ICS65.080

CCSB10

12

天津市地方標(biāo)準(zhǔn)

DB12/T1271—2023

有機(jī)肥中活性大腸桿菌快速測(cè)定PMA-qPCR

法

RapiddetectionofliveEscherichiacoliinorganicfertilizerbyPMA-qPCRmethod

2023-11-07發(fā)布2023-12-08實(shí)施

天津市市場(chǎng)監(jiān)督管理委員會(huì)發(fā)布

DB12/T1271—2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由天津市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會(huì)提出并歸口。

本文件起草單位：天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所。

本文件主要起草人：張蕾、田雪力、池晶晶、路超、楊春蕾、韓靜、王麗麗、白朋勛。

I

DB12/T1271—2023

有機(jī)肥中活性大腸桿菌快速測(cè)定PMA-qPCR法

1范圍

本文件規(guī)定了有機(jī)肥中活性大腸桿菌PMA-qPCR測(cè)定方法的試劑與引物、主要儀器設(shè)備、樣品采集、

檢測(cè)步驟和檢測(cè)結(jié)果等技術(shù)內(nèi)容。

本文件適用于有機(jī)肥中活性大腸桿菌的檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB/T19438.1禽流感病毒通用熒光RT-PCR檢測(cè)方法

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

NY/T525有機(jī)肥料

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

活性大腸桿菌liveEscherichiacoli

在一定條件下可以引起人和多種動(dòng)物發(fā)生胃腸道感染或尿道等多種局部組織器官感染的致病菌。

3.2

暗反應(yīng)darkreaction

二氧化碳在植物細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)一連串酵素反應(yīng)，被還原成為葡萄糖的過程。

3.3

光反應(yīng)lightreaction

光合作用中，光能轉(zhuǎn)變成為化學(xué)能的過程。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件。

PMA：疊氮溴化丙錠（propidiummonoazide）

PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）

qPCR：實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitativereal-timePCR）

SYBRGreenI：核酸凝膠染料(SYBRgreennucleicacidgelstains)

ROX:參比染料（ROXreferencedye）

5原理

1

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PMA是光敏DNA染料，可與DNA發(fā)生不可逆的共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)。PMA無法透過活性細(xì)菌完整的細(xì)胞膜，但

可以進(jìn)入死亡細(xì)菌受損細(xì)胞膜，并永久修飾其DNA，阻斷DNA的PCR擴(kuò)增。在強(qiáng)光照射下，游離在溶液中

未與核酸交聯(lián)的剩余PMA可與水分子反應(yīng)，生成沒有活性的羥胺。羥胺不會(huì)對(duì)后續(xù)從活細(xì)菌提取的DNA

進(jìn)行修飾，不影響DNA正常擴(kuò)增。

樣品經(jīng)PMA預(yù)處理后再進(jìn)行DNA提取及PCR擴(kuò)增，可以克服常規(guī)PCR無法區(qū)分活性細(xì)菌與死亡細(xì)菌釋放

出的游離DNA的缺陷，有效避免PCR檢測(cè)中的假陽性結(jié)果。

6試劑與引物

6.1試劑

6.1.1除另有規(guī)定外，試劑均為分析純或生化試劑。試驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682中二級(jí)水的要求。

6.1.2PMA儲(chǔ)備液（5μg/μL）：1mgPMA溶于200μL20%的DMSO溶液中，-20℃避光保存。

6.1.3PMA工作液：將PMA儲(chǔ)備液以20%DMSO溶液稀釋10倍。

6.1.40.01mol/L（pH7.2）PBS：配方見GB/T19438.1附錄A。

6.1.595%乙醇。

6.1.6DNA提取試劑盒。

6.1.7SYBRPremixExTaq染料法實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒：內(nèi)含TaKaRaExTaqHS，dNTPMixture，Mg2+，

TliRNaseH，SYBRGreenI。根據(jù)qPCR儀型號(hào)選用ROX或ROXII校正。

6.1.8qPCR標(biāo)準(zhǔn)品：含有目的基因的克隆質(zhì)粒，也可采用經(jīng)純化后的基因組DNA。

6.2引物

大腸桿菌uidA基因qPCR擴(kuò)增所用引物見表1。

表1大腸桿菌uidA基因qPCR擴(kuò)增引物

引物名稱引物序列引物濃度擴(kuò)增產(chǎn)物大小

上游引物UAL1939b5’-ATGGAATTTCGCCGATTTTGC-3’10μmoL/L

167bp

下游引物UAL2105b5’-ATTGTTTGCCTCCCTGCTGC-3’10μmoL/L

7主要儀器設(shè)備

超凈工作臺(tái)、冰箱（0℃～4℃）、分析天平（精度0.01g）、恒溫震蕩培養(yǎng)箱、LED光解儀（波長

465nm～475nm、溫度低于37℃）、低溫離心機(jī)（最大離心力≥12000g）、微型孔板離心機(jī)、漩渦震蕩

器、核酸自動(dòng)提取儀、qPCR儀、超微量分光光度計(jì)等。

8樣品采集

8.1采樣方法

應(yīng)按NY/T525中的要求進(jìn)行采樣。

8.2樣品縮分

將采集的樣品混勻，用四分法將樣品縮分至500g。

8.3樣品運(yùn)輸及保存

2

DB12/T1271—2023

樣品在運(yùn)輸過程中宜低溫保存，應(yīng)在6小時(shí)內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)室接樣后不能立即檢測(cè)的，

應(yīng)將樣品放入0℃～4℃冰箱保存，放置時(shí)間不應(yīng)超過24h。

9檢測(cè)步驟

9.1樣品制備

將樣品進(jìn)一步縮分后研磨至全部通過?1mm尼龍篩，混勻。無菌操作下稱取樣品10.0g，加入到帶玻

璃珠的90mL無菌PBS緩沖液中，置于恒溫震蕩培養(yǎng)箱中，200r/min震蕩30min。于4℃，1000×g離心10min

收集上清液。

9.2PMA處理

取1mL上清液至離心管中，加入0.2mLPMA工作液，PMA終濃度約為80μg/mL，避光放置10min。將

離心管置于LED光解儀，曝光5min。再將離心管于4℃，12000×g離心5min，棄上清液，無菌PBS緩沖液

洗滌2次后重懸。

9.3DNA提取

可選用等效的商品化核酸提取試劑盒，或選用核酸自動(dòng)提取儀及配套試劑，參考附錄A。

9.4qPCR反應(yīng)

9.4.1qPCR反應(yīng)體系（20μL）：SYBRPremixExTaq10μL，RoxII0.4μL，上下游引物各0.4μL，ddH2O

6.8μL，標(biāo)準(zhǔn)品或樣品DNA2μL。

9.4.2qPCR反應(yīng)程序：1個(gè)循環(huán)：50℃，2min，95℃，30s；40個(gè)循環(huán)：95℃，5s，60℃，34s。

9.4.3檢測(cè)過程中設(shè)空白對(duì)照、陽性對(duì)照。樣品與對(duì)照均設(shè)3個(gè)重復(fù)。

9.5標(biāo)準(zhǔn)曲線

提取標(biāo)準(zhǔn)品DNA，根據(jù)公式（1）計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)品的原始拷貝數(shù)。將標(biāo)準(zhǔn)品DNA用ddH2O連續(xù)10倍梯度稀

釋4份～6份，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后，以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲

線。

…………（1）

式中：

Ccopies——基因拷貝數(shù)，單位為copies/mL；

CDNA——DNA濃度，單位為g/mL；

L——基因組DNA長度，單位為bp；

23

NA——阿伏伽德羅常數(shù)，取6.02×10。

10檢測(cè)結(jié)果

10.1閾值（Ct）設(shè)定

檢測(cè)結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值直接讀取檢測(cè)結(jié)果，Ct值為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到

設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性

樣品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。

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10.2質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

10.2.1空白對(duì)照無Ct值，且無典型擴(kuò)增曲線。

10.2.2陽性對(duì)照的Ct值應(yīng)＜27.0，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。

10.3檢測(cè)結(jié)果確定

根據(jù)樣品Ct值，在繪制出的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖上得到對(duì)應(yīng)的大腸桿菌的DNA量。

4

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A

A

附錄A

（資料性）

DNA自動(dòng)提取儀操作步驟

A.1試劑盒

基于磁珠分離技術(shù)，均質(zhì)的樣品細(xì)胞被裂解，再通過包覆二氧化硅的磁珠來吸附核酸。然后利用清

洗液去除雜質(zhì)，最終由洗脫液將核酸從磁珠上洗脫下來。試劑盒內(nèi)包含的試劑規(guī)格和數(shù)量見表A.1。所

有試劑應(yīng)于室溫保存（16～30℃），置于陰涼干燥處。使用之前應(yīng)檢查試劑盒有效期，不得使用任何過

期試劑。

表A.1試劑盒組成

試劑名稱規(guī)格數(shù)量單位

磁珠液（MagneticBead）18mL1瓶

裂解液（LysisBuffer）180mL1瓶

清洗液A（WashingBufferA）135mL2瓶

清洗液B（WashingBufferB）40mL2瓶

洗脫液（ElutingBuffer）64mL1瓶

注1：清洗液A在使用前需加135mL95%的乙醇。加完乙醇后要做上標(biāo)記；

注2：清洗液B在使用前需加230mL95%的乙醇。加完乙醇后要做上標(biāo)記。

A.2耗材

根據(jù)實(shí)際工作需要，可選擇96孔或48孔萃取樣品盤。所有耗材為一次性使用，不得重復(fù)使用。

A.3儀器及設(shè)備

自動(dòng)核酸萃取儀、微量移液器及槍頭（100μL；200μL；1000μL）

A.4操作步驟

A.4.1試劑添加

A.4.1.1室溫條件下，在萃取樣品盤1#列/7#列，添加500μL裂解液。

A.4.1.2在萃取樣品盤2#列和3#列/8#列和9#列，添加750μL清洗液A。

A.4.1.3在萃取樣品盤4#列和5#列/10#列和11#列，添加750μL清洗液B。

A.4.1.4在萃取樣品盤6#列/12#列添加50-200μL洗脫液。

A.4.1.5搖晃重懸磁珠，在萃取樣品盤2#/8#列添加50μL磁珠。

A.4.1.6在萃取樣品盤1#列/7#列，添加200μL95%乙醇。

A.4.2加樣

取200μL樣品上清液，加入到萃取樣品盤的1#列/7#列，見圖A.1。

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圖A.1萃取樣品盤

A.4.3啟動(dòng)

開啟自動(dòng)核酸萃取儀進(jìn)樣門，安裝已加好試劑的96孔萃取樣品盤和攪拌套管，確保萃取樣品盤完全

推入底部。關(guān)閉自動(dòng)核酸萃取儀進(jìn)樣門，按下“開始”按鈕。萃取反應(yīng)將在1小時(shí)內(nèi)完成。

A.4.4關(guān)閉

萃取完成后，取出萃取樣品盤，將核酸從6#列/12#列轉(zhuǎn)移到新的離心管保存。最終洗脫下來的核酸

可能存在磁珠殘留，但并不影響后續(xù)操作，若是需最小化磁珠殘留所帶來的風(fēng)險(xiǎn)，可將洗脫液轉(zhuǎn)移到離

心管，全速離心1min，然后將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中。建議使用新鮮制備的核酸用于后續(xù)操作，若

要長期保存核酸，建議存于-80℃超低溫冰箱。

B

6

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參考文獻(xiàn)

[1]GB/T20000.1—2014標(biāo)準(zhǔn)化工作指南第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化和相關(guān)活動(dòng)的