ICSBT/CALAS95—實(shí)驗(yàn)動(dòng) 肝螺桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)Laboratoryanimal-DetectionofHelicobacterhepaticusbyloop-mediatedisothermal 發(fā) 實(shí)中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì) GB/T1.1—2020給出的規(guī)則起草。A為資料性附錄。本文件由全國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAC/TC281）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物L(fēng)AMP檢測(cè)方法。（包括所有的修改單）GB GB/T 《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增loop-mediatedisothermal聚合酶（BstDNApolymerase）60℃～65℃恒溫15min～60min109～1010倍的核酸擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物由一系列復(fù)雜的大DNA混合而成。 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediatedisothermalamplification） 磷酸鹽緩沖液（phosphatebufferedsaline）fla B（flagellinB）DNAflaB基因序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)一組LAMP引物，包括外引物F3和B3、內(nèi)引物FIP和BIP以及環(huán)引物L(fēng)B，對(duì)DNALAMP擴(kuò)增結(jié)果判定樣品中是否含有肝螺桿菌。LAMPF3B3FIPBIP第三篇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)方法系列標(biāo)準(zhǔn)第三篇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)方法系列標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝螺桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝螺桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）可特異性識(shí)別靶序列上的6BstDNA聚合酶（BstDNApolymerase啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在flaB基因序列啟動(dòng)互補(bǔ)鏈合成，在同一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成有許多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖-DNADNA合成時(shí)，從脫氧核糖核酸三磷酸底物（dNTP）中析出的焦磷酸離子與反應(yīng)溶液中的鎂離子反應(yīng)，產(chǎn)生大量白色焦磷酸鎂沉淀。焦磷酸鎂沉淀與鈣黃綠素結(jié)合，產(chǎn)生黃綠色熒光。因此，可以把渾濁度作為反應(yīng)的指標(biāo)，僅用肉眼觀察反應(yīng)液顏色變化，即可判定擴(kuò)增與否，無(wú)需繁瑣的電泳和紫外觀察。離心機(jī)：2000r/min～13000r/min水浴鍋或恒溫孵育器：60℃～65℃冰箱：2℃～5℃、–20℃微量移液器（0.1L～2L、1L～10L、10L～100L、100L～1000L）及無(wú)無(wú)菌透明離心管：1.5mL、5mL、15mLLAMP反應(yīng)管（透明）試劑除特殊說(shuō)明外，實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純或符合生化試劑標(biāo)準(zhǔn)，各溶液按照附錄A所DNADNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，貨DP302]或其他等效試劑。LAMP試劑：LAMPDNA擴(kuò)增試劑盒（SLP204）本文件給出試劑盒相關(guān)信息是為了方便本文件使用者，并不表示對(duì)該產(chǎn)品的認(rèn)可。如果其他產(chǎn)品具有相同的效果，那么可使用這些等效產(chǎn)品。去離子水溶解，–20℃1LAMP2.0g5mL4mLPBS，經(jīng)勻漿后充分振蕩，3000r/min離心10min，吸取上清液轉(zhuǎn)至干凈離心管中編號(hào)備用。1mLPBS1.5mLPBS30min5mL無(wú)菌離心管中。取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲水直接轉(zhuǎn)移5L無(wú)菌離心管中，備用。15mL30min5mL無(wú)菌離心管中。3次。DNA1mL～5mL上述樣本，10000r/min1min200μLGA20μLK220μLGB15s，70℃10min，溶液應(yīng)變清亮，簡(jiǎn)短離心以CB3中（吸附柱放入收集管中12000r/min30sCB3CB3500μLGD，12000r/min30s，倒掉廢液，將吸CB3放入收集管中。CB3600μLPW，12000r/min30s，倒掉廢液，將吸CB3放入收集管中。7.2.8PW12CB3放入收集管中。CB3放回收集管中，12000r/min2minCB350200μLTE2min～5min，12000r/min2min，將溶液收集到離DNA應(yīng)盡快進(jìn)行下一步反應(yīng)。若暫不能進(jìn)行，應(yīng)凍存于–20℃?zhèn)溆?。LAMPLAMP2。2LAMP F3（5B3（5FIP（40BIP（40LB（20BstDNA聚合酶DNA6345minLAMP擴(kuò)增。LAMP擴(kuò)增結(jié)束后，肉眼觀察樣品反應(yīng)管液體顏色，顯示為黃綠色判為陽(yáng)性，橙色則GB19489規(guī)定執(zhí)行，由具備相關(guān)資質(zhì)的工作人員進(jìn)行相應(yīng)操作；檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染的過(guò)程控制按照GB/T19495.2要求執(zhí)行。附錄（資料性附錄磷酸鹽緩沖液A0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：稱取磷酸二氫鈉（NaH2PO4·H2O）27.6g，適量去離子水1000mL，混勻。B（Na2HPO4·7H2O53.6g71.6gNa2HPO4·2H2O35.6g），1000mL0.02mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）（pH7.2）A14mL、B36mL，加氯化鈉（NaCl）8.5g800mL去離子水溶解稀釋，HClpH7.21000mL12115min，冷卻備用。50×TAE0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH8.0） 18.61g滅菌去離子 805mol/L氫氧化鈉溶 調(diào)pH至100mL，121℃、15min50×TAE三羥甲基氨基甲烷 242乙 57.10.5mol/LEDTA溶液 100100mL，121℃、15min溴化乙錠（EB）溶液（10溴化乙 10滅菌去離子 1含0.5g/mL溴化乙錠的2.0%瓊脂 21×TAE電泳緩沖 加至10010mg/mLEB5L，輕輕混勻，避免產(chǎn)3mm～5mm，需確認(rèn)梳齒下或梳齒間沒(méi)有氣泡，待凝固后取出梳子備用。FoxJG,DewhirstFE,TullJG,etal.1994.Helicobacterhepaticussp.nov.amicroaerophilicbacteriumisolatedfromliversandintestinalmucosalscrapingsfrommice[J].JClinMicrobiol,32(5):1238-1245.M?hlerConvenorM,BerardM,FeinsteinR,etal.2014.FELASArecommendationsforthehealthmonitoringofmouse,rat,hamster,guineapigandrabbitcoloniesinbreedingandexperimentalunits[J].LabAnimal,48(3):NotomiT,OkayamaH,TmitaN,etal.2000.Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA[J].NucleicAcidsRes,28(12):e63.SuerbaumS,JosenhansC,SterzenbachT.2003.ThecompletegenomesequenceofthecarcinogenicbacteriumHelicobacterhepaticus[J]．ProcNatlAcadSciUSA,100(13):790