1T/HNSBSXH10—2025羅漢果中8種羅漢果皂苷的含量測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法本文件規(guī)定了羅漢果中8種羅漢果皂苷含量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。本文件適用于羅漢果中羅漢果皂苷Ⅱe、羅漢果皂苷Ⅲ、羅漢果皂苷Ⅳ、羅漢果皂苷Ⅳa、賽門苷Ⅰ、羅漢果皂苷Ⅴ、異羅漢果皂苷Ⅴ和11-O-羅漢果皂苷Ⅴ等8種羅漢果皂苷含量的測定，其他羅漢果產(chǎn)品可參考執(zhí)行。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1羅漢果皂苷Mogrosides羅漢果皂苷是以羅漢果醇為母核經(jīng)糖基化修飾后形成的一系列葫蘆烷型四環(huán)三萜皂苷化合物，包括羅漢果皂苷Ⅱe、羅漢果皂苷Ⅲ、羅漢果皂苷Ⅳ、羅漢果皂苷Ⅳa、賽門苷Ⅰ、羅漢果皂苷Ⅴ、異羅漢果皂苷Ⅴ和11-O-羅漢果皂苷Ⅴ等。4符號本文件沒有需要特別說明的符號。5原理羅漢果樣品中的羅漢果皂苷類化合物用甲醇水溶液超聲提取,采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定,外標(biāo)法定量。6試劑和材料除非另有規(guī)定,所有試劑均為分析純。6.1試劑6.1.1水:GB/T6682,一級。6.1.2甲醇(CH4O):色譜純。6.1.3乙腈(C2H3N):色譜純。T/HNSBSXH10—202526.1.4甲酸(CH2O2):色譜純。6.2試劑配制6.2.180%甲醇溶液:取80mL甲醇,加水定容至100mL,混勻。6.3標(biāo)準(zhǔn)品羅漢果皂苷類化合物標(biāo)準(zhǔn)品:相關(guān)信息見表1,純度不低于98%。表1羅漢果皂苷類化合物標(biāo)準(zhǔn)品基本信息表序號中文名稱英文名稱分子量CAS號1羅漢果皂苷IIeMogrosideIIe801.0188901-38-62羅漢果皂苷IIIMogrosideIII963.15130567-83-83賽門苷ISiamenosideI1125.30126105-12-24羅漢果皂苷IVMogrosideIV1125.3089590-95-45羅漢果皂苷IVaMogrosideIVa1125.3088901-41-16羅漢果皂苷VMogrosideV1287.4388901-36-4711-O-羅漢果皂苷V11-oxo-mogrosideV1285.42126105-11-18異羅漢果皂苷VIsomogrosideV1287.431126032-65-26.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制6.4.1羅漢果皂苷類化合物標(biāo)準(zhǔn)儲備液:準(zhǔn)確稱取8種(表1)待測物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解后,加入80%甲醇溶液定量稀釋,制成高濃度單標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。分別移取一定量的8種單標(biāo)準(zhǔn)品儲備液于25mL容量瓶,80%甲醇溶液定容,制成0.1mg/mL的母液作為標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。避光2~4℃以下保存,備用。6.4.2羅漢果皂苷類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:用80%甲醇溶液對0.1mg/mL的母液稀釋配成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。7儀器設(shè)備7.1超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源(ESI)。7.2電熱鼓風(fēng)干燥箱：溫度50℃~330℃,功率3.1kW。7.3超聲波清洗器：超聲輸人功率300W。7.4離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于7500r/min。7.5不銹鋼粉碎機(jī)：細(xì)度50目~300目,功率1.4kW。7.6天平：感量0.001g和0.0001g。7.7微量移液器：10μL~100μL和100μL~1000μL。8試樣制備8.1試樣制備將羅漢果樣品混合均勻，分出0.5kg作為試樣，用粉碎機(jī)粉碎并通過孔徑20目篩。混勻密封，并做標(biāo)記。T/HNSBSXH10—202538.2試樣提取稱取羅漢果粉末0.5g(精確至0.0001g),置于50mL離心管中,加人25mL80%甲醇溶液，室溫下超聲提取30min。于7500r/min離心5min,將上清液轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中。沉淀物再用80%甲醇溶液重復(fù)提取一次，在相同條件下離心5min,合并上清液,80%甲醇溶液定容至100mL。上樣前,采用0.22μm有機(jī)相濾膜過濾。9測定9.1超高效液相色譜參考條件9.1.1色譜柱:AgilentPoroshell120SBC18(100mm×2.1mm,2.7μm)或性能相當(dāng)者;9.1.2流動相A:0.1%甲酸水溶液,取0.1mL甲酸(5.1.3)加水(5.1.1)定容至100mL,混勻。9.1.4柱溫:室溫;9.1.5流速:0.2mL/min;9.1.6進(jìn)樣量:2μL;9.1.7流動相:梯度洗脫程序見表2。表2流動相及梯度洗脫程序步驟運(yùn)行時間/min流動相水相/%流動相乙腈/%0080132536040418.01805809.2質(zhì)譜參考條件9.2.1掃描方式:負(fù)離子掃描:9.2.2離子化電壓:4500V;9.2.3離子源溫度:550℃;9.2.4氣簾氣:氮?dú)?純度為97%以上),壓力為20psi;9.2.5霧化氣:氮?dú)?純度為97%以上),氣壓為55psi;9.2.6輔助氣:氮?dú)?純度為97%以上),氣壓為45psi:9.2.7檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);9.2.8羅漢果皂苷類化合物保留時間和監(jiān)測離子對信息見附錄A。9.3供試樣品的測定在儀器的最佳條件下,分別取羅漢果皂苷類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液與羅漢果樣品上機(jī)測定?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液中8種羅漢果皂苷總離子色譜圖和各組分離子色譜圖見附錄B。9.4定性測量在相同試驗條件下測定試樣和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,若樣品溶液中檢出色譜峰的保留時間與基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)物色譜峰的保留時間一致(變化范圍在±2.5%),且樣品溶液的質(zhì)譜離子對4相對豐度與濃度相當(dāng)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)譜離子對相對豐度相比較,相對離子豐度的相對偏差不超過表3規(guī)定的范圍,則可判定樣品中存在該組分?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液中各羅漢果皂苷離子色譜圖見附錄B。表3定性測定時相對離子豐度的最大允許誤差相對離子豐度，%>50>20~50>10~20允許的相對偏差，%9.5定量測量以不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo),色譜峰面積(響應(yīng)值)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.99。試樣溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍內(nèi)。如超出線性范圍,應(yīng)重新試驗或?qū)⒃嚇尤芤汉突|(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液作相應(yīng)稀釋后重新測定。單點(diǎn)校準(zhǔn)定量時,試樣溶液中待測物的濃度與溶劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度相差不超過30%。9.6結(jié)果計算用液相色譜-質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理軟件或者按照公式計算試樣中檢測目標(biāo)物量，按公式(1)計式中:W—試樣中羅漢果皂苷類化合物的含量的數(shù)值,單位為毫克每千克(mg/kg);A—樣品中羅漢果皂苷類化合物的峰面積;ρi—標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的數(shù)值,單位為毫克每升(mg/L);V—定容體積的數(shù)值,單位為毫升(mL);f—稀釋倍數(shù);Ai—標(biāo)樣中羅漢果皂苷類化合物的峰面積;m—最終溶液所代表的試樣質(zhì)量的數(shù)值,單位為克(g)。注:計算結(jié)果應(yīng)扣除空白值,測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示,保留3位有效數(shù)字。10精密度10.1重復(fù)性在重復(fù)性條件下獲得的2次獨(dú)立的測定結(jié)果的絕對差值不大于這2個測定值的算術(shù)平均值的15%。10.2再現(xiàn)性在再現(xiàn)性條件下獲得的2次獨(dú)立的測試結(jié)果的絕對差值不大于2個測定值的算術(shù)平均值T/HNSBSXH10—2025(資料性附錄)羅漢果皂苷類化合物保留時間、監(jiān)測離子對信息羅漢果皂苷類化合物保留時間和監(jiān)測離子對信息見表A.1.表A.1羅漢果皂苷類化合物保留時間和監(jiān)測離子對信息中文名稱保留時間min前體離子m/z碎片離子m/z去簇電壓碰撞電壓羅漢果皂苷IIe13.86799.5-170-65羅漢果皂苷III12.04961.6-170-70賽門苷I10.171123.6-220-75羅漢果皂苷IV11.221123.6-220-75羅漢果皂苷IVa10.641123.6-220-75羅漢果皂苷V8.431285.8-220-9011-O-羅漢果皂苷V6.321283.7-220-85異羅漢果皂苷V9.511285.8-220-90注：q為定量離子。6（規(guī)范性附錄）8種羅漢果皂苷類化合物總離子流圖和各組分離子色譜圖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中8種羅漢果皂苷類化合物總離子色譜圖見圖B.1，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中8種羅漢果皂苷類化合物各組分離子色譜圖見圖B.2。B.1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中8種羅漢果皂苷類化合物總離子色譜圖圖B.1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中8種羅漢果皂苷類化合物總離子色譜圖T/HNSBSXH10—20257B.2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中8種羅漢果皂苷類化合物各組分離子色譜圖圖B.2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中8種羅漢果皂苷類化合物各組分離子色譜圖T/HNSBSXH10—20258參考文獻(xiàn)[1]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典（第一部）[M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015，212．[2]馬小軍，莫長明．藥用甜料植物羅漢果遺傳資源的挖掘與創(chuàng)新[M]．人民衛(wèi)生出版社，2024．[3]LeeC.IntensesweetenerfromLoHanKuo(Momordicagrosvenori)[J].Experientia,1975,31(5):533-534.[4]KasaiR,MatsumotoK,NieRL,etal.GlycosidesfromChinesemedicinalplant,Hemsleyapanacis-scandens,andstructure-tasterelationshipofcucurbitanglycoside[J].Chem.Pharm.Bull,1988,36(1):234-243.[5]MurataY,YoshikawaS,SuzukiYA.Sweetnesscharacteristicsofthetri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