ICS65.020IDB13/T6044—2025本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由河北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本文件起草單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院、河北省農(nóng)林科學(xué)院谷子研究所、河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所、河北省植保植檢總站。本文件起草人：齊永志、馬駿、董志平、王永芳、王燁、甄文超、王逍冬、吳玉星、耿立格、郄彥敏、趙立強(qiáng)、勾建軍、李娜、崔彥、劉娜、班勝聰。DB13/T6044—20251小麥抗莖基腐病鑒定技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了小麥抗莖基腐病室內(nèi)苗期和田間成株期鑒定的接種體制備、抗病性鑒定方法、病情調(diào)查分級標(biāo)準(zhǔn)和抗病性評價(jià)的技術(shù)要求。本文件適用于小麥對莖基腐病的室內(nèi)苗期和田間成株期抗病性鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1白穗whitehead由假禾谷鐮刀菌侵染引起的莖基部褐變腐爛造成的小麥枯死穗，呈整莖干枯狀，且拔起不帶根。4接種體的制備4,1病原物獲取選擇有代表性、致病力強(qiáng)的假禾谷鐮刀菌菌株。病菌分離鑒定、致病性及周年侵染循環(huán)見附錄A。4.2分生孢子懸浮液接種體的制備將病菌接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potatodextroseagar，PDA；見附錄B.1）固體平板培養(yǎng)基上活化（9cm培養(yǎng)皿），25℃條件下，黑暗培養(yǎng)5～7d；用無菌打孔器打成直徑為0.5cm的菌餅，取10～15枚菌餅放入含有150mL羧甲基纖維素鈉液體培養(yǎng)基（CarboxymethylCellulose，CMC；見附錄B.2）的三角瓶內(nèi)，25℃黑暗振蕩（180r/min）培養(yǎng)3～5d后，4層紗布過濾，于顯微鏡下觀察，用無菌水或去離子水調(diào)節(jié)孢子懸浮液濃度至1.0×106個孢子/mL，然后加入0.5%的吐溫20，混勻，4℃保存，備用。4.3麥粒接種體的制備將小麥籽粒用水浸泡10～12h，取吸脹水的麥粒300g，放入聚乙烯塑料袋（長×寬×高=36cm×10cm×8cm）或500mL三角瓶中，置于滅菌鍋中121℃滅菌30min，冷卻后備用。接種時(shí)，將裝有無菌冷卻麥粒的聚乙烯塑料袋或三角瓶置于超凈工作臺中，表面噴灑75%酒精，打開紫外燈表面消毒20min。將在PDA平板上（9cm培養(yǎng)皿）黑暗、25℃條件下培養(yǎng)7d的菌株，用無菌打孔器打成直徑為0.5cm的菌餅，接入滅菌好的麥粒上，每個聚乙烯塑料袋或三角瓶接入20枚菌餅。黑暗、25℃條件下培養(yǎng)，每天輕輕搖晃聚乙烯塑料袋或三角瓶，以保證菌絲長勢均勻。培養(yǎng)20d后待菌絲長滿麥粒表面即可，放在4℃冰箱中冷藏備用。田間使用前，將長滿菌絲的麥粒倒出，在通風(fēng)背光處晾干，用小型粉碎機(jī)粉碎成直徑為2mm左右的顆粒。5抗病性鑒定5.1室內(nèi)苗期抗病性鑒定2DB13/T6044—2025選取籽粒飽滿、大小一致的小麥種子，75%酒精消毒2min，無菌水沖洗3遍。消毒后的小麥種子在培養(yǎng)皿中25℃催芽2～3d，待種子出芽5mm后，將種子在以上備好的1.0×106個孢子/mL的孢子懸浮液接種體中浸泡1min，播種至規(guī)格為5×10的穴盤中，每穴2粒，每個品種播種10粒，每盤可以播種10個品種。重復(fù)3次。溫室自然光照，晝夜溫度分別設(shè)定為25±2℃和20±2℃。采用底部灌水方式澆水。以‘Sunco’和‘新麥26’分別為抗病、感病對照，播種5周以后，當(dāng)感病對照嚴(yán)重發(fā)病時(shí)進(jìn)行調(diào)查。5.2田間成株期抗病性鑒定在小麥莖基腐病常發(fā)區(qū)，選擇地勢平坦、土壤肥沃程度居中的地塊建立田間鑒定病圃，周圍留2m以上的保護(hù)行。利用人工接種方法，將已粉碎的麥粒接種體按15g/m接種量與細(xì)沙或細(xì)土（不能攥成團(tuán)）按照體積比1:1比例混合均勻成菌土。每個品種種植4行，每行1m，播種100粒種子。重復(fù)3次。先開溝，然后撒播種子，再均勻覆蓋菌土，最后埋土3～4cm。以‘Sunco’和‘新麥26’分別為抗病、感病對照，每20個品種設(shè)1組對照。在乳熟末期進(jìn)行調(diào)查。田間管理：均勻施足底肥，做好土地平整；播種時(shí)間與當(dāng)?shù)卮筇锷a(chǎn)一致，或適當(dāng)早播；足墑播種，及時(shí)灌溉過冬水和拔節(jié)孕穗水，足量灌溉，保持均勻，揚(yáng)花期后不再澆水；鑒定圃不使用任何殺菌劑。6病情調(diào)查6.1室內(nèi)苗期病情調(diào)查室內(nèi)種植5周后，待感病對照充分發(fā)病時(shí)，調(diào)查記錄待鑒品種單株發(fā)病程度。每個品種調(diào)查10株。發(fā)病嚴(yán)重度級值分級標(biāo)準(zhǔn)見表1，按照附錄C.1記錄調(diào)查結(jié)果。按照如下公式（1）計(jì)算病情指數(shù)。表1小麥莖基腐病苗期發(fā)病嚴(yán)重度分級標(biāo)準(zhǔn)度Si——各嚴(yán)重度級值；Fi——各嚴(yán)重度的病株數(shù)；N——調(diào)查總株數(shù)。6.2田間成株期病情調(diào)查在小麥乳熟末期，調(diào)查每個品種中間2行的白穗率，重復(fù)3次。要求待鑒品種1d內(nèi)全部完成調(diào)查。按照附錄C.2記錄調(diào)查結(jié)果，按照如下公式（2）計(jì)算相對白穗率。DB13/T6044—20253WEPcc——感病對照品種的白穗率。若鑒定圃發(fā)病整體較輕，利用白穗率難以區(qū)分抗病材料時(shí)，可利用白穗率淘汰部分白穗率高的感病材料，其余的再按照成株期發(fā)生程度進(jìn)行調(diào)查。小麥莖基腐病成株期發(fā)病嚴(yán)重度級值分級標(biāo)準(zhǔn)見表2。從中間2行隨機(jī)取樣，每行調(diào)查20個莖，共調(diào)查40個莖。調(diào)查時(shí)撥去葉鞘記錄各莖病級，要求1d內(nèi)調(diào)查完畢，或所有待鑒定品種一起取樣，當(dāng)天調(diào)查不完放在冷庫。按照附錄C.3記錄調(diào)查結(jié)果。按照如上公式（1）計(jì)算病情指數(shù)，按照如下公式（3）計(jì)算相對病情指數(shù)。表2小麥莖基腐病成株期嚴(yán)重度分級標(biāo)準(zhǔn)DIic——待鑒品種的病情指數(shù)；DIcc——感病對照品種的病情指數(shù)。7抗病性評價(jià)7.1鑒定有效性判斷當(dāng)感病對照品種達(dá)到感病級別時(shí)鑒定有效。室內(nèi)苗期鑒定感病對照品種病情指數(shù)≥40.0，田間成株期鑒定感病對照品種病情指數(shù)≥30.0，該批次鑒定有效。7.2抗病性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)7.2.1室內(nèi)苗期抗病性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)按照病情指數(shù)，將小麥莖基腐病抗病性類型劃分為5個級別（見表3）。淘汰高感品種，感病及以上級別的待鑒品種繼續(xù)進(jìn)行田間成株期鑒定。表3室內(nèi)苗期小麥對莖基腐病抗病性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)DB13/T6044—202547.2.2田間成株期抗病性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)田間感病對照品種白穗率達(dá)到3%及以上時(shí)，按照公式（2）計(jì)算相對白穗率。根據(jù)相對白穗率將小麥莖基腐病抗病性類型劃分為5個級別（見表4）。若鑒定圃發(fā)病普遍較輕，則利用白穗率淘汰部分感病材料，其余的按照成株期發(fā)病嚴(yán)重度分級標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查的數(shù)據(jù)計(jì)算病情指數(shù)，進(jìn)一步按照公式（3）計(jì)算相對病情指數(shù)，按照相對病情指數(shù)進(jìn)行分級（見表4）。表4田間成株期小麥莖基腐病抗病性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)7.3重復(fù)鑒定田間成株期初次鑒定中表現(xiàn)為中抗及以上的小麥，次年用相同的方法進(jìn)行重復(fù)鑒定。7,4抗病性評價(jià)結(jié)論根據(jù)2年抗病性鑒定結(jié)果對鑒定材料進(jìn)行抗病性評價(jià)。室內(nèi)苗期鑒定和田間成株期鑒定結(jié)果應(yīng)分別記錄，以成株期鑒定結(jié)果為主要參考依據(jù)。抗病性級別以統(tǒng)計(jì)的最高相對病情指數(shù)為準(zhǔn)。DB13/T6044—20255假禾谷鐮刀菌的分離鑒定、致病性及周年侵染循環(huán)A.1病菌的分離培養(yǎng)從待鑒定區(qū)域有代表性的田間采集小麥莖基腐病發(fā)病的樣品，剪去上下部位，留下發(fā)病的莖基部，用自來水沖洗干凈，放在濾紙上，從病健結(jié)合部位剪下0.5cm的小段，在超凈工作臺無菌條件下進(jìn)行消毒。首先浸泡于75%乙醇中10s，3%的次氯酸鈉中1min進(jìn)行表面消毒，然后用無菌水清洗3次，最后將病組織放入提前準(zhǔn)備好的含有100mg/mL氨芐青霉素的PDA平板上。將培養(yǎng)皿倒置，于25℃條件下進(jìn)行黑暗培養(yǎng)，2～3d后挑取由分離組織上長出的菌落邊緣的病菌菌絲，轉(zhuǎn)接至新的PDA平板上，待菌落長出后依此方法轉(zhuǎn)接3次得到純培養(yǎng)物。A.2形態(tài)學(xué)鑒定將以上得到的純培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)5d，觀察并記錄菌落的形態(tài)特征與菌絲顏色，同時(shí)打取5～8枚菌餅放入含有50mL的CMC培養(yǎng)基中，放置于25℃、180r/min條件下?lián)u培3d，吸取10μL孢懸液制成玻片，在顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)。假禾谷鐮刀菌菌絲一般前期為白色，中后期為粉紅色或紫紅色絨狀，常沿培養(yǎng)皿邊緣長滿整皿。其分生孢子呈鐮刀形，有隔膜3～7個，頂端鈍圓，基部足細(xì)胞明顯，單個無色，大小為22～60.5μm×2.5～5.5μm。A.3分子生物學(xué)鑒定挑取菌絲（約0.5g）放入含有3顆直徑2mm鋼珠的2mL無酶無菌離心管中，置于液氮中迅速冷凍，并用組織研磨儀研磨成粉狀物；利用十六烷基三甲基溴化銨（Cetyl-trimethylammoniumBromide，CTAB）法提取菌絲DNA，瓊脂糖電泳及吸光值質(zhì)檢合格后，稀釋至50ng/μL備用。用假禾谷鐮刀菌特異性引物（Fp1-1：CGGGGTAGTTTCACATTTCCG；Fp1-2：GAGAATGTGATGACGACAATA）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包含2×TaqPCRMasterMix12.5μL，DNA模板1μL，10μmoL/L的正反向引物各1μL，雙蒸水補(bǔ)足到25μL。反應(yīng)程序：94℃3min;94℃30s,56℃1min,72℃90s，35個循環(huán);72℃終延伸10min,12℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠在110V恒壓下電泳分離，紫外燈下觀察，在523bp附近有清晰目標(biāo)條帶的，可確定為假禾谷鐮刀菌。A.4致病性檢測按照以上技術(shù)方案獲得待鑒定區(qū)域有代表性的假禾谷鐮刀菌菌株，在小麥抗感不同品種上進(jìn)行接種，選擇致病性強(qiáng)的單一菌株或者混合菌株用來進(jìn)行抗莖基腐病鑒定。A.5周年侵染循環(huán)小麥莖基腐病是長期推行秸稈還田、免耕播種等保護(hù)性耕作條件下引發(fā)的重要病害，在小麥-玉米一年兩熟區(qū)表現(xiàn)更加突出（如圖A.1）。該病以田間小麥根茬攜帶病原菌越夏；小麥?zhǔn)斋@后，貼茬播種玉米，田間小麥根茬上的病原菌在潮濕的玉米田間可以繼續(xù)存活并繁衍積累；玉米收獲后，田間小麥病殘?bào)w隨玉米秸稈一起粉碎并淺旋耕，均勻分散至有效侵染的小麥播種層。小麥播種后，病原菌侵染小麥根莖結(jié)合處或地中莖，嚴(yán)重的造成爛芽、死苗；感病較輕的麥苗則繼續(xù)生長，病原菌向上、向內(nèi)擴(kuò)展，造成莖基部褐變，或向上擴(kuò)展侵染至1～2節(jié)，嚴(yán)重的可達(dá)3～4節(jié)，引起枯稈或白穗，在田間呈零散分布。白穗病莖拔出時(shí)基部折斷不帶根，嚴(yán)重影響產(chǎn)量。小麥?zhǔn)斋@后，病原菌再次隨小麥根茬越夏。該病周年循環(huán)、逐年積累和擴(kuò)散，成為田間發(fā)病率很高，產(chǎn)量損失很大的重要病害。假禾谷鐮刀菌在小麥抽穗揚(yáng)花期也能侵染麥穗引起赤霉病，病菌在麥穗上擴(kuò)展，攜帶假禾谷鐮刀菌的小麥種子可以進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，并在新的地塊繼續(xù)周年侵染、積累、擴(kuò)散并為害，使該病在黃淮海小麥-玉米一年兩熟區(qū)快速擴(kuò)散，并普遍發(fā)生，目前已經(jīng)成為該區(qū)域普遍關(guān)注，影響小麥生產(chǎn)安全的重要病害，2022年被中國科學(xué)列入我國十大產(chǎn)業(yè)技術(shù)難題之一。DB13/T6044—20256圖A.1保護(hù)性耕作條件下小麥-玉米一年兩熟區(qū)小麥莖基腐病擴(kuò)散及周年侵染循環(huán)規(guī)律DB13/T6044—20257培養(yǎng)基制備B.1馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potatodextroseagar，PDA）固體培養(yǎng)基的制備B.1.1稱量去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15～20g。B.1.2將馬鈴薯切成小塊放入鍋中，加蒸餾水或去離子水1000mL，煮沸20～30min。用紗布濾去馬鈴薯殘?jiān)?。B.1.3將馬鈴薯濾液放回鍋中，加入瓊脂，加熱熔化。在瓊脂熔化過程中，需要用玻璃棒不斷攪拌，并控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。B.1.4加入葡萄糖，溶解后，加入適量蒸餾水或去離子水以補(bǔ)充加熱過程中損失的水分，定容至1000mL。B.1.5將配制的培養(yǎng)基分裝于三角瓶內(nèi)。分裝三角瓶的容量以不超過三角瓶容積的三分之一為宜。B.1.6加塞、包扎后將上述培養(yǎng)基以121℃、高壓蒸氣滅菌25min，備用。B.2羧甲基纖維素鈉（CarboxymethylCellulose，CMC）液體培養(yǎng)基的制備羧甲基纖維素鈉（CMC）液體培養(yǎng)基是以CMC-Na為唯一碳源的培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基制備方法有以下兩種。B.2.1利用羧甲基纖維素液體培養(yǎng)基粉制備稱取羧甲基纖維素液體培養(yǎng)基粉42g（或按照購買商品標(biāo)準(zhǔn)稱?。?，用蒸餾水或去離子水充分溶解后定容至1000mL，調(diào)節(jié)pH值7.2±0.2，121℃高壓蒸氣滅菌25min，備用。B.2.2利用化學(xué)試劑制備分別稱取羧甲基纖維素鈉15.0g，硝酸銨1g，磷酸二氫鉀1.0g