腹瀉病毒檢測程序標本收集和處理采集糞便5g（5mL），置于清潔、干燥、無肥皂或消毒液殘留的容器中，標本采集后30min內(nèi)放入-20℃冰箱，如有特殊情況未能及時放入-20制備10%的便懸液：將0.2g或200μL糞便標本加到1.5mLEppendorf管中，加入標本處理液，震蕩3次，每次10s。然后靜置10min，再以8000r/min離心5min，吸取上清進行下一步試驗或-20℃A組輪狀病毒ELISA檢測采用DAKO輪狀病毒ELISA檢測試劑盒，具體操作見試劑盒說明書。核酸提取采用Geneaid病毒核酸提取試劑盒和QIAamp?病毒核酸提取試劑盒，具體操作見試劑盒說明書。A組輪狀病毒分型輪狀病毒陽性的標本進一步進行基因分型，毒株分型采用逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈式反應（RT-PCR）進行。G血清型分型：一次擴增采用編碼VP7基因的保守序列設計引物（正鏈引物BEG9，負鏈引物END9），擴增基因的片斷，二次擴增正鏈引物為基因保守序列的公用引物（Rvg9），負鏈引物根據(jù)基因內(nèi)不同血清型的特征序列設計一組分型引物（aAt8、aBT1、aCT2、aDT4、ET3、aFT9），這樣從擴增產(chǎn)物的特征分子量大小即可區(qū)別輪狀病毒的不同血清型。P基因型分型：其引物設計原理類似，一次擴增引物（4Con3、4Con2）選擇VP4基因內(nèi)的保守序列，二次擴增負鏈引物選擇不同基因型的特征序列，設計一組分型引物（1T1、2T1、3T1、4T1、5T1），正鏈引物仍采用公用引物（4Con3）。試驗所需引物序列和設計擴增產(chǎn)物大小請見表14。G、P分型的具體實驗操作步驟核酸變性G分型時，在0.2mL的Eppendorf管中加入正鏈引物20μMBEG9和負鏈引物20μMEND9各1μL、RNA模板5μL、DEPC處理過的水3μL混合后放在98℃逆轉(zhuǎn)錄及第一次PCR擴增4.3.2.1在上述0.2mLEppendorf管中再加入下列物質(zhì)：ddH2O22.3μL2.5mMdNTPs4.0μL10×Buffer5.0μL25mMMgCl28.0μLAMV逆轉(zhuǎn)錄酶10U/μL0.2μLTaq酶5U/μL0.5μL4.3.2.2放入PCR儀，條件：42℃，60min，9894℃94℃30s，42℃30s，72℃用于輪狀病毒分型的寡聚核苷酸引物引物G/P分型位置引物序列片段大小（bp）4Con3P（+）11-325′-TGGCTTCGCCATTTTATAGACA-3′4Con2P（+）868-8875′-ATTTCGGACCATTTATAACC-3′8771T1P[8]（-）339-3565′-TCTACTTGGATAACGTGC-3′3462T1P[4]（-）474-4945′-CTATTGTTAGAGGTTAGAGTC-3′4843T1P[6]（-）259-2785′-TGTTGATTAGTTGGATTCAA-3′2684T1P[9]（-）385-4025′-TGAGACATGCAATTGGAC-3′3925T1P[10]（-）575-5945′-ATCATAGTTAGTAGTCGG-3′584Beg9G（+）1-285′-GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG-3′End9G（-）1062-10365′-GGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG-3′1062Rvg9G（-）1062-10445′-GGTCACATCATACAATTCT-3′aAt8G8（+）178-1985′-GTCACACCATTTGTAAATTCG-3′885aBT1G1（+）314-3355′-CAAGTACTCAAATCAATGATGG-3′749aCT2G2（+）411-4355′-CAATGATATTAACACCTTTTCTGTG-3′652aDT4G4（+）480-4985′-CGTTTCTGGTGAGGAGTTG-3′583aET3G3（+）689-7095′-CGTTTGAAGAAGTTGCAACAG-3′374aFT9G9（+）757-7765′-CTAGATGTAACTACAACTAC-3′306第二次擴增4.3.3.1PCR反應體系G分型ddH2O：23.5μL2mMdNTPs：8.0μL10×Buffer：5.0μL25mMMgCl2：4.0μL20μMRvg9：1.0μLaAt8、aBT1、aCT2、aDT4、ET3、aFT9（20μM）混合引物：各1.0μL5U/μLTaq酶：0.5μLP分型ddH2O：24.5μL2mMdNTPs：8.0μL10×Buffer：5.0μL25mMMgCl2：4.0μL20μM4Con3：1.0μL1T1、2T1、3T1、4T1、5T1（20μM）混合引物：各1.0μL5U/μLTaq酶：0.5μL4.3.3.2在0.2mLEppendorf管中加入上述反應液，再加入第一次PCR產(chǎn)物2μL，放入PCR儀中，進行第二次擴增，條件：94℃預變性1min；30次循環(huán)：94℃30s，42℃30s，72℃1min；核酸凝膠電泳：將擴增產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察和照相，然后與DNAmarker對照，根據(jù)目的條帶的大小對照表14中的條帶大小判斷毒株型別。注意：①aAt8、aBT1、aCT2、aDT4、ET3、aFT9混合引物，以及1T1、2T1、3T1、4T1、5T1混合引物中，每一條單一的引物濃度均為20μM。②上述分型過程中使用的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶購自美國Promega公司，Taq酶購自上海Promega公司。其他腹瀉病毒PCR檢測對所有標本提取核酸后，應用RT-PCR或PCR方法對B組輪狀病毒、C組輪狀病毒、諾如病毒、札如病毒、星狀病毒和腺病毒同時進行檢測。反轉(zhuǎn)錄5.1.1RT反應體系5×firststrandbufferdNTP（各10mmol/L）DTT（10mmol/L）SuperScriptIII逆轉(zhuǎn)錄酶（200U/μL）RandomPrimer（0.5μg/μL）RNAase抑制劑（40U/μL）DEPC處理H2O病毒核酸2.05μL0.75μL0.75μL0.50μL0.75μL0.50μL2.20μL7.50μL5.1.250℃反轉(zhuǎn)錄1h，99PCR鑒定以上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板進行B組輪狀病毒、C組輪狀病毒、諾如病毒、札如病毒、星狀病毒的PCR檢測；腺病毒以提取核酸作為模板進行反應。引物序列見表15。5.2.1B組和C組輪狀病毒、星狀病毒和腺病毒的PCR反應體系中包括模板2.5μL，33μmol/l的引物貯存液各0.2μL，dNTP貯存液（各種dNTP的濃度為2.5mmol/l）2.0μL，5U/μL的Taq聚合酶0.125μL，10×PCR緩沖液2.5μL，MgCl2（25mmol/L）2.0μL，總體積25μL。其中B組和C組輪狀病毒、星狀病毒檢測的模板為cDNA，腺病毒檢測的模板為病毒核酸。諾如病毒和札如病毒的檢測為復合PCR方法，PCR反應體系中包括cDNA2.5μL，33μmol/l的引物貯存液各0.2μL，dNTP貯存液（各種dNTP的濃度為2.5mmol/l）2.0μL，5U/μL的Taq聚合酶0.125μL，10×PCR緩沖液2.5μL，MgCl2（25mmol/L）2.0μL，總體積25μL。5.2.2反應體系94℃預變性5min，35個循環(huán)（94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min），B組和C組輪狀病毒、諾如病毒、札如病毒、星狀病毒和腺病毒檢測所需引物病毒名稱引物序列片段大小（bp）B組輪狀病毒B5-2:5′-GGCAATAAAATGGCTTCATTGC-3′814B5-3:5′-GGGTTTTTACAGCTTCGGCT-3′C組輪狀病毒NG8S1:5′-ATTATGCTCAGACTATCGCCAC-3′352NG8S2:5′-GTTTCTGTACTAGCTGGTGAAC-3′諾如病毒（GI）G1-SKF:5′-CTGCCCGAATTYGTAAATGA-3′330GI-SKR:5′-CCAACCCARCCATTRTACA-3′諾如病毒（GII）CoG2F:5′-CARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG-3′387G2-SKR:5′-CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3′札如病毒SLV-5317:5′-CTCGCCACCTACRAWGCBTG