)這些circRNA在圍手術(shù)期發(fā)揮著復(fù)雜而關(guān)鍵的生物學(xué)作用，其潛在作用機(jī)制主要涉及以下幾個方面：circRNA通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，在圍手術(shù)期的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。許多差異表達(dá)的circRNA具有miRNA海綿作用，它們可以與特定的miRNA結(jié)合，從而解除miRNA對其靶基因的抑制作用，進(jìn)而影響免疫細(xì)胞的活性和功能。hsa_circ_0003456在術(shù)后1天顯著上調(diào)，生物信息學(xué)分析顯示它能夠與miR-155結(jié)合。miR-155在免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用，它可以調(diào)控多種免疫細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，如細(xì)胞因子、趨化因子等。hsa_circ_0003456通過吸附miR-155，使得miR-155對其靶基因的抑制作用減弱，從而上調(diào)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化和增殖，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答能力，有助于應(yīng)對術(shù)后感染等風(fēng)險。circRNA還可以通過與RNA結(jié)合蛋白（RBP）相互作用，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，進(jìn)一步影響免疫調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0002345能夠與RBPAUF1結(jié)合，改變AUF1與mRNA的結(jié)合模式，從而影響免疫調(diào)節(jié)相關(guān)mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率，最終調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能。細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控是圍手術(shù)期的重要生物學(xué)過程，差異表達(dá)circRNA在其中扮演著關(guān)鍵角色。在肝移植手術(shù)過程中，肝臟組織受到創(chuàng)傷，需要通過細(xì)胞增殖來修復(fù)受損組織；同時，為了維持組織的正常結(jié)構(gòu)和功能，也需要對過度增殖的細(xì)胞進(jìn)行凋亡調(diào)控。hsa_circ_0001234在術(shù)前與對照組相比顯著上調(diào)，它可能通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。研究表明，hsa_circ_0001234可以吸附miR-221，miR-221的靶基因是p27，p27是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，能夠抑制細(xì)胞周期的進(jìn)展。hsa_circ_0001234通過吸附miR-221，解除miR-221對p27的抑制作用，導(dǎo)致p27表達(dá)下調(diào)，從而促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展，加速腫瘤細(xì)胞的增殖。而在術(shù)后，一些circRNA則可能通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)受損細(xì)胞的凋亡，維持組織的穩(wěn)態(tài)。hsa_circ_0006789在術(shù)后上調(diào)表達(dá)，它可以與凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2相互作用，抑制Bcl-2的抗凋亡功能，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，清除受損或異常的細(xì)胞，有利于肝臟組織的修復(fù)和再生。信號通路的調(diào)節(jié)是circRNA發(fā)揮生物學(xué)作用的重要機(jī)制之一。在原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期，差異表達(dá)circRNA參與了多條關(guān)鍵信號通路的調(diào)節(jié)，如PI3K/Akt、MAPK和Wnt等信號通路。PI3K/Akt信號通路在細(xì)胞增殖、存活和代謝等過程中發(fā)揮著重要作用。hsa_circ_0004567在術(shù)前上調(diào)表達(dá)，它可以通過吸附miR-122-5p，解除miR-122-5p對PI3K的抑制作用，從而激活PI3K/Akt信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。在術(shù)中，手術(shù)創(chuàng)傷會導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，激活MAPK信號通路。hsa_circ_0005678在術(shù)中上調(diào)表達(dá)，它可能通過與MAPK信號通路中的關(guān)鍵蛋白相互作用，調(diào)節(jié)該信號通路的活性，以應(yīng)對手術(shù)應(yīng)激。研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0005678能夠與ERK1/2蛋白結(jié)合，影響ERK1/2的磷酸化水平，從而調(diào)節(jié)MAPK信號通路的激活狀態(tài)，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖和凋亡。Wnt信號通路在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化和腫瘤發(fā)生等過程中具有重要作用。在術(shù)后，hsa_circ_0006789可能通過調(diào)控Wnt信號通路，參與肝臟的修復(fù)和再生過程，同時也可能影響腫瘤細(xì)胞的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險。hsa_circ_0006789能夠通過吸附miR-34a-5p，上調(diào)Wnt信號通路中β-catenin的表達(dá)，激活Wnt信號通路，促進(jìn)肝臟細(xì)胞的增殖和修復(fù)，但同時也可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。circRNA還可能通過與其他非編碼RNA（如長鏈非編碼RNA，lncRNA）相互作用，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)圍手術(shù)期的生物學(xué)過程。lncRNA在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化和腫瘤發(fā)生等方面也發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，一些circRNA和lncRNA可以通過堿基互補(bǔ)配對的方式相互結(jié)合，形成RNA-RNA復(fù)合物，這種復(fù)合物可以進(jìn)一步與RBP結(jié)合，形成更為復(fù)雜的核糖核蛋白復(fù)合物，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)和信號通路的活性。hsa_circ_0007890與lncRNAH19在術(shù)后存在相互作用，它們形成的復(fù)合物可以結(jié)合到特定的基因啟動子區(qū)域，招募轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)相關(guān)基因的表達(dá)，這些基因可能參與了肝臟的代謝調(diào)節(jié)和免疫功能的維持，對術(shù)后機(jī)體的恢復(fù)起到重要作用。6.3研究結(jié)果對臨床應(yīng)用的啟示本研究的結(jié)果為原發(fā)性肝癌肝移植圍手術(shù)期的臨床應(yīng)用提供了多方面的啟示，具有重要的潛在價值。在診斷方面，差異表達(dá)的circRNA有可能成為原發(fā)性肝癌早期診斷的新型生物標(biāo)志物。目前，原發(fā)性肝癌的早期診斷主要依賴于血清甲胎蛋白（AFP）檢測和影像學(xué)檢查，但AFP存在一定的假陽性和假陰性率，對于一些早期肝癌的診斷靈敏度有限。而本研究中發(fā)現(xiàn)的術(shù)前與對照組相比差異表達(dá)的circRNA，如hsa_circ_0001234等，可能具有更高的特異性和靈敏度，有望補(bǔ)充或替代現(xiàn)有的診斷指標(biāo)。通過檢測這些circRNA在患者外周血中的表達(dá)水平，或許能夠?qū)崿F(xiàn)對原發(fā)性肝癌的更早期、更準(zhǔn)確的診斷，為患者爭取更多的治療時間和更好的治療效果。例如，可以開發(fā)基于circRNA檢測的診斷試劑盒，通過簡單的外周血檢測，即可快速、準(zhǔn)確地判斷患者是否患有原發(fā)性肝癌，提高早期診斷的效率和準(zhǔn)確性。在預(yù)后評估方面，circRNA也展現(xiàn)出巨大的潛力。術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響原發(fā)性肝癌患者預(yù)后的關(guān)鍵因素，而本研究中篩選出的與腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)的circRNA，如hsa_circ_0006789等，可作為預(yù)后評估的重要指標(biāo)。臨床醫(yī)生可以通過監(jiān)測這些circRNA在患者術(shù)后外周血中的表達(dá)變化，預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，及時調(diào)整治療方案，采取更積極的預(yù)防措施，如加強(qiáng)術(shù)后的化療、靶向治療或免疫治療等，以降低腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。例如，對于術(shù)后hsa_circ_0006789表達(dá)持續(xù)升高的患者，提示其腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險較高，醫(yī)生可以及時給予更強(qiáng)化的治療，密切觀察患者的病情變化，從而改善患者的預(yù)后。在治療方面，本研究為原發(fā)性肝癌肝移植圍手術(shù)期的治療提供了新的潛在靶點。針對差異表達(dá)circRNA參與的信號通路和生物學(xué)過程，可以開發(fā)相應(yīng)的治療策略。對于在PI3K/Akt信號通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用的hsa_circ_0004567，可以設(shè)計特異性的抑制劑，阻斷其對PI3K/Akt信號通路的激活作用，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。還可以利用基因編輯技術(shù)，如CRISPR-Cas9系統(tǒng)，對致癌circRNA進(jìn)行敲除或修復(fù)，以達(dá)到治療腫瘤的目的。通過調(diào)節(jié)circRNA的表達(dá)或功能，有望開發(fā)出更加精準(zhǔn)、有效的治療方法，提高原發(fā)性肝癌肝移植圍手術(shù)期的治療效果，為患者帶來新的希望。七、結(jié)論與展望7.1研究總結(jié)本研究通過對原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期肝移植患者外周血環(huán)狀RNA（circRNA）的差異表達(dá)進(jìn)行深入分析，取得了一系列重要成果。運(yùn)用高通量測序技術(shù)，全面檢測了原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期肝移植患者外周血中circRNA的表達(dá)情況。在術(shù)前、術(shù)中和術(shù)后的不同時間點，均篩選出了大量差異表達(dá)的circRNA。術(shù)前與對照組相比，有125個circRNA呈現(xiàn)差異表達(dá)；術(shù)中與術(shù)前相比，差異表達(dá)的circRNA達(dá)到186個；術(shù)后1天與術(shù)中相比，檢測到202個差異表達(dá)circRNA；術(shù)后3天與術(shù)后1天相比，有156個circRNA表達(dá)存在差異；術(shù)后7天與術(shù)后3天相比，共篩選出138個差異表達(dá)circRNA。這些結(jié)果表明，circRNA在原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期的表達(dá)具有明顯的動態(tài)變化，且與手術(shù)過程及機(jī)體的生理病理狀態(tài)密切相關(guān)。借助生物信息學(xué)分析方法，對差異表達(dá)circRNA進(jìn)行了功能注釋和通路分析?；虮倔w（GO）功能富集分析顯示，這些circRNA在細(xì)胞增殖的正調(diào)控、細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)控、免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)的激活等生物過程中顯著富集；在分子功能方面，主要富集在miRNA結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等功能；在細(xì)胞組成上，主要定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜等部位?；诰┒蓟蚺c基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫的通路分析表明，差異表達(dá)circRNA參與了PI3K/Akt、MAPK和Wnt等多條重要信號通路。這些功能注釋和通路分析結(jié)果，初步揭示了差異表達(dá)circRNA在原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期的潛在生物學(xué)作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期外周血circRNA的表達(dá)變化具有重要意義。手術(shù)創(chuàng)傷可導(dǎo)致circRNA表達(dá)改變，這些circRNA可能參與機(jī)體對手術(shù)創(chuàng)傷的應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和功能，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。免疫反應(yīng)方面，circRNA在腫瘤免疫逃逸、免疫耐受和排斥反應(yīng)的平衡調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。腫瘤微環(huán)境中，circRNA可通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞與周圍細(xì)胞的相互作用，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。circRNA的表達(dá)變化還與肝功能密切相關(guān)，可能參與肝功能的調(diào)節(jié)和恢復(fù)過程。在腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移方面，一些circRNA可能參與腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移和血管生成等過程的調(diào)節(jié)，對預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移具有潛在價值。差異表達(dá)circRNA在圍手術(shù)期的潛在作用機(jī)制主要涉及免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控、信號通路調(diào)節(jié)以及與其他非編碼RNA的相互作用。在免疫調(diào)節(jié)中，circRNA通過miRNA海綿作用和與RNA結(jié)合蛋白相互作用，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性和功能。在細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控方面，circRNA通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞周期和凋亡過程。在信號通路調(diào)節(jié)中，circRNA參與PI3K/Akt、MAPK和Wnt等信號通路的調(diào)節(jié)，影響細(xì)胞的增殖、存活和代謝等過程。circRNA還與其他非編碼RNA相互作用，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)圍手術(shù)期的生物學(xué)過程。本研究結(jié)果對臨床應(yīng)用具有重要啟示。在診斷方面，差異表達(dá)的circRNA有可能成為原發(fā)性肝癌早期診斷的新型生物標(biāo)志物，提高診斷的準(zhǔn)確性和早期發(fā)現(xiàn)率。在預(yù)后評估方面，與腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)的circRNA可作為預(yù)后評估的重要指標(biāo)，幫助臨床醫(yī)生預(yù)測患者的預(yù)后，及時調(diào)整治療方案。在治療方面，針對差異表達(dá)circRNA參與的信號通路和生物學(xué)過程，可開發(fā)新的治療策略，為原發(fā)性肝癌肝移植圍手術(shù)期的治療提供新的潛在靶點，提高治療效果。7.2研究不足與展望盡管本研究取得了一定的成果，初步揭示了原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期肝移植患者外周血circRNA的差異表達(dá)及其潛在生物學(xué)作用機(jī)制，但仍存在一些不足之處。在樣本量方面，本研究納入的原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期肝移植患者數(shù)量相對有限，這可能會影響研究結(jié)果的普遍性和可靠性。未來的研究可以進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，納入更多不同病情、不同個體特征的患者，以更全面地了解circRNA在原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期的表達(dá)變化規(guī)律及其與臨床指標(biāo)的相關(guān)性。在研究對象的選擇上，本研究僅選取了原發(fā)性肝癌患者作為實驗組和對照組，未考慮其他肝臟疾病患者或健康人群作為對照，這可能導(dǎo)致研究結(jié)果的特異性和敏感性受到一定影響。后續(xù)研究可以增加其他肝臟疾病患者和健康人群作為對照，以更準(zhǔn)確地分析circRNA在原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期的特異性表達(dá)變化。在研究方法上，雖然高通量測序技術(shù)能夠全面檢測circRNA的表達(dá)情況，但該技術(shù)成本較高，且對實驗條件和數(shù)據(jù)分析能力要求較高，在一定程度上限制了其廣泛應(yīng)用。此外，本研究僅對circRNA的表達(dá)進(jìn)行了檢測和分析，對于circRNA的功能驗證，主要依賴于生物信息學(xué)預(yù)測和已有文獻(xiàn)報道，缺乏直接的實驗驗證。未來可以結(jié)合分子生物學(xué)實驗技術(shù)，如RNA干擾、過表達(dá)實驗等，對篩選出的關(guān)鍵circRNA進(jìn)行功能驗證，深入探究其在原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期的作用機(jī)制。展望未來，circRNA在原發(fā)性肝癌肝移植領(lǐng)域具有廣闊的研究方向和應(yīng)用前景。隨著研究的不斷深入，可以進(jìn)一步探索circRNA與其他生物分子（如蛋白質(zhì)、DNA等）的相互作用，揭示其在原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。還可以開展多中心、大樣本的臨床研究，驗證circRNA作為原發(fā)性肝癌早期診斷生物標(biāo)志物和預(yù)后評估指標(biāo)的準(zhǔn)確性和可靠性，為臨床實踐提供更有力的支持。在治療方面，基于circRNA的靶向治療策略將是未來研究的重點之一。通過設(shè)計特異性的反義寡核苷酸、RNA干擾技術(shù)或基因編輯技術(shù)，調(diào)節(jié)致癌circRNA或抑癌circRNA的表達(dá)，有望開發(fā)出新型的治療方法，提高原發(fā)性肝癌肝移植患者的治療效果和生存率。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，如單細(xì)胞測序技術(shù)、空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)等的應(yīng)用，將為深入研究circRNA在原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期的細(xì)胞特異性表達(dá)和功能提供更強(qiáng)大的工具，有助于進(jìn)一步揭示其在肝癌發(fā)生、發(fā)展和治療中的作用機(jī)制。八、參考文獻(xiàn)[1]SiegelRL,MillerKD,JemalA.Cancerstatistics,2020.CACancerJClin.2020;70(1):7-30.[2]TorreLA,BrayF,SiegelRL,FerlayJ,Lortet-TieulentJ,JemalA.Globalcancerstatistics,2012.CACancerJClin.2015;65(2):87-108.[3]FornerA,ReigM,BruixJ.Hepatocellularcarcinoma.Lancet.2018;391(10127):1301-1314.[4]中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會肝癌學(xué)組。原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版).臨床肝膽病雜志.2019;35(12):2691-2710.[5]MazzaferroV,RegaliaE,DociR,etal.Livertransplantationforthetreatmentofsmall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