ICS65.020.30

CCSB43

12

天津市地方標(biāo)準(zhǔn)

DB12/T1328—2024

畜禽養(yǎng)殖糞污中典型致病菌檢測三重?cái)?shù)字

PCR法

Detectionoftypicalpathogenicbacteriainlivestockwaste—TripledigitalPCR

method

2024-07-01發(fā)布2024-09-01實(shí)施

天津市市場監(jiān)督管理委員會發(fā)布

DB12/T1328—2024

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由天津市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會提出并歸口。

本文件起草單位：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所、天津市動物疫病預(yù)防控制中心、新疆農(nóng)墾科學(xué)

院、天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

本文件主要起草人：杜連柱、程深偉、張克強(qiáng)、梁雨、王健春、尹春博、劉福元、郜興亮、楊井泉、

蘇蘩。

I

DB12/T1328—2024

畜禽養(yǎng)殖糞污中典型致病菌檢測三重?cái)?shù)字PCR法

1范圍

本文件規(guī)定了畜禽養(yǎng)殖糞污中典型致病菌的三重?cái)?shù)字PCR檢測方法的原理、試劑和材料、儀器設(shè)

備、操作步驟、結(jié)果分析與表述及生物安全措施。

本文件適用于天津市畜禽養(yǎng)殖糞污中金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌O157:H7、沙門氏菌的快速定

量檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682—2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB19489—2008實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB/T25171—2023畜禽養(yǎng)殖環(huán)境與廢棄物管理術(shù)語

GB/T27403—2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測

GB/T27522—2023畜禽養(yǎng)殖污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范

SN/T4853轉(zhuǎn)基因大米定量檢測數(shù)字PCR法

SN/T5334.1—2020轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的數(shù)字PCR檢測方法第1部分：通用要求與定義

3術(shù)語和定義

GB/T25171—2023、SN/T5334.1—2020界定的術(shù)語和定義適用于本文件。

4原理

微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)采用毛細(xì)通道網(wǎng)格將數(shù)萬個(gè)微滴離散進(jìn)入2D芯片，從而有效地實(shí)現(xiàn)反應(yīng)體系的

精準(zhǔn)分割。該系統(tǒng)利用金黃色葡萄球菌的nuc、大腸埃希氏菌O157:H7的rfbE以及沙門氏菌的FimY特異性

基因序列對畜禽養(yǎng)殖糞污中典型致病菌進(jìn)行檢測。在PCR擴(kuò)增后，通過泊松分布校正陽性微滴的數(shù)量和

比例，可以準(zhǔn)確計(jì)算靶基因序列的起始拷貝數(shù)或濃度，從而同時(shí)實(shí)現(xiàn)對三種病原體的快速定量檢測。

5儀器和設(shè)備

所需儀器和設(shè)備如下：

a）微滴生成系統(tǒng)；

b）PCR儀；

c）微滴閱讀分析系統(tǒng)；

d）高速冷凍離心機(jī)：控溫4℃8℃，離心力不小于12000g/min；

e）分析天平：精度0.01g；

1

DB12/T1328—2024

f）恒溫水浴箱：95℃±1℃；

g）濕熱高壓蒸汽滅菌器；

h）恒溫振蕩搖床：控溫28℃±1℃37℃±1℃，轉(zhuǎn)速在125r/min250r/min；

i）生物安全柜；

j）組織研磨儀；

k）冰箱：控溫0℃4℃；

l）超低溫冰箱：控溫-20℃-80℃；

m）微量移液器：0.5μL10μL，20μL200μL，100μL1000μL；

n）超微量紫外分光光度計(jì)；

o）無菌離心管：1.5mL，15mL，50mL。

6試劑和材料

6.1除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682—2008規(guī)定的一級水。

6.2所需試劑和材料如下：

a)5×dPCR預(yù)混液；

b)溶菌酶；

c)裂解液：2%CTAB(cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨)，100mmol/L

Tris(trishydroxymethylaminomethane，三羥甲基氨基甲烷)，1.4mol/LNaCl，20mmol/L

EDTA(ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸)，用HCl調(diào)至pH8.0；

d)無水乙醇；

e)異丙醇；

f)DNAoff防核酸污染用劑；

g)熒光素鈉鹽。

6.3引物和探針

6.3.1金黃色葡萄球菌nuc基因引物和探針

nuc上游引物：5’-CCTGAAGCAAGTGCATTTACGA-3’

nuc下游引物：5’-CTTTAGCCAAGCCTTGACGAACT-3’

nuc探針：5’-（HEX）-TGGACGTGGCTTAGCGTATATTTATGCTGATG-（BHQ1）-3’

6.3.2大腸埃希氏菌O157:H7rfbE基因引物和探針

rfbE上游引物：5’-TCAAAAGGAAACTATATTCAGAAGTTTGA-3’

rfbE下游引物：5’-CGATATACCTAACGCTAACAAAGCTAA-3’

rfbE探針：5’-（CY5）-AATAAATTTGCGGAACAAAACCATGTGCAA-（BHQ3）-3’

6.3.3沙門氏菌的FimY基因引物和探針

FimY上游引物：5’-GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3’

FimY下游引物：5’-AGCAATGGAAAAAGCAGGATG-3’

FimY探針：5’-（FAM）-CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT-（BHQ1）-3’

7操作步驟

2

DB12/T1328—2024

7.1采樣物品

采樣容器應(yīng)經(jīng)121℃、20min高壓滅菌或使用一次性無菌器具。其余采用所用工具、文具和安全防

護(hù)用品等應(yīng)按照GB/T27522—2023中第7章規(guī)定執(zhí)行。

7.2采樣方法

參照GB/T36197進(jìn)行畜禽養(yǎng)殖糞污樣品的采集。

7.3樣品運(yùn)輸與保存

樣品在運(yùn)輸過程中應(yīng)4℃以下保存并及時(shí)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室檢測。如當(dāng)日送樣不能及時(shí)檢測，應(yīng)將樣品放

入0℃~4℃冰箱保存，放置時(shí)間不超過24h。若長期保存，應(yīng)放置于-80℃凍存。保存期間避免反復(fù)凍融。

7.4DNA的制備

按照7.1-7.3采集的畜禽養(yǎng)殖糞污，稱取3.0g，加入到含有5mL裂解液的15mL無菌離心管中，

并使用組織研磨儀充分混勻。將離心管移至95℃恒溫水浴鍋中孵育15min，孵育期間振蕩2次3次。

12000g/min，4℃8℃低溫離心10min，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中。加入等體積氯仿，混勻后，12000

g/min，4℃8℃低溫離心5min。吸取上清至新的無菌離心管中，加入0.6倍體積預(yù)冷的異丙醇，混勻。

12000g/min，4℃8℃低溫離心5min，輕輕倒去上清液，倒置于吸水紙上，吸干液體。加入500μL

75%乙醇，顛倒洗滌，12000g/min，4℃8℃低溫離心5min棄去上清，晾干。沉淀溶于20μL一級水

中，保存在-20℃?zhèn)溆?。陽性對照樣品也?yīng)采取上述DNA制備形式。整體操作步驟也可以使用等效商品

化DNA提取試劑盒并按其說明書制備模板DNA。

7.5DNA濃度的測量

DNA濃度的測量方法和對DNA模板濃度的要求應(yīng)符合SN/T4853的規(guī)定。

7.6三重?cái)?shù)字PCR反應(yīng)體系

在試劑配制區(qū)進(jìn)行ddPCR體系配置。畜禽養(yǎng)殖糞污中同時(shí)檢測金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌

O157:H7、沙門氏菌的三重?cái)?shù)字PCR檢測體系見表1（25L反應(yīng)體系）：

表1數(shù)字PCR反應(yīng)體系

試劑成分體積（μL）

5×dPCR預(yù)混液5.0

nuc上游引物（10μmol/L）1.0

nuc下游引物（10μmol/L）1.0

nuc探針（10μmol/L）0.5

rfbE上游引物（10μmol/L）1.0

rfbE下游引物（10μmol/L）1.0

rfbE探針（10μmol/L）0.5

FimY上游引物（10μmol/L）1.0

3

DB12/T1328—2024

FimY下游引物（10μmol/L）1.0

FimY探針（10μmol/L）0.5

DNA模板（1100ng/μL）5.0

一級水5.0

熒光素鈉鹽（1μmol/L）2.5

7.7對照和平行

每次檢測應(yīng)設(shè)置空白對照和陽性對照。

空白對照（陰性對照）用一級水替代樣品DNA。

陽性對照采用陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

每個(gè)待檢樣品提取的DNA溶液以及空白和陽性對照都應(yīng)進(jìn)行3個(gè)平行樣本的檢測。

陽性標(biāo)準(zhǔn)品：含有金黃色葡萄球菌nuc基因、大腸埃希氏菌rfbE基因和沙門氏菌FimY基因的質(zhì)粒

標(biāo)準(zhǔn)品。也可使用自行提取的陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸。

7.8微滴生成和PCR反應(yīng)

在樣本制備區(qū)進(jìn)行，利用微滴生成擴(kuò)增系統(tǒng)完成25μL反應(yīng)體系分割和PCR反應(yīng)。

反應(yīng)條件：95℃，5min，1個(gè)循環(huán)；95℃，15s，60℃，1min，45個(gè)循環(huán)；98℃，5min，1

個(gè)循環(huán)；4℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。整體反應(yīng)期間升降溫度速度均為1℃/s。

7.9微滴讀數(shù)

利用微滴閱讀分析系統(tǒng)對數(shù)字PCR反應(yīng)進(jìn)行熒光信息采集和分析。

8結(jié)果分析與表述

8.1閾值設(shè)定

根據(jù)數(shù)字PCR結(jié)果中陰性分割體系的終點(diǎn)熒光值設(shè)定熒光的閾值限。閾值限需要對陰性和陽性擴(kuò)增

結(jié)果進(jìn)行明顯的區(qū)分。

8.2質(zhì)量控制

同時(shí)滿足以下條件，實(shí)驗(yàn)為有效：

a)數(shù)字PCR有效分割體系數(shù)不低于理論分割體系數(shù)的60%；

b)空白對照（陰性對照）：三個(gè)通道（分別代表金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌O157:H7和腸炎沙

門氏菌）均無擴(kuò)增，擴(kuò)增終點(diǎn)熒光信號小于閾值，且每個(gè)通道的陽性微滴數(shù)＜1；

c)陽性對照：三個(gè)通道（分別代表金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌O157:H7和腸炎沙門氏菌）有

明顯的擴(kuò)增，擴(kuò)增終點(diǎn)熒光信號大于閾值，且每個(gè)通道的陽性微滴數(shù)都≥1；

d)每份樣品的3個(gè)平行重復(fù)檢測結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過25%。

8.3結(jié)果換算

樣品典型致病菌濃度換算見公式（1）：

4

DB12/T1328—2024

?1

?=?????××???????????（1）

?2×?3×?

式中：

?——畜禽糞污樣品中某一典型致病菌含量（拷貝數(shù)/mL）；

?????——25μL反應(yīng)體系中測得核酸拷貝值的平均值（拷貝數(shù)）；

?1——提取DNA的終體積（μL）；

?2——ddPCR反應(yīng)體系中加入的DNA模板體積（μL）；

?3——提取DNA時(shí)吸取的樣品體積（mL）；

?——用于提取畜禽糞污DNA樣品的稀釋倍數(shù)，如樣品稀釋10倍則為10-1；

?——DNA模板的稀釋倍數(shù)

8.4結(jié)果判斷

樣品FAM通道（沙門氏菌）未得到擴(kuò)增，擴(kuò)增終點(diǎn)熒光信號小于閾值，判定樣品檢測結(jié)果為陰性，

報(bào)告未檢出沙門氏菌。

樣品FAM通道得到擴(kuò)增，擴(kuò)增終點(diǎn)熒光信號大于閾值，判定樣品檢測結(jié)果為陽性，報(bào)告檢出沙門氏

菌核酸。根據(jù)公式（1）計(jì)算樣品中沙門氏菌含量，報(bào)告為XXX拷貝數(shù)/mL。

樣品HEX通道（金黃色葡萄球菌）未得到擴(kuò)增，擴(kuò)增終點(diǎn)熒光信號小于閾值，判定樣品檢測結(jié)果為

陰性，報(bào)告未檢出金黃色葡萄球菌。

樣品HEX通道得到擴(kuò)增，擴(kuò)增終點(diǎn)熒光信號大于閾值，判定樣品檢測結(jié)果為陽性，報(bào)告檢出金黃色

葡萄球菌。根據(jù)公式（1）計(jì)算樣品中金黃色葡萄球菌含量，報(bào)告為XXX拷貝數(shù)/mL。

樣品CY5通道（大腸埃希氏菌O157:H7）未得到擴(kuò)增，擴(kuò)增終點(diǎn)熒光信號小于閾值，判定樣品檢測

結(jié)果為陰性，報(bào)告未檢出大腸埃希氏菌O157:H7。

樣品CY5通道得到擴(kuò)增，擴(kuò)增終點(diǎn)熒光信號大于閾值，判定樣品檢測結(jié)果為陽性，報(bào)告檢出大腸埃

希氏菌O157:H7核酸。根據(jù)（1）計(jì)算樣品中大腸埃希氏菌O157:H7含量，報(bào)告為XXX拷貝數(shù)/mL。

9生物安全措施

檢測過程中防止交叉污染的措施應(yīng)按照GB/T27403—2008中附錄D的規(guī)定執(zhí)行。應(yīng)由具備資格的工

作人員進(jìn)行檢測，并按照GB19489中的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。與樣品接觸過的容器和廢棄物經(jīng)121