分子生物學(xué)大實驗—目的基因的克隆與及一、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 二、質(zhì)粒概述 三、凝膠電泳 四、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化 五、重組質(zhì)粒的連接 六、限制性內(nèi)切酶消化 第二節(jié)材料、設(shè)備及試劑 二、設(shè)備 三、試劑： 第三節(jié)操作步驟 四、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α進(jìn)行陽性克隆子篩選與鑒定 第一節(jié)基因操作概述DNA聚合酶合成DNA的最適溫度下，以目的DNA為模板進(jìn)行合成。由這三個基本步驟組成一輪循環(huán)，理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴增一倍，這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板，所以經(jīng)25～35輪循環(huán)就可使DNA1、引物：PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對上下游引物所目的DNA序列區(qū)域時可遵循下列原則：(1)引物長度約為16～30bp，太短會降低退火溫度影響引物與模板配對，從而讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應(yīng)，以減少由于密碼子擺動產(chǎn)生的不配對。(6)兩引物之間尤其在3'端不能互補，以防出現(xiàn)引物二聚體，減少產(chǎn)量。(7)引物5'端對擴增特異性影響不大，可在引物設(shè)計時加上限制酶位點、核糖體結(jié)合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標(biāo)記生物素、熒產(chǎn)生錯誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體，過低則降低產(chǎn)量。可配成5～10mmol/L并分裝，-20℃貯存。一般反應(yīng)中每種+可影響酶的活性和真實性，影響引物退火和解鏈溫度，影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。通常Mg2+濃度范圍為0.5～2mmol/L。對于一種新的PCR反應(yīng)，可以用0.1~5mmol/L的遞增濃度的Mg2+進(jìn)行預(yù)備實驗，選出最適的4、模板：PCR反應(yīng)必須以DNA為模板進(jìn)行擴增，模板也可以是環(huán)狀分子(線狀分子比環(huán)狀分子的擴增效果稍好)。就模板DNA而言，影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度。一般反應(yīng)中的模板數(shù)量為102～105個拷貝，對于單拷貝1ng的大腸桿菌DNA。擴增多拷貝序列時，用量更少。靈敏的DNA中分析目的序列。模板量過多則可能增加非特異性許多新的耐熱的DNA聚合酶，這些酶的活性在高溫下活性可維持更長時間。TaqDNA聚合酶的酶活性單1.5~量可根據(jù)DNA、引物及其它因素的變化進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑鰷p。酶量過多會使產(chǎn)物非特異性增加，過少則使產(chǎn)量降低。的退火。另外，反應(yīng)液可加入5mmol/L的二硫蘇糖醇(DDT)常重要，它可使模板DNA完全解鏈，然后加入TaqDNA聚合酶(hotstart)，這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對的引物與模板復(fù)合物所造成的錯誤。變性不完全，往往使PCR失敗，因為未變性完全的DNA雙鏈會很在變性溫度下，雙鏈DNA解鏈只需幾秒鐘即可完全，所耗時間主要是為使反應(yīng)體系完全達(dá)到適當(dāng)?shù)臏囟取?、退火：引物退火的溫度和所需時間的長短取決于引物的堿基組成，引物的長度、引物與模板的配對程度以及引物的濃度。實際使用的退火溫度比擴增引物的Tm值約低應(yīng)提高退火溫度。退火溫度越高，所得產(chǎn)物的特異性越高。通常退火溫度和時間為37℃~55℃,1～2min。3、延伸：延伸反應(yīng)通常為72℃,接近于TaqDNA聚合酶的最適反應(yīng)溫度75℃。實際上，引物延伸在退火時即已開始，因為TaqDNA聚合酶的作用溫度范圍可從20℃~85℃。延伸反應(yīng)時間的長短取決于目的序列的長度和濃度。4、循環(huán)次數(shù)：當(dāng)其它參數(shù)確定之后，循環(huán)次數(shù)主要取決于DNA濃度。一般而言25～30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多，會使PCR產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。通常經(jīng)如果此時產(chǎn)物量仍不夠，需要進(jìn)一步擴增。把一個有用的目的DNA片段通過重組DNA技術(shù)，送進(jìn)粒是重組DNA技術(shù)中常用的載體。質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1～200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依賴于宿主細(xì)胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，如離開宿主細(xì)胞則不能存活，而宿主即使沒有它們也可以正常存活。質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性，如對抗生素的抗性等。質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上為適應(yīng)實驗室操作而進(jìn)行人工構(gòu)建的。與天然質(zhì)粒相比，質(zhì)粒載體通常帶有一個或一個以上的選擇性標(biāo)記基因(如抗生素抗性基因)和一個人工合成的含有多個限制性內(nèi)切酶識別位點的多克隆位點序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量盡可能減少，以便于基因工程操作。大多質(zhì)粒載體帶有一些多用途的輔助序列，這些用途包括通過組織化學(xué)方法肉眼鑒定重組克隆、產(chǎn)生用于序列測定的單鏈DNA、體外轉(zhuǎn)錄外源DNA序列、鑒定片段的插入方向、外源基因的大量表達(dá)等。一個理想的克隆載體大致應(yīng)有下列一些特性1）分子量小、多拷貝、松馳控制型2）具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單切點3）能插入較大的外源DNA片段4）具有容易操作的檢測表型。在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，共價閉環(huán)質(zhì)粒以超螺旋形式存在。在提取質(zhì)粒過程中，除了超螺旋DNA外，還會產(chǎn)生其它形式的質(zhì)粒DNA。如果質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松馳型的環(huán)狀分質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂，則形成線狀DNA(LinearDNA)。當(dāng)提取的質(zhì)粒DNA電泳時，同一質(zhì)粒DNA其超螺旋形式的泳動速度要比開環(huán)和線狀分子的泳動速度快。三、凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。該技術(shù)操作簡便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度離心法）所無法分離的DNA片段。當(dāng)用低濃度的熒光嵌在凝膠中的位置。此外，還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶，用于以后的克隆操作。瓊脂糖可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣，不同濃度瓊脂糖凝膠可分離置在強度和方向恒定的電場下電泳。目前，一般實驗室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進(jìn)行DNA電泳。瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場中，在中性pH值下帶負(fù)電荷的DNA向陽極遷移，其遷移速率由下列多種因素決線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。一個給定大小的線狀DNA分子，其遷移速度在不同濃濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。當(dāng)DNA分子處于不同構(gòu)象時，它在電場中移動距離不開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的，超螺旋DNA移動最快，開環(huán)DNA移動最慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起還是因為含有其他DNA引起時，可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收，用同一種限制性內(nèi)切酶分別水解，然后電泳，如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜，則為同一種DNA。在低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長，片段越大，因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達(dá)到最大，所加電壓不得超過5v/cm。5、嵌入染料的存在會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強，還會使線狀DNA遷移率降低15％。電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配制凝膠)，電導(dǎo)率最小，DNA幾乎不移動，在高離子強度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液)，則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱，嚴(yán)重時會引起凝膠熔化或DNA變性。四、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化使之獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實驗技術(shù)。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(R-，M-)，它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法(如電擊法，CaCl2，RbCl(KCl)等化學(xué)試劑法)的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)表達(dá)實現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。便易行，且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實驗的要求，制備1、細(xì)胞生長狀態(tài)和密度：不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲于4℃的培養(yǎng)菌，最好從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600來控制。DH52、質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度：用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時，轉(zhuǎn)化效率就會降低。一般情況下，DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5％。3、試劑的質(zhì)量：所用的試劑，如CaCl2等均需是最高純度的(GR或AR)，并用超純水配制，最好分裝保存于干燥的4、防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜五、重組質(zhì)粒的連接外源DNA片段和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)策略有以下幾種：1、帶有非互補突出端的片段用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化可以產(chǎn)生帶有非互補的粘性末端，這也是最容易克隆的DNA片段，一般情況下，常用質(zhì)粒載體均帶有多個不同限制酶的識別序列組成的多克隆位點，因而幾乎總能找到與外源DNA片段末端匹配的限制酶切位點的載體，從DNA片段兩端人為加上不同酶切位點以便與載體相連。2、帶有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。由于質(zhì)粒載體也必須用同一種酶消化，亦得到同樣的兩個相同粘性末端，因此在連接反應(yīng)中外源片段和質(zhì)粒載體DNA均可能發(fā)生自身環(huán)化或幾個分子串連形成寡聚物，而且正反兩種連接方向都可能有。3、帶有平末端是由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chǎn)生，或由DNA聚合酶補平所致。由于平端的連接效率比粘性末端要低得多，故在其連接反應(yīng)中，T4DNA連接酶的濃度和外源DNA及載體DNA濃度均要高得多。通常還需加入低濃度的聚乙二醇(PEG8000)以促進(jìn)DNA分子凝聚成聚集體的物質(zhì)以提高轉(zhuǎn)化效率。六、限制性內(nèi)切酶消化限制性內(nèi)切酶可特異地結(jié)合于一段被稱為限制酶識別序列的DNA序列位點上并在此切割雙鏈DNA。絕大多數(shù)限制性內(nèi)切酶識別長度為4、5或6個核苷酸且呈二重對稱的些酶恰在對稱軸處同時切割DNA雙鏈而產(chǎn)生帶平端的DNA片段，另一些酶則在對稱軸兩側(cè)相對的位置上分別切斷兩條鏈，產(chǎn)生帶有單鏈突出端（即粘端）的DNA片段。1個單位限制性內(nèi)切酶是指在最適條件下，在50μl體積1小時內(nèi)完全切開1μgλ噬菌體DNA所需的酶量。不同的限制性內(nèi)切酶生產(chǎn)廠家往往推薦使用截然不同的反應(yīng)條件，甚至對同一種酶也如此。但是，幾乎所有的生產(chǎn)廠家都對其生產(chǎn)的酶制劑優(yōu)化過反應(yīng)條件，因此購買的內(nèi)切酶說明書上均有其識別序列和切割位點，同時提供有酶切緩沖液（buffer，×)和最適條件，使得酶切反應(yīng)變得日益簡單。細(xì)菌體中含有大量蛋白質(zhì)，具有不同的電荷和分子量。在聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）上，不同蛋白質(zhì)的僅取決于分子量。采用考馬斯亮蘭快速染色，可及時觀察電泳分離效果。因而根據(jù)預(yù)計表達(dá)蛋白的分子量，可篩選陽性第二節(jié)材料、設(shè)備及試劑不同來源的模板DNA；表2-1設(shè)計Cry1Ac結(jié)構(gòu)域基因特異引物1AATA-3'4 6789表2-2Cry1Ac結(jié)構(gòu)域菌體陽性克隆子的引物5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'5'-GATTTAGGTGACACTATAG-3'脂糖凝膠電泳所需設(shè)備(電泳槽及電泳儀)；臺式高速離心機；恒溫振蕩搖床；高壓蒸汽消毒器(滅菌鍋)；渦旋振蕩器；恒溫水浴鍋；臺式高速離心機；微波爐或電爐；紫外透射儀；數(shù)碼相機及其附件；電熱恒溫培養(yǎng)箱；無菌工作臺；低溫冰9、氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)母液：配成50mg/ml水溶10mg/ml，并分裝成小份(如1.5ml)保存于-20℃,每一小份一管分裝成小份保存于-20℃。17、按體積/體積＝1：1混合上述飽和酚與氯仿即得酚/氯仿箔或黑紙包裹容器，儲于室溫即可。誘變劑，操作時帶手套），輕輕搖勻。緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液0.5×TAE即可上樣。壓滅菌后冷卻至60℃左右，加入Amp儲存液，使終濃度為23、連接反應(yīng)緩沖液(10×)：0.5mol/LT222s模板總體積（二）、進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并且作柱回收1、用干凈的刀片將單一的DNA條帶從瓊脂糖凝膠上切下，8、將吸附柱放入一個干凈的離心管中，在吸附膜中間位置注意事項紫外燈下切下含待回收DNA的凝膠時，要襯以干凈的塑料結(jié)構(gòu)域基因的雙酶切反應(yīng)體系模板DNA限制性內(nèi)切酶緩沖液去離子水總體積3、加入100uL預(yù)冷的溶液Ⅰ,在渦旋混合器上劇烈振蕩直4、加入200uL新配制的溶液Ⅱ,快速顛倒離心管5次，以混合內(nèi)容物，不要振蕩，室溫3～5min。5、加入150uL預(yù)冷的溶液Ⅲ,溫和地振蕩混勻，可見白色9、用一小條濾紙小心吸去管壁殘留的上清，將離心管放在超凈臺中通風(fēng)干燥，直至無乙醇?xì)馕?。質(zhì)粒DNA，振蕩混勻，-20℃?zhèn)溆?。載體的雙酶切反應(yīng)體系表達(dá)載體限制性內(nèi)切酶緩沖液去離子水總體積1、在離心管中建立下列連接體系表達(dá)載體四、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α進(jìn)行陽性克隆子篩選與鑒定（一）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備（DH5α、BL21plyst）注：常規(guī)CaCl2法，要求無菌操作。5、進(jìn)行分裝，向每一個離心管中加約200uL的感受態(tài)細(xì)胞。（二）連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化（三）從平板中調(diào)取30個菌落編號1～30，經(jīng)T7、SP6特異引物進(jìn)行PCR擴增，來篩選陽性克隆子，最后只需選擇一個陽性重組質(zhì)粒，分別進(jìn)行單酶切、雙酶切及及原始目的片段PCR擴增以確保目的片段真正地連接到表達(dá)載體上。Cry1Ac結(jié)構(gòu)域菌體陽性克隆子的PCR擴增體模板L）去離子水總體積當(dāng)載體上T7、SP6特異引物P調(diào)后，應(yīng)在原目的片段基sBL21plyst，搖菌進(jìn)行SDS、將陽性克隆子分別進(jìn)行質(zhì)粒提取，再分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌2、菌種活化：5mL培養(yǎng)基的試管中各加入氨芐，搖勻。用10uL無菌槍頭挑取單菌落，接種。放入到搖床中，180r/min，37℃,振蕩培養(yǎng)12h。取出活化好的菌種。先放到搖床中，230r/min，37℃,振蕩培養(yǎng)2h~3