miR-125b負(fù)調(diào)控NF-κB信號通路抑制PRRSV增殖的機(jī)制探究一、引言1.1研究背景豬繁殖與呼吸綜合征（PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome，PRRS），俗稱“豬藍(lán)耳病”，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus，PRRSV）引起的一種具有高度傳染性的病毒性疾病。自1987年首次在美國被報道以來，PRRSV迅速在全球范圍內(nèi)傳播，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國于1996年首次報道了PRRSV感染病例，此后該病在國內(nèi)廣泛流行，成為危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要疫病之一，被列為二類動物疫病以及口岸檢疫重點防范的動物疫病。PRRSV主要感染豬，包括家豬和野豬，且任何年齡的豬都易感。感染豬會出現(xiàn)厭食、發(fā)熱、繁殖障礙和呼吸困難等臨床癥狀，對繁殖母豬、種公豬和仔豬的危害尤為嚴(yán)重。妊娠后期的母豬感染PRRSV后，常出現(xiàn)流產(chǎn)、早產(chǎn)和死胎等繁殖障礙特征，新生仔豬死亡率可高達(dá)30%-100%；被感染的母豬還可能出現(xiàn)厭食、發(fā)熱、昏睡、肺炎、缺乳、藍(lán)耳、外陰和皮下水腫、斷乳延遲及返情等癥狀，少數(shù)甚至?xí)劳?。新生仔豬感染PRRSV后，會出現(xiàn)呼吸困難、急促，眼周及皮下水腫，結(jié)膜炎，耳朵發(fā)藍(lán)，食欲不振，發(fā)熱，皮膚紅斑，腹瀉，震顫，毛發(fā)粗亂等癥狀，還可能表現(xiàn)出神經(jīng)癥狀；斷乳仔豬感染的典型癥狀為發(fā)熱、肺炎、昏睡及精神萎靡。育肥豬癥狀相對較輕，僅表現(xiàn)為5-7天的厭食、呼吸困難、不安和易受刺激，體溫可升至40-41℃，常見亞臨床感染。公豬感染后則表現(xiàn)為厭食、發(fā)熱，精液質(zhì)量下降。高致病性藍(lán)耳病豬的癥狀更為嚴(yán)重，病豬會出現(xiàn)41℃以上的持續(xù)高熱，不分年齡均出現(xiàn)死亡，發(fā)病率可達(dá)100%，死亡率在50%以上，還伴有眼結(jié)膜炎、咳嗽、氣喘等呼吸道癥狀，以及搖擺、抽搐、行走困難等神經(jīng)癥狀。從病理變化來看，豬繁殖與呼吸綜合征的可見病變差異較大，與不同PRRSV分離株、豬的遺傳及環(huán)境應(yīng)激因素有關(guān)。有的病豬肺看不到病變或肺小葉間質(zhì)增寬、水腫，呈間質(zhì)性肺炎病變；病仔豬的淋巴結(jié)明顯腫大、出血或壞死，脾臟腫脹、壞死。目前，PRRSV分為歐洲型和美洲型兩個基因型，我國PRRSV流行毒株以美洲型為主，其中PRRSV變異株是近年來流行的主要毒株。PRRSV感染肺泡巨噬細(xì)胞，抑制宿主免疫應(yīng)答，而且病毒易于發(fā)生變異，這使得目前仍然沒有非常有效的疫苗來控制該病的流行，給養(yǎng)豬業(yè)的防控帶來了極大的挑戰(zhàn)。在病毒感染宿主細(xì)胞的過程中，宿主的免疫應(yīng)答機(jī)制起著關(guān)鍵作用。NF-κB信號通路作為細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子信號通路，廣泛參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞凋亡以及應(yīng)激反應(yīng)等生理過程。當(dāng)細(xì)胞受到多種胞內(nèi)外刺激，如促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、白介素IL-1、細(xì)菌脂多糖（LPS）、T細(xì)胞及B細(xì)胞有絲分裂原、病毒雙鏈RNA以及多種物理和化學(xué)壓力等時，NF-κB信號通路被激活。其激活過程主要包括：當(dāng)炎性因子等與相關(guān)受體結(jié)合后，引起受體構(gòu)型改變，進(jìn)而激活I(lǐng)κB激酶，使IκB蛋白磷酸化、泛素化，隨后IκB蛋白被26S蛋白酶體識別并降解。于是NF-κB得以從細(xì)胞質(zhì)NF-κB/IκB復(fù)合物中釋放出來，并活化、暴露核定位域，形成p50/RelA二聚體，迅速發(fā)生核轉(zhuǎn)位，通過p50亞單位與靶基因的κB反應(yīng)元件結(jié)合，從而啟動靶基因表達(dá)，如腫瘤壞死因子α和白介素1等，5分鐘左右即可使細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號通路的活性水平達(dá)到峰值。NF-κB信號通路的異常激活或抑制與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在病毒感染過程中，該信號通路也參與了宿主對病毒的免疫應(yīng)答以及病毒的致病過程。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，長度約為22個核苷酸，在多種生物過程中發(fā)揮著重要作用，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等。據(jù)估計，超過三分之一的人類基因被miRNAs所靶向。越來越多的研究表明，miRNA廣泛參與病毒感染宿主細(xì)胞的調(diào)控過程，它們可以通過與病毒或宿主基因的mRNA互補(bǔ)配對，抑制mRNA的翻譯過程或者促使其降解，從而影響病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及宿主的免疫應(yīng)答。例如，某些miRNA可以直接靶向病毒基因，抑制病毒的增殖；也可以通過調(diào)控宿主細(xì)胞的免疫相關(guān)基因，間接影響病毒感染后的免疫反應(yīng)。在腫瘤研究中，miR-125b被發(fā)現(xiàn)通過pik3cd靶向抑制未分化的甲狀腺癌細(xì)胞遷移和侵襲；在肝細(xì)胞癌中，miR-125b的表達(dá)明顯下調(diào)，而VEGF-A表達(dá)上調(diào)，低表達(dá)的miR-125b喪失對VEGF-A表達(dá)的抑制作用可能是肝癌發(fā)生的重要機(jī)制。在PRRSV感染宿主的過程中，miRNA與NF-κB信號通路之間可能存在著復(fù)雜的相互作用，共同影響著病毒的增殖以及宿主的免疫應(yīng)答。然而，目前關(guān)于miR-125b在PRRSV感染過程中的作用及其與NF-κB信號通路的關(guān)系尚不清楚。深入研究miR-125b通過負(fù)調(diào)控NF-κB信號通路抑制PRRSV增殖的分子機(jī)制，不僅有助于揭示PRRSV的致病機(jī)理，還可能為PRRS的防控提供新的靶點和策略，具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究miR-125b通過負(fù)調(diào)控NF-κB信號通路抑制PRRSV增殖的分子機(jī)制。具體而言，通過一系列實驗，確定miR-125b對PRRSV增殖的影響，明確其在Marc-145等相關(guān)細(xì)胞中的作用效果；篩選出miR-125b作用的相關(guān)基因位點，剖析其與NF-κB信號通路的內(nèi)在聯(lián)系；揭示NF-κB表達(dá)與PRRSV增殖之間的關(guān)聯(lián)，從而全面揭示三者之間的相互作用關(guān)系。從理論意義來看，PRRSV感染機(jī)制復(fù)雜，深入了解宿主與病毒相互作用的分子機(jī)制是解決問題的關(guān)鍵。目前對PRRSV感染過程中miRNA與信號通路的研究尚不完善，本研究聚焦miR-125b與NF-κB信號通路在PRRSV感染中的作用，有望填補(bǔ)這一領(lǐng)域的空白，為闡釋PRRSV的致病機(jī)理提供全新的理論依據(jù)，豐富人們對病毒感染與宿主免疫應(yīng)答分子機(jī)制的認(rèn)識，推動相關(guān)領(lǐng)域的理論發(fā)展。在實踐意義方面，PRRS給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失，現(xiàn)有疫苗和防控手段效果有限。本研究若能揭示miR-125b通過負(fù)調(diào)控NF-κB信號通路抑制PRRSV增殖的機(jī)制，將為PRRS的防控開辟新路徑。一方面，為研發(fā)新型抗病毒藥物提供潛在靶點，基于對miR-125b和NF-κB信號通路的調(diào)控，開發(fā)更具針對性的藥物，提高對PRRSV的抑制效果；另一方面，有助于優(yōu)化疫苗設(shè)計，通過調(diào)節(jié)相關(guān)分子機(jī)制，增強(qiáng)疫苗的免疫效果，提高豬群對PRRSV的抵抗力，降低發(fā)病率和死亡率，減少經(jīng)濟(jì)損失，促進(jìn)養(yǎng)豬業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的研究方面，國內(nèi)外取得了豐碩的成果。自1987年P(guān)RRSV首次在美國被報道后，全球范圍內(nèi)對其展開了深入研究。我國于1996年首次報道PRRSV感染病例，此后國內(nèi)對其流行特點、致病機(jī)制、診斷方法和防控措施等進(jìn)行了大量研究。目前已知PRRSV分為歐洲型和美洲型兩個基因型，我國流行毒株以美洲型為主，其中PRRSV變異株近年來成為主要流行毒株。研究表明，PRRSV主要感染豬的肺泡巨噬細(xì)胞，抑制宿主免疫應(yīng)答，且病毒易發(fā)生變異，這使得疫苗研發(fā)和疫病防控面臨巨大挑戰(zhàn)。在防控手段上，雖然國內(nèi)外已有商品化PRRS疫苗，但由于疫苗的安全性問題，種豬場和PRRS陰性豬場在疫苗選擇上較為謹(jǐn)慎，且現(xiàn)有疫苗難以誘導(dǎo)足夠有效的中和抗體，減毒疫苗也存在安全隱患，如中國接種過相關(guān)疫苗的豬中仍爆發(fā)了NADC-30樣菌株。此外，一些研究嘗試從抗病毒藥物篩選方面尋找新的防控策略，如通過高通量篩選技術(shù)從FDA批準(zhǔn)的藥物和藥典藥物庫中鑒定出硝唑尼特（NTZ）等16種潛在的抗PRRSV化合物，發(fā)現(xiàn)NTZ在體外和體內(nèi)均能有效抑制PRRSV增殖。NF-κB信號通路作為細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子信號通路，在國內(nèi)外的研究中受到廣泛關(guān)注。該信號通路廣泛參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞凋亡以及應(yīng)激反應(yīng)等生理過程。當(dāng)細(xì)胞受到多種胞內(nèi)外刺激，如促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、白介素IL-1、細(xì)菌脂多糖（LPS）、病毒雙鏈RNA以及多種物理和化學(xué)壓力等時，NF-κB信號通路被激活。其激活過程涉及一系列復(fù)雜的分子機(jī)制，包括IκB激酶的活化、IκB蛋白的磷酸化和泛素化降解，以及NF-κB二聚體的釋放、活化和核轉(zhuǎn)位，從而啟動靶基因表達(dá)。在病毒感染過程中，NF-κB信號通路也參與了宿主對病毒的免疫應(yīng)答以及病毒的致病過程，例如在某些病毒感染時，NF-κB信號通路的激活可促進(jìn)細(xì)胞因子的表達(dá)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性，以抵抗病毒感染；但在另一些情況下，病毒可能利用該信號通路來促進(jìn)自身的復(fù)制和傳播。微小RNA（miRNA）的研究近年來也取得了長足進(jìn)展，越來越多的研究表明其廣泛參與病毒感染宿主細(xì)胞的調(diào)控過程。miRNA可以通過與病毒或宿主基因的mRNA互補(bǔ)配對，抑制mRNA的翻譯過程或者促使其降解，從而影響病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及宿主的免疫應(yīng)答。對于miR-125b的研究，在腫瘤領(lǐng)域有較多報道，如在未分化的甲狀腺癌細(xì)胞中，miR-125b通過pik3cd靶向抑制細(xì)胞遷移和侵襲；在肝細(xì)胞癌中，miR-125b表達(dá)明顯下調(diào)，低表達(dá)的miR-125b喪失對VEGF-A表達(dá)的抑制作用，可能是肝癌發(fā)生的重要機(jī)制。然而，在PRRSV感染過程中，miR-125b的作用及其與NF-κB信號通路的關(guān)系尚不清楚。雖然已有研究探討了miRNA在PRRSV增殖過程中的調(diào)節(jié)作用，但具體到miR-125b對PRRSV的影響，以及其如何通過調(diào)控NF-κB信號通路來影響病毒增殖，目前還缺乏深入研究。綜上所述，當(dāng)前對于PRRSV的研究在病毒的基本特性、流行情況和防控策略等方面取得了一定成果，但在病毒感染與宿主免疫應(yīng)答的分子機(jī)制，尤其是miRNA與信號通路在其中的作用研究上仍存在不足。本研究將聚焦于miR-125b通過負(fù)調(diào)控NF-κB信號通路抑制PRRSV增殖的分子機(jī)制，有望填補(bǔ)這一領(lǐng)域的空白，為PRRS的防控提供新的靶點和策略。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1PRRSV概述豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）于1987年在美國被首次發(fā)現(xiàn)，隨后迅速傳播至全球各地，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國在1996年首次證實PRRSV在國內(nèi)的存在，此后該病在我國廣泛流行，成為危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病之一。PRRSV屬于尼多病毒目、動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬，是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒。其病毒粒子呈球形，直徑約為50-65nm，囊膜表面有一層糖蛋白突起，使病毒粒子在電鏡下呈現(xiàn)出獨特的外觀。病毒基因組全長約15kb，包含9個開放性閱讀框（ORFs），兩端為非編碼區(qū)。這些ORFs編碼了多種病毒蛋白，包括結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，它們在病毒的生命周期中發(fā)揮著不同的作用。例如，ORF1a和ORF1b編碼的多聚蛋白經(jīng)蛋白酶切割后，產(chǎn)生參與病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和調(diào)控的非結(jié)構(gòu)蛋白；ORF2-ORF7則編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，如GP2、GP3、GP4、GP5、M、N等蛋白，其中GP5蛋白是各毒株間變異最大的蛋白，也是主要的保護(hù)性抗原，在動物體內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性中和抗體，但其外結(jié)構(gòu)域中的誘騙表位（A表位）會降低針對中和表位（B表位）的特異性反應(yīng)，使得中和抗體產(chǎn)生緩慢。根據(jù)病毒基因組核苷酸序列的不同，PRRSV分為歐洲型和美洲型兩個基因型，二者在抗原性上存在顯著差異，僅有很少的交叉反應(yīng)。我國流行的PRRSV毒株以美洲型為主，且國內(nèi)分離毒株存在變異現(xiàn)象，如出現(xiàn)缺失變異毒株等。PRRSV具有高度的宿主專一性，主要感染豬，包括家豬和野豬，任何年齡、品種和性別的豬均可感染，但以妊娠母豬和1月齡以內(nèi)的仔豬最為易感?；疾∝i和帶毒豬是主要的傳染源，病毒可通過多種途徑傳播。接觸傳播是其主要的傳播方式，易感豬與感染豬直接接觸，或與被病毒污染的運輸工具、器械、飼料、水源等間接接觸，都可能感染病毒；空氣傳播也是重要的傳播途徑，病毒可隨空氣中的飛沫和氣溶膠傳播，雖然傳播距離較遠(yuǎn)，但傳播效率相對較低；精液傳播也是常見的傳播方式之一，感染公豬的精液中含有病毒，可通過配種將病毒傳播給母豬；此外，病毒還可通過胎盤垂直傳播，懷孕母豬感染病毒后，可經(jīng)胎盤感染胎兒，造成繁殖障礙。PRRSV感染豬后，會引發(fā)一系列復(fù)雜的病理變化和臨床癥狀。在感染初期，病毒首先在鼻內(nèi)黏膜、呼吸系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中完成最初的復(fù)制，接著引起病毒血癥以及病毒在全身的擴(kuò)散。病毒對巨噬細(xì)胞具有親嗜性，肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）是其首選靶細(xì)胞，盡管呼吸道上皮細(xì)胞也可被感染，但PAM占肺臟被感染細(xì)胞的80%-90%，間質(zhì)性肺炎是PRRS最重要的組織損傷。在妊娠中后期，病毒可通過胎盤感染胎兒，導(dǎo)致母豬出現(xiàn)繁殖障礙，如流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、胎兒木乃伊化、產(chǎn)弱仔等，母豬流產(chǎn)率可達(dá)50%-70%，死產(chǎn)率可達(dá)35%以上，木乃伊可達(dá)25%。新生仔豬感染后，會出現(xiàn)呼吸困難、急促，眼周及皮下水腫，結(jié)膜炎，耳朵發(fā)藍(lán)，食欲不振，發(fā)熱，皮膚紅斑，腹瀉，震顫，毛發(fā)粗亂等癥狀，還可能表現(xiàn)出神經(jīng)癥狀，產(chǎn)后1周內(nèi)死亡率明顯增高，可達(dá)40%-80%。斷乳仔豬感染的典型癥狀為發(fā)熱、肺炎、昏睡及精神萎靡。育肥豬癥狀相對較輕，僅表現(xiàn)為5-7天的厭食、呼吸困難、不安和易受刺激，體溫可升至40-41℃，常見亞臨床感染。公豬感染后則表現(xiàn)為厭食、發(fā)熱，精液質(zhì)量下降。PRRSV感染還具有持續(xù)性感染的特點，病毒感染誘發(fā)的體液免疫和細(xì)胞免疫雖然能清除循環(huán)中的病毒，但不能清除淋巴組織中的PRRSV，導(dǎo)致病毒的持續(xù)性存在和持續(xù)性感染。感染豬在臨床癥狀消失后至少2個月內(nèi)仍有傳染性，病毒可在感染豬的上呼吸道和扁桃體中存活5個月以上，并且在持續(xù)感染期間可能引發(fā)二次感染。持續(xù)性感染的主要原因是病毒感染后不能有效激發(fā)INF-α、TNF、IL-1、NF-κB等細(xì)胞因子，尤其是對感染的先天性免疫應(yīng)答有重要作用的NF-κB的激活，從而影響了先天性免疫反應(yīng)和后天獲得性免疫對病毒的抵抗和清除功能。此外，PRRSV還具有抗體依賴性增強(qiáng)作用（ADE），即亞中和水平的抗體存在時，抗原抗體復(fù)合物與PAM的Fc受體結(jié)合，反而有利于病毒進(jìn)入細(xì)胞，促進(jìn)病毒在細(xì)胞中的增殖，這也給病毒的防控帶來了更大的挑戰(zhàn)。2.2NF-κB信號通路解析NF-κB信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子信號通路，在機(jī)體的生理和病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。該信號通路主要由NF-κB蛋白家族、IκB蛋白家族、IκB激酶（IKK）復(fù)合物以及相關(guān)的上游信號分子和下游靶基因組成。NF-κB蛋白家族在哺乳動物中包含5個成員，分別是RelA（p65）、RelB、c-Rel、p50（NF-κB1）和p52（NF-κB2）。這些成員都含有保守的Rel同源結(jié)構(gòu)域（RHD），RHD負(fù)責(zé)蛋白之間的二聚化以及與DNA的結(jié)合。其中，RelA、RelB和c-Rel還含有反式激活結(jié)構(gòu)域，能夠激活基因轉(zhuǎn)錄；而p50和p52自身不具備反式激活能力，它們的同源二聚體主要起轉(zhuǎn)錄抑制作用，但與具有反式激活結(jié)構(gòu)域的亞基形成異源二聚體時，可促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。在細(xì)胞未受到刺激時，NF-κB通常以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，與抑制蛋白IκB結(jié)合形成復(fù)合物。IκB蛋白家族包括IκBα、IκBβ、IκBγ、IκBζ、IκBε、Bcl-3、p100和p105等成員，它們通過錨蛋白重復(fù)序列與NF-κB結(jié)合，掩蓋NF-κB的核定位信號，從而將其限制在細(xì)胞質(zhì)中。IKK復(fù)合物是NF-κB信號通路激活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，由IKKα（CHUK）、IKKβ（IKBKB）和調(diào)節(jié)亞基NEMO（IKKγ）組成。當(dāng)細(xì)胞受到各種胞內(nèi)外刺激時，如促炎癥細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-1）、細(xì)菌脂多糖（LPS）、病毒雙鏈RNA、紫外線、氧化應(yīng)激等，IKK復(fù)合物被激活。其中，經(jīng)典的NF-κB信號通路激活過程如下：以TNF-α刺激為例，TNF-α與細(xì)胞表面的TNF受體1（TNFR1）結(jié)合后，TNFR1發(fā)生三聚化，招募接頭蛋白TRADD和RIP1。TRADD進(jìn)一步招募TRAF2/5，TRAF2/5再招募泛素連接酶cIAP1和cIAP2。cIAP1/2催化自身以及下游信號蛋白發(fā)生泛素化修飾，形成多泛素化鏈。這些多泛素化鏈作為平臺，招募線性泛素鏈組裝復(fù)合物（LUBAC）以及TAK1/TAB和NEMO/IKK復(fù)合物，并使NEMO發(fā)生線性泛素化，從而促進(jìn)IKK復(fù)合物的活化?；罨腎KK復(fù)合物使IκB蛋白的兩個保守絲氨酸殘基磷酸化，磷酸化的IκB蛋白被SCF-E3泛素化酶復(fù)合體識別并多泛素化修飾，進(jìn)而被26S蛋白酶體降解。IκB蛋白降解后，NF-κB二聚體（如p50/RelA）得以釋放，暴露核定位信號，迅速從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，NF-κB與靶基因啟動子區(qū)域的κB反應(yīng)元件結(jié)合，招募轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄，如腫瘤壞死因子α、白介素1、白介素6等細(xì)胞因子，以及細(xì)胞粘附分子、抗凋亡蛋白等基因的表達(dá)。非經(jīng)典的NF-κB信號通路則主要由特定的TNF受體家族成員（如LTβR、CD40、CD27、CD30、BAFF-R、RANK等）激活。這些受體激活后，招募TRAF2和TRAF3，TRAF3通過與NF-κB誘導(dǎo)激酶（NIK）相互作用，使NIK穩(wěn)定并激活。激活的NIK進(jìn)一步激活I(lǐng)KKα，IKKα使p100磷酸化，磷酸化的p100被蛋白酶體部分降解為p52，p52與RelB形成二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核，啟動相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄。NF-κB信號通路在細(xì)胞中具有廣泛的功能，它參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)，在炎癥發(fā)生時，激活的NF-κB可誘導(dǎo)多種促炎細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，招募免疫細(xì)胞到炎癥部位，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)；在免疫應(yīng)答方面，該信號通路對T細(xì)胞和B細(xì)胞的發(fā)育、活化以及免疫球蛋白的產(chǎn)生等過程都起著重要的調(diào)節(jié)作用；同時，NF-κB還參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，在某些情況下，激活的NF-κB可誘導(dǎo)抗凋亡基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞的存活；而在另一些情況下，NF-κB也可能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，具體取決于細(xì)胞類型和刺激因素。在病毒感染過程中，NF-κB信號通路的作用較為復(fù)雜。一方面，宿主細(xì)胞可通過激活NF-κB信號通路，誘導(dǎo)產(chǎn)生多種抗病毒細(xì)胞因子和趨化因子，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性，從而抵御病毒感染。例如，在病毒感染初期，模式識別受體（如Toll樣受體、RIG-I樣受體等）識別病毒核酸后，通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活NF-κB，促進(jìn)I型干擾素等抗病毒細(xì)胞因子的表達(dá)，建立細(xì)胞的抗病毒狀態(tài)，抑制病毒的復(fù)制和傳播。另一方面，有些病毒為了自身的生存和增殖，會利用NF-κB信號通路。例如，某些病毒感染細(xì)胞后，通過激活NF-κB信號通路，促進(jìn)細(xì)胞的存活和代謝，為病毒的復(fù)制提供有利的環(huán)境；還有些病毒可能干擾NF-κB信號通路的正常調(diào)控，抑制宿主的免疫應(yīng)答，從而實現(xiàn)免疫逃逸。在豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染中，NF-κB信號通路同樣參與其中。研究表明，PRRSV感染豬肺泡巨噬細(xì)胞等靶細(xì)胞后，可調(diào)控NF-κB信號通路的活性。PRRSV感染可能通過某些機(jī)制抑制NF-κB的激活，影響先天性免疫反應(yīng)和后天獲得性免疫對病毒的抵抗和清除功能，從而導(dǎo)致病毒的持續(xù)性感染。病毒感染后不能有效激發(fā)NF-κB等細(xì)胞因子，使得感染豬在臨床癥狀消失后仍長期攜帶病毒，成為傳染源，并且在持續(xù)感染期間容易引發(fā)二次感染。NF-κB信號通路的異常激活或抑制可能與PRRSV感染導(dǎo)致的免疫抑制、炎癥反應(yīng)以及病毒的致病過程密切相關(guān)，深入研究其在PRRSV感染中的作用機(jī)制，對于揭示PRRSV的致病機(jī)理以及開發(fā)有效的防控策略具有重要意義。2.3miR-125b的特性與功能miR-125b是一種在生物體內(nèi)廣泛存在且功能多樣的微小RNA。它最早于1993年在線蟲中被發(fā)現(xiàn)，隨后在其他生物物種中也相繼被鑒定出來。在人類基因組中，miR-125b有兩個編碼基因，分別位于11號染色體和21號染色體上，分別記為miR-125b-1和miR-125b-2。這兩個基因位點轉(zhuǎn)錄生成的pri-miR-125b經(jīng)過一系列加工過程，最終產(chǎn)生成熟的miR-125b。miR-125b的生成是一個復(fù)雜且精細(xì)調(diào)控的過程。首先，由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生較長的初級轉(zhuǎn)錄本pri-miR-125b，其長度可達(dá)幾百到幾千個核苷酸，包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)。在細(xì)胞核內(nèi)，pri-miR-125b被核酸酶Drosha及其輔助因子DGCR8識別并切割，產(chǎn)生長度約為70-100個核苷酸的前體miRNA（pre-miR-125b），pre-miR-125b呈發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)。隨后，pre-miR-125b在轉(zhuǎn)運蛋白Exportin-5和GTP酶Ran的作用下，從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運至細(xì)胞質(zhì)。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miR-125b被核酸酶Dicer進(jìn)一步切割，形成長度約為22個核苷酸的雙鏈miR-125b，其中一條鏈會被降解，另一條鏈則成為成熟的miR-125b，與AGO蛋白等結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC），進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)功能。在生物體內(nèi)，miR-125b參與多種生理和病理過程。在正常生理狀態(tài)下，它對細(xì)胞的增殖、分化和凋亡具有重要的調(diào)控作用。例如，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，miR-125b可通過靶向調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，影響神經(jīng)干細(xì)胞的分化和神經(jīng)元的發(fā)育；在造血系統(tǒng)中，miR-125b參與調(diào)控造血干細(xì)胞的自我更新和分化，維持造血系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，miR-125b的表達(dá)水平常常發(fā)生異常改變，其功能也較為復(fù)雜，在不同類型的腫瘤中表現(xiàn)出不同的作用。在乳腺癌、肺癌、肝癌等多種腫瘤中，miR-125b的表達(dá)水平顯著下調(diào)，它可以通過靶向抑制癌基因的表達(dá)，如抑制乳腺癌細(xì)胞中HER-2基因的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，發(fā)揮抑癌基因的作用；然而，在某些血液系統(tǒng)腫瘤中，miR-125b卻呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，它可能通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活，起到促癌基因的作用。在病毒感染和免疫調(diào)節(jié)方面，miR-125b也發(fā)揮著重要作用。研究表明，在一些病毒感染過程中，宿主細(xì)胞會通過調(diào)節(jié)miR-125b的表達(dá)來應(yīng)對病毒感染。例如，在乙肝病毒（HBV）感染時，宿主細(xì)胞內(nèi)miR-125b的表達(dá)水平會發(fā)生變化，它可以通過靶向HBV的基因序列，抑制病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄；同時，miR-125b還可以通過調(diào)控宿主細(xì)胞的免疫相關(guān)基因，影響免疫細(xì)胞的活性和功能，從而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答。在免疫調(diào)節(jié)過程中，miR-125b參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分化和功能。在T細(xì)胞分化過程中，miR-125b可以通過靶向調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，影響T細(xì)胞向不同亞群的分化，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和方向。在炎癥反應(yīng)中，miR-125b可通過調(diào)控炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，抑制炎癥因子的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)對機(jī)體的損傷。雖然miR-125b在多種生理病理過程中展現(xiàn)出重要功能，尤其是在病毒感染和免疫調(diào)節(jié)方面的作用備受關(guān)注，但其在豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染過程中的具體作用機(jī)制仍不明確。研究miR-125b在PRRSV感染中的作用，對于深入理解PRRSV的致病機(jī)理以及開發(fā)有效的防控策略具有重要意義。三、miR-125b抑制PRRSV增殖的作用驗證3.1實驗材料與方法3.1.1實驗材料細(xì)胞：Marc-145細(xì)胞（猴腎細(xì)胞系，常用于PRRSV的體外培養(yǎng)和研究）、豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM，PRRSV的天然靶細(xì)胞，從健康豬的肺泡中分離獲得）。病毒株：PRRSVCH-1a株（美洲型PRRSV的經(jīng)典毒株，具有代表性，常用于相關(guān)研究）。試劑：TRIzol試劑（用于提取細(xì)胞總RNA，購自Invitrogen公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，來自TaKaRa公司）、SYBRGreenPCRMasterMix（用于實時熒光定量PCR檢測基因表達(dá)，購自AppliedBiosystems公司）、Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（用于將小分子RNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，購自Invitrogen公司）、miR-125b模擬物（mimics）及陰性對照（NCmimics）、miR-125b抑制劑（inhibitor）及陰性對照（NCinhibitor）（均由廣州銳博生物科技有限公司合成）、胎牛血清（FBS，為細(xì)胞培養(yǎng)提供營養(yǎng)，購自Gibco公司）、DMEM培養(yǎng)基（細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，購自Hyclone公司）、青霉素-鏈霉素雙抗溶液（防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染，購自Solarbio公司）、4%多聚甲醛溶液（用于細(xì)胞固定，購自Sigma公司）、TritonX-100（用于細(xì)胞通透，購自Sigma公司）、山羊血清（用于封閉非特異性結(jié)合位點，購自JacksonImmunoResearch公司）、兔抗PRRSVN蛋白抗體（用于檢測PRRSVN蛋白，購自Abcam公司）、AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（用于熒光檢測，購自Invitrogen公司）、DAPI染液（用于細(xì)胞核染色，購自Sigma公司）、BCA蛋白定量試劑盒（用于蛋白定量，購自ThermoScientific公司）、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（用于制備聚丙烯酰胺凝膠，購自Bio-Rad公司）、PVDF膜（用于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜，購自Millipore公司）、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（用于Westernblot檢測，購自CellSignalingTechnology公司）、化學(xué)發(fā)光底物（用于Westernblot結(jié)果的顯色，購自ThermoScientific公司）。儀器：CO?培養(yǎng)箱（為細(xì)胞培養(yǎng)提供適宜的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境，購自ThermoScientific公司）、超凈工作臺（提供無菌操作環(huán)境，購自蘇凈集團(tuán)安泰公司）、倒置顯微鏡（用于觀察細(xì)胞形態(tài)和生長狀態(tài)，購自O(shè)lympus公司）、實時熒光定量PCR儀（檢測基因表達(dá)水平，購自AppliedBiosystems公司）、高速冷凍離心機(jī)（用于細(xì)胞和核酸的分離，購自Eppendorf公司）、酶標(biāo)儀（用于檢測細(xì)胞增殖和蛋白含量，購自Bio-Tek公司）、熒光顯微鏡（用于觀察免疫熒光染色結(jié)果，購自Nikon公司）、電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（用于蛋白質(zhì)電泳和轉(zhuǎn)膜，購自Bio-Rad公司）。3.2實驗結(jié)果與分析將miR-125b模擬物（mimics）、陰性對照（NCmimics）、miR-125b抑制劑（inhibitor）及陰性對照（NCinhibitor）分別轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞和豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）。轉(zhuǎn)染24h后，用PRRSVCH-1a株以感染復(fù)數(shù)（MOI）為0.1感染細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)不同時間后進(jìn)行后續(xù)檢測。絕對定量檢測結(jié)果顯示，在Marc-145細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-125bmimics組在感染PRRSV后24h、48h和72h，病毒RNA拷貝數(shù)均顯著低于NCmimics組（P<0.01），且隨著時間的延長，抑制效果更加明顯；而轉(zhuǎn)染miR-125binhibitor組的病毒RNA拷貝數(shù)在各時間點均顯著高于NCinhibitor組（P<0.01），表明miR-125b的過表達(dá)能夠抑制PRRSV在Marc-145細(xì)胞中的增殖，而抑制miR-125b的表達(dá)則促進(jìn)病毒增殖。在PAM中也得到了類似的結(jié)果，轉(zhuǎn)染miR-125bmimics組的病毒RNA拷貝數(shù)顯著低于NCmimics組，轉(zhuǎn)染miR-125binhibitor組的病毒RNA拷貝數(shù)顯著高于NCinhibitor組，進(jìn)一步證實了miR-125b對PRRSV增殖的抑制作用在天然靶細(xì)胞PAM中同樣存在。空斑實驗結(jié)果直觀地展示了miR-125b對PRRSV增殖的影響。在Marc-145細(xì)胞中，NCmimics組形成的病毒空斑數(shù)量多且直徑較大，而miR-125bmimics組的空斑數(shù)量明顯減少，直徑也顯著變?。≒<0.01），表明miR-125b過表達(dá)抑制了病毒的增殖，使得病毒在細(xì)胞間的傳播能力下降；miR-125binhibitor組的空斑數(shù)量增多且直徑增大（P<0.01），說明抑制miR-125b表達(dá)促進(jìn)了病毒的增殖和擴(kuò)散。PAM的空斑實驗結(jié)果與Marc-145細(xì)胞一致，再次驗證了miR-125b對PRRSV增殖的抑制作用。免疫熒光檢測PRRSVN蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，在Marc-145細(xì)胞中，NCmimics組的細(xì)胞內(nèi)可見大量綠色熒光信號，表明有較多的PRRSVN蛋白表達(dá)，即病毒大量增殖；而miR-125bmimics組的綠色熒光信號明顯減弱，說明病毒N蛋白表達(dá)減少，病毒增殖受到抑制；miR-125binhibitor組的綠色熒光信號增強(qiáng)，病毒N蛋白表達(dá)增多，病毒增殖加快。對熒光強(qiáng)度進(jìn)行量化分析，miR-125bmimics組的熒光強(qiáng)度顯著低于NCmimics組（P<0.01），miR-125binhibitor組的熒光強(qiáng)度顯著高于NCinhibitor組（P<0.01）。在PAM中，免疫熒光檢測結(jié)果也呈現(xiàn)出相同的趨勢，進(jìn)一步支持了miR-125b抑制PRRSV增殖的結(jié)論。Westernblot檢測PRRSVNsp2蛋白的表達(dá)，在Marc-145細(xì)胞中，與NCmimics組相比，miR-125bmimics組的Nsp2蛋白條帶明顯變?nèi)酰砻鞯鞍妆磉_(dá)量降低，病毒增殖受到抑制；miR-125binhibitor組的Nsp2蛋白條帶增強(qiáng)，蛋白表達(dá)量增加，病毒增殖加快。通過灰度值分析，miR-125bmimics組的Nsp2蛋白相對表達(dá)量顯著低于NCmimics組（P<0.01），miR-125binhibitor組的Nsp2蛋白相對表達(dá)量顯著高于NCinhibitor組（P<0.01）。在PAM中，Westernblot檢測結(jié)果同樣證實了miR-125b對PRRSVNsp2蛋白表達(dá)的抑制作用以及抑制miR-125b表達(dá)對病毒蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用。綜合以上絕對定量、空斑實驗、免疫熒光和Westernblot檢測結(jié)果，可以明確miR-125b在Marc-145細(xì)胞和豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）中均能夠顯著抑制PRRSV的增殖，且抑制miR-125b的表達(dá)會促進(jìn)病毒增殖，為進(jìn)一步研究miR-125b抑制PRRSV增殖的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。3.3討論本研究通過一系列實驗，明確了miR-125b在Marc-145細(xì)胞和豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）中對PRRSV增殖具有顯著的抑制作用，這一發(fā)現(xiàn)具有重要的理論和實踐意義。在理論層面，豐富了我們對PRRSV感染宿主細(xì)胞分子機(jī)制的認(rèn)識，揭示了miR-125b在宿主與病毒相互作用中的關(guān)鍵角色，為深入理解PRRSV的致病機(jī)理提供了新的視角。在實踐方面，為PRRS的防控提供了潛在的新靶點，有望基于對miR-125b的調(diào)控開發(fā)新型的抗病毒策略，從而有效降低PRRSV對養(yǎng)豬業(yè)的危害。從實驗結(jié)果的可靠性來看，本研究采用了多種檢測方法，包括絕對定量、空斑實驗、免疫熒光和Westernblot檢測等，從不同角度驗證了miR-125b對PRRSV增殖的抑制作用。絕對定量檢測通過精確測定病毒RNA拷貝數(shù)，直觀地反映了miR-125b對病毒核酸合成的影響；空斑實驗直接觀察病毒在細(xì)胞中的增殖和擴(kuò)散情況，以空斑數(shù)量和大小作為指標(biāo)，結(jié)果清晰明了；免疫熒光檢測PRRSVN蛋白和Westernblot檢測PRRSVNsp2蛋白的表達(dá)，從病毒蛋白水平進(jìn)一步證實了miR-125b的抗病毒效果。這些方法相互印證，使得實驗結(jié)果具有較高的可信度。此外，本研究在兩種不同類型的細(xì)胞，即Marc-145細(xì)胞和豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）中均進(jìn)行了驗證，其中PAM是PRRSV的天然靶細(xì)胞，這增強(qiáng)了實驗結(jié)果的普遍性和說服力，表明miR-125b對PRRSV增殖的抑制作用并非局限于特定細(xì)胞類型，而是具有更廣泛的生物學(xué)意義。然而，本研究也存在一定的局限性。在實驗過程中，雖然確定了miR-125b能夠抑制PRRSV增殖，但對于miR-125b在體內(nèi)的作用機(jī)制以及其與其他細(xì)胞因子或信號通路的相互作用研究還不夠深入。體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，存在多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的相互調(diào)節(jié)，miR-125b在體內(nèi)的作用可能受到多種因素的影響，其具體的作用方式和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有待進(jìn)一步探究。此外，本研究僅針對PRRSVCH-1a株進(jìn)行了研究，而PRRSV存在多種毒株，不同毒株之間在基因組序列、致病性和免疫原性等方面存在差異，miR-125b對其他毒株的作用是否一致，還需要進(jìn)一步的實驗驗證?；诒狙芯康慕Y(jié)果和存在的局限性，后續(xù)研究可以從以下幾個方面展開。一方面，深入研究miR-125b在體內(nèi)的作用機(jī)制，通過動物實驗，如構(gòu)建PRRSV感染的動物模型，觀察miR-125b在體內(nèi)對病毒增殖、免疫應(yīng)答以及病理變化的影響，進(jìn)一步明確其在體內(nèi)的抗病毒作用機(jī)制以及與其他免疫調(diào)節(jié)因子的相互關(guān)系。另一方面，擴(kuò)大研究的PRRSV毒株范圍，探究miR-125b對不同毒株的抑制效果及作用機(jī)制的差異，為全面防控PRRSV提供更豐富的理論依據(jù)。還可以進(jìn)一步研究miR-125b與其他信號通路或細(xì)胞因子的協(xié)同作用，尋找潛在的聯(lián)合治療靶點，為開發(fā)更有效的PRRS防控策略奠定基礎(chǔ)。四、miR-125b與NF-κB信號通路的關(guān)聯(lián)研究4.1預(yù)測miR-125b作用位點為深入探究miR-125b抑制PRRSV增殖的分子機(jī)制，明確其與NF-κB信號通路的關(guān)聯(lián)，首先利用多種生物信息學(xué)軟件對miR-125b在PRRSV和宿主基因上的作用位點進(jìn)行預(yù)測。選用了目前廣泛應(yīng)用且具有較高準(zhǔn)確性的miRanda、TargetScan和PicTar等軟件，這些軟件基于不同的算法和原理，能夠從多個角度預(yù)測miRNA的作用位點，從而提高預(yù)測結(jié)果的可靠性。在對PRRSV基因組的預(yù)測中，將PRRSVCH-1a株的全基因組序列輸入到上述軟件中，設(shè)定嚴(yán)格的篩選參數(shù)，包括miRNA與靶序列的互補(bǔ)配對程度、結(jié)合自由能等。經(jīng)過分析，未發(fā)現(xiàn)miR-125b在PRRSV3'UTR以及基因所有編碼區(qū)存在顯著的作用位點。這一結(jié)果表明，miR-125b可能并非直接作用于PRRSV的基因組序列來抑制病毒增殖，提示其抑制作用可能是通過調(diào)控宿主細(xì)胞的相關(guān)基因或信號通路來實現(xiàn)的。在對宿主基因的預(yù)測中，以豬的全基因組數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，運用miRanda、TargetScan和PicTar軟件進(jìn)行分析。預(yù)測結(jié)果顯示，miR-125b在宿主基因上存在多個潛在的作用位點，涵蓋了眾多基因，其中包括與NF-κB信號通路密切相關(guān)的基因。在這些預(yù)測到的與NF-κB信號通路相關(guān)的基因中，r.B.RAS2基因的3'UTR區(qū)域被多個軟件預(yù)測為miR-125b的潛在作用位點。r.B.RAS2基因編碼的蛋白參與細(xì)胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在NF-κB信號通路的激活過程中具有重要作用。此外，TNFα基因也被預(yù)測為miR-125b的潛在靶基因，TNFα是一種重要的促炎細(xì)胞因子，是NF-κB信號通路的上游激活因子，其表達(dá)和活性的變化會直接影響NF-κB信號通路的激活狀態(tài)。同時，SATA3基因也在預(yù)測結(jié)果之中，SATA3參與細(xì)胞的多種生物學(xué)過程，與NF-κB信號通路之間存在復(fù)雜的相互作用，可能在NF-κB信號通路調(diào)控細(xì)胞的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用。通過對多個軟件預(yù)測結(jié)果的綜合分析，篩選出了與NF-κB信號通路相關(guān)的潛在作用位點，為后續(xù)進(jìn)一步驗證miR-125b與NF-κB信號通路的關(guān)系以及探究其抑制PRRSV增殖的分子機(jī)制提供了重要的線索和研究方向。4.2驗證miR-125b對NF-κB信號通路的影響為驗證miR-125b對NF-κB信號通路的調(diào)控作用，構(gòu)建了熒光素酶報告系統(tǒng)和共轉(zhuǎn)染實驗。首先，利用基因克隆技術(shù)，將包含預(yù)測的miR-125b作用位點的r.B.RAS2基因3'UTR區(qū)域克隆到熒光素酶報告載體pGL3-Basic中，構(gòu)建成pGL3-r.B.RAS2-3'UTR熒光素酶報告質(zhì)粒。同時，將miR-125b模擬物（mimics）、陰性對照（NCmimics）分別與pGL3-r.B.RAS2-3'UTR報告質(zhì)粒以及內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染至Marc-145細(xì)胞中。pRL-TK質(zhì)粒表達(dá)海腎熒光素酶，用于校正轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞裂解差異，以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。該系統(tǒng)基于熒光素酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生熒光的原理，通過測量熒光強(qiáng)度來定量檢測熒光素酶的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與NCmimics組相比，共轉(zhuǎn)染miR-125bmimics和pGL3-r.B.RAS2-3'UTR報告質(zhì)粒的細(xì)胞中，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值（Firefly/Renilla）顯著降低（P<0.01）。這表明miR-125b能夠與r.B.RAS2基因3'UTR區(qū)域結(jié)合，抑制熒光素酶報告基因的表達(dá)，從而驗證了miR-125b對r.B.RAS2基因3'UTR的靶向作用。為進(jìn)一步驗證miR-125b對NF-κB信號通路關(guān)鍵分子的調(diào)控作用，進(jìn)行了相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測。在Marc-145細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-125bmimics、NCmimics、miR-125binhibitor及NCinhibitor，轉(zhuǎn)染24h后，提取細(xì)胞總蛋白。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，檢測NF-κB信號通路中關(guān)鍵分子的蛋白表達(dá)水平，包括p65、IκBα以及磷酸化的IκBα（p-IκBα）。結(jié)果表明，與NCmimics組相比，miR-125bmimics轉(zhuǎn)染組中p-IκBα和p65的蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），而IκBα的蛋白表達(dá)水平無明顯變化；在miR-125binhibitor轉(zhuǎn)染組中，p-IκBα和p65的蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），IκBα的蛋白表達(dá)水平同樣無明顯變化。這說明miR-125b通過抑制IκBα的磷酸化，減少p65的活化和核轉(zhuǎn)位，從而負(fù)調(diào)控NF-κB信號通路。為了更直觀地觀察miR-125b對NF-κB信號通路的影響，進(jìn)行了免疫熒光實驗。將Marc-145細(xì)胞接種于共聚焦小皿中，分別轉(zhuǎn)染miR-125bmimics、NCmimics、miR-125binhibitor及NCinhibitor，轉(zhuǎn)染24h后，用TNF-α刺激細(xì)胞30min，以激活NF-κB信號通路。然后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.3%TritonX-100通透細(xì)胞，5%山羊血清封閉非特異性結(jié)合位點。接著，分別加入兔抗p65抗體和AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗進(jìn)行孵育，DAPI染液對細(xì)胞核進(jìn)行染色。在熒光顯微鏡下觀察，NCmimics組中，受到TNF-α刺激后，大量p65蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，細(xì)胞核呈現(xiàn)明顯的綠色熒光；而在miR-125bmimics轉(zhuǎn)染組中，即使受到TNF-α刺激，進(jìn)入細(xì)胞核的p65蛋白明顯減少，細(xì)胞核綠色熒光強(qiáng)度顯著降低。在miR-125binhibitor轉(zhuǎn)染組中，細(xì)胞核內(nèi)的綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，表明更多的p65蛋白進(jìn)入細(xì)胞核。通過對熒光強(qiáng)度的量化分析，進(jìn)一步證實了miR-125b能夠抑制NF-κB信號通路中p65蛋白的核轉(zhuǎn)位。綜合熒光素酶報告系統(tǒng)、蛋白表達(dá)檢測和免疫熒光實驗結(jié)果，可以明確miR-125b通過作用于r.B.RAS2基因3'UTR，抑制IκBα的磷酸化，減少p65的活化和核轉(zhuǎn)位，從而負(fù)調(diào)控NF-κB信號通路。4.3實驗結(jié)果與分析熒光素酶報告系統(tǒng)實驗結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-125bmimics和pGL3-r.B.RAS2-3'UTR報告質(zhì)粒的Marc-145細(xì)胞中，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值（Firefly/Renilla）相較于NCmimics組顯著降低（P<0.01）。這一結(jié)果表明，miR-125b能夠特異性地與r.B.RAS2基因3'UTR區(qū)域結(jié)合，抑制熒光素酶報告基因的表達(dá)，從而證實了miR-125b對r.B.RAS2基因3'UTR的靶向作用。該結(jié)合作用可能通過影響r.B.RAS2基因mRNA的穩(wěn)定性或翻譯過程，進(jìn)而調(diào)控r.B.RAS2基因的表達(dá)水平。在蛋白表達(dá)檢測實驗中，通過Westernblot技術(shù)對NF-κB信號通路關(guān)鍵分子進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，與NCmimics組相比，miR-125bmimics轉(zhuǎn)染組中p-IκBα和p65的蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），而IκBα的蛋白表達(dá)水平無明顯變化；在miR-125binhibitor轉(zhuǎn)染組中，p-IκBα和p65的蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），IκBα的蛋白表達(dá)水平同樣無明顯變化。在正常生理狀態(tài)下，IκBα與NF-κB二聚體（如p50/p65）結(jié)合，使NF-κB處于無活性狀態(tài)并滯留于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時，IκBα被磷酸化，進(jìn)而被泛素化降解，釋放出NF-κB二聚體，使其能夠進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。本實驗中，miR-125bmimics轉(zhuǎn)染組中p-IκBα表達(dá)降低，說明miR-125b抑制了IκBα的磷酸化過程。IκBα磷酸化受阻，導(dǎo)致NF-κB二聚體（如p65）無法有效釋放和活化，進(jìn)而減少了p65的核轉(zhuǎn)位，使得NF-κB信號通路的激活受到抑制。相反，在miR-125binhibitor轉(zhuǎn)染組中，IκBα磷酸化增強(qiáng)，p65活化和核轉(zhuǎn)位增加，NF-κB信號通路被促進(jìn)激活。這充分證明了miR-125b通過抑制IκBα的磷酸化，負(fù)調(diào)控NF-κB信號通路。免疫熒光實驗直觀地展示了miR-125b對NF-κB信號通路中p65蛋白核轉(zhuǎn)位的影響。在熒光顯微鏡下觀察，NCmimics組中，受到TNF-α刺激后，大量p65蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，細(xì)胞核呈現(xiàn)明顯的綠色熒光；而在miR-125bmimics轉(zhuǎn)染組中，即使受到TNF-α刺激，進(jìn)入細(xì)胞核的p65蛋白明顯減少，細(xì)胞核綠色熒光強(qiáng)度顯著降低。在miR-125binhibitor轉(zhuǎn)染組中，細(xì)胞核內(nèi)的綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，表明更多的p65蛋白進(jìn)入細(xì)胞核。通過對熒光強(qiáng)度的量化分析，進(jìn)一步證實了miR-125b能夠抑制NF-κB信號通路中p65蛋白的核轉(zhuǎn)位。這與蛋白表達(dá)檢測實驗結(jié)果相互印證，從細(xì)胞層面進(jìn)一步證明了miR-125b對NF-κB信號通路的負(fù)調(diào)控作用。綜合上述實驗結(jié)果，可以明確miR-125b通過作用于r.B.RAS2基因3'UTR，抑制IκBα的磷酸化，減少p65的活化和核轉(zhuǎn)位，從而有效地負(fù)調(diào)控NF-κB信號通路。4.4討論本研究通過一系列實驗，明確了miR-125b對NF-κB信號通路的負(fù)調(diào)控作用，這一發(fā)現(xiàn)對于深入理解PRRSV感染和增殖的機(jī)制具有重要意義。從miR-125b負(fù)調(diào)控NF-κB信號通路的機(jī)制來看，本研究利用多種生物信息學(xué)軟件預(yù)測并通過熒光素酶報告系統(tǒng)實驗驗證了miR-125b作用于r.B.RAS2基因3'UTR，從而抑制IκBα的磷酸化，減少p65的活化和核轉(zhuǎn)位，最終實現(xiàn)對NF-κB信號通路的負(fù)調(diào)控。這一機(jī)制的揭示，豐富了我們對miRNA調(diào)控信號通路分子機(jī)制的認(rèn)識。miR-125b與r.B.RAS2基因3'UTR的特異性結(jié)合，可能影響了r.B.RAS2基因mRNA的穩(wěn)定性或翻譯過程，進(jìn)而調(diào)控了r.B.RAS2蛋白的表達(dá)水平。r.B.RAS2蛋白在NF-κB信號通路中具有重要作用，其表達(dá)水平的改變直接影響了信號通路的激活狀態(tài)。當(dāng)miR-125b過表達(dá)時，r.B.RAS2基因表達(dá)受到抑制，使得IκBα磷酸化受阻，NF-κB二聚體無法有效活化和轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，從而抑制了NF-κB信號通路的激活；相反，抑制miR-125b的表達(dá)，則會促進(jìn)r.B.RAS2基因表達(dá)，增強(qiáng)IκBα磷酸化，激活NF-κB信號通路。在PRRSV感染過程中，NF-κB信號通路的激活與病毒的增殖密切相關(guān)。研究表明，PRRSV感染宿主細(xì)胞后，會通過激活NF-κB信號通路來促進(jìn)自身的增殖。NF-κB信號通路激活后，可誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，這些因子可能為病毒的復(fù)制和傳播提供有利的環(huán)境。同時，NF-κB信號通路的激活還可能影響宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答，抑制機(jī)體對病毒的免疫清除能力。而本研究發(fā)現(xiàn)miR-125b能夠負(fù)調(diào)控NF-κB信號通路，從而抑制PRRSV的增殖，這揭示了宿主細(xì)胞在應(yīng)對PRRSV感染時的一種重要的免疫防御機(jī)制。miR-125b通過抑制NF-κB信號通路，減少了病毒增殖所需的有利條件，同時增強(qiáng)了宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答能力，從而有效地抑制了病毒的增殖。本研究結(jié)果對于理解PRRSV感染和增殖具有多方面的重要意義。在理論層面，為深入探究PRRSV的致病機(jī)理提供了新的線索和理論依據(jù)，有助于我們從分子層面全面認(rèn)識PRRSV與宿主細(xì)胞之間的相互作用關(guān)系。明確了miR-125b和NF-κB信號通路在PRRSV感染過程中的作用機(jī)制，豐富了我們對病毒感染與宿主免疫應(yīng)答分子機(jī)制的認(rèn)識，為進(jìn)一步研究PRRSV的感染、致病和免疫逃逸等過程奠定了基礎(chǔ)。在實踐應(yīng)用方面，本研究結(jié)果為開發(fā)新型的PRRS防控策略提供了潛在的靶點。基于對miR-125b和NF-κB信號通路的調(diào)控，可以設(shè)計和開發(fā)新型的抗病毒藥物，通過調(diào)節(jié)miR-125b的表達(dá)水平或干預(yù)NF-κB信號通路的激活，來抑制PRRSV的增殖，從而達(dá)到防控PRRS的目的。也為優(yōu)化疫苗設(shè)計提供了新思路，通過調(diào)節(jié)相關(guān)分子機(jī)制，增強(qiáng)疫苗的免疫效果，提高豬群對PRRSV的抵抗力。然而，本研究也存在一定的局限性。雖然明確了miR-125b通過負(fù)調(diào)控NF-κB信號通路抑制PRRSV增殖的主要機(jī)制，但在整個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，miR-125b可能還與其他信號通路或分子存在相互作用，這些潛在的相互作用尚未深入探究。體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，存在多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的相互調(diào)節(jié)，miR-125b在體內(nèi)對PRRSV感染和NF-κB信號通路的調(diào)控作用可能受到多種因素的影響，其具體的作用方式和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有待進(jìn)一步通過動物實驗等進(jìn)行深入研究。未來的研究可以從以下幾個方向展開。進(jìn)一步深入研究miR-125b與其他信號通路或分子的相互作用，構(gòu)建完整的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，全面揭示PRRSV感染過程中宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答機(jī)制。通過動物實驗，如構(gòu)建PRRSV感染的動物模型，深入研究miR-125b在體內(nèi)對PRRSV感染、NF-κB信號通路以及免疫應(yīng)答的影響，明確其在體內(nèi)的作用機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。基于本研究結(jié)果，開展新型抗病毒藥物和疫苗的研發(fā)工作，將研究成果轉(zhuǎn)化為實際應(yīng)用，為PRRS的防控提供更有效的手段。五、NF-κB信號通路對PRRSV增殖的影響5.1NF-κB信號通路抑制劑對PRRSV增殖的影響為了深入探究NF-κB信號通路對PRRSV增殖的影響，本研究采用NF-κB轉(zhuǎn)錄抑制劑BAY11-7082處理細(xì)胞。BAY11-7082是一種常用的NF-κB抑制劑，它能夠通過干擾NF-κB抑制蛋白IκB-α的失活，來抑制核因子NF-κB的激活和核轉(zhuǎn)位，IC50值約為10μM，具有良好的抑制效果。將Marc-145細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至80%-90%融合時，分為對照組和實驗組。實驗組加入終濃度為10μM的BAY11-7082處理細(xì)胞2h，對照組加入等體積的DMSO。隨后，兩組細(xì)胞均用PRRSVCH-1a株以感染復(fù)數(shù)（MOI）為0.1感染，繼續(xù)培養(yǎng)不同時間后進(jìn)行噬斑檢測。在感染后的24h、48h和72h，分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，進(jìn)行噬斑檢測。首先，將Marc-145細(xì)胞接種于12孔板中，每孔加入100μL不同稀釋度的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，37℃吸附1h，期間每隔15min輕輕搖晃一次，使病毒充分吸附。然后，棄去上清液，每孔加入含有1.5%羧***纖維素的DMEM維持液1mL，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天，待空斑形成明顯時，棄去維持液，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，然后用0.1%結(jié)晶紫染色10min，流水沖洗，晾干后計數(shù)空斑數(shù)量。結(jié)果顯示，對照組在感染PRRSV后24h、48h和72h，空斑數(shù)量隨著時間的延長逐漸增多，分別為（50±5）個、（120±8）個和（200±10）個；而實驗組在加入BAY11-7082處理后，空斑數(shù)量明顯減少，在相應(yīng)時間點分別為（20±3）個、（50±5）個和（80±8）個，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這表明BAY11-7082處理能夠顯著抑制PRRSV在Marc-145細(xì)胞中的增殖。隨著感染時間的延長，對照組中病毒持續(xù)增殖，空斑數(shù)量不斷增加，而實驗組由于NF-κB信號通路被抑制，病毒的增殖受到明顯阻礙，空斑數(shù)量增長緩慢。這充分說明NF-κB信號通路的激活對PRRSV的增殖具有促進(jìn)作用，抑制該信號通路能夠有效減少病毒的增殖。5.2過表達(dá)p65對PRRSV增殖的影響為進(jìn)一步驗證NF-κB表達(dá)與PRRSV增殖的關(guān)系，進(jìn)行了p65過表達(dá)實驗。將Marc-145細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至70%-80%融合時，分為對照組、miR-125bmimics組和miR-125bmimics+p65組。對照組轉(zhuǎn)染空載體，miR-125bmimics組轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物（mimics），miR-125bmimics+p65組先轉(zhuǎn)染miR-125bmimics，24h后再轉(zhuǎn)染p65過表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染過程中使用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑，按照試劑說明書進(jìn)行操作，以確保轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染48h后，用PRRSVCH-1a株以感染復(fù)數(shù)（MOI）為0.1感染細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)不同時間后進(jìn)行病毒增殖檢測。在感染后的24h、48h和72h，分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用實時熒光定量PCR法檢測病毒RNA拷貝數(shù)，以評估病毒的增殖情況。同時，收集細(xì)胞，提取總蛋白，通過Westernblot檢測PRRSVN蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)一步驗證病毒的增殖情況。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，在感染后的24h，對照組的病毒RNA拷貝數(shù)為（1.5×10?±1.2×10?）copies/mL，miR-125bmimics組的病毒RNA拷貝數(shù)顯著降低，為（3.0×10?±3.5×10?）copies/mL（P<0.01），表明miR-125b過表達(dá)能夠有效抑制PRRSV在感染初期的增殖。而miR-125bmimics+p65組的病毒RNA拷貝數(shù)為（8.0×10?±7.0×10?）copies/mL，顯著高于miR-125bmimics組（P<0.01），但仍低于對照組，說明過表達(dá)p65能夠部分逆轉(zhuǎn)miR-125b對病毒增殖的抑制作用。在感染后的48h和72h，也觀察到了類似的趨勢，隨著時間的延長，對照組病毒RNA拷貝數(shù)持續(xù)上升，miR-125bmimics組病毒增殖受到明顯抑制，miR-125bmimics+p65組病毒增殖介于兩者之間，進(jìn)一步證實了過表達(dá)p65對miR-125b抑制PRRSV增殖的逆轉(zhuǎn)作用。Westernblot檢測結(jié)果與實時熒光定量PCR結(jié)果一致。在感染后的24h，對照組的PRRSVN蛋白條帶明顯，灰度值分析顯示其相對表達(dá)量為1.00±0.08；miR-125bmimics組的N蛋白條帶顯著減弱，相對表達(dá)量為0.35±0.05（P<0.01），表明miR-125b過表達(dá)抑制了病毒N蛋白的表達(dá)。miR-125bmimics+p65組的N蛋白條帶強(qiáng)度介于對照組和miR-125bmimics組之間，相對表達(dá)量為0.60±0.06，顯著高于miR-125bmimics組（P<0.01），再次證明過表達(dá)p65能夠部分逆轉(zhuǎn)miR-125b對PRRSV增殖的抑制作用。在感染后的48h和72h，N蛋白表達(dá)水平的變化趨勢與24h相似，進(jìn)一步驗證了過表達(dá)p65對病毒增殖的影響。綜合以上實驗結(jié)果，過表達(dá)p65能夠部分逆轉(zhuǎn)miR-125b對PRRSV增殖的抑制作用，表明NF-κB信號通路中p65的表達(dá)與PRRSV的增殖密切相關(guān)，激活NF-κB信號通路（通過過表達(dá)p65）有利于PRRSV的增殖。5.3實驗結(jié)果與分析在NF-κB轉(zhuǎn)錄抑制劑BAY11-7082處理細(xì)胞的實驗中，噬斑檢測結(jié)果清晰地顯示出對PRRSV增殖的抑制作用。對照組隨著感染時間的延長，PRRSV在Marc-145細(xì)胞中持續(xù)增殖，空斑數(shù)量不斷增加。這是因為在正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的NF-κB信號通路未被抑制，PRRSV感染能夠激活該信號通路，從而促進(jìn)病毒的增殖。NF-κB信號通路激活后，會誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，這些因子為病毒的復(fù)制提供了有利的環(huán)境，例如促進(jìn)細(xì)胞的代謝活動，為病毒的核酸合成和蛋白質(zhì)合成提供更多的原料和能量；同時，NF-κB信號通路的激活還可能影響宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答，抑制機(jī)體對病毒的免疫清除能力，使得病毒能夠在細(xì)胞內(nèi)大量增殖并擴(kuò)散，表現(xiàn)為空斑數(shù)量的增多。而實驗組加入BAY11-7082處理后，空斑數(shù)量明顯減少。這是因為BAY11-7082能夠干擾NF-κB抑制蛋白IκB-α的失活，抑制核因子NF-κB的激活和核轉(zhuǎn)位。當(dāng)NF-κB信號通路被抑制時，其無法有效地誘導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，從而破壞了病毒增殖所需的有利環(huán)境。同時，宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答不再受到抑制，能夠更好地發(fā)揮對病毒的免疫清除作用，使得病毒的增殖受到明顯阻礙，空斑數(shù)量增長緩慢。這充分說明NF-κB信號通路的激活對PRRSV的增殖具有促進(jìn)作用，抑制該信號通路能夠有效減少病毒的增殖。在過表達(dá)p65的實驗中，實時熒光定量PCR和Westernblot檢測結(jié)果一致表明，過表達(dá)p65能夠部分逆轉(zhuǎn)miR-125b對PRRSV增殖的抑制作用。miR-125b過表達(dá)時，能夠負(fù)調(diào)控NF-κB信號通路，抑制IκBα的磷酸化，減少p65的活化和核轉(zhuǎn)位，從而抑制PRRSV的增殖，表現(xiàn)為病毒RNA拷貝數(shù)和N蛋白表達(dá)水平的降低。當(dāng)在miR-125bmimics組的基礎(chǔ)上過表達(dá)p65時，p65作為NF-κB信號通路的關(guān)鍵分子，其表達(dá)量的增加使得NF-κB信號通路的活性增強(qiáng)。即使存在miR-125b對信號通路的抑制作用，過表達(dá)的p65仍能部分恢復(fù)NF-κB信號通路的激活，進(jìn)而促進(jìn)PRRSV的增殖，使得病毒RNA拷貝數(shù)和N蛋白表達(dá)水平較miR-125bmimics組有所升高。但由于miR-125b仍然存在一定的抑制作用，所以病毒增殖水平仍低于對照組。這進(jìn)一步證明了NF-κB信號通路中p65的表達(dá)與PRRSV的增殖密切相關(guān)，激活NF-κB信號通路（通過過表達(dá)p65）有利于PRRSV的增殖。5.4討論本研究通過使用NF-κB轉(zhuǎn)錄抑制劑BAY11-7082處理細(xì)胞以及過表達(dá)p65的實驗，深入探究了NF-κB信號通路對PRRSV增殖的影響，明確了該信號通路在PRRSV感染過程中的關(guān)鍵作用。NF-κB信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)途徑，在多種生理和病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在病毒感染過程中，NF-κB信號通路的激活狀態(tài)與病毒的增殖密切相關(guān)。對于PRRSV而言，激活NF-κB信號通路能夠促進(jìn)病毒的增殖。這可能是因為NF-κB信號通路激活后，會誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，這些因子為病毒的復(fù)制提供了有利的環(huán)境。例如，NF-κB信號通路激活后，可能上調(diào)細(xì)胞內(nèi)某些代謝相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的代謝活動，為病毒的核酸合成和蛋白質(zhì)合成提供更多的原料和能量。NF-κB信號通路的激活還可能影響宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答，抑制機(jī)體對病毒的免疫清除能力。NF-κB信號通路激活后，可能誘導(dǎo)一些免疫抑制因子的表達(dá)，抑制免疫細(xì)胞的活性，使得病毒能夠在細(xì)胞內(nèi)大量增殖并擴(kuò)散。本研究中，BAY11-7082處理抑制PRRSV增殖的結(jié)果具有重要意義。BAY11-7082能夠干擾NF-κB抑制蛋白IκB-α的失活，抑制核因子NF-κB的激活和核轉(zhuǎn)位。當(dāng)NF-κB信號通路被抑制時，其無法有效地誘導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，從而破壞了病毒增殖所需的有利環(huán)境。宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答不再受到抑制，能夠更好地發(fā)揮對病毒的免疫清除作用，使得病毒的增殖受到明顯阻礙。這一結(jié)果不僅證實了NF-κB信號通路對PRRSV增殖的促進(jìn)作用，也為PRRS的防控提供了新的策略。通過開發(fā)和應(yīng)用NF-κB信號通路抑制劑，有可能有效地抑制PRRSV的增殖，減少病毒對豬群的危害。過表達(dá)p65能夠部分逆轉(zhuǎn)miR-125b對PRRSV增殖的抑制作用，進(jìn)一步證明了NF-κB信號通路與PRRSV增殖的密切關(guān)系。miR-125b過表達(dá)時，能夠負(fù)調(diào)控NF-κB信號通路，抑制PRRSV的增殖。而過表達(dá)p65作為NF-κB信號通路的關(guān)鍵分子，其表達(dá)量的增加使得NF-κB信號通路的活性增強(qiáng)，從而部分恢復(fù)了PRRSV的增殖能力。這一結(jié)果為深入理解miR-125b通過負(fù)調(diào)控NF-κB信號通路抑制PRRSV增殖的機(jī)制提供了有力的證據(jù)。同時，也提示我們在研究PRRSV的防控策略時，可以考慮通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)來實現(xiàn)對病毒增殖的控制。本研究結(jié)果對于PRRS的防治具有重要的指導(dǎo)意義。在實際應(yīng)用中，可以基于對NF-κB信號通路的調(diào)控，開發(fā)新型的抗病毒藥物。篩選和研發(fā)能夠特異性抑制NF-κB信號通路激活的小分子化合物，或者設(shè)計針對NF-κB信號通路關(guān)鍵分子的抗體，以阻斷該信號通路，從而抑制PRRSV的增殖。也可以通過基因治療等手段，調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號通路相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)宿主對PRRSV的抵抗力。這些策略的實施，將有助于降低PRRSV對養(yǎng)豬業(yè)的危害，促進(jìn)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。然而，本研究也存在一定的局限性。雖然明確了NF-κB信號通路對PRRSV增殖的影響，但在實際的PRRSV感染過程中，病毒與宿主細(xì)胞之間的相互作用是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，涉及多種信號通路和分子的相互調(diào)節(jié)。未來的研究需要進(jìn)一步深入探究NF-κB信號通路與其他信號通路之間的相互作用，以及這些相互作用如何共同影響PRRSV的感染和增殖。體內(nèi)環(huán)境與體外實驗存在差異，需要通過動物實驗進(jìn)一步驗證NF-κB信號通路抑制劑和調(diào)節(jié)策略在體內(nèi)的有效性和安全性。六、結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論總結(jié)本研究圍繞miR-125b通過負(fù)調(diào)控NF-κB信號通路抑制PRRSV增殖這一核心問題，開展了一系列實驗研究，取得了以下重要結(jié)論：miR-125b對PRRSV增殖的抑制作用：通過絕對定量、空斑實驗、免疫熒光和Westernblot檢測等多種實驗方法，在Marc-145細(xì)胞和豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）中證實了miR-125b能夠顯著抑制