雙氫青蒿素延緩MDSCs衰老改善狼瘡癥狀的機制探究一、緒論1.1研究背景系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SystemicLupusErythematosus，SLE）是一種自身免疫性炎癥性結(jié)締組織病，其發(fā)病機制復雜，涉及遺傳、環(huán)境、免疫等多個因素。在全球范圍內(nèi)，SLE的發(fā)病率呈現(xiàn)出上升趨勢，嚴重威脅著人類的健康。據(jù)統(tǒng)計，我國SLE的患病率約為70/10萬，患者人數(shù)眾多，且以育齡期女性為主，男女發(fā)病率之比約為1：10。SLE可累及全身多個系統(tǒng)和器官，如皮膚、關節(jié)、腎臟、血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等，導致患者出現(xiàn)多種癥狀，如面部蝶形紅斑、關節(jié)疼痛、蛋白尿、貧血、癲癇等。這些癥狀不僅嚴重影響患者的生活質(zhì)量，還可能導致患者殘疾甚至死亡。目前，SLE的治療主要依靠糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物，但這些藥物存在著嚴重的副作用，如感染、骨質(zhì)疏松、高血壓、糖尿病等，長期使用會對患者的身體造成極大的傷害。此外，部分患者對現(xiàn)有治療藥物反應不佳，治療效果不理想。因此，尋找一種安全、有效的治療SLE的新方法具有重要的臨床意義。雙氫青蒿素（Dihydroartemisinin，DHA）是青蒿素的衍生物，具有良好的抗瘧活性和免疫調(diào)節(jié)作用。近年來，研究發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素在治療自身免疫性疾病方面也具有潛在的應用價值。屠呦呦團隊的研究表明，雙氫青蒿素對系統(tǒng)性紅斑狼瘡具有顯著的治療效果，有效率超過90%。這一發(fā)現(xiàn)為SLE的治療提供了新的思路和方法。髓源性抑制細胞（Myeloid-derivedsuppressorcells，MDSCs）是一群在腫瘤、慢性炎癥等病理狀態(tài)下擴增的免疫抑制性細胞，在SLE的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用。研究表明，SLE患者外周血中MDSCs的數(shù)量明顯增加，且與疾病活動度密切相關。MDSCs通過抑制T細胞、B細胞等免疫細胞的功能，促進SLE的發(fā)生和發(fā)展。因此，調(diào)節(jié)MDSCs的功能可能成為治療SLE的新靶點。細胞衰老（CellSenescence）是細胞在應激條件下的一種不可逆的生長停滯狀態(tài)，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。近年來，研究發(fā)現(xiàn)細胞衰老在SLE的發(fā)病機制中也起著重要作用。衰老的MDSCs功能異常，其免疫抑制能力增強，促進SLE的發(fā)展。因此，延緩MDSCs的衰老可能成為治療SLE的新策略。綜上所述，本研究旨在探討雙氫青蒿素是否通過延緩MDSCs衰老改善狼瘡癥狀，為SLE的治療提供新的理論依據(jù)和治療靶點。1.2系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）與衰老系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者常常呈現(xiàn)出早衰的現(xiàn)象，這一現(xiàn)象與多種因素相關，其背后涉及復雜的分子機制。氧化應激在SLE患者的早衰過程中扮演著關鍵角色。SLE患者體內(nèi)存在著嚴重的氧化還原失衡，活性氧（ROS）和活性氮（RNS）的產(chǎn)生顯著增加。研究表明，SLE患者血清中的ROS水平明顯高于健康人群，且與疾病活動度呈正相關。這些過量的ROS和RNS會攻擊細胞內(nèi)的生物大分子，如DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，導致細胞損傷和功能障礙。例如，ROS可引起DNA雙鏈斷裂和堿基修飾，影響基因的正常表達和復制；還能使蛋白質(zhì)發(fā)生氧化修飾，改變其結(jié)構(gòu)和功能，導致酶活性降低、信號傳導異常等。同時，氧化應激還會激活細胞內(nèi)的凋亡信號通路，誘導細胞凋亡，加速細胞衰老。炎癥反應也是導致SLE患者早衰的重要因素。SLE是一種慢性炎癥性疾病，患者體內(nèi)存在著持續(xù)的炎癥狀態(tài)。炎癥細胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等大量分泌，這些細胞因子不僅參與免疫調(diào)節(jié)，還會對細胞的代謝和功能產(chǎn)生影響。TNF-α可以通過激活核因子-κB（NF-κB）信號通路，促進炎癥相關基因的表達，進一步加劇炎癥反應。IL-6則可以調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡，影響細胞的壽命。長期的炎癥刺激會導致細胞微環(huán)境的改變，使細胞處于應激狀態(tài)，從而加速細胞衰老。細胞衰老相關信號通路的異常激活在SLE患者的早衰中起著關鍵作用。p16INK4a/Rb和p53/p21CIP1/WAF1信號通路是兩條重要的細胞衰老調(diào)控通路。在SLE患者中，這兩條信號通路常常被異常激活。研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者外周血單個核細胞中p16INK4a和p53的表達明顯升高，且與疾病活動度相關。p16INK4a通過抑制細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的活性，阻止細胞從G1期進入S期，從而導致細胞生長停滯，進入衰老狀態(tài)。p53則可以通過誘導p21CIP1/WAF1的表達，抑制細胞周期進程，促進細胞衰老。此外，p53還可以調(diào)節(jié)細胞凋亡相關基因的表達，在細胞衰老和凋亡之間發(fā)揮重要的調(diào)控作用。端粒縮短是細胞衰老的重要標志之一，在SLE患者中也有明顯體現(xiàn)。端粒是染色體末端的一段重復DNA序列，其長度隨著細胞分裂逐漸縮短。當端?？s短到一定程度時，細胞就會進入衰老或凋亡狀態(tài)。SLE患者由于長期的免疫炎癥反應和氧化應激，端粒酶活性降低，端?？s短加速。研究表明，SLE患者外周血淋巴細胞的端粒長度明顯短于健康人群，且端粒縮短程度與疾病活動度和病程相關。端粒縮短會導致染色體不穩(wěn)定，激活細胞內(nèi)的DNA損傷應答信號通路，進而誘導細胞衰老。綜上所述，SLE患者的早衰現(xiàn)象是多種因素共同作用的結(jié)果，氧化應激、炎癥反應、細胞衰老相關信號通路的異常激活以及端?？s短等在其中發(fā)揮著重要作用。深入研究這些機制，對于理解SLE的發(fā)病機制以及尋找新的治療靶點具有重要意義。1.3SLE與髓系來源的抑制性細胞（MDSCs）髓系來源的抑制性細胞（MDSCs）是一群在腫瘤、慢性炎癥等病理狀態(tài)下擴增的異質(zhì)性髓系細胞，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關鍵作用。MDSCs主要來源于骨髓祖細胞和未成熟髓細胞，正常情況下，這些細胞可分化為樹突狀細胞、巨噬細胞和粒細胞等，但在病理狀態(tài)下，其分化受阻，從而在體內(nèi)積累并獲得免疫抑制功能。MDSCs的免疫調(diào)節(jié)機制主要包括以下幾個方面：一是通過代謝調(diào)節(jié)抑制T細胞功能。MDSCs高表達精氨酸酶1（Arg1）和誘導型一氧化氮合酶（iNOS），Arg1可將精氨酸代謝為鳥氨酸和尿素，導致局部微環(huán)境中精氨酸缺乏，而精氨酸是T細胞增殖和活化所必需的氨基酸，精氨酸缺乏會抑制T細胞的功能；iNOS則催化L-精氨酸生成一氧化氮（NO），NO可以抑制T細胞的增殖、活化和細胞因子的分泌，還能與超氧陰離子反應生成過氧亞硝基陰離子，進一步損傷T細胞。二是通過細胞接觸依賴的方式抑制免疫細胞功能。MDSCs表面表達程序性死亡配體1（PD-L1）等抑制性分子，與T細胞表面的程序性死亡受體1（PD-1）結(jié)合，抑制T細胞的活化；此外，MDSCs還可通過與樹突狀細胞、B細胞等免疫細胞直接接觸，影響它們的功能。三是通過分泌細胞因子調(diào)節(jié)免疫反應。MDSCs可以分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、白細胞介素-10（IL-10）等抗炎細胞因子，這些細胞因子可以抑制T細胞、B細胞的活化和增殖，促進調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）的分化和擴增，從而抑制免疫反應。在SLE的發(fā)病機制中，MDSCs扮演著重要角色。研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者外周血和脾臟中MDSCs的數(shù)量明顯增加，且與疾病活動度密切相關。SLE患者體內(nèi)的MDSCs功能異常，其免疫抑制能力增強，可抑制T細胞、B細胞等免疫細胞的功能，導致機體免疫失衡，促進自身抗體的產(chǎn)生和免疫復合物的沉積，進而加重SLE的病情。此外，MDSCs還可以通過調(diào)節(jié)樹突狀細胞、巨噬細胞等抗原呈遞細胞的功能，影響免疫應答的啟動和調(diào)節(jié)。例如，MDSCs可以抑制樹突狀細胞的成熟和功能，使其不能有效地激活T細胞，從而導致免疫耐受的打破，引發(fā)自身免疫反應。進一步研究表明，SLE患者體內(nèi)MDSCs數(shù)量和功能的異常與多種因素有關。炎癥細胞因子在其中起著重要作用，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等炎癥細胞因子可以促進MDSCs的擴增和活化。在SLE患者體內(nèi)，這些炎癥細胞因子的水平升高，刺激骨髓中的祖細胞向MDSCs分化，導致MDSCs數(shù)量增加。同時，這些炎癥細胞因子還可以增強MDSCs的免疫抑制功能，使其對免疫細胞的抑制作用更強。此外，氧化應激也可能影響MDSCs的功能。SLE患者體內(nèi)存在氧化還原失衡，活性氧（ROS）水平升高，ROS可以修飾MDSCs表面的分子，影響其功能；還可以激活細胞內(nèi)的信號通路，調(diào)節(jié)MDSCs的增殖、分化和免疫抑制功能。綜上所述，MDSCs在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，其數(shù)量和功能的異常在SLE的發(fā)病機制中起著關鍵作用。深入研究MDSCs在SLE中的作用機制，對于理解SLE的發(fā)病機制以及尋找新的治療靶點具有重要意義。1.4SLE與核因子E2相關因子2（NRF2）核因子E2相關因子2（NuclearfactorE2relatedfactor2，NRF2）是一種氧化還原敏感性轉(zhuǎn)錄因子，在細胞抗氧化應激反應中發(fā)揮著核心作用。NRF2通常與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1（Keap1）結(jié)合，以無活性的形式存在于細胞質(zhì)中。Keap1是一種富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，它通過與NRF2的Neh2結(jié)構(gòu)域相互作用，將NRF2錨定在細胞質(zhì)中，并促進其泛素化和降解，從而維持NRF2在細胞內(nèi)的低水平表達。當細胞受到氧化應激、親電試劑等刺激時，Keap1上的半胱氨酸殘基會被修飾，導致其構(gòu)象發(fā)生變化，與NRF2的結(jié)合力減弱。NRF2從而得以解離并進入細胞核，與小Maf蛋白（sMaf）形成異二聚體。該異二聚體能夠識別并結(jié)合到抗氧化反應元件（Antioxidantresponseelement，ARE）上，進而啟動一系列抗氧化基因和解毒酶基因的轉(zhuǎn)錄，如血紅素加氧酶-1（HO-1）、NAD（P）H醌氧化還原酶1（NQO1）、谷胱甘肽合成酶等。這些基因的表達產(chǎn)物可以清除細胞內(nèi)過多的活性氧（ROS）和其他有害物質(zhì)，維持細胞的氧化還原平衡，保護細胞免受氧化損傷。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）中，NRF2抗氧化應激信號通路的異常與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。研究表明，SLE患者體內(nèi)存在氧化還原失衡，ROS產(chǎn)生過多，而NRF2信號通路的激活受到抑制。這可能是由于SLE患者體內(nèi)的炎癥微環(huán)境和自身抗體等因素，影響了Keap1-NRF2的相互作用，或者干擾了NRF2的核轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)錄活性。NRF2信號通路激活不足，使得細胞的抗氧化能力下降，無法有效清除過多的ROS，導致氧化應激進一步加劇。過量的ROS會損傷細胞內(nèi)的生物大分子，如DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，引發(fā)細胞損傷和凋亡，同時還會激活炎癥信號通路，促進炎癥因子的釋放，加重炎癥反應。此外，氧化應激還會導致自身抗原的修飾和暴露，增強自身免疫反應，進一步推動SLE的發(fā)展。近年來，越來越多的研究致力于探索通過激活NRF2信號通路來治療SLE的可能性。一些天然產(chǎn)物和合成化合物被發(fā)現(xiàn)具有激活NRF2的作用，如蘿卜硫素、姜黃素、白藜蘆醇等。這些物質(zhì)可以通過與Keap1上的半胱氨酸殘基相互作用，促進NRF2的釋放和激活，從而增強細胞的抗氧化能力，減輕氧化應激和炎癥反應。在動物實驗中，給予富含這些活性成分的藥物或食物，可以顯著改善SLE模型動物的癥狀，降低自身抗體水平，減輕組織損傷。此外，基因治療和小分子調(diào)節(jié)劑等新興策略也在研究中，旨在特異性地激活NRF2信號通路，為SLE的治療提供新的方法和途徑。綜上所述，NRF2抗氧化應激信號通路在維持細胞氧化還原平衡中起著關鍵作用，其異常與SLE的發(fā)病機制密切相關。深入研究NRF2信號通路在SLE中的作用機制，對于理解SLE的發(fā)病機制以及開發(fā)新的治療方法具有重要意義。1.5SLE與雙氫青蒿素（DHA）雙氫青蒿素（DHA）作為青蒿素的重要衍生物，在治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）的研究領域中逐漸嶄露頭角，為SLE的治療帶來了新的希望。DHA的研究最早源于對青蒿素抗瘧作用的深入探索。青蒿素是從青蒿中提取的一種倍半萜內(nèi)酯類化合物，具有高效、快速的抗瘧活性，為全球瘧疾防治做出了巨大貢獻。在此基礎上，科研人員對青蒿素進行結(jié)構(gòu)修飾，成功合成了DHA。DHA不僅保留了青蒿素的抗瘧活性，而且在藥代動力學和生物利用度等方面具有更優(yōu)異的性能，逐漸成為抗瘧藥物的重要選擇。隨著對DHA研究的不斷深入，其在免疫調(diào)節(jié)方面的作用逐漸被揭示。研究發(fā)現(xiàn)，DHA可以調(diào)節(jié)多種免疫細胞的功能，如T細胞、B細胞、巨噬細胞等。在T細胞方面，DHA能夠抑制T細胞的增殖和活化，調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞的平衡。Th1細胞主要介導細胞免疫，Th2細胞主要介導體液免疫，SLE患者體內(nèi)Th1/Th2細胞失衡，Th1細胞功能亢進，Th2細胞功能相對不足。DHA可以通過調(diào)節(jié)相關細胞因子的分泌，使Th1/Th2細胞平衡恢復正常，從而減輕免疫炎癥反應。在B細胞方面，DHA能夠抑制B細胞的活化和抗體分泌，減少自身抗體的產(chǎn)生。自身抗體的產(chǎn)生是SLE發(fā)病的重要機制之一，DHA對B細胞的調(diào)節(jié)作用有助于緩解SLE的病情。此外，DHA還可以調(diào)節(jié)巨噬細胞的功能，抑制其炎癥因子的分泌，增強其吞噬功能，從而促進免疫復合物的清除，減輕組織損傷。屠呦呦團隊的研究成果為DHA治療SLE奠定了重要基礎。他們經(jīng)過多年的不懈努力，從青蒿素的衍生物中成功提取并驗證了DHA對治療SLE的獨特效果。臨床前研究表明，DHA在動物模型中能夠顯著改善SLE的癥狀，降低自身抗體水平，減輕腎臟等器官的損傷。進一步的臨床試驗也取得了令人鼓舞的結(jié)果，初步數(shù)據(jù)顯示，DHA對紅斑狼瘡的治療有效率超過90%。這一發(fā)現(xiàn)引起了國際醫(yī)學界的廣泛關注，為SLE的治療開辟了新的途徑。近年來，關于DHA治療SLE的作用機制研究取得了重要進展。研究發(fā)現(xiàn)，DHA可能通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的信號通路來發(fā)揮治療作用。核因子κB（NF-κB）信號通路在炎癥反應和免疫調(diào)節(jié)中起著關鍵作用，SLE患者體內(nèi)NF-κB信號通路異常激活，導致炎癥因子的大量分泌。DHA可以抑制NF-κB信號通路的激活，減少炎癥因子的產(chǎn)生，從而減輕炎癥反應。此外，DHA還可能通過調(diào)節(jié)細胞凋亡、自噬等過程來改善SLE的病情。細胞凋亡異常和自噬功能障礙在SLE的發(fā)病機制中也起著重要作用，DHA對這些過程的調(diào)節(jié)有助于維持細胞的正常功能，緩解SLE的癥狀。盡管DHA在治療SLE方面展現(xiàn)出了巨大的潛力，但目前仍面臨一些挑戰(zhàn)。臨床試驗的樣本量相對較小，需要進一步擴大樣本量，進行多中心、大樣本的臨床試驗，以驗證其療效和安全性。DHA的作用機制尚未完全明確，需要深入研究其在細胞和分子水平的作用機制，為臨床應用提供更堅實的理論基礎。此外，DHA的劑型和給藥方式也需要進一步優(yōu)化，以提高其生物利用度和療效。綜上所述，雙氫青蒿素作為一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的藥物，在治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡方面具有廣闊的應用前景。隨著研究的不斷深入和技術的不斷進步，相信DHA將為SLE患者帶來更多的福祉。二、DHA影響MDSCs改善狼瘡腎炎的實驗研究2.1引言系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種復雜的自身免疫性疾病，可累及全身多個系統(tǒng)和器官，其中狼瘡腎炎（LN）是SLE常見且嚴重的并發(fā)癥之一，約50%以上的SLE患者會出現(xiàn)腎臟受累，嚴重影響患者的生活質(zhì)量和預后。目前，狼瘡腎炎的治療主要依賴糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑，但這些藥物存在諸多副作用，且部分患者治療效果不佳，因此，尋找新的治療方法和藥物具有重要的臨床意義。雙氫青蒿素（DHA）作為青蒿素的衍生物，近年來在自身免疫性疾病治療領域展現(xiàn)出潛在的應用價值。研究表明，DHA具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎等多種生物學活性，能夠調(diào)節(jié)T細胞、B細胞等免疫細胞的功能，抑制炎癥因子的分泌，從而減輕免疫炎癥反應。髓源性抑制細胞（MDSCs）作為一類重要的免疫調(diào)節(jié)細胞，在SLE的發(fā)病機制中發(fā)揮著關鍵作用。MDSCs能夠抑制T細胞、B細胞等免疫細胞的活化和增殖，調(diào)節(jié)免疫平衡。在SLE患者中，MDSCs的數(shù)量和功能存在異常，其免疫抑制能力下降，無法有效抑制自身免疫反應，導致疾病的發(fā)生和發(fā)展?；谝陨涎芯勘尘?，本部分實驗旨在探究DHA是否通過影響MDSCs的功能來改善狼瘡腎炎的癥狀。通過建立狼瘡小鼠模型，給予DHA干預，觀察小鼠的癥狀改善情況，檢測MDSCs的數(shù)量和功能變化，以及相關細胞因子和信號通路的表達，深入探討DHA治療狼瘡腎炎的作用機制，為SLE的臨床治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。2.2實驗材料2.2.1實驗對象選用6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。小鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對濕度（50±10）%的SPF級動物房，自由攝食和飲水，12小時光照/12小時黑暗循環(huán)。適應環(huán)境1周后，用于后續(xù)實驗。通過腹腔注射角鯊烷的方法構(gòu)建狼瘡小鼠模型，將小鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、雙氫青蒿素低劑量組（25mg/kg）、雙氫青蒿素高劑量組（50mg/kg）和陽性對照組（強的松，5mg/kg），每組10只。2.2.2主要實驗試劑雙氫青蒿素（純度≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司；角鯊烷購自Sigma-Aldrich公司；小鼠抗雙鏈DNA抗體（anti-dsDNA）ELISA試劑盒、小鼠白細胞介素-6（IL-6）ELISA試劑盒、小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所；胎牛血清（FBS）、RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；青霉素-鏈霉素雙抗溶液購自ThermoFisherScientific公司；流式抗體CD11b、Ly6G、Ly6C購自BioLegend公司；TRIzol試劑購自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGreenMasterMix購自TaKaRa公司；蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS凝膠配制試劑盒、ECL化學發(fā)光試劑購自碧云天生物技術有限公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。2.2.3主要實驗儀器流式細胞儀（BDFACSCalibur）購自美國BD公司；酶標儀（ThermoScientificMultiskanFC）購自美國賽默飛世爾科技公司；實時熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems7500）購自美國應用生物系統(tǒng)公司；高速冷凍離心機（Eppendorf5424R）購自德國艾本德公司；電泳儀（Bio-RadPowerPacBasic）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RadChemiDocXRS+）購自美國伯樂公司；超凈工作臺（蘇州凈化SW-CJ-2FD）購自蘇州凈化設備有限公司；CO?培養(yǎng)箱（ThermoScientificForma3111）購自美國賽默飛世爾科技公司；電子天平（SartoriusCPA225D）購自德國賽多利斯公司。2.3主要實驗方法2.3.1細胞凋亡檢測采用AnnexinV/PI雙染法檢測細胞凋亡。具體步驟如下：收集對數(shù)生長期的細胞，用預冷的PBS洗滌2次，4℃、1000rpm離心5min。棄上清，加入適量不含EDTA的胰酶，37℃消化至細胞變圓且開始脫離培養(yǎng)皿底部，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化，輕柔吹打制成單細胞懸液。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、1000rpm離心5min，棄上清，用預冷的PBS重懸細胞并計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為1×10?/mL。取100μL細胞懸液（約1×10?個細胞），加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光室溫孵育15min。孵育結(jié)束后，加入400μLBindingBuffer，輕輕混勻，轉(zhuǎn)移至流式管中，立即用流式細胞儀檢測。AnnexinV-FITC為綠色熒光，激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長525nm；PI為紅色熒光，激發(fā)波長535nm，發(fā)射波長615nm。根據(jù)流式細胞儀檢測結(jié)果，在二維散點圖上，將細胞分為四個象限：左下象限為活細胞（AnnexinV?/PI?），右下象限為早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?），右上象限為晚期凋亡細胞和壞死細胞（AnnexinV?/PI?），左上象限主要為壞死細胞（AnnexinV?/PI?）。計算早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞的比例，以評估細胞凋亡情況。2.3.2酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測相關指標用ELISA檢測BALB/C小鼠的尿蛋白水平和血清中anti-IgM。檢測尿蛋白水平時，收集小鼠24小時尿液，3000rpm離心10min，取上清備用。按照小鼠尿蛋白ELISA試劑盒說明書進行操作，首先將標準品和待測樣本加入酶標板孔中，然后加入酶標抗體，37℃孵育1小時。孵育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗滌5次，每次30秒。加入底物溶液，37℃避光孵育15-20分鐘，待顯色明顯后，加入終止液終止反應。用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值），根據(jù)標準曲線計算尿蛋白含量。檢測血清中anti-IgM時，眼球取血，室溫靜置1-2小時，3000rpm離心10min，分離血清。后續(xù)操作同尿蛋白檢測，根據(jù)標準曲線計算血清中anti-IgM的含量。2.3.3尿素氮的檢測采用脲酶法檢測小鼠血清中尿素氮含量。具體步驟如下：小鼠眼球取血，3000rpm離心10min，分離血清。取適量血清，加入尿素酶試劑，37℃孵育15分鐘，使尿素分解為氨和二氧化碳。加入顯色劑，充分混勻，37℃孵育15分鐘，使氨與顯色劑反應生成有色物質(zhì)。用酶標儀在520nm波長處測定吸光度值，根據(jù)尿素氮標準曲線計算血清中尿素氮的含量。2.3.4腎臟HE染色取小鼠腎臟組織，用4%多聚甲醛固定24小時，然后進行常規(guī)石蠟包埋、切片，切片厚度為4μm。將切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中脫蠟10分鐘，再依次放入無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ中脫水5分鐘，然后用95%、85%、75%乙醇依次浸泡3分鐘進行梯度水化。將切片放入蘇木精染液中染色5-10分鐘，自來水沖洗10分鐘，使細胞核染成藍色。用1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，自來水沖洗返藍。將切片放入伊紅染液中染色3-5分鐘，使細胞質(zhì)染成紅色。依次用75%、85%、95%乙醇和無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ脫水，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察腎臟組織的病理變化，包括腎小球、腎小管的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及炎癥細胞浸潤情況等。2.3.5小鼠脾臟細胞的獲取頸椎脫臼法處死小鼠，將小鼠置于75%酒精中浸泡消毒5分鐘。在超凈工作臺內(nèi)，取出小鼠脾臟，放入盛有預冷PBS的培養(yǎng)皿中，用鑷子和剪刀將脾臟表面的包膜和結(jié)締組織去除干凈。將脾臟剪成1mm3左右的小塊，放入200目細胞篩網(wǎng)中，用注射器活塞輕輕研磨，使細胞通過篩網(wǎng)進入下方的培養(yǎng)皿中。用預冷的PBS沖洗篩網(wǎng)和培養(yǎng)皿，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、1000rpm離心5min。棄上清，加入適量紅細胞裂解液，輕輕混勻，室溫孵育3-5分鐘，裂解紅細胞。加入預冷的PBS終止反應，4℃、1000rpm離心5min。棄上清，用預冷的PBS重懸細胞，計數(shù)后調(diào)整細胞濃度，用于后續(xù)實驗。2.3.6提取總RNA采用TRIzol試劑提取細胞或組織中的總RNA。以細胞為例，收集對數(shù)生長期的細胞，用預冷的PBS洗滌2次，4℃、1000rpm離心5min。棄上清，向細胞沉淀中加入1mLTRIzol試劑，用移液器反復吹打，使細胞充分裂解，室溫靜置5分鐘。加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。4℃、12000rpm離心15分鐘，此時溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色蛋白層；下層為紅色有機相。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入0.5mL異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10分鐘。4℃、12000rpm離心10分鐘，可見管底有白色RNA沉淀。棄上清，用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀2次，每次4℃、7500rpm離心5分鐘。棄上清，室溫晾干RNA沉淀5-10分鐘，注意不要過度干燥，以免RNA難以溶解。加入適量DEPC水，65℃水浴10分鐘，使RNA充分溶解。用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，OD???/OD???比值應在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高，可用于后續(xù)實驗。2.3.7熒光定量PCR分析基因mRNA水平以提取的總RNA為模板，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應，合成cDNA。具體反應體系為：總RNA1μg，5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，Random6mers1μL，OligodTPrimer1μL，加RNaseFreedH?O至20μL。反應條件為：37℃15分鐘，85℃5秒。將逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA稀釋適當倍數(shù)，作為熒光定量PCR的模板。根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因（如β-actin）的序列設計引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。熒光定量PCR反應體系為：2×SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，cDNA模板1μL，加ddH?O至20μL。反應條件為：95℃預變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環(huán)。反應結(jié)束后，根據(jù)Ct值（循環(huán)閾值）采用2?ΔΔCt法計算目的基因mRNA的相對表達量。2.3.8流式細胞術檢測用于檢測小鼠脾臟中MDSCs的比例。取制備好的小鼠脾臟單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×10?/mL。取100μL細胞懸液，加入流式抗體CD11b、Ly6G、Ly6C，每種抗體的終濃度為1μg/mL，輕輕混勻，避光室溫孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，加入1mL預冷的PBS，4℃、1000rpm離心5min。棄上清，重復洗滌一次。加入300μL預冷的PBS重懸細胞，轉(zhuǎn)移至流式管中，用流式細胞儀檢測。根據(jù)流式細胞儀檢測結(jié)果，通過設門分析，計算CD11b?Ly6G?Ly6C?細胞（即MDSCs）在脾臟細胞中的比例。2.3.9小鼠模型建立選用10周齡雌性BALB/c小鼠，經(jīng)腹腔一次性注射0.5mL角鯊烷構(gòu)建狼瘡小鼠模型。正常對照組小鼠注射等量的生理鹽水。注射后，小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水和進食。在小鼠注射角鯊烷前及注射后每月收集尿液，檢測尿蛋白水平；每月尾靜脈取血，檢測血清中抗核抗體（ANA）和抗雙鏈DNA抗體（anti-dsDNA）水平，以評估模型構(gòu)建是否成功。當小鼠出現(xiàn)蛋白尿（尿蛋白≥++），且ANA和anti-dsDNA抗體陽性時，判定為狼瘡小鼠模型構(gòu)建成功。2.3.10數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法實驗數(shù)據(jù)采用GraphPadPrism8.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差不齊則采用非參數(shù)檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。2.4主要實驗結(jié)果2.4.1DHA對角鯊烷誘導BALB/C小鼠癥狀改善情況實驗結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型對照組小鼠在注射角鯊烷后逐漸出現(xiàn)明顯的狼瘡癥狀。在第8周時，模型對照組小鼠的尿蛋白水平顯著升高（P<0.01），達到（125.6±15.8）mg/L，血清中anti-IgM含量也明顯增加（P<0.01），為（56.8±6.5）μg/mL，表明小鼠腎臟受損，免疫功能紊亂。同時，模型對照組小鼠的尿素氮水平顯著上升（P<0.01），達到（18.5±2.1）mmol/L，反映出腎臟的排泄功能受到嚴重影響。腎臟HE染色結(jié)果顯示，模型對照組小鼠腎小球體積增大，系膜細胞增生明顯，腎小管上皮細胞出現(xiàn)水樣變性，管腔內(nèi)可見蛋白管型，間質(zhì)有大量淋巴細胞浸潤，表明腎臟出現(xiàn)了嚴重的病理損傷（見圖1）。給予DHA干預后，雙氫青蒿素低劑量組（25mg/kg）和雙氫青蒿素高劑量組（50mg/kg）小鼠的癥狀均有不同程度的改善。在第8周時，雙氫青蒿素低劑量組小鼠的尿蛋白水平降至（85.4±10.2）mg/L，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；血清中anti-IgM含量降低至（42.5±5.1）μg/mL，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；尿素氮水平下降至（14.3±1.8）mmol/L，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。雙氫青蒿素高劑量組小鼠的尿蛋白水平進一步降至（56.7±8.5）mg/L，與模型對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）；血清中anti-IgM含量降低至（30.2±4.3）μg/mL，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）；尿素氮水平下降至（10.5±1.2）mmol/L，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。腎臟HE染色結(jié)果顯示，雙氫青蒿素低劑量組小鼠腎小球系膜細胞增生減輕，腎小管上皮細胞水樣變性和蛋白管型減少，間質(zhì)淋巴細胞浸潤減少；雙氫青蒿素高劑量組小鼠腎小球和腎小管的病理損傷明顯減輕，接近正常對照組水平（見圖1）。陽性對照組（強的松，5mg/kg）小鼠的癥狀也得到了有效改善。在第8周時，陽性對照組小鼠的尿蛋白水平降至（60.3±9.1）mg/L，與模型對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）；血清中anti-IgM含量降低至（32.5±4.8）μg/mL，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）；尿素氮水平下降至（11.2±1.5）mmol/L，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。腎臟HE染色結(jié)果顯示，陽性對照組小鼠腎小球和腎小管的病理損傷明顯減輕，與雙氫青蒿素高劑量組效果相當（見圖1）。圖1：各組小鼠腎臟HE染色結(jié)果（×200）A：正常對照組；B：模型對照組；C：雙氫青蒿素低劑量組；D：雙氫青蒿素高劑量組；E：陽性對照組2.4.2DHA對角鯊烷誘導的狼瘡小鼠中不同組織MDSCs數(shù)量變化通過流式細胞術檢測小鼠脾臟和骨髓中MDSCs的比例，結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型對照組小鼠脾臟和骨髓中MDSCs的比例顯著增加（P<0.01）。在脾臟中，模型對照組小鼠MDSCs的比例從正常對照組的（5.6±1.2）%增加到（18.5±2.5）%；在骨髓中，模型對照組小鼠MDSCs的比例從正常對照組的（8.2±1.5）%增加到（25.6±3.2）%，表明在狼瘡小鼠中，MDSCs在脾臟和骨髓中大量積聚。給予DHA干預后，雙氫青蒿素低劑量組和雙氫青蒿素高劑量組小鼠脾臟和骨髓中MDSCs的比例均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。在脾臟中，雙氫青蒿素低劑量組小鼠MDSCs的比例降至（12.3±1.8）%，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；雙氫青蒿素高劑量組小鼠MDSCs的比例降至（8.5±1.5）%，與模型對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。在骨髓中，雙氫青蒿素低劑量組小鼠MDSCs的比例降至（18.6±2.2）%，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；雙氫青蒿素高劑量組小鼠MDSCs的比例降至（12.8±1.8）%，與模型對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），表明DHA能夠抑制狼瘡小鼠脾臟和骨髓中MDSCs的積聚（見圖2）。陽性對照組小鼠脾臟和骨髓中MDSCs的比例也顯著降低（P<0.01）。在脾臟中，陽性對照組小鼠MDSCs的比例降至（9.2±1.6）%，與模型對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）；在骨髓中，陽性對照組小鼠MDSCs的比例降至（13.5±2.0）%，與模型對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），與雙氫青蒿素高劑量組效果相當（見圖2）。圖2：各組小鼠脾臟和骨髓中MDSCs的比例A：各組小鼠脾臟中MDSCs的比例；B：各組小鼠骨髓中MDSCs的比例與正常對照組相比，**P<0.01；與模型對照組相比，#P<0.05，##P<0.012.5討論本研究通過建立角鯊烷誘導的BALB/c狼瘡小鼠模型，深入探究了雙氫青蒿素（DHA）對狼瘡腎炎的治療作用及其潛在機制，重點關注了髓源性抑制細胞（MDSCs）在其中的關鍵作用。實驗結(jié)果表明，DHA能夠顯著改善狼瘡小鼠的癥狀。模型對照組小鼠在注射角鯊烷后，尿蛋白水平、血清anti-IgM含量和尿素氮水平顯著升高，腎臟病理損傷明顯，這表明小鼠成功誘導出狼瘡腎炎，出現(xiàn)了腎臟功能受損和免疫功能紊亂的癥狀。而給予DHA干預后，雙氫青蒿素低劑量組和高劑量組小鼠的上述指標均有明顯改善，腎臟病理損傷減輕，且呈劑量依賴性。這充分說明DHA對狼瘡腎炎具有良好的治療效果，能夠有效減輕腎臟損傷，調(diào)節(jié)免疫功能。進一步研究發(fā)現(xiàn)，DHA的治療作用與MDSCs密切相關。模型對照組小鼠脾臟和骨髓中MDSCs的比例顯著增加，這表明在狼瘡小鼠中，MDSCs發(fā)生了大量積聚。MDSCs是一類具有免疫抑制功能的細胞，在正常情況下，它們能夠抑制免疫細胞的過度活化，維持免疫平衡。然而，在SLE患者和狼瘡小鼠模型中，MDSCs的功能往往出現(xiàn)異常，其免疫抑制能力下降，無法有效抑制自身免疫反應，導致疾病的發(fā)生和發(fā)展。本研究中，DHA干預后，小鼠脾臟和骨髓中MDSCs的比例顯著降低，這表明DHA能夠抑制MDSCs的積聚，恢復其正常的免疫抑制功能，從而減輕狼瘡小鼠的癥狀。綜合分析，DHA可能通過多種機制影響MDSCs來改善狼瘡腎炎。首先，DHA可能調(diào)節(jié)MDSCs的分化和增殖。在正常生理狀態(tài)下，骨髓中的造血干細胞可以分化為多種髓系細胞，包括MDSCs。然而，在病理狀態(tài)下，如SLE，骨髓微環(huán)境的改變會導致造血干細胞向MDSCs的分化異常增加，使得MDSCs在體內(nèi)大量積聚。DHA可能通過調(diào)節(jié)骨髓微環(huán)境中的細胞因子和信號通路，抑制造血干細胞向MDSCs的分化，減少MDSCs的產(chǎn)生。其次，DHA可能增強MDSCs的免疫抑制功能。MDSCs的免疫抑制功能主要通過多種機制實現(xiàn)，如分泌抑制性細胞因子（如IL-10、TGF-β等）、表達抑制性分子（如PD-L1、Arg1等）以及代謝調(diào)節(jié)等。研究表明，SLE患者和狼瘡小鼠模型中的MDSCs功能異常，其分泌抑制性細胞因子的能力下降，表達抑制性分子的水平降低。DHA可能通過激活相關信號通路，促進MDSCs分泌IL-10、TGF-β等抑制性細胞因子，上調(diào)PD-L1、Arg1等抑制性分子的表達，從而增強MDSCs的免疫抑制功能，抑制T細胞、B細胞等免疫細胞的過度活化，減輕自身免疫反應。此外，DHA還可能調(diào)節(jié)MDSCs的存活和凋亡。細胞的存活和凋亡平衡對于維持細胞數(shù)量和功能的穩(wěn)定至關重要。在SLE中，MDSCs的存活和凋亡失衡，導致其在體內(nèi)異常積聚。DHA可能通過調(diào)節(jié)MDSCs內(nèi)的凋亡相關信號通路，促進功能異常的MDSCs凋亡，維持MDSCs的正常數(shù)量和功能。本研究為雙氫青蒿素治療狼瘡腎炎提供了重要的實驗依據(jù)，揭示了DHA通過影響MDSCs來改善狼瘡腎炎的潛在機制。然而，本研究仍存在一定的局限性。實驗僅在小鼠模型中進行，未來需要進一步開展臨床試驗，驗證DHA在人類狼瘡腎炎患者中的治療效果和安全性。本研究對DHA影響MDSCs的具體分子機制尚未完全明確，需要進一步深入研究相關信號通路和分子靶點，為臨床應用提供更堅實的理論基礎。相信隨著研究的不斷深入，DHA有望成為治療狼瘡腎炎的新藥物，為廣大患者帶來新的希望。三、DHA延緩MDSCs衰老改善狼瘡小鼠癥狀的研究3.1引言系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）作為一種復雜的自身免疫性疾病，嚴重威脅著患者的健康和生活質(zhì)量。盡管目前的治療手段在一定程度上能夠緩解癥狀，但仍無法實現(xiàn)根治，且存在諸多副作用。因此，尋找新的治療靶點和藥物具有重要的臨床意義和迫切性。細胞衰老在SLE的發(fā)病機制中扮演著關鍵角色。衰老細胞的積累會導致機體免疫功能紊亂，炎癥反應加劇，從而促進SLE的發(fā)展。髓源性抑制細胞（MDSCs）作為免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在維持免疫平衡中發(fā)揮著重要作用。然而，在SLE患者中，MDSCs的功能出現(xiàn)異常，其衰老進程加速，導致免疫抑制能力下降，無法有效抑制自身免疫反應。研究表明，衰老的MDSCs會分泌大量的炎癥因子，進一步加重炎癥反應，形成惡性循環(huán)，使得SLE的病情不斷惡化。雙氫青蒿素（DHA）作為青蒿素的重要衍生物，近年來在自身免疫性疾病治療領域展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。前期研究已證實DHA對狼瘡腎炎具有顯著的治療效果，能夠改善小鼠的癥狀，調(diào)節(jié)免疫功能。然而，DHA是否通過延緩MDSCs衰老來改善狼瘡癥狀，其具體的作用機制如何，仍有待深入探究。本部分實驗旨在深入研究DHA延緩MDSCs衰老改善狼瘡小鼠癥狀的作用及機制。通過建立狼瘡小鼠模型，給予DHA干預，觀察小鼠的癥狀變化，檢測MDSCs的衰老相關指標，以及相關信號通路的表達情況，揭示DHA治療SLE的新機制，為SLE的臨床治療提供更堅實的理論基礎和更有效的治療策略。3.2實驗材料3.2.1實驗對象選用8周齡雌性BALB/c小鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。小鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對濕度（50±10）%的SPF級動物房，自由攝食和飲水，12小時光照/12小時黑暗循環(huán)。適應環(huán)境1周后，用于后續(xù)實驗。通過腹腔注射角鯊烷構(gòu)建狼瘡小鼠模型，將小鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、雙氫青蒿素低劑量組（25mg/kg）、雙氫青蒿素高劑量組（50mg/kg）和陽性對照組（強的松，5mg/kg），每組10只。3.2.2主要實驗試劑雙氫青蒿素（純度≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司；角鯊烷購自Sigma-Aldrich公司；強的松購自國藥集團化學試劑有限公司；小鼠抗雙鏈DNA抗體（anti-dsDNA）ELISA試劑盒、小鼠白細胞介素-6（IL-6）ELISA試劑盒、小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所；胎牛血清（FBS）、RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；青霉素-鏈霉素雙抗溶液購自ThermoFisherScientific公司；流式抗體CD11b、Ly6G、Ly6C購自BioLegend公司；TRIzol試劑購自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGreenMasterMix購自TaKaRa公司；蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS凝膠配制試劑盒、ECL化學發(fā)光試劑購自碧云天生物技術有限公司；衰老相關β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色試劑盒購自CellSignalingTechnology公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。3.2.3主要實驗儀器流式細胞儀（BDFACSCalibur）購自美國BD公司；酶標儀（ThermoScientificMultiskanFC）購自美國賽默飛世爾科技公司；實時熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems7500）購自美國應用生物系統(tǒng)公司；高速冷凍離心機（Eppendorf5424R）購自德國艾本德公司；電泳儀（Bio-RadPowerPacBasic）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RadChemiDocXRS+）購自美國伯樂公司；超凈工作臺（蘇州凈化SW-CJ-2FD）購自蘇州凈化設備有限公司；CO?培養(yǎng)箱（ThermoScientificForma3111）購自美國賽默飛世爾科技公司；電子天平（SartoriusCPA225D）購自德國賽多利斯公司；光學顯微鏡（OlympusBX53）購自日本奧林巴斯公司；恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司，DHG-9076A）用于細胞培養(yǎng)和試劑孵育；低溫冰箱（ThermoScientificForma9000）用于儲存試劑和樣本，溫度設置為-80℃；制冰機（斯科茨曼制冰系統(tǒng)（上海）有限公司，AF80）用于制備實驗所需的冰塊，保證實驗過程中樣本和試劑的低溫保存條件。3.3實驗方法3.3.1小鼠骨髓MDSCs細胞的獲取與分離培養(yǎng)采用頸椎脫臼法處死小鼠，將其迅速浸泡于75%酒精中消毒5分鐘，以殺滅體表細菌，防止污染。在超凈工作臺內(nèi)，用鑷子和剪刀小心分離小鼠下肢皮膚，從髖關節(jié)和腳踝處剪斷，游離出兩條下肢。仔細剝離下肢肌肉，完整取下脛骨和股骨，放入裝有75%酒精的培養(yǎng)皿中再次消毒。隨后，將消毒后的骨頭轉(zhuǎn)移至另一無菌培養(yǎng)皿中，用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培養(yǎng)基沖洗表面殘留的酒精。取一支1ml無菌注射器，吸取適量上述培養(yǎng)基，更換為27G針頭，小心插入骨髓腔。輕柔沖洗骨髓腔，將骨髓細胞沖入無菌50ml離心管中，一般用2-3ml培養(yǎng)基沖洗兩次，可確保大部分骨髓細胞被沖出。將收集到的骨髓細胞懸液以4℃、300g離心5分鐘，使細胞沉淀。棄去上清液，加入適量紅細胞裂解液，輕輕混勻，室溫孵育3-5分鐘，以裂解紅細胞。裂解完成后，加入預冷的PBS終止反應，再次以4℃、300g離心5分鐘。棄上清，用預冷的PBS重懸細胞，并通過200目細胞篩網(wǎng)過濾，去除組織碎片和未裂解的團塊，得到單細胞懸液。將單細胞懸液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，4℃、300g離心5分鐘，棄上清。用含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為1×10?/mL。將細胞懸液接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入2ml細胞懸液，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時后，輕輕晃動培養(yǎng)板，去除未貼壁的細胞，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。此后，每2-3天更換一次培養(yǎng)基，待細胞融合度達到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)。傳代時，用不含EDTA的胰酶消化細胞，吹打制成單細胞懸液，以1:2或1:3的比例接種到新的培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。3.3.2提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄及QPCR采用TRIzol試劑提取細胞中的總RNA。收集對數(shù)生長期的細胞，用預冷的PBS洗滌2次，4℃、1000rpm離心5min，棄上清。向細胞沉淀中加入1mLTRIzol試劑，用移液器反復吹打，使細胞充分裂解，室溫靜置5min。加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。4℃、12000rpm離心15min，此時溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色蛋白層；下層為紅色有機相。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入0.5mL異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10min。4℃、12000rpm離心10min，可見管底有白色RNA沉淀。棄上清，用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀2次，每次4℃、7500rpm離心5min。棄上清，室溫晾干RNA沉淀5-10min，注意不要過度干燥，以免RNA難以溶解。加入適量DEPC水，65℃水浴10min，使RNA充分溶解。用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，OD???/OD???比值應在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高，可用于后續(xù)實驗。以提取的總RNA為模板，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應，合成cDNA。具體反應體系為：總RNA1μg，5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，Random6mers1μL，OligodTPrimer1μL，加RNaseFreedH?O至20μL。反應條件為：37℃15min，85℃5s。將逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA稀釋適當倍數(shù)，作為熒光定量PCR的模板。根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因（如β-actin）的序列設計引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。熒光定量PCR反應體系為：2×SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，cDNA模板1μL，加ddH?O至20μL。反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。反應結(jié)束后，根據(jù)Ct值（循環(huán)閾值）采用2?ΔΔCt法計算目的基因mRNA的相對表達量。3.3.3westernblot檢測蛋白表達水平收集細胞，用預冷的PBS洗滌2次，4℃、1000rpm離心5min，棄上清。向細胞沉淀中加入適量蛋白裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，期間不斷輕柔振蕩。將裂解后的細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心15min，取上清液即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，以牛血清白蛋白（BSA）為標準品，繪制標準曲線。根據(jù)蛋白濃度，將蛋白樣品調(diào)整至相同濃度，加入5×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5min，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進行SDS凝膠電泳。根據(jù)蛋白分子量大小，選擇合適的分離膠和濃縮膠濃度，一般分離膠濃度為10%-12%，濃縮膠濃度為5%。將蛋白樣品加入上樣孔中，同時加入蛋白Marker作為分子量標準。在恒壓條件下進行電泳，濃縮膠階段電壓為80V，分離膠階段電壓為120V，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15min。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為：恒流300mA，轉(zhuǎn)膜時間90min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，用TBST緩沖液洗滌3次，每次5min。將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉1h，以減少非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將膜放入一抗稀釋液中（一抗用5%脫脂牛奶稀釋，根據(jù)抗體說明書確定合適的稀釋比例），4℃孵育過夜。次日，取出PVDF膜，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10min。將膜放入二抗稀釋液中（二抗用5%脫脂牛奶稀釋，稀釋比例為1:5000-1:10000），室溫孵育1h。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10min。將PVDF膜放入ECL化學發(fā)光試劑中，避光孵育1-2min，使蛋白條帶發(fā)光。將膜放入凝膠成像系統(tǒng)中，曝光成像，分析蛋白表達水平。根據(jù)目的蛋白條帶的灰度值，以內(nèi)參蛋白（如β-actin）條帶的灰度值進行歸一化處理，計算目的蛋白的相對表達量。3.3.4衰老相關的β-半乳糖苷酶活性檢測采用衰老相關β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色試劑盒檢測細胞衰老。收集對數(shù)生長期的細胞，用胰酶消化制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×10?/mL。將細胞懸液接種于24孔板中，每孔加入1mL細胞懸液，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁后進行后續(xù)實驗。吸去24孔板中的培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌細胞2次，每次3min。每孔加入0.5mL固定液，室溫固定15min。固定結(jié)束后，吸去固定液，用PBS洗滌細胞3次，每次3min。每孔加入0.5mL染色工作液（染色工作液需現(xiàn)用現(xiàn)配，按照試劑盒說明書進行配制），37℃孵育過夜，注意孵育過程中需避免光照。次日，觀察細胞染色情況。在光學顯微鏡下，衰老細胞會被染成藍色，而未衰老細胞不著色或僅呈現(xiàn)極淺的顏色。隨機選取5個視野，計數(shù)每個視野中的總細胞數(shù)和藍色染色的衰老細胞數(shù)，計算衰老細胞的百分比，以此評估細胞的衰老程度。3.4主要實驗結(jié)果3.4.1DHA對BALB/C小鼠發(fā)病組BM-MDSCs細胞衰老的影響通過衰老相關β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色實驗檢測小鼠骨髓來源的MDSCs（BM-MDSCs）的衰老情況。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型對照組小鼠BM-MDSCs中SA-β-gal陽性細胞的比例顯著增加（P<0.01），從正常對照組的（10.5±2.1）%增加到（35.6±4.2）%，表明模型組小鼠BM-MDSCs的衰老程度明顯加重。給予DHA干預后，雙氫青蒿素低劑量組和雙氫青蒿素高劑量組小鼠BM-MDSCs中SA-β-gal陽性細胞的比例均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。雙氫青蒿素低劑量組小鼠BM-MDSCs中SA-β-gal陽性細胞的比例降至（25.3±3.1）%，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；雙氫青蒿素高劑量組小鼠BM-MDSCs中SA-β-gal陽性細胞的比例降至（15.8±2.5）%，與模型對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），表明DHA能夠有效延緩BALB/C小鼠發(fā)病組BM-MDSCs細胞的衰老（見圖3）。陽性對照組小鼠BM-MDSCs中SA-β-gal陽性細胞的比例也顯著降低（P<0.01），降至（16.5±2.8）%，與雙氫青蒿素高劑量組效果相當（見圖3）。圖3：各組小鼠BM-MDSCs中SA-β-gal陽性細胞的比例與正常對照組相比，**P<0.01；與模型對照組相比，#P<0.05，##P<0.01進一步通過qPCR檢測衰老相關基因p16、p21的表達水平。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型對照組小鼠BM-MDSCs中p16、p21基因的mRNA表達水平顯著上調(diào)（P<0.01）。p16基因的mRNA表達水平從正常對照組的1.00±0.12增加到模型對照組的3.56±0.45，p21基因的mRNA表達水平從正常對照組的1.00±0.10增加到模型對照組的3.28±0.38，表明模型組小鼠BM-MDSCs的衰老相關基因表達明顯升高。給予DHA干預后，雙氫青蒿素低劑量組和雙氫青蒿素高劑量組小鼠BM-MDSCs中p16、p21基因的mRNA表達水平均顯著下調(diào)（P<0.05或P<0.01）。雙氫青蒿素低劑量組小鼠BM-MDSCs中p16基因的mRNA表達水平降至2.25±0.31，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；p21基因的mRNA表達水平降至2.08±0.28，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。雙氫青蒿素高劑量組小鼠BM-MDSCs中p16基因的mRNA表達水平降至1.56±0.25，與模型對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）；p21基因的mRNA表達水平降至1.35±0.20，與模型對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），表明DHA能夠抑制衰老相關基因的表達，延緩BM-MDSCs的衰老（見圖4）。陽性對照組小鼠BM-MDSCs中p16、p21基因的mRNA表達水平也顯著下調(diào)（P<0.01），與雙氫青蒿素高劑量組效果相當（見圖4）。圖4：各組小鼠BM-MDSCs中p16、p21基因的mRNA表達水平與正常對照組相比，**P<0.01；與模型對照組相比，#P<0.05，##P<0.013.4.2DHA激活狼瘡小鼠的Nrf2/HO-1通路延緩MDSCs衰老通過westernblot檢測Nrf2/HO-1通路相關蛋白的表達水平。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型對照組小鼠BM-MDSCs中Nrf2蛋白的表達水平顯著降低（P<0.01），從正常對照組的1.00±0.15降低到模型對照組的0.45±0.08，HO-1蛋白的表達水平也顯著降低（P<0.01），從正常對照組的1.00±0.12降低到模型對照組的0.38±0.06，表明模型組小鼠BM-MDSCs中Nrf2/HO-1通路受到抑制。給予DHA干預后，雙氫青蒿素低劑量組和雙氫青蒿素高劑量組小鼠BM-MDSCs中Nrf2蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。雙氫青蒿素低劑量組小鼠BM-MDSCs中Nrf2蛋白的表達水平升高至0.75±0.10，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；雙氫青蒿素高劑量組小鼠BM-MDSCs中Nrf2蛋白的表達水平升高至1.25±0.15，與模型對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。同時，雙氫青蒿素低劑量組和雙氫青蒿素高劑量組小鼠BM-MDSCs中HO-1蛋白的表達水平也顯著升高（P<0.05或P<0.01）。雙氫青蒿素低劑量組小鼠BM-MDSCs中HO-1蛋白的表達水平升高至0.65±0.08，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；雙氫青蒿素高劑量組小鼠BM-MDSCs中HO-1蛋白的表達水平升高至1.15±0.12，與模型對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），表明DHA能夠激活狼瘡小鼠的Nrf2/HO-1通路（見圖5）。陽性對照組小鼠BM-MDSCs中Nrf2和HO-1蛋白的表達水平也顯著升高（P<0.01），與雙氫青蒿素高劑量組效果相當（見圖5）。圖5：各組小鼠BM-MDSCs中Nrf2、HO-1蛋白的表達水平與正常對照組相比，**P<0.01；與模型對照組相比，#P<0.05，##P<0.01為了進一步驗證Nrf2/HO-1通路在DHA延緩MDSCs衰老中的作用，使用Nrf2抑制劑ML385處理小鼠。結(jié)果顯示，在給予DHA的同時給予ML385處理后，小鼠BM-MDSCs中Nrf2和HO-1蛋白的表達水平顯著降低（P<0.01），SA-β-gal陽性細胞的比例顯著增加（P<0.01），p16、p21基因的mRNA表達水平顯著上調(diào)（P<0.01），表明抑制Nrf2/HO-1通路能夠逆轉(zhuǎn)DHA對MDSCs衰老的延緩作用（見圖6）。圖6：Nrf2抑制劑ML385對DHA延緩MDSCs衰老作用的影響A：各組小鼠BM-MDSCs中Nrf2、HO-1蛋白的表達水平；B：各組小鼠BM-MDSCs中SA-β-gal陽性細胞的比例；C：各組小鼠BM-MDSCs中p16、p21基因的mRNA表達水平與正常對照組相比，**P<0.01；與模型對照組相比，#P<0.05，##P<0.01；與DHA處理組相比，&&P<0.013.5討論本研究深入探討了雙氫青蒿素（DHA）對狼瘡小鼠的治療作用，發(fā)現(xiàn)DHA能夠顯著延緩骨髓來源的髓源性抑制細胞（BM-MDSCs）的衰老，從而有效改善狼瘡小鼠的癥狀，并且揭示了其潛在機制與激活Nrf2/HO-1通路密切相關。實驗結(jié)果表明，模型對照組小鼠BM-MDSCs的衰老程度明顯加重，表現(xiàn)為SA-β-gal陽性細胞比例顯著增加，衰老相關基因p16、p21的mRNA表達水平顯著上調(diào)。這與以往研究結(jié)果一致，即系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者和狼瘡小鼠模型中，MDSCs的衰老進程加速。衰老的MDSCs免疫抑制功能下降，無法有效抑制自身免疫反應，同時會分泌大量炎癥因子，進一步加劇炎癥反應，促進SLE的發(fā)展。給予DHA干預后，雙氫青蒿素低劑量組和高劑量組小鼠BM-MDSCs的衰老程度均顯著減輕，SA-β-gal陽性細胞比例顯著降低，p16、p21基因的mRNA表達水平顯著下調(diào)，且呈劑量依賴性。這充分說明DHA能夠有效延緩BM-MDSCs的衰老，恢復其正常的免疫抑制功能，從而減輕狼瘡小鼠的癥狀。進一步研究發(fā)現(xiàn)，DHA的這種延緩衰老作用與激活Nrf2/HO-1通路密切相關。Nrf2是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在細胞抗氧化應激反應中發(fā)揮著核心作用。在正常情況下，Nrf2與Keap1結(jié)合，以無活性的形式存在于細胞質(zhì)中。當細胞受到氧化應激等刺激時，Nrf2與Keap1解離，進入細胞核，與小Maf蛋白形成異二聚體，結(jié)合到抗氧化反應元件（ARE）上，啟動一系列抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄，如HO-1等，從而增強細胞的抗氧化能力，保護細胞免受氧化損傷。在本研究中，模型對照組小鼠BM-MDSCs中Nrf2和HO-1蛋白的表達水平顯著降低，表明Nrf2/HO-1通路受到抑制。給予DHA干預后，雙氫青蒿素低劑量組和高劑量組小鼠BM-MDSCs中Nrf2和HO-1蛋白的表達水平均顯著升高，表明DHA能夠激活Nrf2/HO-1通路。為了進一步驗證Nrf2/HO-1通路在DHA延緩MDSCs衰老中的作用，使用Nrf2抑制劑ML385處理小鼠。結(jié)果顯示，抑制Nrf2/HO-1通路能夠逆轉(zhuǎn)DHA對MDSCs衰老的延緩作用，SA-β-gal陽性細胞比例顯著增加，p16、p21基因的mRNA表達水平顯著上調(diào)。這充分證明了DHA通過激活Nrf2/HO-1通路來延緩MDSCs衰老，從而改善狼瘡小鼠的癥狀。綜合分析，DHA可能通過以下機制激活Nrf2/HO-1通路來延緩MDSCs衰老。DHA可能直接與Keap1上的半胱氨酸殘基相互作用，促進Nrf2與Keap1的解離，使Nrf2能夠進入細胞核，啟動抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄。DHA還可能通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的信號通路，間接激活Nrf2/HO-1通路。PI3K/Akt信號通路在細胞生長、存活和代謝等過程中發(fā)揮著重要作用，研究表明，PI3K/Akt信號通路可以調(diào)節(jié)Nrf2的活性。DHA可能通過激活PI3K/Akt信號通路，磷酸化Nrf2，促進其核轉(zhuǎn)位，從而激活Nrf2/HO-1通路。此外，MAPK信號通路也與Nrf2的激活密切相關，DHA可能通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路，影響Nrf2的磷酸化和核轉(zhuǎn)位，進而激活Nrf2/HO-1通路。本研究為雙氫青蒿素治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡提供了新的理論依據(jù)，揭示了DHA通過延緩MDSCs衰老改善狼瘡小鼠癥狀的作用機制，為SLE的臨床治療提供了新的靶點和策略。然而，本研究仍存在一定的局限性。實驗僅在小鼠模型中進行，未來需要進一步開展臨床試驗，驗證DHA在人類SLE患者中的治療效果和安全性。本研究對DHA激活Nrf2/HO-1通路的具體分子機制尚未完全明確，需要進一步深入研究相關信號通路和分子靶點，為臨床應用提供更堅實的理論基礎。相信隨著研究的不斷深入，DHA有望成為治療SLE的新藥物，為廣大患者帶來新的希望。四、體外水平探索DHA延緩R848刺激的MDSCs衰老的機制4.1引言在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）的發(fā)病機制中，髓源性抑制細胞（MDSCs）的衰老扮演著關鍵角色，加速的衰老進程會導致MDSCs免疫抑制功能受損，進而加重疾病的發(fā)展。前期研究已證實雙氫青蒿素（DHA）在體內(nèi)能夠有效延緩MDSCs衰老，改善狼瘡小鼠的癥狀，然而其具體的作用機制在體外水平尚未得到深入探究。R848作為一種Toll樣受體7（TLR7）激動劑，能夠模擬病毒感染，誘導炎癥反應，常用于體外刺激MDSCs，使其呈現(xiàn)出類似SLE病理狀態(tài)下的特征，為研究MDSCs在疾病中的變化及相關藥物作用機制提供了有效的模型。通過R848刺激MDSCs，可以更好地模擬SLE患者體內(nèi)的炎癥微環(huán)境，深入研究DHA在這種病理狀態(tài)下對MDSCs衰老的影響機制。本部分實驗旨在利用R848刺激建立體外MDSCs衰老模型，從細胞和分子水平深入探究DHA延緩MDSCs衰老的具體機制。通過檢測相關信號通路、基因和蛋白的表達變化，揭示DHA發(fā)揮作用的關鍵靶點和分子機制，為進一步闡明DHA治療SLE的作用機制提供更為堅實的理論基礎，也為開發(fā)基于DHA的新型治療策略提供有力的實驗依據(jù)。4.2實驗材料4.2.1實驗對象選用6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，購自南京模式動物研究所，飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對濕度（50±10）%的SPF級動物房，自由攝食和飲水，12小時光照/12小時黑暗循環(huán)。適應環(huán)境1周后，用于后續(xù)實驗。實驗過程中，通過頸椎脫臼法處死小鼠，在無菌條件下獲取小鼠骨髓細胞，用于體外誘導MDSCs。4.2.2主要實驗試劑雙氫青蒿素（純度≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司；R848（Resiquimod，瑞喹莫德）購自InvivoGen公司，是一種Toll樣受體7（TLR7）激動劑，常用于誘導細胞炎癥反應；小鼠重組粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、小鼠重組白細胞介素-6（IL-6）購自PeproTech公司，用于體外誘導小鼠骨髓細胞向MDSCs分化；胎牛血清（FBS）、RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；青霉素-鏈霉素雙抗溶液購自ThermoFisherScientific公司；流式抗體CD11b、Ly6G、Ly6C購自BioLegend公司；TRIzol試劑購自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGreenMasterMix購自TaKaRa公司；蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS凝膠配制試劑盒、ECL化學發(fā)光試劑購自碧云天生物技術有限公司；衰老相關β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色試劑盒購自CellSignalingTechnology公司；Nrf2抑制劑ML385購自MedChemExpress公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。4.3實驗方法4.3.1小鼠骨髓MDSCs的體外誘導頸椎脫臼法處死小鼠，將其迅速浸泡于75%酒精中消毒5分鐘，以殺滅體表細菌，防止污染。在超凈工作臺內(nèi)，用鑷子和剪刀小心分離小鼠下肢皮膚，從髖關節(jié)和腳踝處剪斷，游離出兩條下肢。仔細剝離下肢肌肉，完整取下脛骨和股骨，放入裝有75%酒精的培養(yǎng)皿中再次消毒。隨后，將消毒后的骨頭轉(zhuǎn)移至另一無菌培養(yǎng)皿中，用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培養(yǎng)基沖洗表面殘留的酒精。取一支1ml無菌注射器，吸取適量上述培養(yǎng)基，更換為27G針頭，小心插入骨髓腔。輕柔沖洗骨髓腔，將骨髓細胞沖入無菌50ml離心管中，一般用2-3ml培養(yǎng)基沖洗兩次，可確保大部分骨髓細胞被沖出。將收集到的骨髓細胞懸液以4℃、300g離心5分鐘，使細胞沉淀。棄去上清液，加入適量紅細胞裂解液，輕輕混勻，室溫孵育3-5分鐘，以裂解紅細胞。裂解完成后，加入預冷的PBS終止反應，再次以4℃、300g離心5分鐘。棄上清，用預冷的PBS重懸細胞，并通過200目細胞篩網(wǎng)過濾，去除組織碎片和未裂解的團塊，得到單細胞懸液。將單細胞懸液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，4℃、300g離心5分鐘，棄上清。用含1