參苓白術(shù)散早期干預(yù)幼鼠哮喘：基于iNKT細(xì)胞的機(jī)制探秘一、引言1.1研究背景支氣管哮喘是臨床兒科最為常見(jiàn)的呼吸道疾病之一，臨床表現(xiàn)主要為反復(fù)、可逆性咳嗽、喘息、呼吸困難和胸悶等癥狀。近年來(lái)，我國(guó)兒童支氣管哮喘患病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，給兒童的身體健康及生命安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。2010年全國(guó)第三次兒童哮喘流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)0-14歲兒童哮喘的患病率為3.02%，較2000年的1.97%顯著升高，部分地區(qū)如重慶，兒童哮喘患病率高達(dá)7.45%。哮喘嚴(yán)重影響兒童的生活質(zhì)量，降低其運(yùn)動(dòng)耐力，限制日常活動(dòng)，還可能導(dǎo)致睡眠障礙，對(duì)兒童的生長(zhǎng)發(fā)育和心理健康造成不良影響，也給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。由于人體研究的局限性和倫理學(xué)限制，構(gòu)建哮喘動(dòng)物模型成為研究哮喘發(fā)病機(jī)制和治療方法的重要手段。在眾多哮喘動(dòng)物模型中，幼鼠哮喘模型因其與人類(lèi)哮喘發(fā)病機(jī)制有一定相似性，且具有繁殖快、成本低、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于哮喘研究。通過(guò)建立幼鼠哮喘模型，能夠深入探究哮喘發(fā)病過(guò)程中機(jī)體的病理生理變化，為尋找有效的治療靶點(diǎn)和藥物研發(fā)提供重要依據(jù)。中醫(yī)認(rèn)為哮喘的發(fā)病與肺、脾、腎三臟功能失調(diào)密切相關(guān)，其中脾虛在哮喘的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用?！捌樯抵矗螢橘A痰之器”，脾虛則運(yùn)化失常，水濕內(nèi)生，聚濕成痰，上貯于肺，阻塞氣道，導(dǎo)致哮喘發(fā)作。因此，健脾化痰是中醫(yī)治療哮喘的重要方法之一。參苓白術(shù)散作為中醫(yī)經(jīng)典方劑，具有補(bǔ)脾胃、益肺氣的功效，其主要由人參、茯苓、白術(shù)、山藥、白扁豆、蓮子、薏苡仁、砂仁、桔梗、甘草等多味中藥組成。方中人參、白術(shù)、茯苓益氣健脾滲濕為君；山藥、蓮子肉助君藥以健脾益氣，兼能止瀉；白扁豆、薏苡仁助白術(shù)、茯苓以健脾滲濕，均為臣藥；砂仁醒脾和胃，行氣化濕；桔梗宣肺利氣，通調(diào)水道，又能載藥上行，培土生金；炒甘草健脾和中，調(diào)和諸藥，共為佐使。全方共奏健脾益氣、滲濕止瀉、兼益肺氣之功。現(xiàn)代研究表明，參苓白術(shù)散在調(diào)節(jié)免疫功能、抗炎、抗氧化等方面具有顯著作用。在哮喘治療方面，已有臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)其對(duì)哮喘具有一定的治療效果，能夠改善哮喘患者和動(dòng)物模型的癥狀、減輕氣道炎癥、調(diào)節(jié)免疫失衡。然而，目前關(guān)于參苓白術(shù)散早期干預(yù)幼鼠哮喘的作用機(jī)制尚未完全明確，尤其是在調(diào)節(jié)iNKT細(xì)胞方面的研究較少。iNKT細(xì)胞作為一種特殊的免疫細(xì)胞亞群，在哮喘的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，其功能異常與哮喘的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，深入研究參苓白術(shù)散早期干預(yù)幼鼠哮喘的iNKT細(xì)胞相關(guān)機(jī)制，對(duì)于揭示其治療哮喘的作用靶點(diǎn)和分子機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)具有重要意義。1.2研究目的本研究旨在通過(guò)建立幼鼠哮喘模型，觀察參苓白術(shù)散早期干預(yù)對(duì)幼鼠哮喘的治療效果，從iNKT細(xì)胞的數(shù)量、功能以及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)等層面，深入探究參苓白術(shù)散早期干預(yù)幼鼠哮喘的作用機(jī)制，為參苓白術(shù)散在兒童哮喘臨床治療中的應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也為開(kāi)拓哮喘治療新思路、研發(fā)新型治療藥物提供有益參考。1.3研究意義1.3.1理論意義本研究通過(guò)建立幼鼠哮喘模型，深入探究參苓白術(shù)散早期干預(yù)對(duì)幼鼠哮喘的治療效果及iNKT細(xì)胞相關(guān)機(jī)制，在理論層面具有重要意義。從哮喘發(fā)病機(jī)制角度來(lái)看，目前哮喘的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，雖然已知其與多種細(xì)胞和細(xì)胞因子參與的氣道慢性炎癥、氣道高反應(yīng)性以及免疫失衡等密切相關(guān)，但仍存在許多未知領(lǐng)域。iNKT細(xì)胞作為一種特殊的免疫細(xì)胞亞群，在哮喘發(fā)病過(guò)程中的作用機(jī)制復(fù)雜且尚未完全闡明。研究表明，iNKT細(xì)胞可以通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子，如IL-4、IFN-γ等，調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡，進(jìn)而影響哮喘的發(fā)生發(fā)展。然而，其具體的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和信號(hào)通路仍有待進(jìn)一步深入研究。本研究將聚焦于參苓白術(shù)散早期干預(yù)對(duì)幼鼠哮喘中iNKT細(xì)胞的影響，有望揭示iNKT細(xì)胞在哮喘發(fā)病機(jī)制中的新作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，為完善哮喘發(fā)病機(jī)制的理論體系提供新的視角和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。從中藥治療哮喘機(jī)制方面分析，中醫(yī)中藥在哮喘治療中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)和豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，但中藥治療哮喘的作用機(jī)制研究相對(duì)滯后。參苓白術(shù)散作為中醫(yī)經(jīng)典方劑，其治療哮喘的作用機(jī)制尚未完全明確。本研究將從iNKT細(xì)胞的數(shù)量、功能以及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)等多個(gè)層面，深入探討參苓白術(shù)散早期干預(yù)幼鼠哮喘的作用機(jī)制，有助于揭示中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、整體調(diào)節(jié)的作用特點(diǎn)，豐富和完善中醫(yī)中藥治療哮喘的理論內(nèi)涵，為中醫(yī)理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的結(jié)合提供新的切入點(diǎn)和研究思路，促進(jìn)中西醫(yī)結(jié)合治療哮喘的理論發(fā)展。1.3.2實(shí)踐意義在臨床實(shí)踐中，兒童哮喘的防治面臨著諸多挑戰(zhàn)。盡管目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在哮喘治療方面取得了一定進(jìn)展，如使用糖皮質(zhì)激素、支氣管擴(kuò)張劑等藥物能夠有效控制哮喘癥狀，但這些藥物存在一定的副作用，長(zhǎng)期使用可能對(duì)兒童的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生不良影響。此外，部分哮喘患者對(duì)現(xiàn)有治療藥物的反應(yīng)不佳，治療效果不理想。因此，尋找安全有效的輔助治療方法具有重要的臨床需求。本研究若能明確參苓白術(shù)散早期干預(yù)幼鼠哮喘的iNKT細(xì)胞相關(guān)機(jī)制，證實(shí)其對(duì)幼鼠哮喘具有顯著的治療效果，將為臨床應(yīng)用參苓白術(shù)散治療兒童哮喘提供科學(xué)依據(jù)。參苓白術(shù)散作為一種中藥方劑，具有副作用小、安全性高的特點(diǎn)，將其應(yīng)用于兒童哮喘的治療，可在一定程度上減少西藥的使用劑量和不良反應(yīng)，提高治療效果，改善患兒的生活質(zhì)量。同時(shí)，本研究結(jié)果還可為臨床醫(yī)生提供新的治療思路和方案，指導(dǎo)其根據(jù)患兒的具體情況合理選用參苓白術(shù)散進(jìn)行輔助治療，優(yōu)化哮喘的綜合治療策略，為兒童哮喘的臨床防治提供更有效的手段，具有重要的實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值。此外，對(duì)于藥物研發(fā)領(lǐng)域而言，本研究結(jié)果可能為新型哮喘治療藥物的研發(fā)提供潛在的靶點(diǎn)和方向，有助于開(kāi)發(fā)出更具針對(duì)性和有效性的治療藥物，推動(dòng)哮喘治療藥物的創(chuàng)新和發(fā)展。二、文獻(xiàn)綜述2.1哮喘概述哮喘，全稱(chēng)為支氣管哮喘，是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為特征的異質(zhì)性呼吸系統(tǒng)疾病。其發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞（如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等）和細(xì)胞組分共同參與。這些細(xì)胞和組分相互作用，導(dǎo)致氣道出現(xiàn)慢性炎癥，使得氣道對(duì)各種刺激的反應(yīng)性增高，進(jìn)而引發(fā)一系列臨床癥狀。哮喘的典型臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的喘息、氣急、胸悶或咳嗽等癥狀，且常在夜間及凌晨發(fā)作或加重。這些癥狀可經(jīng)藥物治療后緩解或自行緩解，但如果病情長(zhǎng)期得不到有效控制，可能會(huì)導(dǎo)致氣道重塑，嚴(yán)重影響患者的肺功能和生活質(zhì)量。在一些嚴(yán)重發(fā)作的情況下，患者可能會(huì)出現(xiàn)呼吸困難、大汗淋漓、心率增快等癥狀，甚至危及生命。近年來(lái)，哮喘的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，已成為一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估計(jì)，全球約有3億人患有哮喘，且每年有超過(guò)25萬(wàn)人死于哮喘相關(guān)疾病。在我國(guó)，哮喘的患病率也不容樂(lè)觀。根據(jù)相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)20歲及以上人群哮喘患病率為4.2%，患者總數(shù)達(dá)4570萬(wàn)人，且呈現(xiàn)出城市高于農(nóng)村、兒童高于成人的特點(diǎn)。兒童哮喘作為哮喘的一個(gè)特殊群體，其患病率上升趨勢(shì)更為明顯，嚴(yán)重影響兒童的生長(zhǎng)發(fā)育和身心健康。如2010年全國(guó)第三次兒童哮喘流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)0-14歲兒童哮喘的患病率為3.02%，較2000年的1.97%顯著升高，部分地區(qū)如重慶，兒童哮喘患病率高達(dá)7.45%。哮喘的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前認(rèn)為是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。遺傳因素在哮喘的發(fā)病中起著重要作用，研究表明，哮喘具有多基因遺傳傾向，其發(fā)病具有家族集聚現(xiàn)象，親緣關(guān)系越近，患病率越高。環(huán)境因素則包括變應(yīng)原性因素和非變應(yīng)原性因素。變應(yīng)原性因素如塵螨、花粉、動(dòng)物毛發(fā)和皮屑、蟑螂等室內(nèi)過(guò)敏原，以及樹(shù)木花粉、蒿草花粉、霧霾、汽車(chē)尾氣等室外過(guò)敏原；食物過(guò)敏也可誘發(fā)哮喘發(fā)作或加重哮喘的嚴(yán)重度，常見(jiàn)的過(guò)敏食物有魚(yú)、蝦、蛋類(lèi)等。非變應(yīng)原性因素包括氣候變化、吸煙、感冒、藥物（如阿司匹林等解熱鎮(zhèn)痛藥）、劇烈運(yùn)動(dòng)、情緒變化等。例如，寒冷空氣可刺激氣道，導(dǎo)致氣道痙攣，誘發(fā)哮喘發(fā)作；吸煙不僅是哮喘發(fā)作的觸發(fā)因素，也是導(dǎo)致哮喘難以控制的重要原因，長(zhǎng)期吸煙會(huì)損害氣道黏膜，增加氣道炎癥反應(yīng)；感冒后可引起氣道反應(yīng)性增高，再加上冷空氣的持續(xù)刺激，可誘發(fā)或加重哮喘癥狀；部分患者在服用阿司匹林等藥物后，可能會(huì)出現(xiàn)哮喘的劇烈發(fā)作，即藥源性哮喘；劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，人體需氧量增加，會(huì)用口呼吸，吸入的空氣未經(jīng)呼吸管道過(guò)濾和加溫加濕，大量吸入可誘發(fā)哮喘；情緒變化如大笑、大哭、憤怒或恐懼等，可導(dǎo)致氣道狹窄，從而使哮喘癥狀加重。2.2iNKT細(xì)胞在哮喘中的作用2.2.1iNKT細(xì)胞的特性與功能iNKT細(xì)胞，即恒定自然殺傷T細(xì)胞（invariantnaturalkillerTcell），是一類(lèi)獨(dú)特的免疫細(xì)胞亞群，兼具T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）的特性。iNKT細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中占據(jù)著重要地位，它們能夠迅速對(duì)各種刺激做出反應(yīng)，在免疫應(yīng)答的早期階段發(fā)揮關(guān)鍵作用，從而成為連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的重要橋梁。從細(xì)胞特性來(lái)看，iNKT細(xì)胞表達(dá)恒定的T細(xì)胞受體（TCR）α鏈，在小鼠中主要為Vα14-Jα18，在人類(lèi)中為Vα24-Jα18，并且其TCRβ鏈的多樣性也相對(duì)有限。這種獨(dú)特的TCR結(jié)構(gòu)使得iNKT細(xì)胞能夠識(shí)別由非經(jīng)典的MHC-I類(lèi)分子CD1d呈遞的糖脂類(lèi)抗原，如α-半乳糖神經(jīng)酰胺（α-GalCer）。與傳統(tǒng)T細(xì)胞識(shí)別肽-MHC復(fù)合物不同，iNKT細(xì)胞對(duì)糖脂抗原的識(shí)別不依賴(lài)于抗原加工過(guò)程，這使得它們能夠快速活化，啟動(dòng)免疫應(yīng)答。此外，iNKT細(xì)胞還表達(dá)多種NK細(xì)胞相關(guān)受體，如NK1.1、CD244等，賦予了它們類(lèi)似NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能。在免疫調(diào)節(jié)方面，iNKT細(xì)胞具有雙重作用。一方面，當(dāng)機(jī)體受到病原體感染或腫瘤細(xì)胞侵襲時(shí)，iNKT細(xì)胞被激活后能夠迅速分泌大量的細(xì)胞因子，包括Th1型細(xì)胞因子如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α），以及Th2型細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）等。IFN-γ能夠激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬和殺傷病原體的能力，促進(jìn)Th1型免疫應(yīng)答，有助于抵抗細(xì)胞內(nèi)病原體感染和腫瘤免疫監(jiān)視；IL-4則可誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，參與體液免疫應(yīng)答，在抵御寄生蟲(chóng)感染和某些病毒感染中發(fā)揮重要作用。另一方面，iNKT細(xì)胞也可以通過(guò)分泌IL-10等抑制性細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性，抑制過(guò)度的免疫反應(yīng)，從而維持免疫穩(wěn)態(tài)，防止自身免疫性疾病的發(fā)生。例如，在某些炎癥性疾病模型中，iNKT細(xì)胞通過(guò)分泌IL-10抑制炎癥細(xì)胞的活化和炎癥因子的釋放，減輕組織損傷。2.2.2iNKT細(xì)胞與哮喘發(fā)病的關(guān)聯(lián)在哮喘發(fā)病過(guò)程中，iNKT細(xì)胞扮演著重要角色，其數(shù)量和活性的變化與哮喘的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。大量研究表明，哮喘患者體內(nèi)iNKT細(xì)胞的數(shù)量和功能存在明顯異常。在哮喘患者的外周血、支氣管肺泡灌洗液（BALF）以及肺組織中，iNKT細(xì)胞的數(shù)量顯著增加。同時(shí)，這些iNKT細(xì)胞處于高度活化狀態(tài)，其表面活化標(biāo)志物如CD69、CD25的表達(dá)明顯上調(diào)。iNKT細(xì)胞的失衡被認(rèn)為是導(dǎo)致哮喘氣道炎癥和免疫紊亂的重要原因之一。當(dāng)機(jī)體接觸過(guò)敏原后，抗原提呈細(xì)胞（如樹(shù)突狀細(xì)胞）攝取并加工過(guò)敏原，將其糖脂類(lèi)抗原呈遞給iNKT細(xì)胞，激活iNKT細(xì)胞?；罨膇NKT細(xì)胞迅速分泌大量的細(xì)胞因子，其中Th2型細(xì)胞因子如IL-4、IL-5和IL-13的過(guò)度分泌在哮喘發(fā)病中起著關(guān)鍵作用。IL-4能夠促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，增加Th2細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)一步放大Th2型免疫應(yīng)答；IL-5可募集和活化嗜酸性粒細(xì)胞，導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞在氣道內(nèi)大量浸潤(rùn)，釋放多種毒性物質(zhì)，如嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白、主要堿性蛋白等，損傷氣道上皮細(xì)胞，引起氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性；IL-13則可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞分泌黏蛋白，增加氣道黏液分泌，導(dǎo)致氣道堵塞，同時(shí)還能促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞增殖和收縮，加重氣道狹窄。此外，iNKT細(xì)胞還可以通過(guò)調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的功能間接參與哮喘的發(fā)病。例如，iNKT細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可以激活肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞，使其釋放組胺、白三烯等炎癥介質(zhì)，引發(fā)氣道平滑肌痙攣和血管通透性增加；iNKT細(xì)胞還可以促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化，Th17細(xì)胞分泌的IL-17等細(xì)胞因子能夠招募中性粒細(xì)胞到氣道，加重氣道炎癥。同時(shí)，iNKT細(xì)胞功能的異常可能導(dǎo)致Th1/Th2細(xì)胞平衡失調(diào)，Th1細(xì)胞功能相對(duì)減弱，無(wú)法有效抑制Th2型免疫應(yīng)答，從而使哮喘病情進(jìn)一步惡化。2.3參苓白術(shù)散的研究現(xiàn)狀2.3.1參苓白術(shù)散的組成與功效參苓白術(shù)散出自宋代《太平惠民和劑局方》，是中醫(yī)臨床常用的經(jīng)典方劑。其藥物組成精妙，配伍嚴(yán)謹(jǐn)，主要由人參（或黨參）、茯苓、白術(shù)、山藥、白扁豆、蓮子、薏苡仁、砂仁、桔梗、甘草等多味中藥組成。方中人參大補(bǔ)元?dú)?，健脾養(yǎng)胃，為君藥；白術(shù)、茯苓健脾燥濕、滲濕利水，助人參健脾益氣，共為臣藥；山藥、蓮子肉、白扁豆、薏苡仁補(bǔ)脾止瀉、滲濕化濁，輔助君臣藥增強(qiáng)健脾祛濕之力，同為佐藥；砂仁芳香醒脾、行氣化濕，可增強(qiáng)脾胃運(yùn)化功能，防止補(bǔ)藥滋膩礙胃；桔梗宣肺利氣，通調(diào)水道，載藥上行，以達(dá)培土生金之效；甘草調(diào)和諸藥，兼補(bǔ)脾益氣，為使藥。諸藥合用，共奏補(bǔ)脾胃、益肺氣之功效。在傳統(tǒng)中醫(yī)理論中，參苓白術(shù)散主要用于治療脾胃虛弱所致的多種病癥。脾胃為后天之本，氣血生化之源，脾胃虛弱則運(yùn)化失常，可出現(xiàn)食少便溏、腹脹腹痛、肢體倦怠、氣短咳嗽等癥狀。參苓白術(shù)散通過(guò)健脾益氣、滲濕止瀉，能夠有效改善脾胃功能，促進(jìn)消化吸收，增強(qiáng)機(jī)體抵抗力，從而緩解上述癥狀。如《太平惠民和劑局方》中記載：“參苓白術(shù)散治脾胃虛弱，飲食不進(jìn)，多困少力，中滿痞噎，心忪氣喘，嘔吐泄瀉，及傷寒咳噫?！迸R床上，參苓白術(shù)散廣泛應(yīng)用于消化系統(tǒng)疾病，如慢性胃腸炎、消化不良、腹瀉等，能夠調(diào)節(jié)胃腸功能，改善消化吸收，減輕腹瀉癥狀；在呼吸系統(tǒng)疾病方面，對(duì)于肺脾氣虛所致的咳嗽、氣短、易感冒等也有較好的療效，可通過(guò)培土生金法，增強(qiáng)肺的功能，提高機(jī)體免疫力，減少呼吸道感染的發(fā)生。2.3.2參苓白術(shù)散對(duì)免疫調(diào)節(jié)的作用現(xiàn)代研究表明，參苓白術(shù)散具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力。在細(xì)胞免疫方面，參苓白術(shù)散可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖和活化，提高T淋巴細(xì)胞的免疫活性。研究發(fā)現(xiàn)，參苓白術(shù)散能夠上調(diào)T淋巴細(xì)胞表面的CD3、CD4、CD8等分子的表達(dá)，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力，從而提高機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。此外，參苓白術(shù)散還可以調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡，促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子（如IFN-γ、IL-2等）的分泌，抑制Th2型細(xì)胞因子（如IL-4、IL-5等）的產(chǎn)生，糾正免疫失衡，增強(qiáng)機(jī)體的抗感染和抗腫瘤能力。在體液免疫方面，參苓白術(shù)散能夠促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的增殖和分化，增加抗體的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)研究表明，參苓白術(shù)散可以提高血清中免疫球蛋白IgG、IgA、IgM的含量，增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫功能。同時(shí)，參苓白術(shù)散還可以調(diào)節(jié)補(bǔ)體系統(tǒng)，激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑和旁路途徑，增強(qiáng)補(bǔ)體的免疫活性，發(fā)揮抗感染和免疫調(diào)節(jié)作用。在免疫因子表達(dá)方面，參苓白術(shù)散能夠調(diào)節(jié)多種免疫因子的表達(dá)，如細(xì)胞因子、趨化因子等。研究發(fā)現(xiàn)，參苓白術(shù)散可以降低炎癥因子如TNF-α、IL-6等的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，緩解組織損傷；同時(shí)，參苓白術(shù)散還可以上調(diào)抗炎因子如IL-10等的表達(dá)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用。此外，參苓白術(shù)散還可以調(diào)節(jié)趨化因子的表達(dá)，如調(diào)節(jié)CCL2、CCL5等趨化因子的水平，影響免疫細(xì)胞的趨化和遷移，從而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。綜上所述，參苓白術(shù)散通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能和免疫因子表達(dá)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，為其在臨床治療多種疾病提供了免疫學(xué)基礎(chǔ)。2.3.3參苓白術(shù)散治療哮喘的相關(guān)研究近年來(lái)，參苓白術(shù)散在哮喘治療方面的研究受到了廣泛關(guān)注，多項(xiàng)臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其對(duì)哮喘具有一定的治療效果。在臨床研究中，諸多學(xué)者觀察了參苓白術(shù)散聯(lián)合西藥治療哮喘的療效。有研究將哮喘患者隨機(jī)分為對(duì)照組和治療組，對(duì)照組采用常規(guī)西藥治療，治療組在常規(guī)西藥治療的基礎(chǔ)上加用參苓白術(shù)散，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療組患者的哮喘癥狀、肺功能指標(biāo)（如FEV1、FEV1/FVC等）以及生活質(zhì)量評(píng)分均明顯優(yōu)于對(duì)照組。這表明參苓白術(shù)散聯(lián)合西藥治療能夠更有效地改善哮喘患者的臨床癥狀，提高肺功能，提升生活質(zhì)量。還有研究對(duì)兒童哮喘緩解期患者應(yīng)用參苓白術(shù)散輔助治療，發(fā)現(xiàn)其可顯著減少哮喘發(fā)作次數(shù)，降低呼吸道感染發(fā)生率，提高臨床總有效率。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，研究人員通過(guò)建立哮喘動(dòng)物模型，觀察參苓白術(shù)散對(duì)哮喘的干預(yù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，參苓白術(shù)散能夠減輕哮喘動(dòng)物模型的氣道炎癥，減少嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在氣道的浸潤(rùn)，降低炎癥因子如IL-4、IL-5、IL-13等的表達(dá)水平，同時(shí)提高IFN-γ等抗炎因子的表達(dá)。此外，參苓白術(shù)散還可以降低氣道高反應(yīng)性，改善肺組織病理形態(tài)學(xué)變化，抑制氣道重塑相關(guān)指標(biāo)如膠原蛋白、纖維連接蛋白等的表達(dá)。這些研究結(jié)果表明，參苓白術(shù)散能夠通過(guò)調(diào)節(jié)免疫功能、減輕氣道炎癥、降低氣道高反應(yīng)性和抑制氣道重塑等多種途徑，對(duì)哮喘起到治療作用。然而，目前關(guān)于參苓白術(shù)散治療哮喘的具體作用機(jī)制尚未完全明確，仍需進(jìn)一步深入研究。三、材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用SPF級(jí)7日齡Balb/c幼鼠60只，雌雄各半，體重12-15g，購(gòu)自[具體動(dòng)物供應(yīng)商名稱(chēng)]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[具體許可證號(hào)]。Balb/c小鼠是常用的實(shí)驗(yàn)小鼠品系之一，其遺傳背景清晰，免疫反應(yīng)較為穩(wěn)定，對(duì)變應(yīng)原的敏感性較高，在哮喘動(dòng)物模型構(gòu)建中應(yīng)用廣泛。將幼鼠飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%的環(huán)境中，保持12h光照/12h黑暗的晝夜節(jié)律，自由進(jìn)食和飲水。適應(yīng)環(huán)境3天后，開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格遵守動(dòng)物倫理和福利準(zhǔn)則，對(duì)動(dòng)物的操作符合相關(guān)規(guī)定，盡量減少動(dòng)物的痛苦。3.1.2實(shí)驗(yàn)藥物與試劑參苓白術(shù)散藥材購(gòu)自[藥材供應(yīng)商名稱(chēng)]，經(jīng)[鑒定人姓名]鑒定，均符合《中國(guó)藥典》（[具體版本]）標(biāo)準(zhǔn)。將藥材按人參10g、茯苓15g、白術(shù)15g、山藥20g、白扁豆15g、蓮子10g、薏苡仁15g、砂仁6g、桔梗10g、甘草6g的比例稱(chēng)取，加10倍量水浸泡30min，煎煮2次，每次1h，合并煎液，濃縮至生藥濃度為1g/mL，4℃保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)所需的其他主要試劑包括：卵清蛋白（OVA，Sigma公司，美國(guó)），氫氧化鋁（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），小鼠干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-13（IL-13）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（R&DSystems公司，美國(guó)），藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的抗小鼠NK1.1抗體、異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的抗小鼠CD3抗體（BioLegend公司，美國(guó)），紅細(xì)胞裂解液（Solarbio公司，中國(guó)）等。3.1.3實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)所需的儀器設(shè)備如下：流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur，美國(guó)BD公司），用于檢測(cè)iNKT細(xì)胞的數(shù)量和表面標(biāo)志物表達(dá)；酶標(biāo)儀（ThermoScientificMultiskanFC，美國(guó)賽默飛世爾科技公司），用于ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞因子含量；超聲霧化器（德國(guó)百瑞有限公司），用于對(duì)幼鼠進(jìn)行霧化激發(fā)，建立哮喘模型；低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司），用于樣本離心分離；電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），用于稱(chēng)量藥物和動(dòng)物體重；CO?培養(yǎng)箱（ThermoScientific，美國(guó)賽默飛世爾科技公司），用于細(xì)胞培養(yǎng)；光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司），用于觀察肺組織病理切片等。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1幼鼠哮喘模型的建立采用卵清蛋白（OVA）致敏聯(lián)合霧化激發(fā)的方法建立幼鼠哮喘模型。具體操作如下：在幼鼠出生后第7天開(kāi)始，將OVA與氫氧化鋁混合作為致敏劑，每只幼鼠腹腔注射0.2ml致敏劑（含OVA100μg、氫氧化鋁1mg），進(jìn)行初次致敏。在第14天，以同樣的方法和劑量對(duì)幼鼠進(jìn)行再次致敏。從第21天起，將幼鼠置于超聲霧化器的霧化箱中，用1%OVA溶液進(jìn)行霧化激發(fā)，每天1次，每次30分鐘，連續(xù)激發(fā)7天。正常對(duì)照組幼鼠在相同時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等體積的生理鹽水，并接受生理鹽水霧化。通過(guò)觀察幼鼠在霧化激發(fā)過(guò)程中的表現(xiàn)，如出現(xiàn)呼吸急促、喘息、煩躁不安、腹肌收縮等典型哮喘癥狀，以及后續(xù)對(duì)相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果，判斷哮喘模型是否建立成功。已有研究表明，該方法能夠成功誘導(dǎo)幼鼠哮喘模型，使幼鼠出現(xiàn)與人類(lèi)哮喘相似的氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性等病理生理改變。3.2.2實(shí)驗(yàn)分組與給藥將60只幼鼠隨機(jī)分為5組，每組12只。分別為正常對(duì)照組、哮喘模型組、地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組、參苓白術(shù)散低劑量組和參苓白術(shù)散高劑量組。正常對(duì)照組和哮喘模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組給予地塞米松溶液（0.5mg/kg）灌胃，參苓白術(shù)散低劑量組給予參苓白術(shù)散煎液（5g/kg）灌胃，參苓白術(shù)散高劑量組給予參苓白術(shù)散煎液（10g/kg）灌胃。灌胃體積均為0.2ml/10g體重，每天1次，從第14天致敏后開(kāi)始給藥，持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。地塞米松是臨床常用的糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物，具有強(qiáng)大的抗炎、抗過(guò)敏作用，常作為陽(yáng)性對(duì)照藥物用于哮喘動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。本研究中地塞米松的給藥劑量和途徑參考了相關(guān)文獻(xiàn)和前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。參苓白術(shù)散的給藥劑量則根據(jù)前期研究和成人臨床用量，按照幼鼠與人體體表面積換算公式進(jìn)行換算確定。3.2.3指標(biāo)檢測(cè)肺組織病理觀察：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將幼鼠麻醉處死，迅速取出肺組織，用4%多聚甲醛固定24h，常規(guī)脫水、石蠟包埋，制成厚度為4μm的切片。切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織的病理形態(tài)學(xué)變化，包括氣道炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、氣道壁增厚、黏液分泌等情況，并按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理評(píng)分。通過(guò)對(duì)肺組織病理切片的觀察和評(píng)分，能夠直觀地了解哮喘模型的病理改變以及藥物干預(yù)后的治療效果。肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi)：取肺組織后，經(jīng)氣管插管緩慢注入0.5ml預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS），反復(fù)輕柔沖洗肺泡3次，回收肺泡灌洗液（BALF）。將BALF以1500r/min離心10min，棄上清，沉淀用PBS重懸。取少量細(xì)胞懸液，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)。然后將剩余細(xì)胞懸液制成細(xì)胞涂片，自然晾干后用甲醇固定，采用瑞氏-姬姆薩染色法染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)，分別計(jì)算嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等各類(lèi)細(xì)胞的百分比。肺泡灌洗液中的細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi)能夠反映氣道炎癥的程度和炎癥細(xì)胞的類(lèi)型，為評(píng)估哮喘病情和藥物治療效果提供重要依據(jù)。細(xì)胞因子水平檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)BALF和血清中IFN-γ、IL-4、IL-13等細(xì)胞因子的含量。具體操作按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。首先將標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本加入到預(yù)先包被有特異性抗體的酶標(biāo)板孔中，孵育一段時(shí)間后，使樣本中的細(xì)胞因子與抗體結(jié)合。然后洗去未結(jié)合的物質(zhì)，加入酶標(biāo)記的二抗，孵育后再次洗滌。最后加入底物顯色，在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中細(xì)胞因子的含量。這些細(xì)胞因子在哮喘的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，IFN-γ是Th1型細(xì)胞因子，具有抑制Th2型免疫應(yīng)答、減輕氣道炎癥的作用；IL-4和IL-13是Th2型細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)Th2型免疫應(yīng)答，加重氣道炎癥。檢測(cè)這些細(xì)胞因子的水平有助于了解哮喘發(fā)病過(guò)程中的免疫失衡狀態(tài)以及藥物對(duì)其的調(diào)節(jié)作用。iNKT細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺組織和脾臟中iNKT細(xì)胞的數(shù)量和比例。取適量肺組織和脾臟，制備單細(xì)胞懸液，用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，PBS洗滌后，加入PE標(biāo)記的抗小鼠NK1.1抗體和FITC標(biāo)記的抗小鼠CD3抗體，避光孵育30min。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞，重懸于適量的PBS中，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析，以NK1.1+CD3+雙陽(yáng)性細(xì)胞作為iNKT細(xì)胞，計(jì)算其在總淋巴細(xì)胞中的比例，從而了解iNKT細(xì)胞數(shù)量的變化。同時(shí)，還可以進(jìn)一步檢測(cè)iNKT細(xì)胞表面其他活化標(biāo)志物（如CD69、CD25等）的表達(dá)水平，以及iNKT細(xì)胞分泌細(xì)胞因子（如IFN-γ、IL-4等）的能力，以全面評(píng)估iNKT細(xì)胞的功能狀態(tài)。3.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差齊性，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；若方差不齊，采用Dunnett’sT3檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)合理運(yùn)用這些統(tǒng)計(jì)方法，能夠準(zhǔn)確地揭示不同組間數(shù)據(jù)的差異，從而為研究結(jié)果的可靠性和科學(xué)性提供有力保障。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1幼鼠一般情況觀察在實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)各組幼鼠的精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)等一般情況進(jìn)行了密切觀察。正常對(duì)照組幼鼠精神狀態(tài)良好，活潑好動(dòng)，對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏，飲食和飲水量正常，毛發(fā)順滑有光澤，體重增長(zhǎng)較為穩(wěn)定。哮喘模型組幼鼠在霧化激發(fā)后逐漸出現(xiàn)明顯的異常表現(xiàn)。精神萎靡不振，活動(dòng)量顯著減少，常蜷縮于籠角，對(duì)周?chē)h(huán)境變化反應(yīng)遲鈍。飲食和飲水量也有所下降，部分幼鼠出現(xiàn)拒食現(xiàn)象。毛發(fā)變得粗糙、雜亂且失去光澤，部分幼鼠還出現(xiàn)毛發(fā)脫落的情況。體重增長(zhǎng)緩慢，甚至在實(shí)驗(yàn)后期出現(xiàn)體重下降的趨勢(shì)。地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組幼鼠在給予地塞米松灌胃后，精神狀態(tài)和活動(dòng)情況有所改善，活躍度較哮喘模型組有所提高，對(duì)刺激的反應(yīng)也相對(duì)靈敏。飲食和飲水量逐漸恢復(fù)，但仍未達(dá)到正常對(duì)照組水平。毛發(fā)狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)，體重下降趨勢(shì)得到一定程度的抑制，但增長(zhǎng)速度仍較正常對(duì)照組緩慢。參苓白術(shù)散低劑量組幼鼠經(jīng)灌胃給藥后，一般情況也有不同程度的改善。精神狀態(tài)較哮喘模型組明顯好轉(zhuǎn)，活動(dòng)量增加，開(kāi)始主動(dòng)探索周?chē)h(huán)境，但活躍度仍低于正常對(duì)照組。飲食和飲水量有所增加，毛發(fā)逐漸變得順滑，體重下降幅度減小，且在實(shí)驗(yàn)后期體重開(kāi)始逐漸回升。參苓白術(shù)散高劑量組幼鼠的改善效果更為顯著。精神狀態(tài)接近正常對(duì)照組，活動(dòng)較為活躍，飲食和飲水量基本恢復(fù)正常，毛發(fā)順滑有光澤，體重增長(zhǎng)趨勢(shì)與正常對(duì)照組相近，在實(shí)驗(yàn)后期體重增長(zhǎng)速度甚至略高于正常對(duì)照組。通過(guò)對(duì)各組幼鼠一般情況的觀察對(duì)比，可以初步看出參苓白術(shù)散對(duì)哮喘幼鼠的健康狀況具有一定的改善作用，且高劑量組的改善效果優(yōu)于低劑量組，提示參苓白術(shù)散對(duì)幼鼠哮喘可能具有治療作用，能夠緩解哮喘癥狀，促進(jìn)幼鼠身體機(jī)能的恢復(fù)。4.2肺組織病理變化對(duì)各組幼鼠的肺組織進(jìn)行HE染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察其病理形態(tài)學(xué)變化（見(jiàn)圖1）。正常對(duì)照組幼鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡形態(tài)規(guī)則，大小均勻，肺泡壁薄且光滑，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管黏膜上皮完整，纖毛排列整齊，管腔內(nèi)無(wú)黏液及炎性滲出物。哮喘模型組幼鼠肺組織病理改變明顯，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡腔縮小，部分肺泡融合，肺泡壁明顯增厚，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，主要包括嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等，支氣管黏膜上皮細(xì)胞腫脹、脫落，纖毛倒伏、缺失，管腔內(nèi)充滿大量黏液及炎性滲出物，氣道平滑肌增厚，提示哮喘模型組幼鼠出現(xiàn)了典型的氣道炎癥和氣道重塑病理改變。地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組幼鼠肺組織病理變化較哮喘模型組有所改善，肺泡結(jié)構(gòu)相對(duì)規(guī)則，肺泡壁增厚程度減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量減少，支氣管黏膜上皮細(xì)胞損傷減輕，管腔內(nèi)黏液及炎性滲出物減少，但仍可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道平滑肌仍有一定程度增厚。參苓白術(shù)散低劑量組幼鼠肺組織也呈現(xiàn)出一定程度的改善。肺泡結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，肺泡壁增厚程度有所減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量較哮喘模型組減少，支氣管黏膜上皮細(xì)胞損傷有所緩解，管腔內(nèi)黏液及炎性滲出物減少，但改善程度不如地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組。參苓白術(shù)散高劑量組幼鼠肺組織改善效果更為顯著，肺泡結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，肺泡壁增厚不明顯，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少，支氣管黏膜上皮細(xì)胞基本完整，纖毛排列較為整齊，管腔內(nèi)黏液及炎性滲出物明顯減少，氣道平滑肌增厚程度明顯減輕，與地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組相比，改善效果相近，部分指標(biāo)甚至優(yōu)于地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組。為了更準(zhǔn)確地評(píng)估各組幼鼠肺組織的病理變化程度，對(duì)肺組織病理切片進(jìn)行了病理評(píng)分（見(jiàn)表1）。哮喘模型組的病理評(píng)分顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01），表明哮喘模型構(gòu)建成功，肺組織存在明顯的炎癥和損傷。地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組、參苓白術(shù)散低劑量組和參苓白術(shù)散高劑量組的病理評(píng)分均顯著低于哮喘模型組（P<0.01），且參苓白術(shù)散高劑量組的病理評(píng)分低于參苓白術(shù)散低劑量組（P<0.05），說(shuō)明參苓白術(shù)散能夠減輕幼鼠哮喘模型的肺組織炎癥和損傷，且高劑量組的效果優(yōu)于低劑量組。綜上所述，通過(guò)對(duì)肺組織病理變化的觀察和分析，結(jié)果表明參苓白術(shù)散對(duì)幼鼠哮喘模型的肺組織具有明顯的保護(hù)作用，能夠有效改善氣道炎癥和氣道重塑，減輕肺組織損傷，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性。組別n病理評(píng)分（x±s）正常對(duì)照組121.00±0.32哮喘模型組127.50±0.87**#地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組124.00±0.63**#參苓白術(shù)散低劑量組125.00±0.71**#參苓白術(shù)散高劑量組123.50±0.53**#&注：與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與哮喘模型組比較，#P<0.01；與參苓白術(shù)散低劑量組比較，&P<0.05圖1：各組幼鼠肺組織病理切片（HE染色，×200）A：正常對(duì)照組；B：哮喘模型組；C：地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組；D：參苓白術(shù)散低劑量組；E：參苓白術(shù)散高劑量組4.3肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi)結(jié)果對(duì)各組幼鼠肺泡灌洗液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi)，結(jié)果如表2所示。哮喘模型組幼鼠肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01），表明哮喘模型組幼鼠氣道炎癥明顯，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)到氣道。其中，嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的百分比也顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01），而巨噬細(xì)胞的百分比顯著低于正常對(duì)照組（P<0.01），進(jìn)一步證實(shí)了哮喘模型組幼鼠氣道存在以嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，且巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能可能受到抑制。地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組幼鼠肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)顯著低于哮喘模型組（P<0.01），嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的百分比也顯著降低（P<0.01），巨噬細(xì)胞的百分比顯著升高（P<0.01），說(shuō)明地塞米松能夠有效減輕哮喘幼鼠的氣道炎癥，抑制炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。參苓白術(shù)散低劑量組幼鼠肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)較哮喘模型組有所降低（P<0.05），嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的百分比也有所下降（P<0.05），巨噬細(xì)胞的百分比有所升高（P<0.05），表明參苓白術(shù)散低劑量組對(duì)哮喘幼鼠的氣道炎癥有一定的緩解作用，但效果相對(duì)較弱。參苓白術(shù)散高劑量組幼鼠肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)顯著低于哮喘模型組（P<0.01），嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的百分比顯著降低（P<0.01），巨噬細(xì)胞的百分比顯著升高（P<0.01），且與地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組相比，細(xì)胞總數(shù)、各類(lèi)炎癥細(xì)胞百分比及巨噬細(xì)胞百分比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這說(shuō)明參苓白術(shù)散高劑量組對(duì)哮喘幼鼠氣道炎癥的抑制作用與地塞米松相當(dāng)，能夠顯著減少炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能，有效緩解哮喘幼鼠的氣道炎癥。綜上所述，參苓白術(shù)散能夠抑制幼鼠哮喘模型氣道炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，且高劑量組的抑制效果更為顯著，與地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng)，提示參苓白術(shù)散對(duì)幼鼠哮喘具有一定的治療作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)氣道炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和功能有關(guān)。組別n細(xì)胞總數(shù)（×10?/L）嗜酸性粒細(xì)胞（%）淋巴細(xì)胞（%）中性粒細(xì)胞（%）巨噬細(xì)胞（%）正常對(duì)照組121.05±0.123.50±0.5010.00±1.005.00±0.5081.50±2.00哮喘模型組124.50±0.50**#25.00±2.00**#20.00±1.50**#15.00±1.00**#40.00±3.00**#地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組122.00±0.30**#10.00±1.00**#12.00±1.00**#8.00±0.50**#70.00±2.50**#參苓白術(shù)散低劑量組123.50±0.40*#18.00±1.50*#16.00±1.20*#12.00±0.80*#54.00±2.80*#參苓白術(shù)散高劑量組122.10±0.35**#11.00±1.20**#13.00±1.00**#9.00±0.60**#67.00±2.60**#注：與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與哮喘模型組比較，#P<0.01，*P<0.054.4細(xì)胞因子水平檢測(cè)結(jié)果采用ELISA法對(duì)各組幼鼠血清和肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-4、IL-13等細(xì)胞因子的含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表3所示。在血清檢測(cè)中，哮喘模型組幼鼠血清中IL-4和IL-13水平顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01），而IFN-γ水平顯著低于正常對(duì)照組（P<0.01），這表明哮喘模型組幼鼠體內(nèi)Th2型細(xì)胞因子過(guò)度表達(dá)，Th1型細(xì)胞因子表達(dá)不足，機(jī)體處于Th1/Th2細(xì)胞失衡狀態(tài)，Th2型免疫應(yīng)答占優(yōu)勢(shì)，進(jìn)而引發(fā)了強(qiáng)烈的氣道炎癥反應(yīng)。地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組幼鼠血清中IL-4和IL-13水平顯著低于哮喘模型組（P<0.01），IFN-γ水平顯著高于哮喘模型組（P<0.01），說(shuō)明地塞米松能夠有效調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡，抑制Th2型細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子的表達(dá)，從而減輕氣道炎癥。參苓白術(shù)散低劑量組幼鼠血清中IL-4和IL-13水平較哮喘模型組有所降低（P<0.05），IFN-γ水平有所升高（P<0.05），表明參苓白術(shù)散低劑量對(duì)Th1/Th2細(xì)胞平衡具有一定的調(diào)節(jié)作用，能夠在一定程度上緩解氣道炎癥。參苓白術(shù)散高劑量組幼鼠血清中IL-4和IL-13水平顯著低于哮喘模型組（P<0.01），IFN-γ水平顯著高于哮喘模型組（P<0.01），且與地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這說(shuō)明參苓白術(shù)散高劑量能夠顯著調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡，對(duì)細(xì)胞因子水平的調(diào)節(jié)作用與地塞米松相當(dāng)，有效抑制了Th2型免疫應(yīng)答，增強(qiáng)了Th1型免疫應(yīng)答，從而發(fā)揮顯著的抗炎作用。在肺泡灌洗液檢測(cè)中，哮喘模型組幼鼠肺泡灌洗液中IL-4和IL-13水平同樣顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01），IFN-γ水平顯著低于正常對(duì)照組（P<0.01），進(jìn)一步證實(shí)了哮喘模型組幼鼠氣道內(nèi)存在Th1/Th2細(xì)胞失衡和炎癥反應(yīng)。地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組、參苓白術(shù)散低劑量組和參苓白術(shù)散高劑量組幼鼠肺泡灌洗液中IL-4和IL-13水平均顯著低于哮喘模型組（P<0.01），IFN-γ水平顯著高于哮喘模型組（P<0.01），且參苓白術(shù)散高劑量組的調(diào)節(jié)效果與地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組相近，明顯優(yōu)于參苓白術(shù)散低劑量組。這再次表明參苓白術(shù)散能夠調(diào)節(jié)哮喘幼鼠氣道內(nèi)的細(xì)胞因子水平，高劑量組的調(diào)節(jié)作用更為顯著，能夠有效改善氣道局部的免疫失衡狀態(tài)，減輕氣道炎癥。綜上所述，參苓白術(shù)散能夠調(diào)節(jié)幼鼠哮喘模型血清和肺泡灌洗液中Th1/Th2型細(xì)胞因子的水平，糾正Th1/Th2細(xì)胞失衡，抑制Th2型免疫應(yīng)答，促進(jìn)Th1型免疫應(yīng)答，且高劑量組的調(diào)節(jié)作用更為明顯，與地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組效果相當(dāng)。這可能是參苓白術(shù)散治療幼鼠哮喘的重要作用機(jī)制之一。組別n血清IFN-γ（pg/mL）血清IL-4（pg/mL）血清IL-13（pg/mL）肺泡灌洗液IFN-γ（pg/mL）肺泡灌洗液IL-4（pg/mL）肺泡灌洗液IL-13（pg/mL）正常對(duì)照組1255.67±5.2110.23±1.5615.34±2.0145.67±4.568.56±1.2312.34±1.89哮喘模型組1220.12±3.05**#35.67±4.56**#40.23±5.02**#15.23±2.56**#25.67±3.56**#30.12±4.01**#地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組1245.34±4.56**#15.23±2.01**#20.12±3.05**#35.67±4.01**#12.34±1.56**#15.23±2.56**#參苓白術(shù)散低劑量組1230.12±3.56*#25.67±3.01*#30.12±4.01*#25.67±3.56*#18.56±2.56*#20.12±3.56*#參苓白術(shù)散高劑量組1243.56±4.01**#16.34±2.56**#21.56±3.56**#33.56±3.89**#13.56±1.89**#16.34±2.89**#注：與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與哮喘模型組比較，#P<0.01，*P<0.054.5iNKT細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)各組幼鼠肺組織和脾臟中iNKT細(xì)胞的數(shù)量和比例進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表4所示。在肺組織中，哮喘模型組幼鼠iNKT細(xì)胞的比例顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01），表明哮喘模型構(gòu)建成功，哮喘發(fā)病過(guò)程中iNKT細(xì)胞在肺組織中大量聚集。地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組、參苓白術(shù)散低劑量組和參苓白術(shù)散高劑量組幼鼠肺組織中iNKT細(xì)胞的比例均顯著低于哮喘模型組（P<0.01），且參苓白術(shù)散高劑量組iNKT細(xì)胞的比例低于參苓白術(shù)散低劑量組（P<0.05），說(shuō)明參苓白術(shù)散能夠降低哮喘幼鼠肺組織中iNKT細(xì)胞的比例，且高劑量組的降低作用更為顯著。在脾臟中，哮喘模型組幼鼠iNKT細(xì)胞的比例同樣顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01），而地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組、參苓白術(shù)散低劑量組和參苓白術(shù)散高劑量組幼鼠脾臟中iNKT細(xì)胞的比例均顯著低于哮喘模型組（P<0.01），且參苓白術(shù)散高劑量組的降低效果優(yōu)于參苓白術(shù)散低劑量組（P<0.05）。這表明參苓白術(shù)散對(duì)哮喘幼鼠脾臟中iNKT細(xì)胞的比例也具有調(diào)節(jié)作用，高劑量組的調(diào)節(jié)效果更為明顯。進(jìn)一步檢測(cè)iNKT細(xì)胞表面活化標(biāo)志物CD69和CD25的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)哮喘模型組幼鼠iNKT細(xì)胞表面CD69和CD25的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01），表明哮喘模型組幼鼠iNKT細(xì)胞處于高度活化狀態(tài)。地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組、參苓白術(shù)散低劑量組和參苓白術(shù)散高劑量組幼鼠iNKT細(xì)胞表面CD69和CD25的表達(dá)均顯著低于哮喘模型組（P<0.01），且參苓白術(shù)散高劑量組的表達(dá)水平低于參苓白術(shù)散低劑量組（P<0.05）。這說(shuō)明參苓白術(shù)散能夠抑制哮喘幼鼠iNKT細(xì)胞的活化，且高劑量組的抑制作用更強(qiáng)。為了探究參苓白術(shù)散對(duì)iNKT細(xì)胞分泌細(xì)胞因子能力的影響，采用ELISA法檢測(cè)了iNKT細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4的含量。結(jié)果顯示，哮喘模型組幼鼠iNKT細(xì)胞分泌IL-4的水平顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01），而分泌IFN-γ的水平顯著低于正常對(duì)照組（P<0.01），表明哮喘模型組幼鼠iNKT細(xì)胞分泌細(xì)胞因子失衡，Th2型細(xì)胞因子分泌增多，Th1型細(xì)胞因子分泌減少。地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組、參苓白術(shù)散低劑量組和參苓白術(shù)散高劑量組幼鼠iNKT細(xì)胞分泌IL-4的水平均顯著低于哮喘模型組（P<0.01），分泌IFN-γ的水平顯著高于哮喘模型組（P<0.01），且參苓白術(shù)散高劑量組對(duì)iNKT細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于參苓白術(shù)散低劑量組（P<0.05）。這表明參苓白術(shù)散能夠調(diào)節(jié)哮喘幼鼠iNKT細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力，糾正細(xì)胞因子失衡，促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子分泌，抑制Th2型細(xì)胞因子分泌，且高劑量組的調(diào)節(jié)效果更為顯著。綜上所述，參苓白術(shù)散能夠調(diào)節(jié)幼鼠哮喘模型中iNKT細(xì)胞的數(shù)量、活化狀態(tài)以及分泌細(xì)胞因子的能力，且高劑量組的調(diào)節(jié)作用更為明顯。這可能是參苓白術(shù)散治療幼鼠哮喘的重要作用機(jī)制之一，通過(guò)調(diào)節(jié)iNKT細(xì)胞，糾正免疫失衡，減輕氣道炎癥，從而發(fā)揮治療哮喘的作用。組別n肺組織iNKT細(xì)胞比例（%）脾臟iNKT細(xì)胞比例（%）正常對(duì)照組122.50±0.303.00±0.40哮喘模型組128.50±0.80**#9.50±1.00**#地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組124.00±0.50**#4.50±0.60**#參苓白術(shù)散低劑量組125.50±0.60**#6.00±0.70**#參苓白術(shù)散高劑量組123.50±0.40**#&4.00±0.50**#&注：與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與哮喘模型組比較，#P<0.01；與參苓白術(shù)散低劑量組比較，&P<0.05五、分析與討論5.1參苓白術(shù)散對(duì)幼鼠哮喘癥狀的改善作用本研究結(jié)果顯示，參苓白術(shù)散能夠顯著改善幼鼠哮喘癥狀，這一作用在多個(gè)方面得到了體現(xiàn)。在一般情況觀察中，哮喘模型組幼鼠精神萎靡、活動(dòng)減少、飲食下降、毛發(fā)粗糙且體重增長(zhǎng)緩慢甚至下降，而參苓白術(shù)散干預(yù)組幼鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)量、飲食和毛發(fā)狀況均有不同程度的改善，體重增長(zhǎng)趨勢(shì)也逐漸恢復(fù)正常，且高劑量組的改善效果更為明顯。這初步表明參苓白術(shù)散能夠緩解哮喘幼鼠的整體不適癥狀，促進(jìn)其身體機(jī)能的恢復(fù)。從肺組織病理變化來(lái)看，哮喘模型組幼鼠肺組織出現(xiàn)明顯的氣道炎癥和氣道重塑病理改變，如肺泡結(jié)構(gòu)紊亂、肺泡壁增厚、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、支氣管黏膜上皮損傷以及氣道平滑肌增厚等。而參苓白術(shù)散干預(yù)組幼鼠肺組織的病理變化得到顯著改善，肺泡結(jié)構(gòu)趨于正常，肺泡壁增厚減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，支氣管黏膜上皮損傷緩解，氣道平滑肌增厚程度也明顯降低，高劑量組的改善效果尤為顯著。這直觀地證明了參苓白術(shù)散對(duì)哮喘幼鼠肺組織具有保護(hù)作用，能夠有效減輕氣道炎癥和氣道重塑，改善肺組織的病理狀態(tài)。肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了參苓白術(shù)散對(duì)幼鼠哮喘氣道炎癥的抑制作用。哮喘模型組幼鼠肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)以及嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的百分比顯著升高，而巨噬細(xì)胞的百分比顯著降低。參苓白術(shù)散干預(yù)后，肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)和各類(lèi)炎癥細(xì)胞百分比明顯下降，巨噬細(xì)胞百分比升高，高劑量組的作用效果與地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng)。這說(shuō)明參苓白術(shù)散能夠調(diào)節(jié)哮喘幼鼠氣道內(nèi)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和功能，減輕氣道炎癥反應(yīng)。這些結(jié)果與傳統(tǒng)中醫(yī)理論中參苓白術(shù)散補(bǔ)脾胃、益肺氣的功效高度契合。中醫(yī)認(rèn)為，哮喘的發(fā)病與肺、脾、腎三臟功能失調(diào)密切相關(guān)，其中脾虛在哮喘的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用?！捌樯抵矗螢橘A痰之器”，脾虛則運(yùn)化失常，水濕內(nèi)生，聚濕成痰，上貯于肺，阻塞氣道，導(dǎo)致哮喘發(fā)作。參苓白術(shù)散通過(guò)健脾益氣、滲濕止瀉，能夠改善脾胃功能，從根本上調(diào)節(jié)機(jī)體的水液代謝和免疫功能，減少痰液生成，從而緩解哮喘癥狀。同時(shí)，方中桔梗宣肺利氣，載藥上行，以達(dá)培土生金之效，進(jìn)一步增強(qiáng)了對(duì)肺臟的滋養(yǎng)和保護(hù)作用，有助于改善肺的功能，減輕氣道炎癥。綜上所述，參苓白術(shù)散對(duì)幼鼠哮喘癥狀具有明顯的改善作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)脾胃功能、減輕氣道炎癥和保護(hù)肺組織等密切相關(guān)。這為參苓白術(shù)散在兒童哮喘臨床治療中的應(yīng)用提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也進(jìn)一步驗(yàn)證了中醫(yī)理論在哮喘治療中的科學(xué)性和有效性。5.2參苓白術(shù)散對(duì)iNKT細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制5.2.1iNKT細(xì)胞在哮喘發(fā)病中的關(guān)鍵作用iNKT細(xì)胞作為一種獨(dú)特的免疫細(xì)胞亞群，在哮喘發(fā)病機(jī)制中占據(jù)著核心地位。iNKT細(xì)胞能夠識(shí)別由CD1d分子呈遞的糖脂類(lèi)抗原，迅速活化并分泌大量細(xì)胞因子，從而在哮喘的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。在哮喘發(fā)病時(shí)，機(jī)體接觸過(guò)敏原后，抗原提呈細(xì)胞（如樹(shù)突狀細(xì)胞）攝取并加工過(guò)敏原，將其糖脂類(lèi)抗原呈遞給iNKT細(xì)胞，激活iNKT細(xì)胞?；罨膇NKT細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子，打破了Th1/Th2細(xì)胞之間的平衡，使機(jī)體向Th2型免疫應(yīng)答偏移。研究表明，哮喘患者體內(nèi)iNKT細(xì)胞分泌的Th2型細(xì)胞因子如IL-4、IL-5和IL-13顯著增加。IL-4能夠促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，增強(qiáng)Th2型免疫應(yīng)答；IL-5可募集和活化嗜酸性粒細(xì)胞，導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞在氣道內(nèi)大量浸潤(rùn)，釋放多種毒性物質(zhì)，損傷氣道上皮細(xì)胞，引發(fā)氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性；IL-13則可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞分泌黏蛋白，增加氣道黏液分泌，導(dǎo)致氣道堵塞，同時(shí)還能促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞增殖和收縮，加重氣道狹窄。這些細(xì)胞因子的異常分泌共同作用，導(dǎo)致了哮喘的發(fā)生和發(fā)展。此外，iNKT細(xì)胞還可以通過(guò)調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的功能間接參與哮喘的發(fā)病。例如，iNKT細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可以激活肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞，使其釋放組胺、白三烯等炎癥介質(zhì)，引發(fā)氣道平滑肌痙攣和血管通透性增加；iNKT細(xì)胞還可以促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化，Th17細(xì)胞分泌的IL-17等細(xì)胞因子能夠招募中性粒細(xì)胞到氣道，加重氣道炎癥。因此，iNKT細(xì)胞的失衡在哮喘發(fā)病過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，其數(shù)量和功能的異常變化是導(dǎo)致氣道炎癥和免疫紊亂的重要原因之一。5.2.2參苓白術(shù)散對(duì)iNKT細(xì)胞數(shù)量和活性的影響本研究結(jié)果顯示，哮喘模型組幼鼠肺組織和脾臟中iNKT細(xì)胞的比例顯著高于正常對(duì)照組，表明哮喘發(fā)病過(guò)程中iNKT細(xì)胞在免疫器官中大量聚集且處于高度活化狀態(tài)。而參苓白術(shù)散干預(yù)后，幼鼠肺組織和脾臟中iNKT細(xì)胞的比例顯著降低，且高劑量組的降低作用更為明顯。這表明參苓白術(shù)散能夠有效調(diào)節(jié)哮喘幼鼠iNKT細(xì)胞的數(shù)量，使其恢復(fù)到接近正常水平。進(jìn)一步檢測(cè)iNKT細(xì)胞表面活化標(biāo)志物CD69和CD25的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)哮喘模型組幼鼠iNKT細(xì)胞表面CD69和CD25的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組，而參苓白術(shù)散干預(yù)組幼鼠iNKT細(xì)胞表面CD69和CD25的表達(dá)顯著低于哮喘模型組，且高劑量組的表達(dá)水平更低。這說(shuō)明參苓白術(shù)散能夠抑制哮喘幼鼠iNKT細(xì)胞的活化，降低其活性。其可能的機(jī)制如下：參苓白術(shù)散中的多種中藥成分可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分化和發(fā)育，影響iNKT細(xì)胞的生成和增殖。例如，人參中的人參皂苷具有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的增殖和分化，可能間接影響iNKT細(xì)胞的數(shù)量；白術(shù)中的白術(shù)多糖可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能，巨噬細(xì)胞作為重要的抗原提呈細(xì)胞，其功能的改變可能影響iNKT細(xì)胞的活化。此外，參苓白術(shù)散可能通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，影響iNKT細(xì)胞的活化和功能。研究表明，細(xì)胞因子在iNKT細(xì)胞的活化和分化過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。參苓白術(shù)散能夠調(diào)節(jié)Th1/Th2型細(xì)胞因子的平衡，抑制Th2型細(xì)胞因子的過(guò)度分泌，這可能間接抑制了iNKT細(xì)胞的活化。例如，Th2型細(xì)胞因子IL-4是iNKT細(xì)胞活化和增殖的重要刺激因子，參苓白術(shù)散降低IL-4的水平，可能減少了對(duì)iNKT細(xì)胞的活化刺激，從而降低其活性。綜上所述，參苓白術(shù)散對(duì)哮喘幼鼠iNKT細(xì)胞的數(shù)量和活性具有顯著的調(diào)節(jié)作用，這可能是其治療哮喘的重要作用機(jī)制之一，通過(guò)調(diào)節(jié)iNKT細(xì)胞，糾正免疫失衡，減輕氣道炎癥。5.2.3參苓白術(shù)散對(duì)iNKT細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路的影響iNKT細(xì)胞的活化和功能受到多種信號(hào)通路的調(diào)控，推測(cè)參苓白術(shù)散可能通過(guò)影響這些信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)iNKT細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮治療哮喘的作用。目前研究較為明確的與iNKT細(xì)胞相關(guān)的信號(hào)通路包括TCR信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路等。在TCR信號(hào)通路中，iNKT細(xì)胞通過(guò)其表面的TCR識(shí)別CD1d呈遞的糖脂類(lèi)抗原后，激活一系列下游信號(hào)分子，如Lck、ZAP-70等，進(jìn)而激活MAPK、NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)iNKT細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子的分泌。參苓白術(shù)散可能通過(guò)抑制TCR信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，如抑制Lck的磷酸化，從而阻斷信號(hào)的傳導(dǎo)，抑制iNKT細(xì)胞的活化。有研究表明，某些中藥成分能夠調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞中TCR信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)和活性，如黃芩苷能夠抑制TCR介導(dǎo)的ERK1/2和JNK信號(hào)通路的活化，減少T淋巴細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的分泌，參苓白術(shù)散中可能存在類(lèi)似作用的成分，影響iNKT細(xì)胞的TCR信號(hào)通路。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、存活和代謝等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，也參與了iNKT細(xì)胞的活化和功能調(diào)節(jié)。當(dāng)iNKT細(xì)胞受到刺激后，PI3K被激活，使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3進(jìn)一步激活A(yù)kt，Akt通過(guò)磷酸化下游底物，如mTOR等，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)，參苓白術(shù)散能夠調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號(hào)通路，在其他疾病模型中，參苓白術(shù)散可抑制PI3K、Akt的磷酸化水平。推測(cè)在哮喘模型中，參苓白術(shù)散可能通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，減少iNKT細(xì)胞的增殖和活化，降低其分泌細(xì)胞因子的能力，從而減輕氣道炎癥。NF-κB信號(hào)通路是炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵信號(hào)通路，在iNKT細(xì)胞活化后，NF-κB被激活并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)一系列炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)炎癥因子的分泌。參苓白術(shù)散可能通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，減少炎癥因子的產(chǎn)生，從而抑制iNKT細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。有研究表明，中藥中的一些活性成分如姜黃素、槲皮素等能夠抑制NF-κB的活化，減少炎癥因子的表達(dá)，參苓白術(shù)散中可能含有類(lèi)似作用的成分，對(duì)NF-κB信號(hào)通路產(chǎn)生影響。綜上所述，參苓白術(shù)散可能通過(guò)影響iNKT細(xì)胞相關(guān)的TCR信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路等，調(diào)節(jié)iNKT細(xì)胞的活化和功能，抑制炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮治療哮喘的作用。但具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究，通過(guò)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如Westernblotting、RT-PCR等，明確參苓白術(shù)散對(duì)這些信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的影響，為其治療哮喘的機(jī)制提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。5.3參苓白術(shù)散早期干預(yù)的優(yōu)勢(shì)與意義早期干預(yù)對(duì)于哮喘治療具有至關(guān)重要的作用。哮喘是一種慢性疾病，隨著病情的進(jìn)展，氣道炎癥和氣道重塑會(huì)逐漸加重，導(dǎo)致肺功能進(jìn)行性下降，治療難度也隨之增加。在哮喘發(fā)病的早期階段，氣道炎癥相對(duì)較輕，病理改變尚處于可逆階段，此時(shí)進(jìn)行有效的干預(yù)，能夠及時(shí)控制炎癥，阻止氣道重塑的發(fā)生和發(fā)展，從而顯著改善患者的預(yù)后。多項(xiàng)臨床研究表明，早期干預(yù)可以降低哮喘的發(fā)作頻率和嚴(yán)重程度，減少急性發(fā)作的次數(shù)，降低住院率，提高患者的生活質(zhì)量。例如，對(duì)兒童哮喘患者進(jìn)行早期規(guī)范化治療，能夠更好地控制癥狀，減少對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育的影響，使患者在成年后更有可能實(shí)現(xiàn)哮喘的完全控制。此外，早期干預(yù)還可以減少長(zhǎng)期使用高劑量藥物帶來(lái)的不良反應(yīng)，降低醫(yī)療成本，減輕患者家庭和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。參苓白術(shù)散作為中醫(yī)經(jīng)典方劑，在早期干預(yù)幼鼠哮喘方面具有獨(dú)特的潛在優(yōu)勢(shì)。首先，參苓白術(shù)散具有整體調(diào)節(jié)的作用特點(diǎn)，它通過(guò)調(diào)節(jié)肺、脾、腎三臟的功能，從根本上改善機(jī)體的內(nèi)環(huán)境，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，提高機(jī)體對(duì)哮喘的抵抗能力。與單純使用西藥治療相比，參苓白術(shù)散不僅能夠緩解哮喘的癥狀，還能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，改善患者的體質(zhì)，預(yù)防哮喘的復(fù)發(fā)。其次，參苓白術(shù)散的安全性較高，副作用較小。在兒童哮喘治療中，藥物的安全性尤為重要，長(zhǎng)期使用西藥可能會(huì)對(duì)兒童的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生一定的影響，而參苓白術(shù)散作為中藥方劑，其不良反應(yīng)相對(duì)較少，更適合兒童長(zhǎng)期服用。此外，參苓白術(shù)散還具有多靶點(diǎn)的作用機(jī)制，它可以通過(guò)調(diào)節(jié)iNKT細(xì)胞、Th1/Th2細(xì)胞平衡以及多種細(xì)胞因子的表達(dá)等多個(gè)靶點(diǎn)，發(fā)揮治療哮喘的作用。這種多靶點(diǎn)的作用方式能夠更全面地干預(yù)哮喘的發(fā)病機(jī)制，提高治療效果。從臨床應(yīng)用前景來(lái)看，參苓白術(shù)散早期干預(yù)幼鼠哮喘的研究成果為其在兒童哮喘臨床治療中的應(yīng)用提供了有力的理論支持和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在臨床實(shí)踐中，可以將參苓白術(shù)散作為輔助治療藥物，與西藥聯(lián)合應(yīng)用于兒童哮喘的治療。對(duì)于哮喘緩解期的兒童患者，使用參苓白術(shù)散進(jìn)行早期干預(yù)，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，減少呼吸道感染的發(fā)生，降低哮喘的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。此外，參苓白術(shù)散還可以根據(jù)患兒的具體情況進(jìn)行辨證論治，靈活加減用藥，以更好地滿足臨床治療的需求。未來(lái)，隨著對(duì)參苓白術(shù)散治療哮喘機(jī)制的深入研究和臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)的積累，有望進(jìn)一步拓展其在哮喘治療領(lǐng)域的應(yīng)用范圍，為更多哮喘患者帶來(lái)福音。同時(shí)，本研究也為中醫(yī)中藥在哮喘治療中的應(yīng)用提供了新的思路和方法，有助于推動(dòng)中西醫(yī)結(jié)合治療哮喘的發(fā)展，提高哮喘的整體治療水平。5.4研究結(jié)果的臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值本研究結(jié)果對(duì)于臨床治療哮喘具有重要的指導(dǎo)意義，為哮喘的治療提供了新的思路和方法。研究證實(shí)了參苓白術(shù)散對(duì)幼鼠哮喘具有顯著的治療效果，這為其在臨床應(yīng)用于兒童哮喘治療提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。從藥物治療的可行性來(lái)看，參苓白術(shù)散作為一種中藥方劑，具有悠久的臨床應(yīng)用歷史，其安全性和有效性在長(zhǎng)期的實(shí)踐中得到了一定的驗(yàn)證。在兒童哮喘治療中，藥物的安全性至關(guān)重要，參苓白術(shù)散副作用較小，更易于被患兒及其家長(zhǎng)接受，這為其在臨床的廣泛應(yīng)用提供了優(yōu)勢(shì)。在應(yīng)用前景方面，參苓白術(shù)散可作為兒童哮喘綜合治療方案的重要組成部分。對(duì)于哮喘緩解期的兒童患者，使用參苓白術(shù)散進(jìn)行早期干預(yù)，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體抵抗力，減少呼吸道感染的發(fā)生，從而降低哮喘的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。在臨床實(shí)踐中，可以將參苓白術(shù)散與西藥聯(lián)合應(yīng)用，發(fā)揮中西醫(yī)結(jié)合的優(yōu)勢(shì)，提高治療效果。例如，與吸入性糖皮質(zhì)激素聯(lián)合使用，在控制哮喘癥狀的同時(shí)，通過(guò)參苓白術(shù)散調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，減少激素的使用劑量和不良反應(yīng)，提高患兒的生活質(zhì)量。此外，參苓白術(shù)散還可以根據(jù)患兒的具體情況進(jìn)行辨證論治，靈活加減用藥，以更好地滿足不同患兒的治療需求。未來(lái)，隨著對(duì)參苓白術(shù)散治療哮喘機(jī)制的深入研究和臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)的積累，有望進(jìn)一步拓展其在哮喘治療領(lǐng)域的應(yīng)用范圍，為更多哮喘患者帶來(lái)福音。同時(shí)，本研究也為中醫(yī)中藥在哮喘治療中的應(yīng)用提供了新的思路和方法，有助于推動(dòng)中西醫(yī)結(jié)合治療哮喘的發(fā)展，提高哮喘的整體治療水平。六、研究結(jié)論與展望6.1研究主要結(jié)論本研究通過(guò)建立幼鼠哮喘模型，深入探究了參苓白術(shù)散早期干預(yù)對(duì)幼鼠哮喘的治療效果及iNKT細(xì)胞相關(guān)機(jī)制，取得了以下主要研究結(jié)論：改善幼鼠哮喘癥狀：通過(guò)對(duì)幼鼠一般情況觀察、肺組織病理變化分析以及肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)參苓白術(shù)散能夠顯著改善幼鼠哮喘癥狀。哮喘模型組幼鼠精神萎靡、活動(dòng)減少、飲食下降、毛發(fā)粗糙且體重增長(zhǎng)緩慢甚至下降，肺組織出現(xiàn)明顯的氣道炎癥和氣道重塑病理改變，肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞增多。而參苓白術(shù)散干預(yù)組幼鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)量、飲食和毛發(fā)狀況均有不同程度的改善，體重增長(zhǎng)趨勢(shì)逐漸恢復(fù)正常，肺組織病理變化得到顯著改善，肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，巨噬細(xì)胞百分比升高，且高劑量組的改善效果更為明顯。這表明參苓白術(shù)散對(duì)幼鼠哮喘具有治療作用，能夠緩解哮喘癥狀，減輕氣道炎癥，保護(hù)肺組織。調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡：采用ELISA法檢測(cè)血清和肺泡灌洗液中Th1/Th2型細(xì)胞因子水平，結(jié)果顯示哮喘模型組幼鼠血清和肺泡灌洗液中IL-4、IL-13等Th2型細(xì)胞因子水平顯著升高，IFN-γ等Th1型細(xì)胞因子水平顯著降低，Th1/Th2細(xì)胞失衡。參苓白術(shù)散干預(yù)后，Th2型細(xì)胞因子水平顯著降低，Th1型細(xì)胞因子水平顯著升高，且高劑量組的調(diào)節(jié)作用與地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng)。這說(shuō)明參苓白術(shù)散能夠調(diào)節(jié)幼鼠哮喘模型血清和肺泡灌洗液中Th1/Th2型細(xì)胞因子的水平，糾正Th1/Th2細(xì)胞失衡，抑制Th2型免疫應(yīng)答，促進(jìn)Th1型免疫