實(shí)驗(yàn)十雙層平板法觀察蛭弧菌斑實(shí)驗(yàn)第一頁(yè)，共17頁(yè)。一、蛭弧菌簡(jiǎn)介蛭弧菌(Bdellovibrio)是寄生于其他細(xì)菌并能導(dǎo)致其裂解的一類細(xì)菌。它雖然比通常的細(xì)菌小，能通過(guò)細(xì)菌濾器，有類似噬菌體的作用，但它不是病毒，是一類能"吃掉"細(xì)菌的細(xì)菌。1962年首次發(fā)現(xiàn)于菜豆葉燒病假單胞菌體中，隨后從土壤、污水中都分離到了這種細(xì)菌。第二頁(yè)，共17頁(yè)。特征蛭弧菌屬于蛭弧菌科。具有細(xì)菌的一切形態(tài)特征：?jiǎn)渭?xì)胞，弧形或逗點(diǎn)狀，有時(shí)呈螺旋狀0.3-0.6×0.8-1.2微米，或僅為桿菌長(zhǎng)度的1/3-1/4端生鞭毛，比其他細(xì)菌的鞭毛粗3-4倍，運(yùn)動(dòng)活躍革蘭氏染色陰性。細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量較高，有的占干重的60-70%。DNA含量5%，GC百分?jǐn)?shù)為42-51%。第三頁(yè)，共17頁(yè)。生活方式有寄生型，也有兼性寄生，極少數(shù)營(yíng)腐生。非寄生型營(yíng)腐生生活，可在蛋白胨和酵母提取物培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖，絕大多數(shù)都喪失了寄生性。從自然界分離得到的蛭弧菌都是依賴寄生型，迄今為止，還沒(méi)有直接從自然界分離得到非寄生型。不依賴宿主的蛭弧菌，只能生活在實(shí)驗(yàn)室條件下。第四頁(yè)，共17頁(yè)。生長(zhǎng)要求寄生型蛭弧菌生長(zhǎng)，要求pH6.0-8.5；溫度23-37℃，低于12℃，高于42℃時(shí)均不生長(zhǎng)；能穩(wěn)定分解蛋白質(zhì)，一般不利用碳水化合物，而以肽、氨基酸作碳源和能源；能液化明膠；嚴(yán)格好氧。第五頁(yè)，共17頁(yè)。侵入對(duì)象蛭弧菌與宿主細(xì)胞之間，常表現(xiàn)出一定的特異性。不過(guò)，有的特異性較差，能侵入多種細(xì)菌。例如不同的蛭弧菌菌株，能侵入各類不同的植物病原菌。第六頁(yè)，共17頁(yè)。侵入機(jī)理周質(zhì)空間第七頁(yè)，共17頁(yè)。分布和分離廣泛存在于自然界，土壤、河水、附近海洋水域及下水道污水。將蛭弧菌與敏感菌混合倒平板，在適宜條件下培養(yǎng)2-3天，平板上便會(huì)出現(xiàn)類似噬菌體的噬菌斑，并逐漸擴(kuò)大，宿主細(xì)胞完全被溶解而形成透明區(qū)。從這些透明區(qū)中就可分離到蛭弧菌。利用這一特征，還可計(jì)算出蛭弧菌噬菌體的數(shù)目。同時(shí)可追蹤增殖過(guò)程、寄生潛伏時(shí)間、新產(chǎn)生蛭弧菌的數(shù)量以及它們的活性等。第八頁(yè)，共17頁(yè)。應(yīng)用價(jià)值用于凈化水體和清除工、農(nóng)、醫(yī)等方面的有害細(xì)菌。大量存在于污水中，對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌屬的細(xì)菌均有廣泛的寄生性，因此，有人以蛭弧菌作為水域污染程度的一項(xiàng)最終指標(biāo)理論研究：宿主細(xì)菌-蛭弧菌-蛭弧菌噬菌體這個(gè)"三位一體"的寄生系統(tǒng)。第九頁(yè)，共17頁(yè)。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解噬菌蛭弧菌的生物特性2.掌握雙層平板法分離蛭弧菌技術(shù)

第十頁(yè)，共17頁(yè)。三、實(shí)驗(yàn)材料儀器顯微鏡，生化培養(yǎng)箱，電子天平，高壓滅菌鍋，電熱干燥箱，超凈工作臺(tái)，冰箱，高速離心機(jī)，普通離心機(jī)。菌種大腸桿菌（Escherichiacoli）、噬菌蛭弧菌（Bdellovibriobacteriovoru）。第十一頁(yè)，共17頁(yè)。實(shí)驗(yàn)試劑（1）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉粉5g（0.5%）；蛋白胨10g（1%）；瓊脂20g（2%）；蒸餾水1000ml；pH7.0～7.2（2）雙層平板培養(yǎng)基下層瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂17.5g（1.75%）；蒸餾水1000ml上層LB培養(yǎng)基：蛋白胨5g（0.5%）；酵母提取物1.5g（0.15%）；NaCl2.5g（0.25%）；瓊脂4g（0.4%）；蒸餾水1000ml。大腸桿菌的制備將大腸桿菌接種牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上，放在37℃培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24h后，備用。

第十二頁(yè)，共17頁(yè)。四、實(shí)驗(yàn)程序

1.利用雙層平板法分離噬菌蛭弧菌2.觀察噬菌蛭弧菌斑出現(xiàn)及其形態(tài)的觀察即：通過(guò)雙層平板法使噬菌蛭弧菌對(duì)大腸桿菌的裂解而形成噬菌斑。

第十三頁(yè)，共17頁(yè)。雙層平板法主要優(yōu)點(diǎn)：第十四頁(yè)，共17頁(yè)。五、實(shí)驗(yàn)方法及操作1、蛭弧菌懸液的制備：挑取蛭弧菌單斑浸泡于1.5mL無(wú)菌水中，搗碎混勻，10000g離心1min，得到蛭弧菌懸液，備用。2、大腸桿菌懸液的制備：取0.5mL無(wú)菌水在大腸桿菌的斜面上，用接種環(huán)鉤分散乳化菌苔，制備菌懸液，備用。3、倒入融化的瓊脂培養(yǎng)基20ml于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，冷卻凝固，備用。制作下層瓊脂培養(yǎng)基。第十五頁(yè)，共17頁(yè)。試驗(yàn)操作注意事項(xiàng)