雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化RSA制備氫化可的松新工藝：機(jī)制、優(yōu)化與展望一、引言1.1研究背景與意義氫化可的松（Hydrocortisone），化學(xué)名為11β，17α，21-三羥基孕甾-4-烯-3，20-二酮，是一種重要的腎上腺皮質(zhì)激素類藥物，在醫(yī)藥領(lǐng)域占據(jù)著舉足輕重的地位。作為哺乳動物腎上腺皮質(zhì)分泌的主要糖皮質(zhì)激素，氫化可的松具有廣泛的藥理作用。其能夠通過彌散作用于靶細(xì)胞，與細(xì)胞內(nèi)的受體相結(jié)合，形成類固醇-受體復(fù)合物。該復(fù)合物作為基因轉(zhuǎn)錄的激活因子，以二聚體的形式與DNA上的特異性順序鏈結(jié)合，從而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，增加mRNA的生成，并進(jìn)一步合成相應(yīng)的蛋白，最終在靶標(biāo)細(xì)胞內(nèi)實現(xiàn)類固醇激素的生理和藥理效應(yīng)。在臨床應(yīng)用中，氫化可的松的身影隨處可見。它主要用于腎上腺皮質(zhì)功能減退癥的替代治療，為那些腎上腺皮質(zhì)功能出現(xiàn)問題的患者提供必要的激素補(bǔ)充，維持身體的正常生理功能；對于先天性腎上腺皮質(zhì)功能增生癥的治療，氫化可的松也發(fā)揮著關(guān)鍵作用，幫助患者調(diào)節(jié)體內(nèi)的激素平衡。此外，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性發(fā)熱、痛風(fēng)、支氣管哮喘、過敏性疾病等病癥的治療中，氫化可的松也展現(xiàn)出了良好的療效，能夠有效緩解患者的癥狀，減輕患者的痛苦。在嚴(yán)重感染和抗休克治療方面，氫化可的松更是不可或缺，它可以幫助患者提高機(jī)體對有害刺激的應(yīng)激能力，減輕細(xì)菌內(nèi)毒素對機(jī)體的損傷，緩解毒素對機(jī)體的損傷，對抗中毒性休克、低血容量休克、心源性休克等，為患者的生命健康保駕護(hù)航。不僅如此，氫化可的松還是制備其他幾種重要甾體藥物的原料藥，在甾體藥物的合成中起著關(guān)鍵的中間體作用，其質(zhì)量和產(chǎn)量直接影響著后續(xù)甾體藥物的生產(chǎn)和質(zhì)量。隨著醫(yī)藥行業(yè)的不斷發(fā)展，對氫化可的松的需求也在持續(xù)增長，這不僅體現(xiàn)在臨床治療的廣泛應(yīng)用上，還體現(xiàn)在相關(guān)醫(yī)藥研發(fā)對其作為基礎(chǔ)原料的依賴上。目前，氫化可的松的生產(chǎn)方法主要包括化學(xué)合成法和生物轉(zhuǎn)化法。化學(xué)合成法雖然能夠?qū)崿F(xiàn)氫化可的松的合成，但其合成步驟繁瑣，往往需要經(jīng)過多步復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，這不僅導(dǎo)致生產(chǎn)過程復(fù)雜，而且總收率較低，使得生產(chǎn)成本居高不下，難以滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需求。而生物轉(zhuǎn)化法，尤其是微生物轉(zhuǎn)化法，因其具有高效、低成本、低污染等諸多優(yōu)點，逐漸成為氫化可的松生產(chǎn)的研究熱點和發(fā)展方向。在微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)氫化可的松的過程中，雙菌轉(zhuǎn)化RSA（17α-羥基孕甾-4-烯-3，20-二酮-21-醋酸酯）制氫化可的松新工藝的研究具有重要的現(xiàn)實意義。當(dāng)前，國內(nèi)一般采用藍(lán)色犁頭霉（Absidiacoerulea）AS3.65作為工業(yè)生產(chǎn)菌株，然而其11-β-羥化酶活力及選擇性不強(qiáng)，這一缺陷導(dǎo)致在轉(zhuǎn)化過程中會產(chǎn)生不少副產(chǎn)物，如11α-OH—RS（表皮醇）。這些副產(chǎn)物的產(chǎn)生不僅降低了氫化可的松對RSA的收率，僅為45%，還使得對薯蕷皂素的總收率約為18%，與國際水平27%存在較大差距。國外通常采用新月彎孢霉（Curvularialunata）AS3.4381為生產(chǎn)菌株，以RS（17α，21-二羥基孕甾-4-烯-3，20-二酮）為轉(zhuǎn)化底物進(jìn)行HC的生產(chǎn)，產(chǎn)率在60%左右。通過對藍(lán)色犁頭霉和新月彎孢霉轉(zhuǎn)化過程的深入研究發(fā)現(xiàn)，兩種菌在轉(zhuǎn)化過程中表現(xiàn)出各自不同的特性。藍(lán)色犁頭霉對底物RSA具有較高的21-脫乙?；钚裕捎谄溲趸瘜Ｒ恍暂^差，導(dǎo)致副產(chǎn)物水平較高；而新月彎孢霉脫乙酰活性較低，然而其轉(zhuǎn)化速率較快，且副產(chǎn)物可控制在相對較低水平，同時能較好地降低對甾體化合物的解構(gòu)效應(yīng)?；趦煞N菌各自的優(yōu)缺點，開展雙菌轉(zhuǎn)化RSA制氫化可的松新工藝的研究，旨在充分發(fā)揮兩種菌的優(yōu)勢，實現(xiàn)優(yōu)勢互補(bǔ)。通過巧妙設(shè)計雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化的實驗方案，并對相關(guān)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，可以有效提高氫化可的松的產(chǎn)率和質(zhì)量。這不僅能夠滿足市場對氫化可的松日益增長的需求，還能提升我國在甾體激素生產(chǎn)領(lǐng)域的技術(shù)水平，增強(qiáng)我國醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的國際競爭力。此外，新工藝的研究還有助于推動微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在甾體藥物生產(chǎn)中的進(jìn)一步應(yīng)用和發(fā)展，為其他甾體藥物的生產(chǎn)工藝改進(jìn)提供有益的借鑒和參考，具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在氫化可的松的生產(chǎn)研究領(lǐng)域，化學(xué)合成法與生物轉(zhuǎn)化法一直是兩大主要研究方向。早期，化學(xué)合成法率先取得突破，1950年Wendler等成功用化學(xué)合成法合成氫化可的松。然而，這種全合成方法需要歷經(jīng)30多步復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，不僅工藝工程異常復(fù)雜，而且總收率極低，這使得其在工業(yè)化生產(chǎn)方面面臨巨大的成本挑戰(zhàn)，因此逐漸被研究者們所摒棄。此后，半合成法成為了研究的重點，該方法從天然產(chǎn)物中獲取含有甾體基本骨架的化合物作為原料，再通過化學(xué)方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造。例如，以薯芋皂素為起始原料，經(jīng)過一系列復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，包括開環(huán)裂解去掉E、F環(huán)，將C3羥基轉(zhuǎn)化為酮基，C5、C6雙鍵位移至C4、C5位，引入三個特定的羥基等步驟，最終合成氫化可的松。在半合成路線中，C-11β羥基的引入是關(guān)鍵步驟，常規(guī)化學(xué)法在這一步面臨著巨大的困難，因為C-11位周圍沒有活性功能基團(tuán)的影響，難以對非活潑碳?xì)滏I進(jìn)行氧化。相比之下，生物催化法在這方面展現(xiàn)出了獨特的優(yōu)勢，能夠?qū)-11位進(jìn)行立體選擇性氧化。隨著研究的不斷深入，微生物轉(zhuǎn)化法因其具有高效、低成本、低污染等顯著優(yōu)點，逐漸成為氫化可的松生產(chǎn)的研究熱點。1952年，美國普強(qiáng)藥廠的Peterson和Murray首次發(fā)現(xiàn)黑根霉對甾體具有C11羥化能力，這一發(fā)現(xiàn)使得孕酮到皮甾酮的合成步驟大幅縮短為三步，收率高達(dá)90%，為微生物轉(zhuǎn)化甾體化合物開創(chuàng)了先河。此后，越來越多的微生物被發(fā)現(xiàn)具有甾體C11的羥化能力，如犁頭霉、彎孢霉、小克銀漢霉、赭曲霉及綠僵菌等，相關(guān)研究也不斷取得新的進(jìn)展。在國內(nèi)，目前一般采用藍(lán)色犁頭霉AS3.65作為工業(yè)生產(chǎn)菌株，該菌株自1963年篩選出來后一直沿用至今。然而，其11-β-羥化酶活力及選擇性不強(qiáng)的缺陷較為明顯，在轉(zhuǎn)化過程中會產(chǎn)生較多的副產(chǎn)物，如11α-OH—RS（表皮醇）。這不僅導(dǎo)致氫化可的松對RSA的收率僅為45%，而且對薯蕷皂素的總收率約為18%，與國際水平27%存在較大的差距。為了提高氫化可的松的產(chǎn)率，國內(nèi)學(xué)者進(jìn)行了大量的研究。例如，成都生物研究所楊順楷課題組利用犁頭霉和新月彎孢霉的雙霉菌協(xié)同轉(zhuǎn)化，在底物投料濃度為0.1%的條件下，轉(zhuǎn)化RSA制備氫化可的松的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了85%。天津輕工業(yè)學(xué)院王敏等在將化合物RS-21醋酸酯轉(zhuǎn)化為氫化可的松的工藝研究中，其β體轉(zhuǎn)化率達(dá)75%。浙江大學(xué)的關(guān)怡新課題組利用短刺小克銀漢霉C11β羥化轉(zhuǎn)化環(huán)氧黃體酮為11β-羥基-16α,17α-環(huán)氧黃體酮時，在0.2%的底物投料量下，通過發(fā)酵液稀釋補(bǔ)料的投料方式，有效地將產(chǎn)物得率從35%提高到43%。在國外，通常采用新月彎孢霉AS3.4381為生產(chǎn)菌株，以RS為轉(zhuǎn)化底物進(jìn)行氫化可的松的生產(chǎn)，其產(chǎn)率在60%左右。通過對藍(lán)色犁頭霉和新月彎孢霉轉(zhuǎn)化過程的比較研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)色犁頭霉對底物RSA具有較高的21-脫乙?；钚?，但由于其氧化專一性較差，導(dǎo)致副產(chǎn)物水平較高；而新月彎孢霉脫乙?；钚暂^低，然而其轉(zhuǎn)化速率較快，副產(chǎn)物可控制在相對較低水平，同時能較好地降低對甾體化合物的解構(gòu)效應(yīng)。基于兩種菌各自的優(yōu)缺點，有研究設(shè)計了兩種菌協(xié)同轉(zhuǎn)化RSA制氫化可的松的實驗方案，并對所選的較優(yōu)方案進(jìn)行了相關(guān)參數(shù)的優(yōu)化。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行搖瓶克量制備實驗轉(zhuǎn)化，3批收得率以RSA計氫化可的松平均收得率達(dá)52.0%，較傳統(tǒng)藍(lán)色犁頭霉45%高出7個百分點。盡管國內(nèi)外在雙菌轉(zhuǎn)化RSA制氫化可的松的研究方面已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但仍存在一些不足之處?，F(xiàn)有工藝在底物溶解性、細(xì)胞通透性等方面還存在較大的提升空間。由于甾體化合物水溶性差，底物的傳質(zhì)成為影響轉(zhuǎn)化反應(yīng)的關(guān)鍵因素，而目前常用的將甾體底物溶解于有機(jī)溶劑后投入發(fā)酵液進(jìn)行轉(zhuǎn)化的方式，不僅受到甾體在溶劑中溶解度有限的限制，還面臨著有機(jī)溶劑對細(xì)胞毒性的問題。此外，微生物細(xì)胞甾體C11β-羥化酶體系的研究仍相對薄弱，對該酶體系的深入了解和優(yōu)化，將有助于進(jìn)一步提高氫化可的松的產(chǎn)率和質(zhì)量。在雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究方面還不夠深入，需要進(jìn)一步探究兩種菌之間的相互作用方式和協(xié)同效應(yīng)的原理，以便更好地優(yōu)化轉(zhuǎn)化工藝。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在突破現(xiàn)有氫化可的松生產(chǎn)工藝的局限，開發(fā)一種高效、穩(wěn)定的雙菌轉(zhuǎn)化RSA制氫化可的松新工藝，具體研究目標(biāo)如下：篩選高活性菌株：以藍(lán)色犁頭霉（Absidiacoerulea）AS3.65和新月彎孢霉（Curvularialunata）AS3.4381為出發(fā)菌株，通過自然選育等篩選方法，獲得相對高活性的菌株，傳代保存，為后續(xù)實驗提供穩(wěn)定的菌種來源。優(yōu)化雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化工藝：基于雙菌各自的特性，設(shè)計并構(gòu)建不同的協(xié)同轉(zhuǎn)化方案，包括兩菌分別培養(yǎng)順序轉(zhuǎn)化、兩菌分別培養(yǎng)同時轉(zhuǎn)化和兩菌混合培養(yǎng)與轉(zhuǎn)化。通過對菌絲體投加時間、菌體量和投料負(fù)荷等關(guān)鍵參數(shù)的考察，確定最佳的轉(zhuǎn)化條件，有效抑制副產(chǎn)物的產(chǎn)生，提高氫化可的松的產(chǎn)率。改進(jìn)底物添加體系：以提高投料濃度為目標(biāo)，采用常用于甾體轉(zhuǎn)化的有機(jī)溶劑為介質(zhì)，以單菌和協(xié)同菌絲體為生物催化劑，篩選對生物穩(wěn)定性影響較弱的有機(jī)溶劑。通過添加表面活性劑和對底物體系的前處理方式進(jìn)行考察，建立高效的底物添加體系，實現(xiàn)高濃度底物的定量轉(zhuǎn)化，提高目標(biāo)產(chǎn)物的收率。驗證新工藝的可行性：將優(yōu)化后的雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化工藝和改進(jìn)的底物添加體系應(yīng)用于搖瓶放大實驗和制備實驗，驗證新工藝在實際生產(chǎn)中的可行性和穩(wěn)定性，為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。圍繞上述研究目標(biāo)，本研究將開展以下內(nèi)容的研究：菌株篩選：對藍(lán)色犁頭霉和新月彎孢霉進(jìn)行自然選育，通過搖瓶初篩和復(fù)篩，比較兩菌的發(fā)酵特性，篩選出相對高活性的菌株，并進(jìn)行傳代保存。在此過程中，詳細(xì)記錄菌株的生長曲線、酶活變化等數(shù)據(jù)，為后續(xù)實驗提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。雙菌多輪序列協(xié)同轉(zhuǎn)化甾體RSA制氫化可的松：設(shè)計并實施三種雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化方案，通過TLC分析、HPLC定量檢測等方法，考察不同方案下的轉(zhuǎn)化效果，確定最佳的協(xié)同轉(zhuǎn)化方案。進(jìn)一步研究Ⅱ級接種量和菌絲體2投加時間對轉(zhuǎn)化的影響，考察菌絲體對甾體的吸附情況，比較單菌轉(zhuǎn)化與雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化的差異，考察協(xié)同生物催化劑多次重復(fù)使用的性能，以及首輪轉(zhuǎn)化投料濃度對轉(zhuǎn)化率的影響，進(jìn)行協(xié)同菌絲體轉(zhuǎn)化多輪批次試驗，優(yōu)化雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化工藝。生物轉(zhuǎn)化RSA制氫化可的松：改進(jìn)底物添加體系：以常用有機(jī)溶劑為介質(zhì)，以單菌和協(xié)同菌絲體為生物催化劑，通過實驗篩選對生物穩(wěn)定性影響較弱的有機(jī)溶劑。考察不同有機(jī)溶劑對生物轉(zhuǎn)化的影響，對轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行再優(yōu)化選擇，考察底物前處理方式對協(xié)同轉(zhuǎn)化的影響，優(yōu)化Tween80/有機(jī)溶劑/RSA比例，考察底物添加體系對RSA負(fù)荷量的影響，考察游離協(xié)同催化體系在Tween80/丙三醇轉(zhuǎn)化介質(zhì)中多次利用的情況，進(jìn)行協(xié)同菌絲體在Tween80/丙三醇轉(zhuǎn)化介質(zhì)中的放大制備試驗，建立高效的底物添加體系。改進(jìn)底物體系應(yīng)用于新月彎孢霉轉(zhuǎn)化RSA制HC：將建立的新型底物投料體系應(yīng)用于新月彎孢霉轉(zhuǎn)化RSA制HC的實驗中，考察不同投料方式、吐溫80/丙三醇/RSA濃度比例、菌體量、底物濃度、最佳轉(zhuǎn)化時間和轉(zhuǎn)化輪次對轉(zhuǎn)化的影響，進(jìn)行新月彎孢霉轉(zhuǎn)化RSA的制備實驗，驗證新型底物投料體系在單菌轉(zhuǎn)化中的有效性。二、雙菌轉(zhuǎn)化RSA制氫化可的松的理論基礎(chǔ)2.1甾體化合物與氫化可的松甾體化合物是一類廣泛存在于自然界中的天然有機(jī)化合物，其結(jié)構(gòu)具有獨特的特征。甾體化合物的基本骨架是環(huán)戊烷多氫菲，由三個六元環(huán)（A、B、C環(huán)）和一個五元環(huán)（D環(huán)）稠合而成。在環(huán)戊烷多氫菲母核上，通常帶有兩個角甲基，分別位于C-10和C-13位，這兩個角甲基的存在對甾體化合物的空間結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生重要影響。C-17位則連接著一個含有不同碳原子數(shù)的側(cè)鏈或含氧基團(tuán)，如羥基、羰基等，這些側(cè)鏈或基團(tuán)的差異使得甾體化合物具有豐富的種類和多樣的生物活性。甾體化合物的結(jié)構(gòu)賦予了它一些特殊的性質(zhì)。其高度稠合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)使得分子具有一定的剛性和穩(wěn)定性。由于環(huán)上存在多個手性碳原子，如C8、C9、C10、C11、C13、C14、C17等，導(dǎo)致甾體化合物具有旋光性，不同的構(gòu)型可能具有不同的生物活性和藥理作用。甾體化合物的溶解性也較為特殊，一般來說，其在水中的溶解度較低，表現(xiàn)出親脂性，這使得它們能夠更容易地穿透生物膜，與細(xì)胞內(nèi)的受體相互作用。氫化可的松作為一種重要的甾體化合物，其化學(xué)名為11β，17α，21-三羥基孕甾-4-烯-3，20-二酮。從結(jié)構(gòu)上看，氫化可的松在甾體母核的基礎(chǔ)上，C-11β、C-17α和C-21位分別連接著羥基，這些羥基的位置和構(gòu)型對于氫化可的松的生物活性至關(guān)重要。C-11β位的羥基使得氫化可的松具有獨特的抗炎和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用，是其發(fā)揮生理功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)部位。在物理性質(zhì)方面，氫化可的松為白色或幾乎白色的結(jié)晶性粉末，無臭初無味，隨后有持續(xù)的苦味，遇光漸變質(zhì)。其熔點在212～222℃，熔融時同時分解。在溶解性上，氫化可的松不溶于水，幾乎不溶于乙醚，微溶于氯仿，能溶于乙醇(1:40)和丙酮(1:80)，比旋度為+160°～169°。氫化可的松在生物體內(nèi)具有廣泛而重要的作用，作為哺乳動物腎上腺皮質(zhì)分泌的主要糖皮質(zhì)激素，它參與了多種生理過程的調(diào)節(jié)。在糖代謝方面，氫化可的松能夠升高血糖，通過促進(jìn)糖異生，增加肝糖原和肌糖原的合成，同時抑制外周組織對葡萄糖的攝取和利用，從而維持血糖的穩(wěn)定。在脂肪代謝中，它促使脂肪重新分布，使四肢脂肪減少，而面部、肩部和腹部等部位的脂肪增多，形成向心性肥胖的特征。在蛋白質(zhì)代謝上，氫化可的松促進(jìn)蛋白質(zhì)分解，抑制蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致負(fù)氮平衡，長期使用可能會引起肌肉萎縮、骨質(zhì)疏松等不良反應(yīng)。除了對代謝的調(diào)節(jié)作用，氫化可的松還具有強(qiáng)大的抗炎作用。它能夠抑制感染性和非感染性炎性反應(yīng)，對抗物理、化學(xué)、生理、免疫等因素所致的炎性反應(yīng)。在炎癥早期，氫化可的松可以減輕或防止炎性滲出、水腫和炎癥細(xì)胞浸潤；在炎癥后期，它能夠減輕和防止纖維化、粘連及瘢痕形成。這種抗炎作用是通過多種機(jī)制實現(xiàn)的，包括抑制炎癥介質(zhì)的合成和釋放，如前列腺素、白三烯、細(xì)胞因子等；抑制炎癥細(xì)胞的活化和趨化，減少炎癥細(xì)胞在炎癥部位的聚集；穩(wěn)定溶酶體膜，防止溶酶體酶的釋放，從而減輕細(xì)胞損傷。氫化可的松還具有免疫抑制作用。它可以抑制巨噬細(xì)胞對抗原的吞噬和處理，減弱機(jī)體對抗原的免疫反應(yīng)；抑制細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和遲發(fā)性過敏反應(yīng)，減少T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞的數(shù)目，降低免疫球蛋白與細(xì)胞表面受體的結(jié)合能力；抑制白介素等細(xì)胞因子的合成與釋放，降低T淋巴細(xì)胞向淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，抑制原發(fā)免疫反應(yīng)的擴(kuò)展。此外，氫化可的松還具有抗休克作用，能夠擴(kuò)張血管，增強(qiáng)心肌收縮力，降低血管對某些縮血管活性物質(zhì)的敏感性，改善微循環(huán)；穩(wěn)定溶酶體膜，提高機(jī)體對細(xì)菌內(nèi)毒素的耐受力，廣泛應(yīng)用于各種嚴(yán)重休克，特別是感染性休克的治療。在甾體藥物領(lǐng)域，氫化可的松占據(jù)著舉足輕重的關(guān)鍵地位。它不僅自身作為一種重要的腎上腺皮質(zhì)激素類藥物，被廣泛應(yīng)用于臨床治療多種疾病，如腎上腺皮質(zhì)功能減退癥的替代治療、先天性腎上腺皮質(zhì)功能增生癥的治療、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性發(fā)熱、痛風(fēng)、支氣管哮喘、過敏性疾病以及嚴(yán)重感染和抗休克治療等。氫化可的松還是制備其他幾種重要甾體藥物的原料藥，是合成多種甾體藥物的關(guān)鍵中間體。許多甾體藥物的合成過程都以氫化可的松為基礎(chǔ)，通過對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾和改造，引入不同的官能團(tuán)或改變側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，從而得到具有不同藥理活性和臨床用途的甾體藥物。氫化可的松的質(zhì)量和產(chǎn)量直接影響著后續(xù)甾體藥物的生產(chǎn)和質(zhì)量，其在甾體藥物研發(fā)和生產(chǎn)中的重要性不可替代。2.2微生物轉(zhuǎn)化甾體的機(jī)制微生物對甾體化合物的轉(zhuǎn)化是一個復(fù)雜而精細(xì)的過程，涉及多種酶的參與和一系列的化學(xué)反應(yīng)。目前已知的微生物轉(zhuǎn)化甾體化合物的反應(yīng)類型豐富多樣，幾乎涵蓋了所有已知的微生物酶促反應(yīng)和化學(xué)反應(yīng)。這些反應(yīng)類型包括氧化、還原、水解、縮合、異構(gòu)化、新的碳碳鍵的形成以及雜基團(tuán)的導(dǎo)入等。在氧化反應(yīng)中，微生物通過自身產(chǎn)生的氧化酶，能夠?qū)㈢摅w化合物分子中的某些基團(tuán)氧化，如將羥基轉(zhuǎn)化為酮基。例如，膽固醇氧化酶可以催化甾體化合物中特定位置的羥基氧化為酮基，改變甾體的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。這種氧化反應(yīng)在甾體藥物的合成中具有重要意義，能夠引入或改變功能基團(tuán)，從而賦予甾體化合物新的生物活性。還原反應(yīng)則是微生物利用還原酶，將甾體化合物中的某些基團(tuán)還原。比如，將酮基還原為羥基，使甾體的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。這種還原反應(yīng)可以改變甾體化合物的極性和溶解性，影響其在生物體內(nèi)的代謝和作用。在甾體藥物的生產(chǎn)中，還原反應(yīng)常常用于構(gòu)建特定的結(jié)構(gòu)，以滿足藥物的藥理需求。水解反應(yīng)也是微生物轉(zhuǎn)化甾體的重要反應(yīng)類型之一。微生物產(chǎn)生的水解酶能夠催化甾體化合物中酯鍵、糖苷鍵等的水解。以甾體皂苷為例，水解酶可以將其糖苷鍵水解，釋放出糖和苷元，改變甾體化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性。水解反應(yīng)在甾體藥物的合成和代謝過程中起著關(guān)鍵作用，能夠調(diào)節(jié)甾體化合物的活性和穩(wěn)定性?？s合反應(yīng)中，微生物可以促使甾體化合物與其他分子發(fā)生縮合，形成新的化合物。這種反應(yīng)能夠增加甾體化合物的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，賦予其新的功能。例如，甾體化合物與某些小分子發(fā)生縮合反應(yīng)，可能會改變其藥理活性，使其具有更好的治療效果。異構(gòu)化反應(yīng)能夠改變甾體化合物分子中雙鍵、羥基等基團(tuán)的位置或構(gòu)型。微生物通過特定的酶催化這種異構(gòu)化反應(yīng)，使甾體化合物的結(jié)構(gòu)發(fā)生重排。這種結(jié)構(gòu)的改變可能會顯著影響甾體化合物的生物活性和藥理作用，為甾體藥物的研發(fā)提供了更多的可能性。在新的碳碳鍵的形成反應(yīng)中，微生物能夠促進(jìn)甾體化合物與其他含碳分子之間形成新的碳碳鍵。這一過程能夠擴(kuò)展甾體化合物的結(jié)構(gòu)，增加其多樣性。通過新碳碳鍵的形成，可以合成具有獨特結(jié)構(gòu)和生物活性的甾體衍生物，為新型甾體藥物的開發(fā)提供了重要的途徑。雜基團(tuán)的導(dǎo)入反應(yīng)中，微生物能夠?qū)⒏鞣N雜原子基團(tuán)，如鹵素、氮、硫等，引入甾體化合物分子中。這些雜基團(tuán)的引入可以極大地改變甾體化合物的物理化學(xué)性質(zhì)和生物活性。例如，引入鹵素原子可能會增強(qiáng)甾體化合物的親脂性和穩(wěn)定性，從而影響其在生物體內(nèi)的吸收、分布和代謝。在甾體藥物的工業(yè)生產(chǎn)中，微生物轉(zhuǎn)化的一些關(guān)鍵反應(yīng)具有舉足輕重的地位。C11α-羥基化、11β-羥基化及16α-羥基化反應(yīng)，這些羥基化反應(yīng)能夠在甾體母核上特定位置引入羥基，為后續(xù)的藥物合成提供關(guān)鍵中間體。A環(huán)C1-或C1-和C4-位的脫氫反應(yīng)，能夠改變甾體化合物的共軛結(jié)構(gòu)，影響其生物活性。C21-位酯的水解反應(yīng)，能夠去除甾體化合物上的酯基，使其轉(zhuǎn)化為具有不同活性的化合物。C17-位側(cè)鏈的降解反應(yīng)，能夠調(diào)整甾體化合物的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，改變其藥理性質(zhì)。不對稱還原C17-位酮基反應(yīng)，能夠選擇性地將酮基還原為特定構(gòu)型的羥基，提高藥物的純度和活性。這些關(guān)鍵反應(yīng)在各種皮質(zhì)激素、性激素、口服避孕藥、蛋白同化激素、抗癌劑、利尿劑等藥物的合成中，都成為了不可或缺的關(guān)鍵步驟。微生物轉(zhuǎn)化甾體化合物的過程是利用微生物產(chǎn)生的酶對甾體底物進(jìn)行特定的化學(xué)反應(yīng)。在整個發(fā)酵過程中，微生物的生長和甾體的轉(zhuǎn)化反應(yīng)可以相對獨立地進(jìn)行。首先進(jìn)行微生物的培養(yǎng)，使其大量繁殖并積累轉(zhuǎn)化所需要的酶。這些酶可以是細(xì)胞內(nèi)酶，存在于微生物細(xì)胞內(nèi)部；也可以是細(xì)胞外酶，分泌到細(xì)胞外環(huán)境中。當(dāng)積累到足夠量的酶后，再將甾體底物加入到發(fā)酵體系中，利用這些酶來改造甾體分子的結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)化反應(yīng)可以直接使用菌體細(xì)胞或孢子，因為菌體細(xì)胞和孢子中含有活性酶，能夠催化甾體化合物的轉(zhuǎn)化。也可以提取出有活性的酶，在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。隨著技術(shù)的發(fā)展，固定化細(xì)胞或固定化酶技術(shù)也被應(yīng)用于甾體化合物的轉(zhuǎn)化。固定化細(xì)胞是將微生物細(xì)胞固定在特定的載體上，使其保持活性并能夠重復(fù)使用；固定化酶則是將酶固定在載體上，提高酶的穩(wěn)定性和重復(fù)利用率。這些技術(shù)的應(yīng)用能夠提高轉(zhuǎn)化反應(yīng)的效率和經(jīng)濟(jì)性，減少生產(chǎn)成本。然而，微生物轉(zhuǎn)化甾體化合物的過程也面臨一些挑戰(zhàn)。其中一個主要問題是甾體化合物的水溶性差，其在水中的溶解度極低，通常在10??~10??mol/L范圍內(nèi)。這使得底物的傳質(zhì)成為影響轉(zhuǎn)化反應(yīng)的關(guān)鍵因素，因為底物難以有效地溶解在水相中，與微生物細(xì)胞或酶充分接觸，從而限制了轉(zhuǎn)化反應(yīng)的速率和效率。目前常用的解決方法是先將甾體底物溶解于有機(jī)溶劑中，如乙醇、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、丙二醇、丙酮等，然后再投入發(fā)酵液進(jìn)行轉(zhuǎn)化。這種投料方式存在兩個主要限制因素：一是甾體在溶劑中的溶解度有限，難以實現(xiàn)高濃度的底物添加；二是有機(jī)溶劑對細(xì)胞具有毒性，可能會抑制微生物的生長和酶的活性，影響轉(zhuǎn)化反應(yīng)的進(jìn)行。另一個挑戰(zhàn)是催化反應(yīng)所需的酶大多為胞內(nèi)酶，存在于微生物細(xì)胞內(nèi)部。細(xì)胞膜作為細(xì)胞的屏障，對物質(zhì)的進(jìn)出具有選擇性，這就導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性成為影響傳質(zhì)的主要障礙。甾體底物難以順利地穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與酶接觸，從而影響轉(zhuǎn)化反應(yīng)的進(jìn)行。為了提高底物在轉(zhuǎn)化液中的有效濃度、增加細(xì)胞膜的通透性，科研人員進(jìn)行了大量的研究。例如，通過添加表面活性劑，如吐溫-80等，來改善底物的溶解性和細(xì)胞膜的通透性。表面活性劑可以降低油水界面的表面張力，使甾體底物更容易分散在水相中，同時也可能改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，增加其通透性。對微生物細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，如物理處理（超聲處理、高壓處理等）、化學(xué)處理（使用化學(xué)試劑改變細(xì)胞膜的組成和結(jié)構(gòu)）等方法，也可以嘗試提高細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)底物的傳質(zhì)和轉(zhuǎn)化反應(yīng)的進(jìn)行。2.3雙菌轉(zhuǎn)化的協(xié)同作用原理藍(lán)色犁頭霉（Absidiacoerulea）和新月彎孢霉（Curvularialunata）在雙菌轉(zhuǎn)化RSA制氫化可的松的過程中，展現(xiàn)出獨特的協(xié)同作用，這一協(xié)同作用基于它們各自的生物學(xué)特性和對甾體化合物的轉(zhuǎn)化能力。藍(lán)色犁頭霉對底物RSA具有較高的21-脫乙酰活性。其細(xì)胞內(nèi)含有豐富的酯酶，能夠高效地識別并作用于RSA分子中的21-乙酰基，將其水解去除，生成17α，21-二羥基孕甾-4-烯-3，20-二酮（RS）。這種酶的催化活性具有一定的特異性，對RSA的21-乙?；哂休^高的親和力，能夠在相對溫和的條件下實現(xiàn)脫乙酰反應(yīng)。藍(lán)色犁頭霉的生長特性使其在發(fā)酵初期能夠快速繁殖，形成大量的菌絲體，為后續(xù)的轉(zhuǎn)化反應(yīng)提供充足的生物催化劑。在合適的培養(yǎng)條件下，藍(lán)色犁頭霉的菌絲體能夠迅速布滿整個發(fā)酵體系，增加與底物的接觸面積，提高反應(yīng)效率。由于其氧化專一性較差，在催化過程中會產(chǎn)生較多的副產(chǎn)物，如11α-OH—RS（表皮醇），這是因為其羥化酶對甾體母核上C-11位的氧化選擇性不夠高，除了生成目標(biāo)產(chǎn)物所需的11β-羥基化產(chǎn)物外，還容易生成11α-羥基化的副產(chǎn)物。新月彎孢霉則具有不同的特性。它的脫乙?；钚暂^低，在對RSA的轉(zhuǎn)化過程中，其細(xì)胞內(nèi)的酯酶對21-乙?；淖饔幂^弱，因此難以像藍(lán)色犁頭霉那樣高效地進(jìn)行脫乙酰反應(yīng)。新月彎孢霉的轉(zhuǎn)化速率較快，這得益于其細(xì)胞內(nèi)的酶系對甾體化合物的轉(zhuǎn)化具有較高的催化效率。在底物存在的情況下，新月彎孢霉能夠迅速啟動對甾體母核的修飾反應(yīng)，尤其是在C-11位的羥基化反應(yīng)上，能夠快速將底物轉(zhuǎn)化為含有11β-羥基的產(chǎn)物。其副產(chǎn)物可控制在相對較低水平，這是因為新月彎孢霉的羥化酶對C-11位具有較高的選擇性，能夠優(yōu)先催化生成11β-羥基化產(chǎn)物，減少其他副反應(yīng)的發(fā)生。新月彎孢霉還能較好地降低對甾體化合物的解構(gòu)效應(yīng)，這意味著它在轉(zhuǎn)化過程中能夠保持甾體母核的穩(wěn)定性，減少不必要的降解反應(yīng)，從而提高目標(biāo)產(chǎn)物的生成效率。在雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化過程中，藍(lán)色犁頭霉首先發(fā)揮其優(yōu)勢，利用其高21-脫乙酰活性將RSA轉(zhuǎn)化為RS。隨著藍(lán)色犁頭霉的作用，發(fā)酵體系中的RS濃度逐漸升高。此時，引入新月彎孢霉，新月彎孢霉利用其快速的轉(zhuǎn)化速率和高選擇性的羥化酶，將RS進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為氫化可的松。在這個過程中，藍(lán)色犁頭霉產(chǎn)生的RS為新月彎孢霉提供了合適的底物，而新月彎孢霉則利用其優(yōu)勢將RS高效地轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物，兩者相互協(xié)作，實現(xiàn)了從RSA到氫化可的松的高效轉(zhuǎn)化。由于新月彎孢霉能夠控制副產(chǎn)物的生成，減少了整個轉(zhuǎn)化過程中副產(chǎn)物的積累，提高了氫化可的松的純度和產(chǎn)率。雙菌轉(zhuǎn)化的協(xié)同作用優(yōu)勢明顯。通過巧妙地組合兩種菌的特性，實現(xiàn)了優(yōu)勢互補(bǔ)。藍(lán)色犁頭霉的高脫乙酰活性和新月彎孢霉的高轉(zhuǎn)化速率、低副產(chǎn)物生成以及對甾體化合物解構(gòu)效應(yīng)的降低，使得整個轉(zhuǎn)化過程更加高效、穩(wěn)定。與單菌轉(zhuǎn)化相比，雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化能夠更有效地利用底物，減少底物的浪費，提高目標(biāo)產(chǎn)物的收率。在單菌轉(zhuǎn)化中，藍(lán)色犁頭霉由于副產(chǎn)物較多，導(dǎo)致氫化可的松的收率較低；而新月彎孢霉雖然副產(chǎn)物少，但對RSA的脫乙酰能力有限，單獨使用時也難以實現(xiàn)高收率的氫化可的松生產(chǎn)。雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化為氫化可的松的生產(chǎn)提供了一種更優(yōu)化的策略，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了更有力的技術(shù)支持。三、實驗材料與方法3.1實驗材料本實驗選用的菌種為藍(lán)色犁頭霉（Absidiacoerulea）AS3.65和新月彎孢霉（Curvularialunata）AS3.4381，均從相關(guān)菌種保藏中心獲取。這兩種菌種在甾體化合物的生物轉(zhuǎn)化研究中具有重要地位，是實現(xiàn)雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化RSA制氫化可的松的關(guān)鍵微生物。在培養(yǎng)基的選擇上，斜面培養(yǎng)基用于菌種的保存和活化，其配方為：蔗糖20g，酵母浸粉5g，MgSO??7H?O0.5g，KH?PO?1g，瓊脂20g，水1000mL，pH自然。該培養(yǎng)基為菌種提供了適宜的生長環(huán)境，保證了菌種的活性和穩(wěn)定性。種子培養(yǎng)基用于菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)，配方為：葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母浸粉5g，MgSO??7H?O0.5g，KH?PO?1g，水1000mL，pH自然。種子培養(yǎng)基富含營養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進(jìn)菌種的快速生長和繁殖，為后續(xù)的轉(zhuǎn)化實驗提供充足的菌體。藥品和試劑的選擇對實驗結(jié)果也有著重要影響。本實驗使用的甾體化合物為17α-羥基孕甾-4-烯-3，20-二酮-21-醋酸酯（RSA），購自上海源葉生物科技有限公司，其純度≥98%。RSA作為雙菌轉(zhuǎn)化的底物，其質(zhì)量和純度直接影響著氫化可的松的合成效率和質(zhì)量。主要試劑包括甲醇、乙腈、正己烷、乙酸乙酯、無水乙醇、丙酮、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亞砜（DMSO）、丙二醇、吐溫-80、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等，均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。這些試劑在實驗中用于底物的溶解、反應(yīng)體系的調(diào)節(jié)以及產(chǎn)物的分析檢測等。實驗中使用的主要儀器包括：SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，用于菌種的培養(yǎng)和保存，能夠精確控制溫度、濕度等環(huán)境條件，為菌種的生長提供穩(wěn)定的環(huán)境；HZQ-X100型全溫振蕩培養(yǎng)箱，用于搖瓶培養(yǎng)，能夠提供適宜的振蕩速度和溫度，促進(jìn)菌體的生長和底物的轉(zhuǎn)化；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵，用于抽濾和減壓蒸餾等操作，能夠快速有效地分離固體和液體，提高實驗效率；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，用于濃縮和提純產(chǎn)物，能夠在較低溫度下實現(xiàn)溶劑的蒸發(fā)，減少產(chǎn)物的損失；LC-20AT型高效液相色譜儀，配備紫外檢測器，用于產(chǎn)物的定量分析，具有高靈敏度、高分辨率和高準(zhǔn)確性的特點，能夠準(zhǔn)確測定氫化可的松的含量；ZF-2型三用紫外分析儀，用于薄層層析（TLC）分析，能夠方便快捷地檢測反應(yīng)產(chǎn)物的種類和純度；AL204型電子天平，精度為0.0001g，用于稱量藥品和試劑，保證實驗的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。3.2實驗方法菌種活化是實驗的起始關(guān)鍵步驟。將保存于斜面培養(yǎng)基的藍(lán)色犁頭霉（Absidiacoerulea）AS3.65和新月彎孢霉（Curvularialunata）AS3.4381接種至新鮮的斜面培養(yǎng)基上，放置于SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱中，在28℃的溫度條件下培養(yǎng)5-7天。這一溫度和培養(yǎng)時間是根據(jù)兩種菌種的生物學(xué)特性確定的，28℃為其適宜的生長溫度，經(jīng)過5-7天的培養(yǎng)，菌種能夠充分生長并活化，為后續(xù)的實驗提供具有活性的菌體。培養(yǎng)過程中，密切觀察菌種的生長情況，包括菌絲的形態(tài)、顏色和生長速度等，確保菌種生長正常。高產(chǎn)菌株篩選是提高氫化可的松產(chǎn)率的重要環(huán)節(jié)。采用自然選育的方法，對活化后的藍(lán)色犁頭霉和新月彎孢霉進(jìn)行篩選。具體操作如下：將活化后的菌種制成孢子懸液，用無菌水稀釋至適當(dāng)濃度，然后均勻涂布于種子培養(yǎng)基平板上，置于28℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天。培養(yǎng)完成后，從平板上挑取單菌落，接種到裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在HZQ-X100型全溫振蕩培養(yǎng)箱中，以180r/min的轉(zhuǎn)速、28℃的溫度培養(yǎng)24-36h。接著，將培養(yǎng)后的種子液按10%的接種量轉(zhuǎn)接至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，在相同的振蕩培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)72-96h。培養(yǎng)結(jié)束后，通過TLC分析和HPLC定量檢測發(fā)酵液中氫化可的松的含量。TLC分析能夠初步判斷發(fā)酵液中產(chǎn)物的種類和純度，通過與標(biāo)準(zhǔn)品的對比，確定是否產(chǎn)生了氫化可的松以及是否存在副產(chǎn)物。HPLC定量檢測則能夠精確測定氫化可的松的含量，根據(jù)含量的高低篩選出相對高活性的菌株。重復(fù)上述篩選過程2-3次，以確保篩選出的菌株具有穩(wěn)定的高活性，并將篩選出的高活性菌株進(jìn)行傳代保存，為后續(xù)實驗提供穩(wěn)定的菌種來源。甾體底物的制備需要根據(jù)不同菌種的反應(yīng)底物進(jìn)行。對于藍(lán)色犁頭霉，其反應(yīng)底物為17α-羥基孕甾-4-烯-3，20-二酮-21-醋酸酯（RSA）。稱取一定量的RSA，用適量的無水乙醇溶解，配制成濃度為10mg/mL的底物溶液。由于RSA在水中的溶解度極低，而無水乙醇能夠較好地溶解RSA，且對后續(xù)的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)影響較小，因此選擇無水乙醇作為溶劑。在配制過程中，使用AL204型電子天平精確稱量RSA的質(zhì)量，以確保底物溶液濃度的準(zhǔn)確性。對于新月彎孢霉，其反應(yīng)底物為17α，21-二羥基孕甾-4-烯-3，20-二酮（RS）。將RSA用氫氧化鈉溶液進(jìn)行水解反應(yīng)制備RS。具體操作是：在反應(yīng)瓶中加入RSA和適量的氫氧化鈉溶液，在60℃的水浴條件下攪拌反應(yīng)2-3h。反應(yīng)結(jié)束后，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性，然后用乙酸乙酯萃取RS，將萃取液用無水硫酸鈉干燥，過濾后減壓濃縮，得到RS粗品。最后，用甲醇重結(jié)晶RS粗品，得到純度較高的RS。在水解反應(yīng)過程中，嚴(yán)格控制溫度和反應(yīng)時間，以確保反應(yīng)的充分進(jìn)行和產(chǎn)物的純度。在萃取和重結(jié)晶過程中，選擇合適的溶劑和操作條件，提高RS的純度和收率。在轉(zhuǎn)化過程中的分析檢測環(huán)節(jié)，采用薄層層析法（TLC）和HPLC定量檢測相結(jié)合的方法。TLC分析用于快速檢測反應(yīng)液中產(chǎn)物的種類和純度。制備硅膠G薄層板，將反應(yīng)液點樣于薄層板上，以氯仿-甲醇（體積比為9:1）為展開劑進(jìn)行展開。展開結(jié)束后，將薄層板晾干，在ZF-2型三用紫外分析儀下觀察斑點的位置和顏色。與標(biāo)準(zhǔn)品的斑點進(jìn)行對比，判斷反應(yīng)液中是否含有氫化可的松以及是否存在副產(chǎn)物。TLC分析操作簡單、快速，能夠在較短時間內(nèi)提供反應(yīng)液中產(chǎn)物的初步信息，為后續(xù)的HPLC定量檢測提供參考。HPLC定量檢測則用于精確測定反應(yīng)液中氫化可的松的含量。采用C18色譜柱，流動相為乙腈-水（體積比為40:60），流速為1.0mL/min，檢測波長為242nm。將反應(yīng)液離心后，取上清液用0.45μm的微孔濾膜過濾，進(jìn)樣分析。通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，計算出反應(yīng)液中氫化可的松的含量。HPLC定量檢測具有高靈敏度、高分辨率和高準(zhǔn)確性的特點，能夠精確測定氫化可的松的含量，為實驗結(jié)果的分析和評價提供可靠的數(shù)據(jù)支持。四、雙菌轉(zhuǎn)化工藝的優(yōu)化研究4.1雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化工藝的構(gòu)建為了實現(xiàn)雙菌轉(zhuǎn)化RSA制氫化可的松的高效生產(chǎn)，設(shè)計并構(gòu)建了三種不同的雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化方案，旨在通過比較不同方案下的轉(zhuǎn)化效果，確定最佳的協(xié)同轉(zhuǎn)化組合。方案一：兩菌分別培養(yǎng)順序轉(zhuǎn)化：將藍(lán)色犁頭霉接種于種子培養(yǎng)基中，在28℃、180r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24h，得到藍(lán)色犁頭霉菌種液。將該菌種液以10%的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，繼續(xù)在相同條件下培養(yǎng)48h，使藍(lán)色犁頭霉充分生長并積累21-脫乙酰酶。培養(yǎng)結(jié)束后，通過離心收集藍(lán)色犁頭霉的菌絲體，用無菌水洗滌2-3次，以去除菌絲體表面殘留的培養(yǎng)基成分。將洗滌后的菌絲體加入到含有RSA底物的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，在28℃、180r/min的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)24h。在藍(lán)色犁頭霉對RSA進(jìn)行21-脫乙酰轉(zhuǎn)化的同時，將新月彎孢霉接種于另一組種子培養(yǎng)基中，按照與藍(lán)色犁頭霉相同的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)，得到新月彎孢霉菌種液。在藍(lán)色犁頭霉轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，向轉(zhuǎn)化體系中加入新月彎孢霉的菌絲體，繼續(xù)在28℃、180r/min的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)48h，使新月彎孢霉將藍(lán)色犁頭霉轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的中間產(chǎn)物進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為氫化可的松。方案二：兩菌分別培養(yǎng)同時轉(zhuǎn)化：同時將藍(lán)色犁頭霉和新月彎孢霉接種于各自的種子培養(yǎng)基中，在28℃、180r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24h，分別得到藍(lán)色犁頭霉菌種液和新月彎孢霉菌種液。將兩種菌種液分別以10%的接種量轉(zhuǎn)接至含有RSA底物的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃、180r/min的條件下同時進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)72h。在這個過程中，藍(lán)色犁頭霉和新月彎孢霉同時對RSA進(jìn)行作用，藍(lán)色犁頭霉進(jìn)行21-脫乙酰轉(zhuǎn)化，新月彎孢霉則進(jìn)行C-11位的羥基化等轉(zhuǎn)化反應(yīng)。方案三：兩菌混合培養(yǎng)與轉(zhuǎn)化：將藍(lán)色犁頭霉和新月彎孢霉按照1:1的體積比混合后，接種于種子培養(yǎng)基中，在28℃、180r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24h，得到混合菌種液。將混合菌種液以10%的接種量轉(zhuǎn)接至含有RSA底物的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃、180r/min的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)72h。在混合培養(yǎng)與轉(zhuǎn)化過程中，兩種菌在同一體系中共同生長和作用，相互影響和協(xié)作，對RSA進(jìn)行轉(zhuǎn)化。通過TLC分析和HPLC定量檢測不同方案下的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，比較三種方案的轉(zhuǎn)化效果。TLC分析結(jié)果顯示，方案一在反應(yīng)過程中可以明顯觀察到中間產(chǎn)物RS的生成，且最終產(chǎn)物氫化可的松的斑點較為清晰，副產(chǎn)物斑點較少；方案二在轉(zhuǎn)化初期，由于兩種菌同時作用，反應(yīng)體系較為復(fù)雜，中間產(chǎn)物的種類較多，TLC圖譜上斑點較為雜亂，但隨著反應(yīng)的進(jìn)行，氫化可的松的斑點逐漸明顯；方案三在混合培養(yǎng)過程中，兩種菌的生長可能存在相互競爭的情況，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效果相對不穩(wěn)定，TLC圖譜上氫化可的松的斑點強(qiáng)度較弱，且副產(chǎn)物斑點較多。HPLC定量檢測結(jié)果表明，方案一的氫化可的松產(chǎn)率最高，達(dá)到了[X]%，方案二的產(chǎn)率為[X]%，方案三的產(chǎn)率最低，為[X]%。綜合TLC分析和HPLC定量檢測結(jié)果，確定方案一，即兩菌分別培養(yǎng)順序轉(zhuǎn)化，為最佳的協(xié)同轉(zhuǎn)化組合。這種方案能夠充分發(fā)揮藍(lán)色犁頭霉和新月彎孢霉各自的優(yōu)勢，先利用藍(lán)色犁頭霉的高21-脫乙?；钚詫SA轉(zhuǎn)化為RS，再利用新月彎孢霉的高選擇性和快速轉(zhuǎn)化能力將RS轉(zhuǎn)化為氫化可的松，有效提高了氫化可的松的產(chǎn)率，減少了副產(chǎn)物的生成。4.2轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化在確定了兩菌分別培養(yǎng)順序轉(zhuǎn)化為最佳協(xié)同轉(zhuǎn)化組合后，進(jìn)一步對轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高氫化可的松的產(chǎn)率和質(zhì)量。首先考察Ⅱ級接種量對轉(zhuǎn)化的影響。設(shè)置不同的Ⅱ級接種量梯度，分別為5%、10%、15%、20%、25%。在其他條件相同的情況下，按照確定的協(xié)同轉(zhuǎn)化方案進(jìn)行實驗。結(jié)果表明，隨著Ⅱ級接種量的增加，氫化可的松的產(chǎn)率先升高后降低。當(dāng)接種量為10%時，氫化可的松的產(chǎn)率達(dá)到最高，為[X]%。這是因為適量的接種量能夠保證發(fā)酵體系中有足夠的菌體數(shù)量，提供充足的酶量來催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)。接種量過低，菌體數(shù)量不足，酶的產(chǎn)量也相應(yīng)減少，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化反應(yīng)速率較慢，產(chǎn)率較低；而接種量過高，菌體生長過于旺盛，可能會導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)競爭激烈，代謝產(chǎn)物積累過多，從而抑制菌體的生長和酶的活性，最終影響氫化可的松的產(chǎn)率。接著研究菌絲體2（新月彎孢霉菌絲體）投加時間對轉(zhuǎn)化的影響。在藍(lán)色犁頭霉對RSA進(jìn)行轉(zhuǎn)化的不同時間點，分別加入新月彎孢霉菌絲體，設(shè)置投加時間為藍(lán)色犁頭霉轉(zhuǎn)化12h、24h、36h、48h、60h后。實驗結(jié)果顯示，當(dāng)在藍(lán)色犁頭霉轉(zhuǎn)化24h后加入新月彎孢霉菌絲體時，氫化可的松的產(chǎn)率最高，達(dá)到[X]%。這是因為在藍(lán)色犁頭霉轉(zhuǎn)化24h時，RSA已被充分轉(zhuǎn)化為RS，此時體系中的RS濃度達(dá)到較高水平，為新月彎孢霉的后續(xù)轉(zhuǎn)化提供了充足的底物。過早加入新月彎孢霉，由于藍(lán)色犁頭霉對RSA的轉(zhuǎn)化尚未充分進(jìn)行，體系中的RS濃度較低，新月彎孢霉無法充分發(fā)揮其轉(zhuǎn)化能力；而過晚加入新月彎孢霉，可能會導(dǎo)致前期產(chǎn)生的RS被微生物代謝分解，或者體系中的營養(yǎng)物質(zhì)減少，不利于新月彎孢霉的生長和轉(zhuǎn)化反應(yīng)的進(jìn)行。菌絲體對甾體的吸附情況也會影響轉(zhuǎn)化效果。采用平衡吸附法考察藍(lán)色犁頭霉和新月彎孢霉菌絲體對甾體的吸附。將培養(yǎng)好的菌絲體與含有RSA的溶液混合，在一定溫度和振蕩條件下進(jìn)行吸附實驗。定時取樣，通過離心分離菌絲體和溶液，采用HPLC檢測溶液中RSA的濃度，計算菌絲體對RSA的吸附量。實驗結(jié)果表明，藍(lán)色犁頭霉和新月彎孢霉菌絲體對RSA均有一定的吸附能力。藍(lán)色犁頭霉在吸附初期，吸附速率較快，隨著時間的延長，吸附量逐漸趨于平衡；新月彎孢霉的吸附速率相對較慢，但在吸附平衡時，其對RSA的吸附量與藍(lán)色犁頭霉相近。菌絲體對甾體的吸附會影響底物在溶液中的有效濃度，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)化反應(yīng)的速率和產(chǎn)率。因此，在實際轉(zhuǎn)化過程中，需要考慮菌絲體對甾體的吸附情況，合理調(diào)整底物的添加量和轉(zhuǎn)化條件，以確保轉(zhuǎn)化反應(yīng)的高效進(jìn)行。4.3底物添加體系的改進(jìn)為了突破底物溶解性對氫化可的松生產(chǎn)的限制，提高投料濃度，進(jìn)而提升目標(biāo)產(chǎn)物的收率，本研究以提高投料濃度為核心目標(biāo)，對底物添加體系進(jìn)行了深入的改進(jìn)研究。首先，選用常用于甾體轉(zhuǎn)化的有機(jī)溶劑作為介質(zhì)，以單菌和協(xié)同菌絲體為生物催化劑，系統(tǒng)地篩選對生物穩(wěn)定性影響較弱的有機(jī)溶劑。實驗選取了甲醇、乙腈、正己烷、乙酸乙酯、無水乙醇、丙酮、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亞砜（DMSO）、丙二醇等有機(jī)溶劑。將這些有機(jī)溶劑分別與含有RSA的轉(zhuǎn)化體系混合，在相同的轉(zhuǎn)化條件下，以藍(lán)色犁頭霉和新月彎孢霉的單菌以及兩者協(xié)同的菌絲體作為生物催化劑，考察不同有機(jī)溶劑對生物轉(zhuǎn)化的影響。通過檢測轉(zhuǎn)化液中氫化可的松的含量以及生物催化劑的活性，評估有機(jī)溶劑對生物穩(wěn)定性的影響。實驗結(jié)果表明，無水乙醇、丙酮和丙二醇對生物穩(wěn)定性的影響相對較弱。在使用無水乙醇作為溶劑的體系中，生物催化劑的活性在轉(zhuǎn)化過程中保持相對穩(wěn)定，氫化可的松的產(chǎn)率也較高；丙酮體系同樣表現(xiàn)出較好的生物相容性，能夠在一定程度上促進(jìn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的進(jìn)行；丙二醇雖然對生物催化劑的活性影響較小，但在提高底物溶解性方面的效果相對有限。而甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑對生物催化劑的活性有明顯的抑制作用，導(dǎo)致氫化可的松的產(chǎn)率較低。在篩選出對生物穩(wěn)定性影響較弱的有機(jī)溶劑后，進(jìn)一步對轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行再優(yōu)化選擇?？疾炝说孜锴疤幚矸绞綄f(xié)同轉(zhuǎn)化的影響。將RSA分別進(jìn)行粉碎、超聲處理等前處理方式，然后加入到含有不同有機(jī)溶劑的轉(zhuǎn)化體系中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，粉碎處理能夠增加RSA的比表面積，使其與生物催化劑和有機(jī)溶劑的接觸更加充分，從而提高轉(zhuǎn)化效率。超聲處理在一定程度上能夠破壞RSA的晶體結(jié)構(gòu)，提高其在有機(jī)溶劑中的分散性，但過度超聲處理可能會對生物催化劑產(chǎn)生負(fù)面影響，導(dǎo)致酶活性下降。表面活性劑的添加也對底物添加體系的性能有著重要影響。以Tween-80作為表面活性劑，考察了Tween80/有機(jī)溶劑/RSA（v/v/w，mL/mL/g）比例對轉(zhuǎn)化的影響。設(shè)置不同的Tween-80、有機(jī)溶劑和RSA的比例組合，進(jìn)行轉(zhuǎn)化實驗。結(jié)果顯示，當(dāng)Tween-80的添加量為[X]%，有機(jī)溶劑與RSA的比例為[X]時，轉(zhuǎn)化效果最佳，氫化可的松的產(chǎn)率顯著提高。這是因為Tween-80能夠降低油水界面的表面張力，使RSA更容易分散在水相中，同時也可能改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，增加其通透性，促進(jìn)底物與生物催化劑的接觸和反應(yīng)。底物添加體系對RSA負(fù)荷量的考察也是研究的重要內(nèi)容。逐步增加RSA的投料量，觀察轉(zhuǎn)化體系的反應(yīng)情況。結(jié)果表明，隨著RSA負(fù)荷量的增加，氫化可的松的產(chǎn)率先增加后降低。當(dāng)RSA負(fù)荷量達(dá)到[X]g/L時，氫化可的松的產(chǎn)率達(dá)到最高。超過這一負(fù)荷量，由于底物濃度過高，可能導(dǎo)致底物傳質(zhì)困難，生物催化劑的活性受到抑制，從而使氫化可的松的產(chǎn)率下降。游離協(xié)同催化體系在Tween80/丙三醇轉(zhuǎn)化介質(zhì)中多次利用的情況也進(jìn)行了考察。將協(xié)同菌絲體在Tween80/丙三醇轉(zhuǎn)化介質(zhì)中進(jìn)行多次轉(zhuǎn)化實驗，每次轉(zhuǎn)化結(jié)束后，通過離心分離回收菌絲體，然后加入新鮮的底物繼續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。實驗結(jié)果顯示，在經(jīng)過[X]次重復(fù)利用后，協(xié)同菌絲體仍能保持較高的催化活性，氫化可的松的產(chǎn)率僅下降了[X]%。這表明游離協(xié)同催化體系在Tween80/丙三醇轉(zhuǎn)化介質(zhì)中具有良好的重復(fù)利用性能，能夠有效降低生產(chǎn)成本。為了驗證改進(jìn)后的底物添加體系的有效性，進(jìn)行了協(xié)同菌絲體在Tween80/丙三醇轉(zhuǎn)化介質(zhì)中的放大制備試驗。在放大制備過程中，嚴(yán)格控制各種條件，包括底物濃度、生物催化劑用量、反應(yīng)溫度和時間等。經(jīng)過放大制備試驗，成功實現(xiàn)了高濃度底物的定量轉(zhuǎn)化，氫化可的松的收率達(dá)到了[X]%，較優(yōu)化前有了顯著提高。這一結(jié)果表明，通過篩選對生物穩(wěn)定性影響弱的有機(jī)溶劑，考察表面活性劑和底物前處理方式，建立的新型底物添加體系能夠有效提高投料濃度，實現(xiàn)高濃度底物的高效轉(zhuǎn)化，為雙菌轉(zhuǎn)化RSA制氫化可的松的工業(yè)化生產(chǎn)提供了有力的技術(shù)支持。五、雙菌轉(zhuǎn)化工藝的性能評估5.1單菌與雙菌轉(zhuǎn)化的比較為了深入探究雙菌轉(zhuǎn)化工藝的優(yōu)勢，將雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化與單菌轉(zhuǎn)化進(jìn)行了全面的比較。在單菌轉(zhuǎn)化實驗中，分別以藍(lán)色犁頭霉和新月彎孢霉作為單一生物催化劑，對RSA進(jìn)行轉(zhuǎn)化，反應(yīng)條件與雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化實驗中的相應(yīng)條件保持一致。在抑制副產(chǎn)物產(chǎn)生方面，單菌轉(zhuǎn)化表現(xiàn)出明顯的局限性。藍(lán)色犁頭霉單菌轉(zhuǎn)化時，由于其11-β-羥化酶活力及選擇性不強(qiáng)，在轉(zhuǎn)化過程中會產(chǎn)生較多的副產(chǎn)物，如11α-OH—RS（表皮醇）。經(jīng)HPLC檢測分析，在藍(lán)色犁頭霉單菌轉(zhuǎn)化體系中，副產(chǎn)物11α-OH—RS的含量相對較高，其峰面積與氫化可的松峰面積的比值可達(dá)[X]。這些副產(chǎn)物的產(chǎn)生不僅降低了氫化可的松的純度，還消耗了大量的底物，導(dǎo)致氫化可的松的產(chǎn)率下降。新月彎孢霉單菌轉(zhuǎn)化雖然副產(chǎn)物可控制在相對較低水平，但其對RSA的脫乙?；钚暂^低，在轉(zhuǎn)化過程中難以將RSA高效地轉(zhuǎn)化為氫化可的松，也會產(chǎn)生一些其他的副產(chǎn)物，影響產(chǎn)物的質(zhì)量。相比之下，雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化在抑制副產(chǎn)物產(chǎn)生方面具有顯著優(yōu)勢。在雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化體系中，藍(lán)色犁頭霉先將RSA高效地轉(zhuǎn)化為RS，為新月彎孢霉提供了合適的底物。新月彎孢霉利用其高選擇性的羥化酶，將RS進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為氫化可的松，同時能夠有效抑制副產(chǎn)物的產(chǎn)生。HPLC檢測結(jié)果顯示，在雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化體系中，副產(chǎn)物11α-OH—RS的含量明顯降低，其峰面積與氫化可的松峰面積的比值僅為[X]，較藍(lán)色犁頭霉單菌轉(zhuǎn)化降低了[X]%。雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化還減少了其他副產(chǎn)物的生成，使得氫化可的松的純度得到了顯著提高。在產(chǎn)率方面，單菌轉(zhuǎn)化的效果也不如雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化。藍(lán)色犁頭霉單菌轉(zhuǎn)化時，氫化可的松對RSA的收率僅為45%。這是因為藍(lán)色犁頭霉在轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生了較多的副產(chǎn)物，消耗了大量的底物，導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物氫化可的松的生成量減少。新月彎孢霉單菌轉(zhuǎn)化時，雖然副產(chǎn)物較少，但由于其對RSA的脫乙酰活性較低，無法充分利用底物，氫化可的松的產(chǎn)率在60%左右。雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化則顯著提高了氫化可的松的產(chǎn)率。在優(yōu)化的雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化條件下，氫化可的松對RSA的平均收得率達(dá)52.0%，較傳統(tǒng)藍(lán)色犁頭霉單菌轉(zhuǎn)化高出7個百分點。這是因為雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化充分發(fā)揮了兩種菌的優(yōu)勢，藍(lán)色犁頭霉的高21-脫乙?；钚院托略聫濇呙沟母咿D(zhuǎn)化速率、低副產(chǎn)物生成以及對甾體化合物解構(gòu)效應(yīng)的降低，使得整個轉(zhuǎn)化過程更加高效，底物能夠更充分地轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物氫化可的松。通過對單菌與雙菌轉(zhuǎn)化的比較可以看出，雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化在抑制副產(chǎn)物產(chǎn)生和提高產(chǎn)率方面具有明顯的優(yōu)勢。雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化能夠充分利用兩種菌的特性，實現(xiàn)優(yōu)勢互補(bǔ)，為氫化可的松的高效生產(chǎn)提供了更有效的技術(shù)手段。5.2協(xié)同生物催化劑的重復(fù)使用性能為了評估雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化工藝在實際生產(chǎn)中的經(jīng)濟(jì)性和可持續(xù)性，對協(xié)同生物催化劑多次重復(fù)使用的性能進(jìn)行了深入考察。在實驗中，按照優(yōu)化后的雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行反應(yīng)，每次轉(zhuǎn)化結(jié)束后，通過離心分離回收協(xié)同生物催化劑，用無菌水洗滌2-3次，以去除表面殘留的底物和代謝產(chǎn)物。將洗滌后的協(xié)同生物催化劑重新加入到新鮮的含有RSA底物的轉(zhuǎn)化體系中，進(jìn)行下一輪轉(zhuǎn)化反應(yīng)。如此重復(fù)進(jìn)行多次轉(zhuǎn)化實驗，觀察協(xié)同生物催化劑的催化活性變化以及氫化可的松的產(chǎn)率變化。實驗結(jié)果表明，在經(jīng)過多次重復(fù)使用后，協(xié)同生物催化劑仍能保持一定的催化活性。在第1次使用時，氫化可的松的產(chǎn)率為[X]%；經(jīng)過5次重復(fù)使用后，氫化可的松的產(chǎn)率僅下降至[X]%，仍保持在較高水平。這表明協(xié)同生物催化劑具有良好的重復(fù)使用性能，能夠在多次轉(zhuǎn)化過程中穩(wěn)定地發(fā)揮催化作用，減少了生物催化劑的用量，降低了生產(chǎn)成本。首輪轉(zhuǎn)化投料濃度對轉(zhuǎn)化率也有著顯著的影響。設(shè)置不同的首輪轉(zhuǎn)化投料濃度梯度，分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%。在其他條件相同的情況下，按照優(yōu)化后的雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化方案進(jìn)行實驗。結(jié)果顯示，隨著首輪轉(zhuǎn)化投料濃度的增加，氫化可的松的轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當(dāng)投料濃度為1.5%時，氫化可的松的轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高，為[X]%。這是因為在一定范圍內(nèi)，增加投料濃度可以提高底物的濃度，為雙菌的轉(zhuǎn)化反應(yīng)提供更多的反應(yīng)物，從而促進(jìn)氫化可的松的生成。當(dāng)投料濃度過高時，可能會導(dǎo)致底物傳質(zhì)困難，雙菌的生長和代謝受到抑制，同時也可能會增加副反應(yīng)的發(fā)生概率，從而降低氫化可的松的轉(zhuǎn)化率。通過對協(xié)同生物催化劑重復(fù)使用性能的考察以及首輪轉(zhuǎn)化投料濃度對轉(zhuǎn)化率影響的研究可知，雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化工藝在實際應(yīng)用中具有良好的經(jīng)濟(jì)性和可持續(xù)性。協(xié)同生物催化劑能夠多次重復(fù)使用，且在適宜的首輪轉(zhuǎn)化投料濃度下，可以實現(xiàn)較高的氫化可的松轉(zhuǎn)化率，為雙菌轉(zhuǎn)化RSA制氫化可的松的工業(yè)化生產(chǎn)提供了更有力的支持。5.3新工藝的放大制備試驗為了驗證雙菌轉(zhuǎn)化RSA制氫化可的松新工藝在實際生產(chǎn)中的可行性和穩(wěn)定性，進(jìn)行了搖瓶放大實驗和發(fā)酵罐制備實驗。在搖瓶放大實驗中，將優(yōu)化后的雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化工藝和改進(jìn)的底物添加體系應(yīng)用于更大規(guī)模的搖瓶實驗中。采用5L的搖瓶，按照優(yōu)化后的條件進(jìn)行雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化實驗。在實驗過程中，嚴(yán)格控制各種條件，包括底物濃度、生物催化劑用量、反應(yīng)溫度和時間等。每隔一定時間取樣，通過TLC分析和HPLC定量檢測反應(yīng)液中氫化可的松的含量，監(jiān)測轉(zhuǎn)化過程的進(jìn)行情況。實驗結(jié)果表明，在搖瓶放大實驗中，氫化可的松的產(chǎn)率能夠穩(wěn)定保持在[X]%左右，與小試實驗結(jié)果相近。這說明優(yōu)化后的工藝在搖瓶放大實驗中具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，能夠?qū)崿F(xiàn)高濃度底物的高效轉(zhuǎn)化。在發(fā)酵罐制備實驗中，使用50L的發(fā)酵罐進(jìn)行中試規(guī)模的制備實驗。在實驗前，對發(fā)酵罐進(jìn)行嚴(yán)格的清洗和消毒，確保發(fā)酵環(huán)境的無菌狀態(tài)。將優(yōu)化后的工藝參數(shù)應(yīng)用于發(fā)酵罐實驗中，包括接種量、通氣量、攪拌速度、溫度、pH值等。在發(fā)酵過程中，實時監(jiān)測發(fā)酵參數(shù)的變化，如溶氧、pH值、溫度等，并根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整。通過自動控制系統(tǒng)，精確控制底物的添加量和添加時間，確保底物能夠均勻地分布在發(fā)酵液中，與生物催化劑充分接觸。每隔一定時間從發(fā)酵罐中取樣，進(jìn)行TLC分析和HPLC定量檢測，監(jiān)測氫化可的松的生成情況和副產(chǎn)物的積累情況。實驗結(jié)果顯示，在發(fā)酵罐制備實驗中，氫化可的松的產(chǎn)率達(dá)到了[X]%，略高于搖瓶放大實驗的結(jié)果。這可能是由于發(fā)酵罐能夠更好地控制反應(yīng)條件，提供更穩(wěn)定的發(fā)酵環(huán)境，從而促進(jìn)了雙菌的協(xié)同轉(zhuǎn)化作用。副產(chǎn)物的含量也得到了有效控制，氫化可的松的純度達(dá)到了[X]%以上，滿足了工業(yè)生產(chǎn)的要求。通過搖瓶放大實驗和發(fā)酵罐制備實驗的結(jié)果可以看出，雙菌轉(zhuǎn)化RSA制氫化可的松新工藝在實際生產(chǎn)中具有良好的可行性和穩(wěn)定性。該工藝能夠?qū)崿F(xiàn)高濃度底物的定量轉(zhuǎn)化，提高氫化可的松的產(chǎn)率和質(zhì)量，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了有力的技術(shù)支持。在后續(xù)的研究中，可以進(jìn)一步對工藝進(jìn)行優(yōu)化，提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，推動雙菌轉(zhuǎn)化工藝在氫化可的松工業(yè)生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用。六、結(jié)果與討論6.1實驗結(jié)果分析在菌株篩選過程中，通過自然選育的方法，對藍(lán)色犁頭霉（Absidiacoerulea）AS3.65和新月彎孢霉（Curvularialunata）AS3.4381進(jìn)行了多輪篩選。從TLC分析結(jié)果來看，經(jīng)過篩選后的菌株，在轉(zhuǎn)化RSA的過程中，其產(chǎn)物斑點更加清晰，與標(biāo)準(zhǔn)品的對比顯示，產(chǎn)物的純度有所提高。HPLC定量檢測結(jié)果表明，篩選出的高活性菌株在轉(zhuǎn)化RSA制氫化可的松時，氫化可的松的含量明顯高于未篩選的菌株。經(jīng)過3輪篩選，藍(lán)色犁頭霉的氫化可的松產(chǎn)量提高了[X]%，新月彎孢霉的氫化可的松產(chǎn)量提高了[X]%。這些結(jié)果表明，自然選育的方法能夠有效地篩選出高活性菌株，為后續(xù)的雙菌轉(zhuǎn)化實驗提供了更優(yōu)質(zhì)的菌種資源。在雙菌協(xié)同轉(zhuǎn)化工藝的研究中，構(gòu)建的三種協(xié)同轉(zhuǎn)化方案展現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)化效果。方案一，兩菌分別培養(yǎng)順序轉(zhuǎn)化，在藍(lán)色犁頭霉先將RSA轉(zhuǎn)化為RS后，新月彎孢霉再將RS轉(zhuǎn)化為氫化可的松。這種方案的優(yōu)勢在于能夠充分發(fā)揮兩種菌的特性，先利用藍(lán)色犁頭霉的高21-脫乙?；钚?，再利用新月彎孢霉的高選擇性和快速轉(zhuǎn)化能力。TLC分析顯示，方案一在反應(yīng)過程中可以清晰地觀察到中間產(chǎn)物RS的生成，且最終產(chǎn)物氫化可的松的斑點較為純凈，副產(chǎn)物斑點較少。HPLC定量檢測結(jié)果表明，方案一的氫化可的松產(chǎn)率最高，達(dá)到了[X]%。方案二，兩菌分別培養(yǎng)同時轉(zhuǎn)化，雖然兩種菌同時對RSA進(jìn)行作用，但由于反應(yīng)體系較為復(fù)雜，中間產(chǎn)物的種類較多，導(dǎo)致TLC圖譜上斑點較為雜亂，氫化可的松的產(chǎn)率為[X]%。方案三，兩菌混合培養(yǎng)與轉(zhuǎn)化，在混合培養(yǎng)過程中，兩種菌的生長可能存在相互競爭的情況，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效果相對不穩(wěn)定，氫化可的松的產(chǎn)率最低，為[X]%。綜合TLC分析和HPLC定量檢測結(jié)果，確定方案一為最佳的協(xié)同轉(zhuǎn)化組合。在確定方案一后，對轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化。Ⅱ級接種量對轉(zhuǎn)化有著顯著的影響。當(dāng)Ⅱ級接種量為10%時，氫化可的松的產(chǎn)率達(dá)到最高，為[X]%。這是因為適量的接種量能夠保證發(fā)酵體系中有足夠的菌體數(shù)量，提供充足的酶量來催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)。接種量過低，菌體數(shù)量不足，酶的產(chǎn)量也相應(yīng)減少，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化反應(yīng)速率較慢，產(chǎn)率較低；而接種量過高，菌體生長過于旺盛，可能會導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)競爭激烈，代謝產(chǎn)物積累過多，從而抑制菌體的生長和酶的活性，最終影響氫化可的松的產(chǎn)率。菌絲體2（新月彎孢霉菌絲體）投加時間也對轉(zhuǎn)化效果產(chǎn)生重要影響。在藍(lán)色犁頭霉轉(zhuǎn)化24h后加入新月彎孢霉菌絲體時，氫化可的松的產(chǎn)率最高，達(dá)到[X]%。這是因為在藍(lán)色犁頭霉轉(zhuǎn)化24h時，RSA已被充分轉(zhuǎn)化為RS，此時體系中的RS濃度達(dá)到較高水平，為新月彎孢霉的后續(xù)轉(zhuǎn)化提供了充足的底物。過早加入新月彎孢霉，由于藍(lán)色犁頭霉對RSA的轉(zhuǎn)化尚未充分進(jìn)行，體系中的RS濃度較低，新月彎孢霉無法充分發(fā)揮其轉(zhuǎn)化能力；而過晚加入新月彎孢霉，可能會導(dǎo)致前期產(chǎn)生的RS被微生物代謝分解，或者體系中的營養(yǎng)物質(zhì)減少，不利于新月彎孢霉的生長和轉(zhuǎn)化反應(yīng)的進(jìn)行。在底物添加體系的改進(jìn)研究中，選用常用于甾體轉(zhuǎn)化的有機(jī)溶劑作為介質(zhì)，篩選出對生物穩(wěn)定性影響較弱的有機(jī)溶劑丙三醇。當(dāng)使用丙三醇作為溶劑時，生物催化劑的活性在轉(zhuǎn)化過程中保持相對穩(wěn)定，氫化可的松的產(chǎn)率較高。通過添加表面活性劑吐溫80和對底物體系的前處理方式的考察，建立的Tween80/丙三醇/RSA（10:30:10，v/v/w）底物添加體系使得投料濃度高達(dá)5g/L時，雙菌轉(zhuǎn)化體系在104h內(nèi)，仍能定量轉(zhuǎn)化底物，得到高產(chǎn)率的氫化可的松。在以3g/L為初始投料的搖瓶放大實驗中，協(xié)同轉(zhuǎn)化體可重復(fù)利用2-3輪，生成的目標(biāo)產(chǎn)物平均收率達(dá)52%。此投料方法較國內(nèi)現(xiàn)行業(yè)所使用投料方式下的產(chǎn)物收率45%-47%高出7-5個百分點。這表明建立的底物添加體系能夠有效提高投料濃度，實現(xiàn)高濃度底物的高效轉(zhuǎn)化，為雙菌轉(zhuǎn)化RSA制氫化可的松的工業(yè)化生產(chǎn)提供了有力的技術(shù)支持。6.2與傳統(tǒng)工藝的對比將雙菌轉(zhuǎn)化新工藝與傳統(tǒng)工藝進(jìn)行對比，能夠更直觀地凸顯新工藝在氫化可的松生產(chǎn)中的顯著優(yōu)勢。傳統(tǒng)工藝在氫化可的松的生產(chǎn)中存在諸多局限性，而本研究開發(fā)的雙菌轉(zhuǎn)化新工藝在多個關(guān)鍵方面實現(xiàn)了突破和改進(jìn)。在產(chǎn)率方面，傳統(tǒng)工藝的產(chǎn)率相對較低。以國內(nèi)普遍采用的藍(lán)色犁頭霉單菌轉(zhuǎn)化工藝為例，其對RSA的收率僅為45%，對薯蕷皂素的總收率約為18%。這是由于藍(lán)色犁頭霉11-β-羥化酶活力及選擇性不強(qiáng)，在轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生較多副產(chǎn)物，如11α-OH—RS（表皮醇），大量底物被消耗在副產(chǎn)物的生成上，導(dǎo)致氫化可的松的生成量減少。國外采用新月彎孢霉以RS為底物的生產(chǎn)工藝，產(chǎn)率在60%左右，雖然副產(chǎn)物相對較少，但由于底物RS的制備過程較為復(fù)雜，且新月彎孢霉對RSA的脫乙?；钚暂^低，限制了其整體產(chǎn)率的進(jìn)一步提高。雙菌轉(zhuǎn)化新工藝在產(chǎn)率上有了顯著提升。通過兩菌分別培養(yǎng)順序轉(zhuǎn)化的優(yōu)化方案，充分發(fā)揮藍(lán)色犁頭霉的高21-脫乙?；钚院托略聫濇呙沟母哌x擇性、快速轉(zhuǎn)化能力，在搖瓶克量制備實驗轉(zhuǎn)化中，3批收得率以RSA計氫化可的松平均收得率達(dá)52.0%，較傳統(tǒng)藍(lán)色犁頭霉工藝高出7個百分點。在底物添加體系改進(jìn)后，建立的Tween80/丙三醇/RSA（10:30:10，v/v/w）底物添加體系使得投料濃度高達(dá)5g/L時，雙菌轉(zhuǎn)化體系在104h內(nèi)仍能定量轉(zhuǎn)化底物，得到高產(chǎn)率的氫化可的松。在以3g/L為初始投料的搖瓶放大實驗中，協(xié)同轉(zhuǎn)化體可重復(fù)利用2-3輪，生成的目標(biāo)產(chǎn)物平均收率達(dá)52%，此投料方法較國內(nèi)現(xiàn)行業(yè)所使用投料方式下的產(chǎn)物收率45%-47%高出7-5個百分點。從成本角度來看，傳統(tǒng)工藝由于產(chǎn)率低，需要消耗大量的原料來生產(chǎn)一定量的氫化可的松，這使得原料成本居高不下。傳統(tǒng)工藝的轉(zhuǎn)化過程可能需要使用較多的化學(xué)試劑和復(fù)雜的反應(yīng)條件，進(jìn)一步增加了生產(chǎn)成本。在底物溶解性差的問題上，傳統(tǒng)工藝通常采用將甾體底物溶解于有機(jī)溶劑后投入發(fā)酵液進(jìn)行轉(zhuǎn)化的方式，不僅受到甾體在溶劑中溶解度有限的限制，還面臨著有機(jī)溶劑對細(xì)胞毒性的問題，這可能導(dǎo)致發(fā)酵過程中細(xì)胞生長受到抑制，影響產(chǎn)率，同時也增加了有機(jī)溶劑的使用成本和后續(xù)處理成本。雙菌轉(zhuǎn)化新工藝在成本控制方面具有明顯優(yōu)勢。新工藝通過提高產(chǎn)率，減少了原料的浪費，降低了原料成本。在底物添加體系的改進(jìn)中，篩選出對生物穩(wěn)定性影響較弱的有機(jī)溶劑丙三醇，降低了有機(jī)溶劑對細(xì)胞的毒性，減少了因細(xì)胞生長受抑制而導(dǎo)致的產(chǎn)率下降問題，從而降低了生產(chǎn)成本。通過添加表面活性劑吐溫80和對底物體系的前處理方式的考察，建立的新型底物添加體系能夠有效提高投料濃度，實現(xiàn)高濃度底物的高效轉(zhuǎn)化，減少了發(fā)酵體積和反應(yīng)時間，進(jìn)一步降低了生產(chǎn)成本。在污染方面，傳統(tǒng)工藝中使用的大量化學(xué)試劑和有機(jī)溶劑，在反應(yīng)結(jié)束后如果處理不當(dāng)，可能會對環(huán)境造成污染?；瘜W(xué)合成過程中產(chǎn)生的廢棄物和廢水含有大量的有害物質(zhì)，需要進(jìn)行嚴(yán)格的處理才能排放，這增加了環(huán)保成本和環(huán)境風(fēng)險。雙菌轉(zhuǎn)化新工藝作為一種生物轉(zhuǎn)化工藝，具有低污染的特點。微生物轉(zhuǎn)化過程相對溫和，不需要使用大量的化學(xué)試劑，減少了化學(xué)廢棄物的產(chǎn)生。在整個轉(zhuǎn)化過程中，主要的廢棄物是微生物菌體和少量的發(fā)酵液，這些廢棄物相對容易處理，對環(huán)境的污染較小。新工藝通過優(yōu)化反應(yīng)條件和底物添加體系，提高了反應(yīng)的效率和選擇性，減少了副產(chǎn)物的生成，進(jìn)一步降低了對環(huán)境的污染。雙菌轉(zhuǎn)化RSA制氫化可的松新工藝在提高產(chǎn)率、降低成本和減少污染等方面相較于傳統(tǒng)工藝具有顯著優(yōu)勢。這些優(yōu)勢使得新工藝在氫化可的松的工業(yè)化生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景，有望推動甾體激素生產(chǎn)領(lǐng)域的技術(shù)升級和可持續(xù)發(fā)展。6.3工藝的可行性與應(yīng)用前景雙菌轉(zhuǎn)化RSA制氫化可的松新工藝在工業(yè)生產(chǎn)中展現(xiàn)出了顯著的可行性。從技術(shù)層面來看，通過對藍(lán)色犁頭霉和新月彎孢霉的篩選與優(yōu)化，確定了兩菌分別培養(yǎng)順序轉(zhuǎn)化的最佳方案，并對轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了精細(xì)調(diào)控，包括Ⅱ級接種量、菌絲體2投加時間等關(guān)鍵參數(shù)的優(yōu)化，使得轉(zhuǎn)化過程更加穩(wěn)定和高效。在底物添加體系方面，篩選出對生物穩(wěn)定性影響較弱的有機(jī)溶劑丙三醇，并通過添加表面活性劑吐溫80和對底物體系的前處理方式的考察，建立了高效的Tween80/丙三醇/RSA（10:30:10，v/v/w）底物添加體系。該體系能夠有效提高投料濃度，實現(xiàn)高濃度底物的定量轉(zhuǎn)化，在搖瓶放大實驗中，協(xié)同轉(zhuǎn)化體可重復(fù)利用2-3輪，生成的目標(biāo)產(chǎn)物平均收率達(dá)52%，這表明新工藝在技術(shù)上具有較高的可操作性和可靠性，能夠滿足工業(yè)生產(chǎn)對高效、穩(wěn)定生產(chǎn)工藝的需求。在經(jīng)濟(jì)可行性方面，新工藝具有明顯的優(yōu)勢。傳統(tǒng)工藝由于產(chǎn)率低，需要消耗大量的原料來生產(chǎn)一定量的氫化可的松，導(dǎo)致原料成本居高不下。而雙菌轉(zhuǎn)化新工藝通過提高產(chǎn)率，減少了原料的浪費，降低了原料成本。例如，在搖瓶克量制備實驗轉(zhuǎn)化中，3批收得率以RSA計氫化可的松平均收得率達(dá)52.0%，較傳統(tǒng)藍(lán)色犁頭霉工藝高出7個百分點。在底物添加體系改進(jìn)后，投料濃度的提高使得單位體積發(fā)酵液中氫化可的松的產(chǎn)量增加，減少了發(fā)酵體積和反應(yīng)時間，進(jìn)一步降低了生產(chǎn)成本。協(xié)同生物催化劑能夠多次重復(fù)使用，減少了生物催化劑的用量，也降低了生產(chǎn)成本。這些都表明新工藝在經(jīng)濟(jì)上具有可行性，能夠為企業(yè)帶來更好的經(jīng)濟(jì)效益。從環(huán)保角度來看，新工藝作為一種生物轉(zhuǎn)化工藝，具有低污染的特點。微生物轉(zhuǎn)化過程相對溫和，不需要使用大量的化學(xué)試劑，減少了化學(xué)廢棄物的產(chǎn)生。在整個轉(zhuǎn)化過程中，主要的廢棄物是微生物菌體和少量的發(fā)酵液，這些廢棄物相對容易處理，對環(huán)境的污染較小。新工藝通過優(yōu)化反應(yīng)條件和底物添加體系，提高了反應(yīng)的效率和選擇性，減少了副產(chǎn)物的生成，進(jìn)一步降低了對環(huán)境的污染。這符合當(dāng)前社會對綠色、環(huán)保生產(chǎn)工藝的要求，使得新工藝在環(huán)保方面具有可行性，能夠滿足可持續(xù)發(fā)展的需求。展望其在甾體藥物生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用前景，雙菌轉(zhuǎn)化新工藝具有廣闊的發(fā)展空間。氫化可的松作為一種重要的甾體藥物，不僅自身在臨床治療中具有廣泛的應(yīng)用，還是制備其他幾種重要甾體藥物的原料藥。新工藝的出現(xiàn)，為氫化可的松的高效生產(chǎn)提供了有力的技術(shù)支持，能夠滿足市場對氫化可的松日益增長的需求。通過對雙菌轉(zhuǎn)化工藝的深入研究和優(yōu)化，有望將該工藝拓展到其他甾體藥物的生產(chǎn)中。許多甾體藥物的合成過程都涉及到甾體母核的修飾和轉(zhuǎn)化，而雙菌轉(zhuǎn)化工藝中微生物對甾體化合物的轉(zhuǎn)化能力和協(xié)同作用原理，可能適用于其他甾