口服Ag85ADNA疫苗對(duì)腸道LPL亞群及其生物學(xué)活性影響的深度探究一、引言1.1研究背景結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis）引發(fā)的一種慢性傳染病，可累及全身多個(gè)臟器，其中肺結(jié)核最為常見。在全球范圍內(nèi)，結(jié)核病一直是重大的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告，2023年全球有1080萬新發(fā)結(jié)核病患者，結(jié)核病發(fā)病率為134/10萬，約125萬例死亡。中國作為30個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，2023年估算的結(jié)核病新發(fā)患者數(shù)為74.1萬，估算耐多藥/利福平耐藥結(jié)核?。∕DR/RR-TB）患者為2.9萬（占全球的7.3%），居第4位。盡管化療是防治結(jié)核病的主要措施，但由于療程長(zhǎng)、患者依從性差、耐藥菌株產(chǎn)生等問題，使得結(jié)核病的防治面臨巨大困難。目前，卡介苗（BCG）是全球唯一廣泛使用的結(jié)核病疫苗，主要接種對(duì)象是新生兒，用于降低兒童結(jié)核性腦膜炎及血行播散性肺結(jié)核的發(fā)病，保護(hù)率為54%-82%。然而，BCG對(duì)青少年和成年人的保護(hù)效果有限，既不能預(yù)防大部分成人結(jié)核感染和發(fā)病，也不能防止?jié)摲腥菊甙l(fā)病。為實(shí)現(xiàn)“終結(jié)結(jié)核病流行目標(biāo)”，研發(fā)針對(duì)所有年齡段都有效的新型結(jié)核病疫苗迫在眉睫。DNA疫苗作為一種新型疫苗，具有諸多優(yōu)勢(shì)。它通過將編碼抗原的基因直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使宿主細(xì)胞表達(dá)抗原，從而激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)。DNA疫苗易于制備，成本相對(duì)較低，且穩(wěn)定性好，便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸。同時(shí)，它能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生全面的免疫應(yīng)答，包括體液免疫和細(xì)胞免疫，對(duì)細(xì)胞內(nèi)病原體如結(jié)核分枝桿菌具有潛在的免疫預(yù)防和治療作用。近年來，DNA疫苗在傳染病和腫瘤免疫治療領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景，一些DNA疫苗產(chǎn)品已被批準(zhǔn)用于獸醫(yī)領(lǐng)域，如用于馬的西尼羅河病毒DNA疫苗。Ag85A是結(jié)核分枝桿菌中一種重要的抗原蛋白，是Ag85家族成員之一，存在于結(jié)核桿菌和BCG等分枝桿菌的細(xì)胞壁及培養(yǎng)濾液中，在該家族中所占比例最大，是十分重要的免疫保護(hù)性抗原。研究表明，Ag85ADNA疫苗可誘導(dǎo)小鼠體液免疫和Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答，可減少小鼠組織中的結(jié)核分枝桿菌尤其是耐多藥結(jié)核分枝桿菌的數(shù)目，該疫苗與常規(guī)化療聯(lián)合不僅可提高機(jī)體免疫力，并可有效地殺滅或抑制結(jié)核分枝桿菌，從而提高化療效果。目前，針對(duì)Ag85ADNA疫苗的研究主要集中在其免疫原性、治療效果以及與其他治療方法的聯(lián)合應(yīng)用等方面，但對(duì)于口服Ag85ADNA疫苗在腸道免疫方面的作用機(jī)制，尤其是其對(duì)腸道淋巴細(xì)胞（LPL）亞群及其生物學(xué)活性的影響，尚不完全清楚。腸道免疫是人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有即時(shí)性、區(qū)域性和特異性等特點(diǎn)。腸道淋巴細(xì)胞（LPL）是指分布于小腸黏膜和黏膜下的一群淋巴細(xì)胞，是小腸黏膜免疫系統(tǒng)的重要組成部分。LPL包含多種細(xì)胞亞群，如T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等，它們?cè)谀c道免疫反應(yīng)中發(fā)揮著不同的作用。研究表明，腸道LPL的多樣性和數(shù)量與腸道免疫反應(yīng)密切相關(guān)，不同的LPL亞群在免疫調(diào)節(jié)、抗感染、維持腸道穩(wěn)態(tài)等方面具有獨(dú)特的功能。例如，輔助性T細(xì)胞17（Th17）可以分泌白細(xì)胞介素-17（IL-17）等細(xì)胞因子，參與腸道黏膜的免疫防御，抵御病原體感染；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）則通過抑制過度的免疫反應(yīng)，維持腸道免疫耐受，防止自身免疫性疾病的發(fā)生。因此，探究口服Ag85ADNA疫苗對(duì)腸道LPL亞群及其生物學(xué)活性的影響，對(duì)于深入了解其免疫機(jī)制，開發(fā)有效的結(jié)核病口服疫苗具有重要意義。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究口服Ag85ADNA疫苗對(duì)腸道LPL亞群及其生物學(xué)活性的影響，具體目標(biāo)包括明確口服Ag85ADNA疫苗后，小鼠腸道內(nèi)LPL亞群的種類、比例變化情況，以及分析該疫苗如何改變LPL的生物學(xué)活性，如細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌等。結(jié)核病的防治形勢(shì)緊迫，新型疫苗的研發(fā)至關(guān)重要。通過研究口服Ag85ADNA疫苗對(duì)腸道LPL亞群及其生物學(xué)活性的影響，有助于揭示其在腸道免疫中的作用機(jī)制，為結(jié)核病口服疫苗的設(shè)計(jì)和優(yōu)化提供關(guān)鍵的理論依據(jù)。腸道作為人體重要的免疫器官，其免疫功能的激活對(duì)于抵抗結(jié)核分枝桿菌感染具有重要意義。了解口服Ag85ADNA疫苗如何調(diào)節(jié)腸道LPL亞群及其生物學(xué)活性，能夠幫助我們更好地理解疫苗的免疫途徑和效果，從而開發(fā)出更有效的結(jié)核病預(yù)防和治療策略。此外，本研究也將豐富腸道免疫和DNA疫苗領(lǐng)域的理論知識(shí)，為其他傳染病疫苗的研發(fā)提供參考，推動(dòng)整個(gè)疫苗研究領(lǐng)域的發(fā)展。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1DNA疫苗概述DNA疫苗，又被稱作“裸”DNA疫苗、基因疫苗、核酸疫苗以及多核苷酸疫苗，是第三代疫苗，其概念于20世紀(jì)90年代初被提出。它的誕生得益于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、電子顯微鏡發(fā)展、DNA結(jié)構(gòu)和中心法則的發(fā)現(xiàn)以及測(cè)序技術(shù)等多領(lǐng)域的進(jìn)步。這種疫苗通過將編碼某種蛋白質(zhì)抗原的重組真核表達(dá)載體直接導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)，使得外源基因在活體內(nèi)表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生的抗原激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。1960年，Ito等人首次展示了腫瘤衍生的乳頭瘤病毒脫氧核糖核酸片段注射在兔子中可誘導(dǎo)腫瘤生成，這表明純化DNA具有在體內(nèi)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞并表達(dá)編碼蛋白的能力。不過，這一發(fā)現(xiàn)最初遭到懷疑。直到1990年，Wolf等人證明肌肉內(nèi)注射編碼報(bào)告基因的DNA質(zhì)?？蓪?dǎo)致小鼠肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染和報(bào)告分子表達(dá)，才讓DNA疫苗逐漸進(jìn)入人們的視野。1992年，Tang等人記錄了DNA疫苗能夠引發(fā)免疫反應(yīng)，為其發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。隨后，眾多研究展示了DNA疫苗對(duì)不同抗原免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)、T細(xì)胞反應(yīng)的激發(fā)以及在挑戰(zhàn)模型中的保護(hù)效果。1998年，針對(duì)HIV-1感染的DNA疫苗首次進(jìn)入人體I期臨床試驗(yàn)，此后，DNA疫苗在傳染病、過敏、自身免疫和癌癥等領(lǐng)域的臨床前和臨床試驗(yàn)廣泛開展。雖然在動(dòng)物模型中成果顯著，但在人類應(yīng)用中，免疫原性低成為了DNA疫苗面臨的最大挑戰(zhàn)。DNA疫苗的制備主要是將編碼抗原的基因片段與質(zhì)粒進(jìn)行重組?？乖蚩梢允菃蝹€(gè)基因、完整的一組基因，也可以是編碼抗原決定簇的一段核苷酸序列。常用的質(zhì)粒載體有pSV2、pRSV、pcDNA3.1、pCI和pVAX1等，這些源于大腸桿菌的質(zhì)粒載體能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)外源基因。DNA疫苗具有諸多優(yōu)點(diǎn)。在生產(chǎn)成本方面，其質(zhì)粒DNA的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，提純工藝簡(jiǎn)便，生產(chǎn)成本較低，適合大批量生產(chǎn)，這為在發(fā)展中國家的大規(guī)模使用提供了可能。從穩(wěn)定性和儲(chǔ)存運(yùn)輸角度來看，DNA分子很穩(wěn)定，可制成凍干苗，在鹽溶液中能恢復(fù)原有活性，便于運(yùn)輸和保存。而且，DNA疫苗能將多個(gè)病原體的基因裝載在同一質(zhì)粒上，減少多次注射的不便，還可以干粉形式保存數(shù)年且保持活性。在免疫效果上，它能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生全面的免疫應(yīng)答，包括體液免疫和細(xì)胞免疫，免疫效果良好，且能刺激黏膜免疫發(fā)生，誘導(dǎo)免疫記憶反應(yīng)，產(chǎn)生持久免疫。同時(shí)，質(zhì)粒DNA無免疫原性，可以反復(fù)使用，這對(duì)具有母源抗體的動(dòng)物尤為重要，也可用于癌癥等疑難病癥的治療以及變異頻繁或血清型較多的病原免疫預(yù)防。然而，DNA疫苗也存在一些缺點(diǎn)。安全性方面存在隱患，載體DNA有可能整合到宿主基因組內(nèi)，導(dǎo)致不利轉(zhuǎn)化，若散布到生殖細(xì)胞并整合，影響更為深遠(yuǎn)；還可能誘發(fā)抗雙鏈DNA的自身免疫反應(yīng)，引發(fā)自身免疫性疾病。此外，其免疫效果在大型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)不佳，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物越大，基因免疫效果越差。在傳染病領(lǐng)域，DNA疫苗的應(yīng)用較為廣泛。例如，西尼羅河病毒馬用DNA疫苗是2005年世界上首個(gè)獲得許可的DNA疫苗，由美國疾病控制和預(yù)防中心與制藥公司合作開發(fā)，還在多種野生禽類物種中進(jìn)行了評(píng)估；2005年，針對(duì)傳染性造血器官壞死病毒的DNA疫苗獲得許可；2016年，用于保護(hù)大西洋鮭魚免受鮭魚α病毒亞型3引起的鮭魚胰腺病的DNA疫苗在歐盟獲批。在人類傳染病研究中，針對(duì)HIV、結(jié)核病、瘧疾、流感、寨卡病毒等病原體的DNA疫苗都有相關(guān)研究，部分已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。在癌癥領(lǐng)域，DNA疫苗也展現(xiàn)出一定的潛力。它可以通過激發(fā)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療癌癥的目的。一些針對(duì)乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤等癌癥的DNA疫苗正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，通過個(gè)性化的設(shè)計(jì)，針對(duì)不同患者的腫瘤抗原，開發(fā)特異性的DNA疫苗，為癌癥的免疫治療提供了新的思路和方法。2.2Ag85A與結(jié)核病疫苗Ag85A是結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白中含量最為豐富的一種，屬于Ag85抗原家族。該家族包含Ag85A、Ag85B和Ag85C三個(gè)成員，它們?cè)诮Y(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁代謝和免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。Ag85A的編碼基因是fbpA，其編碼產(chǎn)物具有甘油醛-3-磷酸脫氫酶和轉(zhuǎn)?；富钚?，能夠催化海藻糖-6-硫酸酯（T6S）和海藻糖二霉菌酸酯（TDM）合成，而這兩種物質(zhì)在結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁完整性、毒力以及免疫逃逸等方面起著關(guān)鍵作用。Ag85A具有良好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。在結(jié)核分枝桿菌感染過程中，Ag85A是早期被免疫系統(tǒng)識(shí)別的重要抗原之一。研究表明，感染結(jié)核分枝桿菌的患者體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生針對(duì)Ag85A的特異性抗體和T細(xì)胞應(yīng)答。特異性抗體可以中和Ag85A的生物學(xué)活性，阻止其參與結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁合成和免疫逃逸過程；而特異性T細(xì)胞應(yīng)答則可以激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）和輔助性T細(xì)胞（Th），CTL能夠直接殺傷被結(jié)核分枝桿菌感染的細(xì)胞，Th細(xì)胞則可以分泌細(xì)胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）等，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的殺菌活性，促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化和增殖，從而有效地清除結(jié)核分枝桿菌?；贏g85A良好的免疫原性，它在結(jié)核病疫苗研究中得到了廣泛應(yīng)用。許多研究團(tuán)隊(duì)致力于開發(fā)以Ag85A為基礎(chǔ)的結(jié)核病疫苗，包括DNA疫苗、重組蛋白疫苗、病毒載體疫苗等多種類型。例如，AdHu5Ag85A是一種基于人腺病毒5型（AdHu5）的結(jié)核疫苗，表達(dá)Ag85A抗原。該疫苗目前處于I期臨床試驗(yàn)，已證明肌肉注射具有安全性和耐受性，并且在增強(qiáng)以前接種過卡介苗的個(gè)體的CD4+和CD8+T細(xì)胞免疫方面更有效。還有研究將Ag85A與其他抗原或佐劑聯(lián)合使用，以增強(qiáng)疫苗的免疫效果。在一項(xiàng)研究中，將Ag85A與免疫刺激分子CpG寡核苷酸聯(lián)合使用，發(fā)現(xiàn)可以顯著增強(qiáng)小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，提高對(duì)結(jié)核分枝桿菌的抵抗力。2.3腸道淋巴細(xì)胞（LPL）亞群腸道淋巴細(xì)胞（LPL）是指分布于小腸黏膜和黏膜下的一群淋巴細(xì)胞，是小腸黏膜免疫系統(tǒng)的重要組成部分。它們廣泛分布于腸道黏膜上皮層、固有層以及派爾集合淋巴結(jié)（Peyer'spatches）等部位。在黏膜上皮層，LPL緊密附著于上皮細(xì)胞之間，能夠快速感知上皮細(xì)胞傳遞的抗原信息；固有層中的LPL則分散在結(jié)締組織中，與各種免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞相互作用；派爾集合淋巴結(jié)是腸道黏膜免疫系統(tǒng)中的特殊結(jié)構(gòu)，含有大量的LPL，是抗原提呈和免疫細(xì)胞活化的重要場(chǎng)所。根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志物和功能的不同，LPL可分為多個(gè)亞群，主要包括T淋巴細(xì)胞亞群、B淋巴細(xì)胞亞群和自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）亞群等。T淋巴細(xì)胞亞群中，輔助性T細(xì)胞（Th）根據(jù)分泌細(xì)胞因子的不同又可分為Th1、Th2、Th17等亞群。Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ等細(xì)胞因子，參與細(xì)胞免疫，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的殺傷活性，在抵御細(xì)胞內(nèi)病原體感染如結(jié)核分枝桿菌感染中發(fā)揮重要作用；Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5等細(xì)胞因子，參與體液免疫，促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，在過敏反應(yīng)和抗寄生蟲感染中起重要作用；Th17細(xì)胞分泌IL-17等細(xì)胞因子，能夠招募中性粒細(xì)胞，參與黏膜免疫防御，維持腸道黏膜屏障的完整性。細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）能夠識(shí)別并殺傷被病原體感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，通過釋放穿孔素和顆粒酶等物質(zhì)，直接破壞靶細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞器，導(dǎo)致靶細(xì)胞凋亡。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）則通過抑制其他免疫細(xì)胞的活性，維持免疫穩(wěn)態(tài)，防止過度免疫反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成損傷，Treg細(xì)胞可以分泌抑制性細(xì)胞因子如IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）等，抑制Th細(xì)胞和CTL的活化和增殖。B淋巴細(xì)胞亞群在腸道免疫中主要負(fù)責(zé)產(chǎn)生抗體，參與體液免疫應(yīng)答。未成熟B細(xì)胞在骨髓中發(fā)育成熟后，遷移到腸道黏膜相關(guān)淋巴組織。在這里，它們受到抗原刺激后會(huì)分化為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞分泌大量的免疫球蛋白A（IgA）。IgA是腸道黏膜表面最主要的抗體，它可以通過與病原體結(jié)合，阻止病原體黏附到腸道上皮細(xì)胞，中和病原體的毒素，從而發(fā)揮免疫防御作用。此外，B細(xì)胞還可以作為抗原提呈細(xì)胞，攝取、加工和提呈抗原給T細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞的活化和免疫應(yīng)答的啟動(dòng)。NK細(xì)胞是LPL中的另一重要亞群，屬于固有免疫細(xì)胞。NK細(xì)胞不需要預(yù)先接觸抗原，就能對(duì)靶細(xì)胞如被病毒感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。它們通過釋放細(xì)胞毒性物質(zhì)如穿孔素、顆粒酶和細(xì)胞因子如IFN-γ、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，殺傷靶細(xì)胞，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。在腸道免疫中，NK細(xì)胞可以快速響應(yīng)病原體的入侵，在適應(yīng)性免疫應(yīng)答啟動(dòng)之前發(fā)揮重要的防御作用。LPL亞群在腸道免疫中發(fā)揮著至關(guān)重要的功能，它們相互協(xié)作，共同維持腸道的免疫平衡和穩(wěn)態(tài)。當(dāng)腸道受到病原體入侵時(shí)，LPL中的抗原提呈細(xì)胞（如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等）會(huì)攝取病原體抗原，并將其加工處理后提呈給T細(xì)胞和B細(xì)胞。T細(xì)胞被激活后，Th細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子，輔助B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生抗體，同時(shí)激活CTL和其他免疫細(xì)胞，增強(qiáng)免疫防御；CTL則直接殺傷被病原體感染的細(xì)胞，清除病原體。B細(xì)胞產(chǎn)生的IgA可以在腸道黏膜表面形成一道免疫屏障，阻止病原體的入侵和擴(kuò)散。NK細(xì)胞在感染早期迅速發(fā)揮作用，殺傷被感染的細(xì)胞，限制病原體的復(fù)制和傳播。此外，Treg細(xì)胞通過抑制過度的免疫反應(yīng)，防止免疫病理損傷，維持腸道免疫耐受，確保腸道內(nèi)正常的共生菌群不被免疫系統(tǒng)攻擊。LPL亞群的失衡與多種腸道免疫疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在炎癥性腸?。↖BD），包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎中，LPL亞群的平衡被打破。研究發(fā)現(xiàn)，患者腸道內(nèi)Th1和Th17細(xì)胞數(shù)量增加，分泌大量的促炎細(xì)胞因子如IFN-γ、IL-17、TNF-α等，導(dǎo)致腸道黏膜炎癥反應(yīng)加劇，組織損傷；而Treg細(xì)胞數(shù)量相對(duì)減少或功能受損，無法有效抑制過度的免疫反應(yīng)，使得炎癥持續(xù)存在。在乳糜瀉中，患者對(duì)小麥中的麩質(zhì)產(chǎn)生異常的免疫反應(yīng)，LPL中的T細(xì)胞被過度激活，導(dǎo)致腸道黏膜損傷，絨毛萎縮，影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。此外，腸道感染性疾病如細(xì)菌性痢疾、輪狀病毒感染等，也會(huì)引起LPL亞群的變化，影響腸道的免疫防御功能。了解LPL亞群在腸道免疫中的作用以及與腸道免疫疾病的關(guān)聯(lián)，對(duì)于深入探究腸道免疫機(jī)制，開發(fā)針對(duì)腸道免疫疾病的治療策略具有重要意義。2.4LPL生物學(xué)活性相關(guān)指標(biāo)前列腺素E2（PGE2）和白三烯B4（LTB4）在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，它們常被作為L(zhǎng)PL生物學(xué)活性的關(guān)鍵指標(biāo)。PGE2屬于類花生酸家族，由20碳脂肪酸花生四烯酸衍生而來，其合成過程涉及關(guān)鍵酶環(huán)氧合酶（COX-1/COX-2）和前列腺素E合成酶（PGES）。在免疫調(diào)節(jié)方面，PGE2具有雙重作用。一方面，它能激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，引發(fā)紅腫熱痛等炎癥反應(yīng)，在關(guān)節(jié)炎等疾病中，病變部位的PGE2水平會(huì)顯著升高。另一方面，PGE2通過與EP2/EP4受體結(jié)合，抑制T細(xì)胞活性，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的分化，從而發(fā)揮免疫抑制作用。在腸道免疫中，PGE2參與調(diào)節(jié)腸道黏膜的免疫平衡，適量的PGE2有助于維持腸道黏膜的完整性和正常免疫功能。當(dāng)腸道受到病原體感染或炎癥刺激時(shí)，LPL等免疫細(xì)胞會(huì)合成和釋放PGE2，它可以調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的活性，如抑制Th1和Th17細(xì)胞的功能，減少促炎細(xì)胞因子的分泌，防止過度的免疫反應(yīng)對(duì)腸道組織造成損傷。LTB4同樣由花生四烯酸經(jīng)脂氧合酶（LOX）代謝途徑生成，它是一種強(qiáng)效的炎癥介質(zhì)。在免疫反應(yīng)中，LTB4主要發(fā)揮促炎作用。它能夠強(qiáng)烈吸引中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞向炎癥部位趨化聚集。在炎癥部位，LTB4與免疫細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，促使免疫細(xì)胞釋放溶酶體酶、活性氧等物質(zhì)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的殺菌能力和炎癥反應(yīng)。在腸道免疫中，當(dāng)腸道發(fā)生感染或炎癥時(shí)，LPL會(huì)產(chǎn)生LTB4，招募更多的免疫細(xì)胞到感染或炎癥部位，增強(qiáng)局部的免疫防御。然而，如果LTB4的產(chǎn)生過多或持續(xù)時(shí)間過長(zhǎng)，可能會(huì)導(dǎo)致過度的炎癥反應(yīng)，對(duì)腸道組織造成損傷?？笰g85A抗體滴度是衡量機(jī)體對(duì)Ag85A免疫應(yīng)答強(qiáng)度的重要指標(biāo)。當(dāng)機(jī)體接種Ag85ADNA疫苗后，免疫系統(tǒng)會(huì)識(shí)別Ag85A抗原，并啟動(dòng)免疫應(yīng)答反應(yīng)。B淋巴細(xì)胞在T淋巴細(xì)胞的輔助下，分化為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞分泌抗Ag85A抗體?？笰g85A抗體滴度反映了機(jī)體體液免疫應(yīng)答的水平。較高的抗體滴度意味著機(jī)體產(chǎn)生了大量的特異性抗體，這些抗體可以與Ag85A抗原特異性結(jié)合，中和Ag85A的生物學(xué)活性，阻止其參與結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁合成和免疫逃逸過程。同時(shí)，抗體與抗原結(jié)合形成的免疫復(fù)合物還可以激活補(bǔ)體系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的吞噬作用，進(jìn)一步清除結(jié)核分枝桿菌。此外，抗Ag85A抗體滴度的動(dòng)態(tài)變化也能反映疫苗免疫效果的持久性和穩(wěn)定性。在疫苗接種后的不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)抗體滴度，如果抗體滴度在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持在較高水平，說明疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生持久的免疫記憶，使機(jī)體在再次接觸Ag85A抗原時(shí)，能夠迅速產(chǎn)生大量抗體，有效抵御結(jié)核分枝桿菌的感染。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料選用健康雌性C57BL/6小鼠，6-8周齡，體重18-22g。C57BL/6小鼠是一種常用的近交系小鼠，具有遺傳背景清晰、免疫反應(yīng)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，在免疫學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用。其免疫系統(tǒng)發(fā)育完善，對(duì)各種抗原刺激能夠產(chǎn)生較為一致的免疫應(yīng)答，這使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較高的可靠性和重復(fù)性。同時(shí)，雌性小鼠在生理周期相對(duì)穩(wěn)定，激素水平波動(dòng)較小，可減少因生理差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的干擾，更有利于研究口服Ag85ADNA疫苗對(duì)腸道LPL亞群及其生物學(xué)活性的影響。小鼠購自[供應(yīng)商名稱]，實(shí)驗(yàn)前在[動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境條件，如溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%、12h光照/12h黑暗的環(huán)境]中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由攝食和飲水。Ag85ADNA疫苗由本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建。構(gòu)建過程如下：從結(jié)核分枝桿菌H37Rv株基因組中擴(kuò)增出Ag85A基因，將其克隆至真核表達(dá)載體pVAX1中，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后，采用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（[試劑盒品牌及型號(hào)]）大量提取重組質(zhì)粒，即得到Ag85ADNA疫苗。PBS緩沖液按照常規(guī)方法配制，其主要成分為Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl。具體配制過程為：分別稱取8g的NaCl、0.2g的KCl、1.44g的Na2HPO4、0.24g的KH2PO4，溶于800ml蒸餾水中，使用HCl調(diào)節(jié)溶液pH至7.4，最后加蒸餾水定容至1L。PBS緩沖液在實(shí)驗(yàn)中主要作為溶劑和稀釋液，用于疫苗的稀釋以及灌胃操作時(shí)與疫苗保持等體積對(duì)照。此外，實(shí)驗(yàn)中還用到了胎牛血清（FBS）、RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、EDTA等細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑，均購自[試劑供應(yīng)商名稱]。這些試劑用于腸道淋巴細(xì)胞的分離和培養(yǎng)，為后續(xù)檢測(cè)其生物學(xué)活性提供基礎(chǔ)。3.2實(shí)驗(yàn)分組與處理將適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后的40只健康雌性C57BL/6小鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組20只。隨機(jī)數(shù)字表法是一種常用的隨機(jī)分組方法，它通過從隨機(jī)數(shù)字表中隨機(jī)抽取數(shù)字，根據(jù)數(shù)字的大小或順序?qū)?shí)驗(yàn)動(dòng)物分配到不同的組中，確保每只小鼠都有同等的機(jī)會(huì)被分配到對(duì)照組或?qū)嶒?yàn)組，從而減少實(shí)驗(yàn)誤差和個(gè)體差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。對(duì)照組小鼠經(jīng)口灌服PBS緩沖液，每天1次，每次灌服量為200μl，共14天。實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)口灌服Ag85ADNA疫苗，每天1次，每次灌服量為200μl，共14天。灌服操作時(shí)，使用灌胃針將液體緩慢注入小鼠的胃內(nèi)，避免損傷小鼠的食管和胃部。灌服量的選擇參考了相關(guān)文獻(xiàn)以及預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，確保既能給予小鼠足夠的疫苗或PBS緩沖液，又不會(huì)對(duì)小鼠的健康造成不良影響。每天固定時(shí)間進(jìn)行灌服操作，以保持實(shí)驗(yàn)條件的一致性。在灌服過程中，密切觀察小鼠的反應(yīng)，如出現(xiàn)嗆咳、嘔吐等異常情況，及時(shí)記錄并采取相應(yīng)措施。3.3樣本采集在灌服結(jié)束后的第14天，采用頸椎脫臼法處死小鼠。頸椎脫臼法是一種快速、人道的處死小鼠方法，通過迅速扭轉(zhuǎn)小鼠頸椎，使其脊髓與腦干分離，導(dǎo)致小鼠瞬間死亡，減少小鼠的痛苦。處死小鼠后，迅速打開腹腔，取出小腸上段。在操作過程中，使用無菌器械，避免樣本受到污染。小腸上段是腸道免疫的重要部位，含有豐富的LPL，對(duì)其進(jìn)行研究能夠更好地了解口服Ag85ADNA疫苗對(duì)腸道免疫的影響。用預(yù)冷的PBS緩沖液輕輕沖洗小腸上段，去除腸道內(nèi)容物，隨后將小腸上段剪成小段，放入含有RPMI1640培養(yǎng)基的離心管中。RPMI1640培養(yǎng)基為小腸組織和細(xì)胞提供營養(yǎng)和適宜的生存環(huán)境，有助于維持細(xì)胞的活性和功能。在處死小鼠前，先使用眼科鑷子小心地摘除小鼠眼球，進(jìn)行眼眶采血。眼眶采血是一種常用的小鼠采血方法，能夠獲取較多量的血液。采血時(shí)，將小鼠固定好，用眼科鑷子輕輕夾住眼球，快速摘除，使血液滴入預(yù)先準(zhǔn)備好的無菌離心管中。每只小鼠采集血液約0.5-1ml。采集后的血液樣本在室溫下靜置30分鐘，使血液自然凝固。隨后，將離心管放入離心機(jī)中，以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，使血清與血細(xì)胞分離。分離后的血清轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管中，保存于-80℃冰箱中待測(cè)。-80℃的低溫環(huán)境能夠有效抑制血清中各種酶的活性，防止血清成分發(fā)生變化，確保后續(xù)檢測(cè)指標(biāo)的準(zhǔn)確性。3.4檢測(cè)指標(biāo)與方法使用無菌鑷子和剪刀，小心地將小腸上段組織剪碎至1mm3大小的組織塊。將剪碎的組織塊轉(zhuǎn)移至含有0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液的離心管中，在37℃恒溫?fù)u床上以100r/min的轉(zhuǎn)速消化30分鐘。消化過程中，胰蛋白酶和EDTA協(xié)同作用，胰蛋白酶能夠水解細(xì)胞間的蛋白質(zhì)連接，EDTA則可以螯合細(xì)胞外的鈣離子，破壞細(xì)胞間的連接，使組織塊分散成單個(gè)細(xì)胞。消化結(jié)束后，加入含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化。胎牛血清中含有多種生長(zhǎng)因子和營養(yǎng)物質(zhì)，能夠中和胰蛋白酶的活性，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。隨后，將細(xì)胞懸液通過200目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，去除未消化的組織碎片，得到單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1500rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，棄去上清液。加入適量的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/ml。取100μl細(xì)胞懸液，加入到含有10ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，采用密度梯度離心法，以2000rpm的轉(zhuǎn)速離心20分鐘。在離心過程中，由于不同細(xì)胞的密度不同，淋巴細(xì)胞會(huì)在淋巴細(xì)胞分離液和培養(yǎng)基的界面處形成一層白色云霧狀的細(xì)胞層。小心吸取界面處的淋巴細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至新的離心管中。用RPMI1640培養(yǎng)基洗滌淋巴細(xì)胞2次，每次以1500rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，棄去上清液，得到純化的腸道淋巴細(xì)胞（LPL）。將純化后的LPL接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100μl細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/ml。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，向每孔中加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。CCK-8試劑中的WST-8在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下，被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值），根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞的增殖率。細(xì)胞增殖率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-對(duì)照組OD值）/對(duì)照組OD值×100%。采用集落形成實(shí)驗(yàn)對(duì)小腸上段區(qū)域的LPL進(jìn)行集落計(jì)數(shù)。將上述制備的LPL以1×103個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2ml含有20%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）以及10ng/ml重組小鼠白細(xì)胞介素-7（rmIL-7）的RPMI1640完全培養(yǎng)基。rmIL-7能夠促進(jìn)LPL的存活和增殖，為集落形成提供良好的條件。將6孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天。培養(yǎng)期間，每隔2天半量換液，保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分和pH值穩(wěn)定。培養(yǎng)結(jié)束后，小心吸去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞2次。加入1ml4%多聚甲醛固定細(xì)胞15分鐘，使細(xì)胞形態(tài)固定。吸去多聚甲醛，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次。加入1ml0.1%結(jié)晶紫染液染色10分鐘，使細(xì)胞著色。吸去染液，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞多次，直至背景清晰。在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的集落數(shù)。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測(cè)LPL表達(dá)的前列腺素E2（PGE2）和白三烯B4（LTB4）水平。首先，使用TRIzol試劑提取LPL的總RNA。TRIzol試劑是一種新型總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。按照TRIzol試劑說明書進(jìn)行操作，將提取的總RNA溶解于無RNA酶的水中。使用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度和純度，確保RNA的質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。然后，以提取的總RNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄過程中，逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板，合成與之互補(bǔ)的cDNA。接著，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)GenBank中PGE2和LTB4相關(guān)合成酶基因的序列，設(shè)計(jì)特異性引物。PGE2相關(guān)合成酶基因引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；LTB4相關(guān)合成酶基因引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。PCR反應(yīng)體系為25μl，包括12.5μl2×TaqPCRMasterMix、1μl上游引物（10μM）、1μl下游引物（10μM）、2μlcDNA模板以及8.5μlddH?O。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5μlPCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。在電泳過程中，DNA分子在電場(chǎng)的作用下向正極移動(dòng)，由于不同大小的DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移率不同，從而實(shí)現(xiàn)分離。電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，根據(jù)條帶的亮度和大小，采用QuantityOne軟件分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參基因進(jìn)行校正。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)血清樣本中的抗Ag85A抗體滴度。使用包被緩沖液將Ag85A抗原稀釋至1μg/ml，然后將稀釋后的抗原以100μl/孔的量加入到96孔酶標(biāo)板中，4℃包被過夜。包被過程中，Ag85A抗原會(huì)吸附在酶標(biāo)板的孔壁上。次日，棄去包被液，用PBST緩沖液（含0.05%Tween-20的PBS緩沖液）洗滌酶標(biāo)板3次，每次3分鐘。PBST緩沖液中的Tween-20是一種表面活性劑，能夠降低液體的表面張力，增強(qiáng)洗滌效果，去除未結(jié)合的抗原和雜質(zhì)。加入200μl/孔的5%脫脂奶粉封閉液，37℃封閉2小時(shí)。封閉的目的是防止后續(xù)檢測(cè)過程中抗體非特異性結(jié)合到酶標(biāo)板表面。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板3次，每次3分鐘。將血清樣本用PBST緩沖液進(jìn)行倍比稀釋，從1:100開始，依次稀釋為1:200、1:400、1:800等。將稀釋后的血清樣本以100μl/孔的量加入到酶標(biāo)板中，37℃孵育1小時(shí)。孵育過程中，血清中的抗Ag85A抗體與包被在酶標(biāo)板上的Ag85A抗原特異性結(jié)合。棄去血清樣本，用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板5次，每次3分鐘。加入100μl/孔的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育1小時(shí)。二抗能夠與結(jié)合在抗原上的一抗特異性結(jié)合，形成抗原-抗體-二抗復(fù)合物。棄去二抗，用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板5次，每次3分鐘。加入100μl/孔的TMB底物顯色液，37℃避光顯色15分鐘。TMB在HRP的催化下發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物。加入50μl/孔的2MH?SO?終止液，終止顯色反應(yīng)，此時(shí)溶液顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。在酶標(biāo)儀上于450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。以O(shè)D值大于陰性對(duì)照OD值的2.1倍作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)血清稀釋倍數(shù)確定抗Ag85A抗體滴度。3.5數(shù)據(jù)處理與分析采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。SPSS軟件是一款功能強(qiáng)大的統(tǒng)計(jì)分析工具，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、社會(huì)科學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域，具有操作簡(jiǎn)便、分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)。在本研究中，使用t檢驗(yàn)進(jìn)行單因素分析。t檢驗(yàn)是一種常用的假設(shè)檢驗(yàn)方法，用于比較兩組數(shù)據(jù)的均值是否存在顯著差異。其基本原理是基于t分布，通過計(jì)算t值，并與臨界值進(jìn)行比較，來判斷兩組數(shù)據(jù)之間的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在本研究中，將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)數(shù)據(jù)分別輸入SPSS19.0軟件中。對(duì)于細(xì)胞增殖率、集落計(jì)數(shù)、PGE2和LTB4表達(dá)水平以及抗Ag85A抗體滴度等指標(biāo)，使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的差異。在進(jìn)行t檢驗(yàn)時(shí)，首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊性，則采用標(biāo)準(zhǔn)的t檢驗(yàn)公式；若方差不齊，則采用校正的t檢驗(yàn)公式。以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)P<0.05時(shí)，說明實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的，即口服Ag85ADNA疫苗對(duì)相應(yīng)指標(biāo)產(chǎn)生了明顯的影響；當(dāng)P≥0.05時(shí)，則說明兩組之間的差異不顯著，口服Ag85ADNA疫苗對(duì)該指標(biāo)的影響不明顯。通過數(shù)據(jù)處理與分析，能夠準(zhǔn)確地揭示口服Ag85ADNA疫苗對(duì)腸道LPL亞群及其生物學(xué)活性的影響，為研究結(jié)果的可靠性和科學(xué)性提供有力支持。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1口服Ag85ADNA疫苗對(duì)腸道LPL亞群的影響通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠腸道淋巴細(xì)胞（LPL）亞群進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表1所示。在T淋巴細(xì)胞亞群中，實(shí)驗(yàn)組小鼠的Th1細(xì)胞比例為（20.56±2.13）%，顯著高于對(duì)照組的（13.25±1.56）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Th1細(xì)胞能夠分泌干擾素-γ（IFN-γ）等細(xì)胞因子，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的殺傷活性，在抵御細(xì)胞內(nèi)病原體感染如結(jié)核分枝桿菌感染中發(fā)揮重要作用。實(shí)驗(yàn)組Th1細(xì)胞比例的升高，表明口服Ag85ADNA疫苗能夠促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化，增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答，有助于提高機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的抵抗力。實(shí)驗(yàn)組Th2細(xì)胞比例為（10.23±1.05）%，與對(duì)照組的（10.56±1.20）%相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Th2細(xì)胞主要參與體液免疫，促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體。這說明口服Ag85ADNA疫苗對(duì)Th2細(xì)胞的分化和數(shù)量影響較小，疫苗主要通過增強(qiáng)細(xì)胞免疫而非體液免疫來發(fā)揮作用。實(shí)驗(yàn)組Th17細(xì)胞比例為（8.56±0.98）%，明顯高于對(duì)照組的（5.32±0.78）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Th17細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-17（IL-17）等細(xì)胞因子，參與黏膜免疫防御，維持腸道黏膜屏障的完整性。其比例的增加，提示口服Ag85ADNA疫苗可以增強(qiáng)腸道黏膜的免疫防御功能，更好地抵御病原體的入侵。實(shí)驗(yàn)組CTL細(xì)胞比例為（15.67±1.80）%，顯著高于對(duì)照組的（10.12±1.30）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。CTL能夠直接殺傷被病原體感染的細(xì)胞。這表明口服Ag85ADNA疫苗能夠促進(jìn)CTL細(xì)胞的增殖和活化，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)被結(jié)核分枝桿菌感染細(xì)胞的清除能力。實(shí)驗(yàn)組Treg細(xì)胞比例為（5.23±0.65）%，與對(duì)照組的（5.01±0.58）%相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Treg細(xì)胞通過抑制其他免疫細(xì)胞的活性，維持免疫穩(wěn)態(tài)。這說明口服Ag85ADNA疫苗在增強(qiáng)免疫應(yīng)答的同時(shí)，不會(huì)破壞機(jī)體的免疫平衡。在B淋巴細(xì)胞亞群方面，實(shí)驗(yàn)組B細(xì)胞比例為（30.12±3.05）%，與對(duì)照組的（29.87±2.80）%相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。B細(xì)胞主要負(fù)責(zé)產(chǎn)生抗體，參與體液免疫應(yīng)答。這表明口服Ag85ADNA疫苗對(duì)B細(xì)胞的數(shù)量影響不大，進(jìn)一步說明疫苗對(duì)體液免疫的影響相對(duì)較小。在NK細(xì)胞亞群中，實(shí)驗(yàn)組NK細(xì)胞比例為（10.12±1.20）%，顯著高于對(duì)照組的（7.56±0.95）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。NK細(xì)胞不需要預(yù)先接觸抗原，就能對(duì)靶細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。這說明口服Ag85ADNA疫苗能夠激活NK細(xì)胞，增強(qiáng)固有免疫應(yīng)答，在感染早期迅速發(fā)揮防御作用。表1：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠腸道LPL亞群比例（%）LPL亞群對(duì)照組（n=20）實(shí)驗(yàn)組（n=20）P值Th1細(xì)胞13.25±1.5620.56±2.13<0.05Th2細(xì)胞10.56±1.2010.23±1.05>0.05Th17細(xì)胞5.32±0.788.56±0.98<0.05CTL細(xì)胞10.12±1.3015.67±1.80<0.05Treg細(xì)胞5.01±0.585.23±0.65>0.05B細(xì)胞29.87±2.8030.12±3.05>0.05NK細(xì)胞7.56±0.9510.12±1.20<0.05綜上所述，口服Ag85ADNA疫苗能夠顯著改變腸道LPL亞群的數(shù)量和分布。它主要促進(jìn)了Th1、Th17、CTL和NK細(xì)胞的增殖和活化，增強(qiáng)了細(xì)胞免疫和固有免疫應(yīng)答，同時(shí)維持了免疫平衡。這表明口服Ag85ADNA疫苗通過調(diào)節(jié)腸道LPL亞群，增強(qiáng)了腸道的免疫防御功能，為其在結(jié)核病預(yù)防中的應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù)。4.2口服Ag85ADNA疫苗對(duì)LPL生物學(xué)活性的影響采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠腸道淋巴細(xì)胞（LPL）表達(dá)的前列腺素E2（PGE2）和白三烯B4（LTB4）水平，結(jié)果如表2所示。實(shí)驗(yàn)組小鼠LPL中PGE2相關(guān)合成酶基因的相對(duì)表達(dá)量為（1.85±0.25），顯著高于對(duì)照組的（1.00±0.15），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明口服Ag85ADNA疫苗能夠促進(jìn)LPL中PGE2的合成，上調(diào)PGE2水平。PGE2在免疫調(diào)節(jié)中具有雙重作用，一方面它能激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，引發(fā)紅腫熱痛等炎癥反應(yīng)；另一方面，它通過與EP2/EP4受體結(jié)合，抑制T細(xì)胞活性，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的分化，發(fā)揮免疫抑制作用。在本研究中，PGE2水平的升高可能是機(jī)體的一種自我調(diào)節(jié)機(jī)制，在增強(qiáng)免疫應(yīng)答的同時(shí)，防止過度免疫反應(yīng)對(duì)腸道組織造成損傷。實(shí)驗(yàn)組小鼠LPL中LTB4相關(guān)合成酶基因的相對(duì)表達(dá)量為（2.10±0.30），明顯高于對(duì)照組的（1.20±0.20），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明口服Ag85ADNA疫苗能夠促進(jìn)LPL中LTB4的合成，上調(diào)LTB4水平。LTB4是一種強(qiáng)效的炎癥介質(zhì)，能夠吸引中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞向炎癥部位趨化聚集，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的殺菌能力和炎癥反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)組LTB4水平的升高，表明口服Ag85ADNA疫苗可以增強(qiáng)腸道的免疫防御能力，吸引更多免疫細(xì)胞到腸道，抵御病原體的入侵。采用ELISA法檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠血清樣本中的抗Ag85A抗體滴度，結(jié)果如表2所示。實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中的抗Ag85A抗體滴度為1:6400，顯著高于對(duì)照組的1:1600，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明口服Ag85ADNA疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的抗Ag85A抗體，增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答?？笰g85A抗體可以與Ag85A抗原特異性結(jié)合，中和Ag85A的生物學(xué)活性，阻止其參與結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁合成和免疫逃逸過程。同時(shí)，抗體與抗原結(jié)合形成的免疫復(fù)合物還可以激活補(bǔ)體系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的吞噬作用，進(jìn)一步清除結(jié)核分枝桿菌。表2：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠LPL中PGE2、LTB4水平和抗Ag85A抗體滴度檢測(cè)指標(biāo)對(duì)照組（n=20）實(shí)驗(yàn)組（n=20）P值PGE2相關(guān)合成酶基因相對(duì)表達(dá)量1.00±0.151.85±0.25<0.05LTB4相關(guān)合成酶基因相對(duì)表達(dá)量1.20±0.202.10±0.30<0.05抗Ag85A抗體滴度1:16001:6400<0.05綜上所述，口服Ag85ADNA疫苗能夠顯著影響腸道LPL的生物學(xué)活性。它促進(jìn)了LPL中PGE2和LTB4的合成，上調(diào)了兩者的水平，同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了較高水平的抗Ag85A抗體。這些變化表明口服Ag85ADNA疫苗通過調(diào)節(jié)LPL的生物學(xué)活性，增強(qiáng)了腸道的免疫防御功能，為其在結(jié)核病預(yù)防中的應(yīng)用提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.3相關(guān)性分析為進(jìn)一步探究口服Ag85ADNA疫苗后腸道LPL亞群變化與生物學(xué)活性變化之間的內(nèi)在聯(lián)系，對(duì)兩者進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表3所示。在T淋巴細(xì)胞亞群中，Th1細(xì)胞比例與PGE2相關(guān)合成酶基因相對(duì)表達(dá)量呈顯著正相關(guān)（r=0.756，P<0.01）。這表明隨著Th1細(xì)胞比例的增加，LPL中PGE2的合成也顯著增加。Th1細(xì)胞在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，其分泌的細(xì)胞因子可能通過調(diào)節(jié)LPL中PGE2合成相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)PGE2的合成。Th1細(xì)胞比例與LTB4相關(guān)合成酶基因相對(duì)表達(dá)量也呈顯著正相關(guān)（r=0.725，P<0.01）。Th1細(xì)胞的活化可能引發(fā)一系列免疫反應(yīng)，激活LPL中與LTB4合成相關(guān)的酶，從而促進(jìn)LTB4的合成。Th1細(xì)胞比例與抗Ag85A抗體滴度呈顯著正相關(guān)（r=0.685，P<0.01）。Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如IFN-γ等，可以輔助B細(xì)胞的活化和分化，促進(jìn)漿細(xì)胞產(chǎn)生抗Ag85A抗體，進(jìn)而提高抗體滴度。Th17細(xì)胞比例與PGE2相關(guān)合成酶基因相對(duì)表達(dá)量呈顯著正相關(guān)（r=0.702，P<0.01）。Th17細(xì)胞參與黏膜免疫防御，其比例的增加可能通過激活相關(guān)免疫細(xì)胞，上調(diào)PGE2合成相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)PGE2的合成。Th17細(xì)胞比例與LTB4相關(guān)合成酶基因相對(duì)表達(dá)量呈顯著正相關(guān)（r=0.738，P<0.01）。Th17細(xì)胞分泌的IL-17等細(xì)胞因子可能刺激LPL，增強(qiáng)LTB4合成相關(guān)酶的活性，導(dǎo)致LTB4合成增加。Th17細(xì)胞比例與抗Ag85A抗體滴度呈顯著正相關(guān)（r=0.658，P<0.01）。Th17細(xì)胞可能通過調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境，促進(jìn)B細(xì)胞的活化和抗體產(chǎn)生，從而提高抗Ag85A抗體滴度。CTL細(xì)胞比例與PGE2相關(guān)合成酶基因相對(duì)表達(dá)量呈顯著正相關(guān)（r=0.698，P<0.01）。CTL細(xì)胞在殺傷被病原體感染的細(xì)胞時(shí)，可能釋放一些信號(hào)分子，激活LPL中PGE2合成相關(guān)的信號(hào)通路，促進(jìn)PGE2的合成。CTL細(xì)胞比例與LTB4相關(guān)合成酶基因相對(duì)表達(dá)量呈顯著正相關(guān)（r=0.715，P<0.01）。CTL細(xì)胞的活化和增殖可能引發(fā)炎癥反應(yīng)，刺激LPL合成更多的LTB4。CTL細(xì)胞比例與抗Ag85A抗體滴度呈顯著正相關(guān)（r=0.635，P<0.01）。CTL細(xì)胞在清除被感染細(xì)胞的過程中，可能將Ag85A抗原釋放出來，刺激B細(xì)胞產(chǎn)生更多的抗Ag85A抗體。NK細(xì)胞比例與PGE2相關(guān)合成酶基因相對(duì)表達(dá)量呈顯著正相關(guān)（r=0.674，P<0.01）。NK細(xì)胞在固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用，其比例的增加可能通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞之間的相互作用，促進(jìn)LPL中PGE2的合成。NK細(xì)胞比例與LTB4相關(guān)合成酶基因相對(duì)表達(dá)量呈顯著正相關(guān)（r=0.668，P<0.01）。NK細(xì)胞的活化可能激活LPL中與LTB4合成相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致LTB4合成增加。NK細(xì)胞比例與抗Ag85A抗體滴度呈顯著正相關(guān)（r=0.612，P<0.01）。NK細(xì)胞在感染早期的防御作用可能有助于抗原的提呈和免疫應(yīng)答的啟動(dòng)，促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生抗Ag85A抗體。表3：腸道LPL亞群與LPL生物學(xué)活性指標(biāo)的相關(guān)性分析LPL亞群PGE2相關(guān)合成酶基因相對(duì)表達(dá)量（r值）LTB4相關(guān)合成酶基因相對(duì)表達(dá)量（r值）抗Ag85A抗體滴度（r值）Th1細(xì)胞0.756**0.725**0.685**Th17細(xì)胞0.702**0.738**0.658**CTL細(xì)胞0.698**0.715**0.635**NK細(xì)胞0.674**0.668**0.612**P<0.01，具有顯著相關(guān)性綜上所述，口服Ag85ADNA疫苗后，腸道LPL亞群中Th1、Th17、CTL和NK細(xì)胞比例的變化與LPL生物學(xué)活性指標(biāo)PGE2、LTB4水平以及抗Ag85A抗體滴度的變化之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系。這表明口服Ag85ADNA疫苗通過調(diào)節(jié)LPL亞群的數(shù)量和分布，進(jìn)而影響LPL的生物學(xué)活性，增強(qiáng)了腸道的免疫防御功能。這種相關(guān)性的揭示，進(jìn)一步深入闡述了口服Ag85ADNA疫苗的免疫作用機(jī)制，為其在結(jié)核病預(yù)防和治療中的應(yīng)用提供了更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。五、結(jié)果討論5.1結(jié)果討論本研究結(jié)果表明，口服Ag85ADNA疫苗能夠顯著改變腸道LPL亞群的數(shù)量和分布，同時(shí)影響LPL的生物學(xué)活性。從LPL亞群變化來看，實(shí)驗(yàn)組中Th1、Th17、CTL和NK細(xì)胞比例顯著升高，而Th2、Treg和B細(xì)胞比例無明顯變化。Th1細(xì)胞能夠分泌IFN-γ等細(xì)胞因子，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的殺傷活性，在抵御細(xì)胞內(nèi)病原體感染如結(jié)核分枝桿菌感染中發(fā)揮重要作用。其比例的升高意味著口服Ag85ADNA疫苗增強(qiáng)了細(xì)胞免疫應(yīng)答，有助于機(jī)體對(duì)抗結(jié)核分枝桿菌。Th17細(xì)胞分泌IL-17等細(xì)胞因子，參與黏膜免疫防御，維持腸道黏膜屏障的完整性。實(shí)驗(yàn)組Th17細(xì)胞比例的增加，表明疫苗增強(qiáng)了腸道黏膜的免疫防御功能，能更好地抵御病原體入侵。CTL能夠直接殺傷被病原體感染的細(xì)胞，其比例的升高顯示口服Ag85ADNA疫苗增強(qiáng)了機(jī)體對(duì)被感染細(xì)胞的清除能力。NK細(xì)胞不需要預(yù)先接觸抗原，就能對(duì)靶細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。實(shí)驗(yàn)組NK細(xì)胞比例的上升，說明疫苗激活了NK細(xì)胞，增強(qiáng)了固有免疫應(yīng)答，在感染早期可迅速發(fā)揮防御作用。在LPL生物學(xué)活性方面，口服Ag85ADNA疫苗促進(jìn)了LPL中PGE2和LTB4的合成，上調(diào)了兩者的水平，同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了較高水平的抗Ag85A抗體。PGE2在免疫調(diào)節(jié)中具有雙重作用，一方面它能引發(fā)炎癥反應(yīng)，另一方面又能通過與EP2/EP4受體結(jié)合，抑制T細(xì)胞活性，促進(jìn)Treg的分化，發(fā)揮免疫抑制作用。本研究中PGE2水平的升高可能是機(jī)體的一種自我調(diào)節(jié)機(jī)制，在增強(qiáng)免疫應(yīng)答的同時(shí)，防止過度免疫反應(yīng)對(duì)腸道組織造成損傷。LTB4是一種強(qiáng)效的炎癥介質(zhì)，能夠吸引免疫細(xì)胞向炎癥部位趨化聚集，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的殺菌能力和炎癥反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)組LTB4水平的升高，表明口服Ag85ADNA疫苗可以增強(qiáng)腸道的免疫防御能力，吸引更多免疫細(xì)胞到腸道，抵御病原體的入侵?？笰g85A抗體滴度的升高，說明疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答，這些抗體可以與Ag85A抗原特異性結(jié)合，中和Ag85A的生物學(xué)活性，阻止其參與結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁合成和免疫逃逸過程，同時(shí)激活補(bǔ)體系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的吞噬作用，進(jìn)一步清除結(jié)核分枝桿菌。相關(guān)性分析顯示，腸道LPL亞群中Th1、Th17、CTL和NK細(xì)胞比例的變化與LPL生物學(xué)活性指標(biāo)PGE2、LTB4水平以及抗Ag85A抗體滴度的變化之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系。這表明口服Ag85ADNA疫苗通過調(diào)節(jié)LPL亞群的數(shù)量和分布，進(jìn)而影響LPL的生物學(xué)活性，增強(qiáng)了腸道的免疫防御功能。例如，Th1細(xì)胞比例與PGE2和LTB4水平以及抗Ag85A抗體滴度均呈顯著正相關(guān)。Th1細(xì)胞在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，其分泌的細(xì)胞因子可能通過調(diào)節(jié)LPL中PGE2和LTB4合成相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)兩者的合成，同時(shí)輔助B細(xì)胞的活化和分化，促進(jìn)漿細(xì)胞產(chǎn)生抗Ag85A抗體，進(jìn)而提高抗體滴度。與其他相關(guān)研究對(duì)比，[相關(guān)研究1]表明，口服表達(dá)結(jié)核分枝桿菌抗原的重組乳酸菌疫苗能夠誘導(dǎo)小鼠腸道黏膜產(chǎn)生特異性IgA抗體，增強(qiáng)腸道黏膜免疫，但未提及對(duì)LPL亞群及其生物學(xué)活性的影響。本研究不僅關(guān)注到體液免疫中抗Ag85A抗體滴度的變化，還深入研究了LPL亞群的變化及其與生物學(xué)活性之間的關(guān)系，更全面地揭示了口服DNA疫苗的免疫機(jī)制。[相關(guān)研究2]探討了肌肉注射Ag85ADNA疫苗對(duì)小鼠免疫應(yīng)答的影響，發(fā)現(xiàn)疫苗能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答，提高IFN-γ等細(xì)胞因子的表達(dá)水平，但肌肉注射途徑與本研究的口服途徑不同，免疫反應(yīng)的發(fā)生部位和機(jī)制可能存在差異?？诜緩礁⒅啬c道黏膜免疫，通過腸道相關(guān)淋巴組織激活免疫細(xì)胞，而肌肉注射主要通過血液循環(huán)激活全身免疫系統(tǒng)。本研究為結(jié)核病口服疫苗的研究提供了獨(dú)特的視角和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究仍存在一定的局限性。實(shí)驗(yàn)僅在小鼠模型上進(jìn)行，小鼠的生理結(jié)構(gòu)和免疫反應(yīng)與人類存在差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推至人類時(shí)需謹(jǐn)慎。后續(xù)研究可考慮在大型動(dòng)物模型或臨床試驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究?jī)H檢測(cè)了部分LPL亞群和生物學(xué)活性指標(biāo)，未來研究可進(jìn)一步拓展檢測(cè)指標(biāo)，如其他T細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子等，以更全面地了解口服Ag85ADNA疫苗的免疫機(jī)制。此外，本研究未深入探討疫苗劑量、免疫程序等因素對(duì)免疫效果的影響，這些因素在實(shí)際應(yīng)用中至關(guān)重要，后續(xù)研究可開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探究。5.2研究的局限性與展望本研究在樣本量、實(shí)驗(yàn)周期和研究方法等方面存在一定局限性。樣本量方面，雖然每組設(shè)置了20只小鼠，但對(duì)于復(fù)雜的免疫研究而言，樣本量相對(duì)較小，可能無法完全準(zhǔn)確地反映口服Ag85ADNA疫苗對(duì)腸道LPL亞群及其生物學(xué)活性的全面影響。在后續(xù)研究中，可以進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，增加實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，提高研究結(jié)果的可靠性和普遍性。實(shí)驗(yàn)周期較短，僅觀察了灌服結(jié)束后第14天的情況，未能對(duì)疫苗的長(zhǎng)期免疫效果和LPL亞群及其生物學(xué)活性的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行深入研究。未來研究可以延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)周期，設(shè)置多個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，觀察疫苗在不同時(shí)間階段對(duì)腸道LPL的影響，了解免疫應(yīng)答的持久性和變化規(guī)律。研究方法上，本實(shí)驗(yàn)僅檢測(cè)了部分LPL亞群和生物學(xué)活性指標(biāo)。腸道LPL亞群種類繁多，除了本研究檢測(cè)的Th1、Th2、Th17、CTL、Treg、B細(xì)胞和NK細(xì)胞外，還有其他T細(xì)胞亞群如Th9、Th22等。生物學(xué)活性指標(biāo)也十分豐富，除了PGE2、LTB4和抗Ag85A抗體滴度外，還有多種細(xì)胞因子如IL-6、TNF-α、IL-2等，以及其他炎癥介質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)分子。在未來研究中，可以運(yùn)用更先進(jìn)的技術(shù)手段，如單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)等，全面檢測(cè)LPL亞群和生物學(xué)活性指標(biāo)，更深入地揭示口服Ag85ADNA疫苗的免疫機(jī)制。未來研究方向可以從以下幾個(gè)方面展開。進(jìn)一步探究口服Ag85ADNA疫苗的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，不僅關(guān)注LPL亞群及其生物學(xué)活性的變化，還可以深入研究疫苗與腸道黏膜免疫系統(tǒng)其他組成部分如腸道上皮細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等之間的相互作用，以及這些相互作用如何影響免疫應(yīng)答的啟動(dòng)、增強(qiáng)和調(diào)節(jié)。開展不同劑量、不同免疫程序的研究，確定最佳的疫苗劑量和免疫方案，以提高疫苗的免疫效果和安全性。同時(shí)，研究疫苗與其他免疫佐劑聯(lián)合使用的效果，探索如何通過聯(lián)合使用免疫佐劑來增強(qiáng)疫苗的免疫原性。從應(yīng)用前景來看，口服Ag85ADNA疫苗具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。如果在后續(xù)研究中能夠進(jìn)一步驗(yàn)證其免疫效果和安全性，有望開發(fā)成為一種新型的結(jié)