滇池海東濕地放線菌的分離鑒定及抗菌活性檢測(cè)摘要濕地放線菌的研究目前已成為世界范圍內(nèi)的熱門學(xué)科，也屬于前沿領(lǐng)域。中國(guó)濕地狀況目前形勢(shì)極其嚴(yán)峻，隨著科學(xué)技術(shù)技術(shù)的發(fā)展，濕地生態(tài)日益遭到破壞，面積在不斷減少，如果繼續(xù)這樣下去，環(huán)境危機(jī)不可避免。通過對(duì)濕地放線菌的研究與探索，可以更好的幫助我們了解濕地破壞的關(guān)鍵以及采取相應(yīng)的措施治理以及恢復(fù)其生態(tài)功能，繼續(xù)造福人類。放線菌是一種能產(chǎn)生多種有益代謝產(chǎn)物的微生物菌株，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。它有廣泛的來源和品種，特別是在濕地。通過對(duì)放線菌的培養(yǎng)、篩選、鑒定及其抗菌活性的研究，可以更好地掌握放線菌的生理生化特性、代謝過程和繁殖，更好、更方便地為人類服務(wù)。云南是世界三大喀斯特集中區(qū)之一。微生物是濕地土壤中最活躍的部分，是生態(tài)系統(tǒng)能量流和物質(zhì)循環(huán)的主要驅(qū)動(dòng)力，而且放線菌能產(chǎn)生大量具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物，對(duì)人類有很大作用。因此，對(duì)土壤放線菌的研究具有重要的價(jià)值。特殊的地理位置，亞熱帶季風(fēng)氣候和豐富多樣的生態(tài)環(huán)境，不僅創(chuàng)造了滇池海東濕地的特殊地貌，而且為濕地的微生物提供了特殊的棲息地。該地區(qū)的放線菌具有明顯的特征。為此，對(duì)海東濕地保護(hù)區(qū)放線菌資源進(jìn)行了探索、分離和鑒定，并對(duì)放線菌資源進(jìn)行開發(fā)和利用，從而達(dá)到可持續(xù)發(fā)展和環(huán)境保護(hù)，具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。本文針對(duì)于昆明滇池海東濕地土壤放線菌展開研究，通過對(duì)放線菌進(jìn)行培養(yǎng)，篩選，分離與鑒定，最后再對(duì)其進(jìn)行一系列的檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析，得出結(jié)論。采樣時(shí)的取樣法為柱狀取樣法，實(shí)驗(yàn)中，通過培養(yǎng)，分離和篩選，最后得到13株菌種。緊接著提取菌DNA，DNA提取方法為試劑盒法和酶法，然后將菌種的DNA進(jìn)行PCR操作，PCR產(chǎn)物送往測(cè)序公司進(jìn)行16SrDNA基因測(cè)序分析。將有效序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，最后得出菌種為鞘孢囊菌（Elytrosporangium）；對(duì)其進(jìn)行生理生化特性實(shí)驗(yàn)以及抗菌活性檢測(cè)等一系列實(shí)驗(yàn)過程，最后得出結(jié)果是:鞘孢囊菌（Elytrosporangium）能明顯使明膠液化以及能夠產(chǎn)生淀粉酶，除此之外，鞘孢囊菌（Elytrosporangium）對(duì)大腸桿菌和假單孢菌有輕微抑菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌有較重的抑制性。關(guān)鍵詞：放線菌濕地分離鑒定抑菌性凝膠電泳AbstractTheresearchofactinomycetesinwetlandhasbecomeahotsubjectintheworld，andalsobelongstothefrontierfield.Withthedevelopmentofscienceandtechnology，thewetlandecologyhasbeendestroyeddaybydayandtheareahasbeendecreasing.Ifwecontinuetodoso，theenvironmentalcrisiswillbeinevitable.Throughtheresearchandexplorationofwetlandactinomycetes，wecanbetterunderstandthekeytowetlanddestructionandtakeappropriatemeasurestocontrolandrestoreitsecologicalfunctions，andcontinuetobenefitmankind.Actinomycesisakindofmicrobialstrainwhichcanproducemanybeneficialmetabolitesandhashigheconomicvalue.Ithasawiderangeofsourcesandvarieties，especiallyinwetlands.Throughthestudyoftheculture，screening，identificationandantimicrobialactivityofactinomycetes，wecanbettergraspthephysiologicalandbiochemicalcharacteristics，metabolicprocessandreproductionofactinomycetes，andservehumanbetterandmoreconveniently.Yunnanisoneofthethreemajorkarstconcentrationareasintheworld.Microorganismisthemostactivepartofwetlandsoilandthemaindrivingforceofenergyflowandmaterialcycleinecosystem.Actinomycetescanproducealargenumberofbioactivesecondarymetabolites，whichplayanimportantroleinhumanbeings.Therefore，thestudyofsoilactinomycetesisofgreatvalue.Thespecialgeographicallocation，subtropicalmonsoonclimateandrichanddiverseecologicalenvironmentnotonlycreatethespeciallandformofHaidongwetlandinDianchiLake，butalsoprovideaspecialhabitatforwetlandmicroorganisms.Actinomycetesinthisareahaveobviouscharacteristics.Therefore，itisofgreattheoreticalandpracticalsignificancetoexplore，isolateandidentifytheActinomycetesResourcesinHaidongWetlandReserve，andtodevelopandutilizetheActinomycetesResourcessoastoachievesustainabledevelopmentandenvironmentalprotection.Inthispaper，thesoilactinomycetesofHaidongwetlandinDianchiLakeofKunmingwerestudied.Throughthecultivation，screening，isolationandidentificationofactinomycetes，aseriesoftestsanddataanalysiswerecarriedouttodrawconclusions.Samplingmethodiscolumnarsamplingmethod.Intheexperiment，13strainsofbacteriawereobtainedthroughculture，isolationandscreening.TheDNAofthestrainwasextractedbyKitMethodandenzymaticmethod，thentheDNAofthestrainwasoperatedbyPCR，andtheproductofPCRwassenttothesequencingcompanyfor16SrDNAgenesequencinganalysis.BycomparingtheeffectivesequencesinNCBIdatabase，weconcludethatthestrainisSphingocystisspp.andthephysiologicalandbiochemicalcharacteristicsofthestrainandthedetectionofitsantimicrobialactivityaretested.TheresultsshowthatSphingocystisspp.canliquefygelatinandproduceamylase.Inaddition，Sphingocystisspp.hasslightantimicrobialactivityagainstEscherichiacoliandPseudomonasspp.andhasslightantimicrobialactivityagainstStaphylococcusaureus.Coccihaveastronginhibitoryeffect.Keywords:ActinomycetesWetlandIsolationandidentificationBacteriostaticactivityGelelectrophoresis目錄第一章文獻(xiàn)綜述 11.1濕地生態(tài)系統(tǒng) 11.1.1濕地生態(tài)系統(tǒng)定義 .2放線菌菌株在光學(xué)顯微鏡下形態(tài)123456789101112圖3.2放線菌菌株在電子顯微鏡下的形態(tài)特征將在采集的土壤樣本經(jīng)過培養(yǎng)后再經(jīng)過多次篩選后得到的菌株放到光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，如圖3.2可以看到每株菌種菌絲非常明顯，放線菌數(shù)量很多，且呈不均勻狀態(tài)分布在培養(yǎng)基上。3.3菌株的分子生物學(xué)鑒定（瓊脂糖凝膠電泳圖和PCR圖）圖3.3凝膠電泳圖根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳圖可以看出，圖中模糊能看到一些熒光條帶，證明確實(shí)含有DNA，可以進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而且還能看到，放線菌菌種序列長(zhǎng)度大概在1100到1300之間，不算是很高。圖3.4PCR圖將DNA進(jìn)行擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物送往測(cè)序公司進(jìn)行16SrDNA基因測(cè)序分析。將有效序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，將同源性最高序列定為參照菌株，最后得出結(jié)論，菌株為鞘孢囊菌（Elytrosporangium），其測(cè)序數(shù)列如下：CCCGATGATAACCGTGGTACCGTCCTCCCGAAGGTTAGACTAGCTACTTCTGGTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGACATTCTGATTCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGATCGGTTTTATGGGATTAGCTCCACCTCGCGGCTTGGCAACCCTTTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCACCATTACGTGCTGGTAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAATGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCATTGGATGTCAAGGCCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCG3.4鞘孢囊菌的生理生化特征3.4.1明膠液化圖3.5明膠實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)定鞘孢囊菌（Elytrosporangium）產(chǎn)生蛋白酶的能力。將菌株接種于明膠培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)，分別于第5、7、9天觀察液化程度。觀察前，應(yīng)變管在冰箱中冷卻半小時(shí)。如果明膠凝固成固態(tài)，就意味著它不液化。如果培養(yǎng)基中有液體，說明明膠已經(jīng)液化。如圖，明膠已徹底液化。3.4.2淀粉水解圖3.6淀粉水解實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)定鞘孢囊菌能否產(chǎn)生淀粉酶。將菌種接種在淀粉瓊脂平板上，28℃培養(yǎng)10天，然后在菌落周圍滴上Logol碘溶液。當(dāng)菌落周圍出現(xiàn)透明圈時(shí)，菌種產(chǎn)生的淀粉酶透明圈的大小表明了淀粉酶活性的強(qiáng)度。如果菌落染成藍(lán)色，沒有透明的圓形，菌株就不會(huì)產(chǎn)生淀粉酶。如圖所示，鞘孢囊菌能產(chǎn)生淀粉酶，從而使淀粉水解。3.5抗菌活性實(shí)驗(yàn)3.5.1濾紙片法大腸桿菌圖3.7大腸桿菌濾紙片法實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖所示，通過插片法實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，鞘孢囊菌對(duì)大腸桿菌有輕微的抑制性，抑菌圈較小，抑菌直徑如下圖表格：抑菌直徑表菌株序號(hào)直徑31.92.01.8表3.1大腸桿菌抑菌直徑由表格可以看出，大腸桿菌的抑菌直徑在1.2到2.0之間，算是比較小的抑菌直徑，說明鞘孢囊菌對(duì)大腸桿菌只有輕微抑制性。假單孢菌圖3.8假單孢菌濾紙片法實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖所示，通過插片法實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，鞘孢囊菌對(duì)假單孢菌有輕微的抑制性，抑菌圈較小，抑菌直徑如下圖表格：抑菌直徑表菌株號(hào)直徑表3.2假單孢菌抑菌直徑由表格可以看出，大腸桿菌的抑菌直徑在1.2到1.9之間，算是比較小的抑菌直徑，說明鞘孢囊菌對(duì)假單孢菌只有輕微抑制性。金色葡萄球菌圖3.9濾紙片法實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖所示，通過插片法實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，鞘孢囊菌對(duì)金色葡萄球菌有較重的抑制性，抑菌圈較大，抑菌直徑如下圖表格：抑菌直徑表菌株號(hào)直徑表3.3金色葡萄球菌抑菌直徑由表格可以看出，金色葡萄球菌的抑菌直徑在1.5到2.3之間，算是比較大的抑菌直徑，說明鞘孢囊菌對(duì)金色葡萄球菌有較重的抑制性。

第四章結(jié)論與討論4.1結(jié)論分析4.1.1放線菌的形態(tài)特征將在采集的土壤樣本經(jīng)過培養(yǎng)后再經(jīng)過多次篩選后經(jīng)肉眼以及放到實(shí)驗(yàn)室光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，圖3.1和圖3.2可以觀察到放線菌的菌落形態(tài)為干燥、不透明、表面呈致密的絲絨狀，上有一薄層彩色的“干粉”；菌落和培養(yǎng)基的連接緊密，難以挑??；菌落的正反面顏色非常不一致，以及在菌落邊緣的瓊脂平面有變形的現(xiàn)象等等。4.1.2放線菌的生理生化特征經(jīng)過明膠液化實(shí)驗(yàn)，由圖3.5可以看出，在含有放線菌菌株的培養(yǎng)基經(jīng)過一周的·培養(yǎng)后拿出來進(jìn)行觀察，原本是固體狀態(tài)的培養(yǎng)基已經(jīng)完全被液化，說明放線菌在生長(zhǎng)過程中產(chǎn)酶能力強(qiáng)，由于新陳代謝過程，能產(chǎn)生大量酶從而能使明膠液化。經(jīng)過淀粉水解實(shí)驗(yàn)，由圖3.6可以看出，將放線菌接種到淀粉瓊脂平板上后，經(jīng)過10天的培養(yǎng)，將培養(yǎng)基拿出，在菌落周圍加Lugol碘液，會(huì)明顯的看到菌落周圍呈現(xiàn)出透明色，而且光圈范圍特別大，說明放線菌在生長(zhǎng)時(shí)的新陳代謝中會(huì)產(chǎn)生大量的淀粉酶，由此，我們可以根據(jù)這一特性，將其進(jìn)行工廠化培養(yǎng)，生產(chǎn)更多利于人類的有用淀粉酶。4.1.3菌株的分子生物學(xué)鑒定（電泳圖和PCR圖）本實(shí)驗(yàn)用細(xì)菌16Sr DNA的PCR擴(kuò)增引物為細(xì)菌通用引物，對(duì)放線菌菌種16SrDNA基因進(jìn)行擴(kuò)增。圖3.3為菌株放線菌的16SrDNA電泳圖。圖3.4為放線菌的PCR圖，結(jié)果顯示，放線菌菌種序列長(zhǎng)度大概在1100bp-1300bp左右。測(cè)序結(jié)果通過NCBI的BLAST程序?qū)Ρ?，再根?jù)圖3.1和3.2的肉眼形態(tài)觀察和光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)觀察，最后結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征，確定為鞘孢囊菌。4.1.4鞘孢囊菌抗菌活性檢測(cè)由圖3.7~3.9和表3.1~3.3可以看出，將菌種浸泡入菌液后，放入三片濾紙片直到其完全浸泡濕潤(rùn)，用鑷子夾出放入培養(yǎng)基事先打好的凹槽中，最后結(jié)果顯示，鞘孢囊菌對(duì)假單孢菌和大腸桿菌有輕微的抑制性，對(duì)金黃色葡萄球菌有較重的抑制性，所以，在前兩者的生長(zhǎng)過程中有輕微的影響，菌種都偏正常生長(zhǎng)，抑菌圈小，且數(shù)量繁多，然而，在金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基上，菌株的生長(zhǎng)受到了一定的抑制，菌種數(shù)量偏少。4.2討論首先，在本論文的實(shí)驗(yàn)過程中，有諸多的程序以及實(shí)驗(yàn)方法，其中比較重要的是DNA的提取，PCR擴(kuò)增以及16SrDNA測(cè)序。在DNA的提取時(shí)，我們分別實(shí)行了兩種方法，分別是酶法和試劑盒法，最后發(fā)現(xiàn)試劑盒法效果比較顯著，只是操作較為復(fù)雜；PCR擴(kuò)增時(shí)，一定要清楚反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件，稍有差池結(jié)果都有很大差別；16SrDNA測(cè)序是目前世界范圍內(nèi)較為專業(yè)也是很普遍的測(cè)序方法，根據(jù)測(cè)序數(shù)列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，再根據(jù)其外貌形態(tài)特征判斷出菌株種類。在實(shí)驗(yàn)操作中，絕大部分的儀器都需要進(jìn)行高壓滅菌以及潔凈操作，一些操作需要在超凈工作臺(tái)里進(jìn)行稍有不慎就會(huì)污染菌種，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而且，實(shí)驗(yàn)中還會(huì)接觸一些危險(xiǎn)性化學(xué)藥品，所以，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要注意自身安全，遵守實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，嚴(yán)格進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其次，本文的目的是通過對(duì)滇池海東濕地的土壤微生物放線菌進(jìn)行培養(yǎng)，篩選，以及分離和鑒定，通過16SrDNA測(cè)序方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定，最后再結(jié)合其外觀形體特征，確定其具體是什么菌種，再對(duì)其進(jìn)行生理生化測(cè)試以及抗菌活性檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果分析它的生化功能和代謝途徑，以便于更好的服務(wù)社會(huì)。生理生化特征的測(cè)定能夠反映菌株的本質(zhì)屬性特征，是微生物本身某種代謝產(chǎn)生的途徑或者是某種酶的特有的表現(xiàn)，通過這些特征可以區(qū)分不同的微生物類群。根據(jù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)鞘孢囊菌生理生化特征為：鞘孢囊菌放到明膠培養(yǎng)基上后，會(huì)將明膠液化，從而培養(yǎng)基變成液體；淀粉水解實(shí)驗(yàn)中，鞘孢囊菌能產(chǎn)生淀粉酶，將淀粉水解，然后滴加Lugol碘液呈現(xiàn)透明。根據(jù)這一特性，人們可以嘗試性的進(jìn)行工廠化操作，擴(kuò)大培養(yǎng)，將會(huì)給人們帶來巨大的收益。最后，濕地放線菌的研究與探索是建立在分子學(xué)水平上的科學(xué)研究，在全世界范圍內(nèi)都屬于前言領(lǐng)域和頂尖科技，能在這一領(lǐng)域取得的絲毫進(jìn)展都將推動(dòng)微生物科學(xué)向前飛速發(fā)展。中國(guó)濕地目前狀況不容樂觀，面積不斷縮小，污染日益加重，而放線菌又是濕地中的重要角色，對(duì)濕地起著中要作用，所以對(duì)濕地放線菌的研究勢(shì)在必行。微生物就是一個(gè)巨大的資源庫，它對(duì)人類的發(fā)展無可代替，它已經(jīng)滲透到人類生產(chǎn)生活中的方方面面；生物制藥，污水處理，工業(yè)生產(chǎn)，醫(yī)療都有它的影子。前世界首富比爾蓋茨說過，下一個(gè)世界首富必將出自生物領(lǐng)域，21世紀(jì)屬于生物領(lǐng)域，微生物又是生物領(lǐng)域的重要組成部分，將來一定會(huì)發(fā)展越來越快，越來越好。參考文獻(xiàn)[1]陸健健，何文珊，童春富

，等.

濕地生態(tài)學(xué)[M].北京:高等教育出版社，2006.[2]黃新南.食物鏈與生態(tài)金字塔圖[J].中學(xué)生物教學(xué)，1998(4):45-45.[3]CostanzaR，DArge、R，GrootR，etal.Thevalueoftheworldsecosystemservicesandnaturalcapital[J].Nature，1997，387(15):253-260[4]呂磊，劉春學(xué).滇池濕地生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能價(jià)值評(píng)估[J].環(huán)境科學(xué)導(dǎo)刊，2010，29(1):76-80.[5]孟祥麗，張麗芬，張文杰，等.我國(guó)濕地生態(tài)系統(tǒng)現(xiàn)狀綜述[J].生物技術(shù)世界，2013(7):18-18.[6]韓大勇，楊永興，楊楊，等.濕地退化研究進(jìn)展[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2012，32(4):1293-1307.[7]楊永興.國(guó)際濕地科學(xué)研究進(jìn)展和中國(guó)濕地科學(xué)研究?jī)?yōu)先領(lǐng)域與展望[J].地球科學(xué)進(jìn)展，2002，17(4):508-514.[8]徐麗華.放線菌系統(tǒng)學(xué)[M].科學(xué)出版社，2007.[9]張春娥.“中國(guó)微生物學(xué)會(huì)1979年學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編”[J]，1979.[10]SkinnerFA.AMethodforDistin?uishin?BetweenViableSporesandMycelialFra?mentsofActinomycetesinSoils[J].JGenMicrobiol，1951，5(1):159-166.[11]KatznelsonH，ColeSE.Productionofgibberellin-likesubstancesbybacteriaandactinomycetes.[J].CanadianJournalofMicrobiology，1965，11(4):733-741.[12]SivasithamparamK，ParkerCA.EffectsofCertainIsolatesofBacteriaandActinomycetesonGaeumannomycesgraminisvar.triticiandTake-AllofWheat[J].AustralianJournalofBotany，1978，26(6):773-782.[13]HallRL，HallRL.Analysisofthenatureofinterferencebetweenplantsofdifferentspecies.I.ConceptsandextensionofthedeWitanalysistoexamineeffects[J].Aust.j.agric.res，1974，25(5):739-747.[14]沈梅生.鏈霉菌屬的兩個(gè)新種[J].微生物學(xué)報(bào)，1981.[15]CooperV.E.，Phypotopathology.，1950，40(3):544-552[16]E.W.臘塞爾.土壤條件與植物生長(zhǎng)[J].1979.[17]李夢(mèng)臻，張芃芃，郝京生，etal.基于納米孔的DNA測(cè)序技術(shù)[J].國(guó)外醫(yī)藥(抗生素分冊(cè))，2017，38(3):125-128.[18]BosshardPP，AbelsS，ZbindenR，etal.RibosomalDNAsequencingforidentificationofaerobicgram-positiverodsintheclinicallaboratory(an18-monthevaluation)[J].JournalofClinicalMicrobiology，2003，41(9):4134.[19]姜成林，徐麗華主編.微生物資源開發(fā)利用[M].中國(guó)輕工業(yè)出版社.2001.4.[20]姜成林，徐麗華.云南高