基因工程（一）【2021?山東卷25.（12分）】人類γ基因啟動(dòng)子上游的調(diào)控序列中含有BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)結(jié)合BCL11A蛋白后，γ基因的表達(dá)被抑制。通過改變該結(jié)合位點(diǎn)的序列，解除對(duì)γ基因表達(dá)的抑制，可對(duì)某種地中海貧血癥進(jìn)行基因治療?？蒲腥藛T擴(kuò)增了γ基因上游不同長度的片段，將這些片段分別插入表達(dá)載體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和熒光檢測，以確定BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)的具體位置。相關(guān)信息如圖所示。PCR如何擴(kuò)增目的基因？依據(jù)終止子，如何構(gòu)建基因表達(dá)載體？【真題感悟】如何選擇限制酶？（1）為將擴(kuò)增后的產(chǎn)物定向插入載體指導(dǎo)熒光蛋白基因表達(dá)，需在引物末端添加限制酶識(shí)別序列。據(jù)圖可知，在F1～F7末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是______，在R末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是_______。本實(shí)驗(yàn)中,從產(chǎn)物擴(kuò)增到載體構(gòu)建完成的整個(gè)過程共需要______種酶。（2）將構(gòu)建的載體導(dǎo)入除去BCL11A基因的受體細(xì)胞，成功轉(zhuǎn)化后，含F(xiàn)1～F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的載體表達(dá)熒光蛋白，受體細(xì)胞有熒光，含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無熒光。含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無熒光的原因是________________。（3）向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素，含F(xiàn)1～F4與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞不再有熒光，而含F(xiàn)5～F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞仍有熒光。若γ基因上游調(diào)控序列上與引物序列所對(duì)應(yīng)的位置不含有BCL11A蛋白的結(jié)合位點(diǎn)序列，據(jù)此結(jié)果可推測，BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)位于________，理由是___________。如何解決這類問題？1.闡明基因工程的工具和基本操作程序，熟練掌握基礎(chǔ)知識(shí)。2.理解PCR基本原理及DNA聚合酶、引物的作用機(jī)理，能運(yùn)用PCR原理解決生產(chǎn)中的實(shí)際問題。3.訓(xùn)練思維能力和邏輯推理能力，提高語言表達(dá)的準(zhǔn)確性和有效性?！緦W(xué)習(xí)目標(biāo)】考點(diǎn)1基因工程的基本工具【考點(diǎn)突破】1．下圖是細(xì)胞中的有關(guān)反應(yīng)，圈內(nèi)是相應(yīng)酶的作用位點(diǎn)，從括號(hào)中選出催化該反應(yīng)酶。（限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶）限制性內(nèi)切核酸酶DNA聚合酶RNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶DNA連接酶2．將目的基因（圖乙）插入到載體質(zhì)粒（圖甲）中，試分析：（1）能否用AluⅠ酶切割質(zhì)粒和目的基因？為什么？

（2）若用SmaⅠ酶和PstⅠ酶切割，目的基因插入質(zhì)粒會(huì)出現(xiàn)什么結(jié)果？

（3）應(yīng)選哪種限制酶進(jìn)行切割？這樣做有什么好處？不能。會(huì)破壞目的基因目的基因反向插入載體質(zhì)粒HindⅢ酶和

PstⅠ酶保證目的基因和載體質(zhì)粒正確定向連接，避免目的基因自身環(huán)化標(biāo)記基因全被破壞例1如圖表示構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)的某種質(zhì)粒與目的基因。已知限制酶Ⅰ的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)是—↓GATC—。分析可知，最好選擇限制酶________切割質(zhì)粒，限制酶______切割目的基因所在的DNA，這樣做的好處分別是______________________、______________________。ⅡⅠ限制酶Ⅰ切割質(zhì)粒不會(huì)把兩個(gè)標(biāo)記基因都破壞掉，目的基因兩端均有限制酶Ⅱ的識(shí)別序列如何選擇合適的限制酶？總結(jié)：選擇合適的限制酶的原則（1）確定插入方向。保證目的基因是按照轉(zhuǎn)錄方向插入啟動(dòng)子下游、終止子上游。（2）保護(hù)目的基因。目的基因不能被限制酶切割。（3）保護(hù)載體相關(guān)結(jié)構(gòu)。載體的啟動(dòng)子、終止子等結(jié)構(gòu)不能被限制酶切割。（4）標(biāo)記基因。至少要保證有一個(gè)標(biāo)記基因是完整的。（5）選擇兩種或多種限制酶。既能保證目的基因正確插入，又可避免目的基因自身環(huán)化。考點(diǎn)2PCR1.下圖示PCR一次循環(huán)的三步，據(jù)圖分析。（1）DNA復(fù)制為何需要引物？

（2）DNA聚合酶從何處開始延伸子鏈？

（3）DNA的合成方向是？DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3'端延伸DNA鏈。引物為DNA聚合酶提供了3'端。DNA聚合酶從引物的3'端開始延伸DNA鏈5'→3'例2如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列，如右圖所示。若下表所列為已知的DNA序列和設(shè)計(jì)的一些PCR引物，步驟Ⅱ選用的PCR引物必須是____（從引物①②③④中選擇，填編號(hào)）3’3’解題思路：據(jù)子鏈延伸方向→確定引物的5′→3′→判斷引物序列②④【拓展】實(shí)際生產(chǎn)中有時(shí)還要根據(jù)需要，對(duì)擴(kuò)增所需引物進(jìn)行改造或重新設(shè)計(jì),下圖是某同學(xué)設(shè)計(jì)的一組引物（只標(biāo)注了部分堿基序列）不合理（如下圖），請(qǐng)說明理由。引物I和引物II局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而導(dǎo)致失效設(shè)計(jì)的引物不能存在堿基互補(bǔ)配對(duì)的序列，否則引物會(huì)失效。

新型冠狀病毒檢測常用RT-PCR技術(shù)，這是將mRNA逆轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的PCR反應(yīng)相結(jié)合的技術(shù)，具體過程如下圖所示。（1）過程①是指_________，所需的條件有__________。（2）從過程②開始只進(jìn)行PCR，而不再進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，原因是____。（3）利用RT-PCR技術(shù)可對(duì)某些微量RNA病毒進(jìn)行檢測，并可提高檢測的靈敏度，原因是____________________________。PCR擴(kuò)增的應(yīng)用實(shí)例——病毒檢測逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄的條件：mRNA模板、四種脫氧核苷酸、逆轉(zhuǎn)錄酶、引物A。思路：從結(jié)果逆推，直至題干所給條件（原因）進(jìn)行PCR→耐高溫的DNA聚合酶→溫度變化（升高到90℃以上）不進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄→逆轉(zhuǎn)錄酶失活→溫度變化提高靈敏度→DNA含量高→病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的DNA擴(kuò)增引物B、耐高溫的DNA聚合酶溫度升高到90℃以上，耐高溫的DNA聚合酶活性最強(qiáng)，逆轉(zhuǎn)錄酶變性失活。病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的DNA擴(kuò)增后含量升高。1.基因工程方面：

①獲得目的基因。無論目的基因是從基因文庫中獲取、逆轉(zhuǎn)錄合成的還是人工合成的，都需PCR擴(kuò)增后用于構(gòu)建基因表達(dá)載體。

②目的基因檢測。提取受體細(xì)胞中的染色體DNA或mRNA,擴(kuò)增后探針雜交檢測目的基因是否插入受體細(xì)胞或目的基因是否轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA.

2.刑偵方面：擴(kuò)增刑事現(xiàn)場提取的罪犯核酸，和嫌疑人的核酸進(jìn)行比對(duì)。3.親子鑒定、死者遺骸鑒定等4.遺傳病診斷5.基因組測序總結(jié)：PCR技術(shù)的應(yīng)用1.圖1所示目的基因和質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)應(yīng)選用限制酶___________________。2.若發(fā)現(xiàn)目的基因兩側(cè)無所需限制酶識(shí)別序列（如圖2），應(yīng)如何解決？EcoRⅠ和Sau3AⅠ擴(kuò)增目的基因時(shí)，在引物的5′端添加相關(guān)限制酶的識(shí)別序列。考點(diǎn)3基因表達(dá)載體的構(gòu)建及重組DNA的篩選EcoRⅠSau3AⅠHindⅢEcoRⅠSau3AⅠHindⅢ3.右圖所示質(zhì)粒上有氨芐青霉素抗性基因(amp)和四環(huán)素抗性基因(tet)。若將目的基因插入限制酶BamHⅠ和SalⅠ之間，分析如何篩選含有目的基因的受體細(xì)胞。含amp的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，導(dǎo)入質(zhì)粒的細(xì)胞形成菌落。將菌落影印到含tet的培養(yǎng)基復(fù)制板上沒有而母板上有的細(xì)胞就是含有目的基因的細(xì)胞2.熒光檢測：在目的基因下游連接熒光蛋白基因，檢測受體細(xì)胞是否發(fā)熒光。不僅檢測受體細(xì)胞是否含有目的基因，還能檢測目的基因是否表達(dá)合成蛋白質(zhì)。1.抗生素檢測例3【2021?山東卷25.（12分）】人類γ基因啟動(dòng)子上游的調(diào)控序列中含有BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)結(jié)合BCL11A蛋白后，γ基因的表達(dá)被抑制。通過改變該結(jié)合位點(diǎn)的序列，解除對(duì)γ基因表達(dá)的抑制，可對(duì)某種地中海貧血癥進(jìn)行基因治療?？蒲腥藛T擴(kuò)增了γ基因上游不同長度的片段，將這些片段分別插入表達(dá)載體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和熒光檢測，以確定BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)的具體位置。相關(guān)信息如圖所示。原理：BCL11A蛋白與結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合→啟動(dòng)子不發(fā)揮作用→γ基因表達(dá)受抑制（1）為將擴(kuò)增后的產(chǎn)物定向插入載體指導(dǎo)熒光蛋白基因表達(dá)，需在引物末端添加限制酶識(shí)別序列。據(jù)圖可知，在F1～F7末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是______，在R末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是_______。本實(shí)驗(yàn)中,從產(chǎn)物擴(kuò)增到載體構(gòu)建完成的整個(gè)過程共需要______種酶。RF1RF1先確定目的基因的插入方向選合適的限制酶R端F端擴(kuò)增：耐高溫的DNA聚合酶載體構(gòu)建：限制酶DNA連接酶4種—C—GTTAATCGAG—C—（2）將構(gòu)建的載體導(dǎo)入除去BCL11A基因的受體細(xì)胞，成功轉(zhuǎn)化后，含F(xiàn)1～F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的載體表達(dá)熒光蛋白，受體細(xì)胞有熒光，含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無熒光。含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無熒光的原因是________________。BCL11A蛋白與結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合→啟動(dòng)子不發(fā)揮作用→γ基因表達(dá)受抑制RF除去BCL11A蛋白基因→下游熒光蛋白基因正常表達(dá)→細(xì)胞有熒光細(xì)胞無熒光←熒光蛋白基因不表達(dá)擴(kuò)增產(chǎn)物的啟動(dòng)子不完整←RF（3）向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素，含F(xiàn)1～F4與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞不再有熒光，而含F(xiàn)5～F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞仍有熒光。若γ基因上游調(diào)控序列上與引物序列所對(duì)應(yīng)的位置不含有BCL11A蛋白的結(jié)合位點(diǎn)序列，據(jù)此結(jié)果可推測，BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)位于________，理由是___________。BCL11A蛋白與結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合→啟動(dòng)子不發(fā)揮作用→熒光蛋白基因不表達(dá)→受體細(xì)胞無熒光添加雌激素→BCL11A蛋白結(jié)合→熒光蛋白基因不表達(dá)→受體細(xì)胞無熒光←F4受體細(xì)胞有熒光熒光蛋白基因表達(dá)←目的基因上無BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)F5（3）向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素，含F(xiàn)1～F4與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞不再有熒光，而含F(xiàn)5～F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞仍有熒光。若γ基因上游調(diào)控序列上與引物序列所對(duì)應(yīng)的位置不含有BCL11A蛋白的結(jié)合位點(diǎn)序列，據(jù)此結(jié)果可推測，BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)位于________，理由是___________。引物F4與F5在調(diào)控序列上所對(duì)應(yīng)序列之間的區(qū)段上根據(jù)有無熒光情況判斷，F(xiàn)1～F4與R擴(kuò)增產(chǎn)物上均有結(jié)合位點(diǎn)，因此結(jié)合位點(diǎn)位于F4所對(duì)應(yīng)調(diào)控序列的下游（右側(cè)）；F5～F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物上均無結(jié)合位點(diǎn)，可知結(jié)合位點(diǎn)位于F5所對(duì)應(yīng)調(diào)控序列的上游（左側(cè)），所以結(jié)合位點(diǎn)位于引物F4與F5在調(diào)控序列上所對(duì)應(yīng)序列之間的區(qū)段上RF（3）向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素，含F(xiàn)1～F4與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞不再有熒光，而含F(xiàn)5～F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞仍有熒光。若γ基因上游調(diào)控序列上與引物序列所對(duì)應(yīng)的位置不含有BCL11A蛋白的結(jié)合位點(diǎn)序列，據(jù)此