基因組重組技術(shù)操作細(xì)則一、基因組重組技術(shù)概述

基因組重組技術(shù)是指通過人工手段將不同來源的DNA片段進行切割、連接和重組，從而創(chuàng)造出新的基因組合或改良現(xiàn)有基因序列的技術(shù)。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究、基因功能分析、疾病模型構(gòu)建、生物制藥等領(lǐng)域。為確保操作安全、高效，需嚴(yán)格遵循以下操作細(xì)則。

二、實驗準(zhǔn)備

（一）試劑與材料

1.限制性核酸內(nèi)切酶：根據(jù)目標(biāo)DNA序列選擇合適的內(nèi)切酶，常見類型包括EcoRI、BamHI、HindIII等。

2.DNA連接酶：用于連接DNA片段，常用T4DNA連接酶。

3.TaqDNA聚合酶：用于PCR擴增（如需）。

4.緩沖液：包括限制性內(nèi)切酶緩沖液、連接酶緩沖液等。

5.載體DNA：如質(zhì)粒或噬菌體DNA，用于承載重組基因。

6.宿主細(xì)胞：如大腸桿菌（E.coli），用于轉(zhuǎn)化和擴增重組DNA。

7.瓊脂糖凝膠：用于DNA電泳檢測。

（二）儀器設(shè)備

1.PCR儀：用于DNA擴增。

2.電泳儀：用于DNA片段分離檢測。

3.離心機：用于樣本分離。

4.超凈工作臺：用于無菌操作。

5.移液器：精確吸取試劑。

（三）實驗流程

1.提取DNA：從源生物體中提取目標(biāo)DNA，可通過細(xì)胞裂解或商業(yè)試劑盒獲取。

2.設(shè)計引物：根據(jù)目標(biāo)序列設(shè)計特異性引物（如需PCR擴增）。

3.準(zhǔn)備反應(yīng)體系：按以下步驟配置限制性內(nèi)切酶消化體系：

-DNA模板（100-500ng）

-限制性內(nèi)切酶（1-5U/μL）

-緩沖液（10-20μL）

-無菌水補足體積至50μL

-37℃水浴消化1-4小時。

三、基因組重組操作步驟

（一）DNA片段切割

1.限制性內(nèi)切酶消化：

-將提取的DNA與限制性內(nèi)切酶、緩沖液混合。

-37℃恒溫反應(yīng)1-2小時，確保完全切割。

-通過瓊脂糖凝膠電泳驗證切割效果，確保目標(biāo)片段分離清晰。

2.酶切產(chǎn)物純化：

-使用凝膠回收試劑盒或柱式純化系統(tǒng)回收目標(biāo)DNA片段。

-通過OD260nm檢測純化DNA濃度（預(yù)期值：1.8-2.0）。

（二）DNA連接

1.連接反應(yīng)體系配置：

-純化后的目標(biāo)片段（50-100ng）

-載體DNA（50-100ng）

-T4DNA連接酶（1-2U/μL）

-連接酶緩沖液（10μL）

-無菌水補足體積至50μL

2.連接反應(yīng)條件：

-16℃連接過夜（增強連接效率）。

-37℃溫育1小時（快速連接）。

-通過瓊脂糖凝膠電泳檢測連接產(chǎn)物，確認(rèn)條帶大小正確。

（三）轉(zhuǎn)化與篩選

1.轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞：

-將連接產(chǎn)物通過熱激法或電穿孔法導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。

-冰上靜置30分鐘，42℃熱激45秒，冰上冷卻2分鐘。

2.平板篩選：

-涂布含抗生素（如氨芐青霉素）的LB平板。

-37℃培養(yǎng)過夜，篩選陽性克隆（抗生素抗性菌株）。

3.驗證重組DNA：

-提取質(zhì)粒DNA，通過PCR或限制性內(nèi)切酶驗證重組序列正確性。

-送測序平臺進行序列測定（可選）。

四、注意事項

1.無菌操作：所有試劑和操作需在超凈工作臺進行，避免污染。

2.酶活性校準(zhǔn)：定期檢測限制性內(nèi)切酶和連接酶活性，確保實驗效率。

3.DNA純度檢測：OD260/280比值應(yīng)介于1.8-2.0，過低可能影響連接效率。

4.反應(yīng)條件優(yōu)化：初次實驗建議測試不同溫度、時間組合，以獲得最佳結(jié)果。

五、安全防護

1.個人防護：佩戴手套、護目鏡，穿實驗服，避免接觸皮膚和眼睛。

2.廢棄物處理：實驗廢棄物需經(jīng)高壓滅菌后統(tǒng)一處理。

3.設(shè)備維護：定期校準(zhǔn)電泳儀、離心機等設(shè)備，確保運行穩(wěn)定。

基因組重組技術(shù)操作需嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)致，以上步驟需根據(jù)具體實驗需求進行調(diào)整。

三、基因組重組操作步驟

（一）DNA片段切割

1.限制性內(nèi)切酶消化：

-目標(biāo)DNA準(zhǔn)備：從細(xì)胞或組織中提取目標(biāo)DNA，使用商業(yè)試劑盒或自行提取。提取后，通過瓊脂糖凝膠電泳初步檢測DNA質(zhì)量和純度，確保主條帶清晰，無明顯降解或雜質(zhì)。使用核酸蛋白測定儀（如NanoDrop）檢測DNA濃度和純度（OD260/280比值應(yīng)介于1.8-2.0），必要時進行乙醇沉淀純化。

-限制性內(nèi)切酶選擇：根據(jù)目標(biāo)DNA序列的酶切位點信息，選擇合適的限制性內(nèi)切酶。常見內(nèi)切酶類型包括EcoRI（識別GAATTC，切割產(chǎn)生粘性末端）、BamHI（識別GGATCC，切割產(chǎn)生粘性末端）、HindIII（識別AAGCTT，切割產(chǎn)生粘性末端）、SmaI（識別CCCGG，切割產(chǎn)生平末端）等?？刹殚喢盖袛?shù)據(jù)庫（如NEB網(wǎng)站）獲取酶的特異性、最優(yōu)工作條件（溫度、緩沖液）及識別序列。

-酶切反應(yīng)體系配置：在無菌PCR管中依次加入以下試劑，總體積通常為20-50μL：

-目標(biāo)DNA模板（50-1000ng，濃度需預(yù)先測定）

-限制性內(nèi)切酶（1-5U/μL，根據(jù)酶活性調(diào)整用量）

-酶切緩沖液（10-20μL，需確認(rèn)與所選酶兼容，若酶商提供緩沖液則直接使用，否則需根據(jù)說明書添加Mg2?等必需離子）

-無菌水補足至50μL

-酶切反應(yīng)條件：

-溫度：大多數(shù)內(nèi)切酶最適溫度為37℃，少數(shù)如HaeIII為45℃，BstNI為55℃。需參考酶的說明書。

-時間：通常37℃水浴1-4小時，對于低豐度位點或大量DNA，可延長至6-8小時。平末端連接酶（如SmaI）無溫度要求，但需確保緩沖液適宜。

-酶量優(yōu)化：初次實驗可嘗試不同酶量（如0.5U/μL、1U/μL、2U/μL），觀察消化效果，避免過量酶導(dǎo)致非特異性切割或DNA降解。

-酶切效果驗證：通過1%-2%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物。使用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（如LambdaDNAHindIII消化級分）進行對照。理想結(jié)果應(yīng)顯示單一、清晰的條帶，或根據(jù)預(yù)期產(chǎn)生特定條帶大小的片段。若出現(xiàn)多條非特異性條帶，可能原因包括：酶濃度過高、DNA純度低、酶失活或反應(yīng)條件不當(dāng)。需重新優(yōu)化實驗。

2.酶切產(chǎn)物純化：

-凝膠回收法：若酶切產(chǎn)物通過凝膠電泳分離，使用凝膠回收試劑盒（如Axygen、Zymo）進行回收。步驟如下：

-切取含目標(biāo)條帶的凝膠片段，置于預(yù)冷的凝膠回收柱中。

-加入裂解緩沖液使DNA充分釋放，離心洗脫。

-重復(fù)洗滌步驟，去除凝膠碎片和抑制劑。

-乙醇沉淀或直接使用柱式純化試劑盒（如AxygenGelExtractionKit）進一步純化，最后用無酶水溶解DNA。

-柱式純化法（直接酶切）：若直接在溶液中進行酶切，可使用PCR純化柱（如QiagenPCRPurificationKit）或特定DNA純化柱（如AxygenDNAPurificationKit）進行純化。步驟：

-酶切反應(yīng)完成后，加入等體積的乙醇（含3M醋酸銨）沉淀DNA。

-離心收集沉淀，棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀。

-空氣干燥或真空干燥5-10分鐘，避免過度干燥。

-加入無酶水溶解DNA，使用移液器輕輕吹打確保完全溶解。

-純化產(chǎn)物檢測：通過瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白測定儀檢測純化DNA的濃度和純度。預(yù)期濃度：50-500ng/μL，OD260/280：1.8-2.0。若純度不足，需重新純化。

（二）DNA連接

1.連接反應(yīng)體系配置：

-組分：在無菌PCR管中依次加入以下試劑，總體積通常為10-50μL：

-目標(biāo)DNA片段（10-500ng，濃度需測定）

-載體DNA（10-100ng，若載體為質(zhì)粒，需先進行線性化處理，如用SmaI或BamHI單一酶切）

-T4DNA連接酶（0.5-2.5U/μL，根據(jù)酶活性調(diào)整）

-連接酶緩沖液（5-10μL，需確認(rèn)與T4DNA連接酶兼容，若商提供則直接使用，否則需添加10mMMgCl?、1mMATP等必需成分）

-無菌水補足至50μL

-連接效率優(yōu)化：

-溫度：T4DNA連接酶最適溫度為16℃，此溫度下連接效率最高，尤其適用于平末端連接。若使用粘性末端，也可嘗試37℃（1小時）或4℃（過夜）。

-時間：平末端連接建議16℃過夜；粘性末端連接可37℃連接1小時或室溫連接30分鐘。

-酶量：根據(jù)酶活性調(diào)整用量，通常1U/μL足以完成連接，過量酶可能影響效率。

-pH值：連接反應(yīng)需在pH7.6-8.0范圍內(nèi)進行，緩沖液通常已調(diào)節(jié)至適宜pH。

2.連接反應(yīng)條件：

-平末端連接：

-16℃水浴過夜（12-16小時）。

-4℃保存?zhèn)溆没蛑苯愚D(zhuǎn)化。

-粘性末端連接：

-37℃水浴1小時（快速連接）。

-或16℃過夜（提高連接特異性）。

-或室溫連接30分鐘（簡便快捷）。

-連接效果驗證：通過瓊脂糖凝膠電泳檢測連接產(chǎn)物。理想結(jié)果應(yīng)顯示預(yù)期大小的單一條帶。若出現(xiàn)彌散性條帶，可能原因包括：DNA濃度過高、連接酶濃度過高、反應(yīng)時間過長或DNA降解。需重新優(yōu)化。

3.連接產(chǎn)物純化（可選）：

-若后續(xù)步驟對連接產(chǎn)物純度要求高（如測序、亞克?。?，可使用PCR純化柱（如QiagenPCRPurificationKit）或凝膠回收試劑盒進行純化。純化后用無酶水溶解DNA，檢測濃度和純度。

（三）轉(zhuǎn)化與篩選

1.宿主細(xì)胞準(zhǔn)備：

-感受態(tài)細(xì)胞制備：若使用商業(yè)感受態(tài)細(xì)胞（如ThermoFisher、NewEnglandBiolabs），按說明書操作。若自行制備，需通過鈣離子處理（如氯化鈣法）或電穿孔法制備感受態(tài)細(xì)胞。制備完成后，需通過轉(zhuǎn)化效率測試（如用pUC19質(zhì)粒檢測）確認(rèn)細(xì)胞活性（預(yù)期轉(zhuǎn)化效率：10?-101?cfu/μgDNA）。

-細(xì)胞儲存：感受態(tài)細(xì)胞需-80℃凍存，使用前需在冰上復(fù)蘇。

2.轉(zhuǎn)化操作：

-熱激法：

-取100μL感受態(tài)細(xì)胞置于預(yù)冷的無菌離心管中，冰上靜置5分鐘。

-加入連接產(chǎn)物（通常1-5μL，含0.5-10ngDNA），輕輕混勻，冰上靜置30分鐘。

-42℃水浴熱激45-90秒（通常45秒），立即冰上冷卻2分鐘。

-加入900μL預(yù)熱LB培養(yǎng)基（含抗生素，如氨芐青霉素100μg/mL），37℃振蕩培養(yǎng)45-60分鐘。

-取100μL菌液涂布含相同抗生素的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜。

-電穿孔法：

-取20-50μL感受態(tài)細(xì)胞置于預(yù)冷的電穿孔杯中，冰上靜置5分鐘。

-加入連接產(chǎn)物（通常1-5μL，含0.5-10ngDNA），輕輕混勻，冰上靜置10-15分鐘。

-置于電穿孔儀中，設(shè)置電擊參數(shù)（如電壓1.5-2.5kV，電容25-50μF，時間1-5μs，具體參數(shù)需根據(jù)電穿孔儀和細(xì)胞類型優(yōu)化）。電擊后立即加入900μLLB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)45-60分鐘。

-取100μL菌液涂布含相同抗生素的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜。

3.平板篩選：

-抗生素選擇：根據(jù)載體上抗生素抗性基因（如氨芐青霉素抗性基因ampicillinresistance，編碼β-內(nèi)酰胺酶）選擇相應(yīng)抗生素（如氨芐青霉素）。常見濃度：100-200μg/mL。

-平板制作：稱取3g瓊脂糖粉末加入100mLLB培養(yǎng)基（含抗生素），加熱溶解，冷卻至50-55℃，傾注于培養(yǎng)皿，待凝固后倒置。

-涂布操作：使用移液器吸取菌液，在超凈工作臺中均勻涂布于平板表面，避免氣泡。

-培養(yǎng)：37℃培養(yǎng)12-16小時，觀察菌落生長情況。陽性轉(zhuǎn)化子平板應(yīng)出現(xiàn)分散的單一菌落。

4.陽性克隆驗證：

-菌落PCR驗證：

-用移液器挑取單菌落，接種于含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜培養(yǎng)。

-提取質(zhì)粒DNA，進行PCR擴增（引物需設(shè)計在載體和插入片段的邊界區(qū)域）。預(yù)期PCR產(chǎn)物大小應(yīng)與連接產(chǎn)物預(yù)期大小一致。

-限制性內(nèi)切酶驗證：

-提取質(zhì)粒DNA，使用與連接反應(yīng)不同的限制性內(nèi)切酶（如若連接使用了EcoRI+BamHI，可用HindIII驗證載體部分，或用BamHI驗證插入片段部分），進行瓊脂糖凝膠電泳。預(yù)期結(jié)果應(yīng)顯示與插入片段大小一致的條帶。

-測序驗證（推薦）：選取數(shù)個陽性克隆送測序（如使用BigDyeTerminator測序法或Illumina測序平臺），確認(rèn)重組序列正確性。測序結(jié)果與目標(biāo)序列進行比對，確保無突變或錯誤連接。

（四）重組質(zhì)粒擴增與提取

1.質(zhì)粒擴增：

-培養(yǎng)單克?。簭尿炞C正確的單菌落中挑取，接種于含抗生素的LB液體培養(yǎng)基（1mL），37℃振蕩過夜培養(yǎng)。

-擴大培養(yǎng)：取100μL過夜菌液接種于500mL含抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)4-6小時，直至OD600達(dá)到0.6-0.8。

2.質(zhì)粒提?。?/p>

-堿裂解法（一步法）：

-收集菌液，冰上冷卻，離心收集菌體。

-加入裂解緩沖液（含NaOH和SDS），顛倒混勻，冰上孵育5分鐘。

-加入氯仿-異戊醇（24:1），顛倒混勻，離心分離有機相和水相。

-取水相，加入等體積異丙醇，混勻，-20℃沉淀DNA過夜。

-離心收集沉淀，用70%乙醇洗滌，空氣干燥，無酶水溶解。

-柱式質(zhì)粒提取試劑盒（如QiagenPlasmidMaxiKit）：

-收集菌液，離心收集菌體，重懸于預(yù)洗緩沖液（P1），加入裂解緩沖液（P2），混勻。

-加入高鹽緩沖液（P3），混合后離心，棄上清。

-加入洗脫緩沖液（PE），室溫孵育5分鐘，離心收集洗脫液。

-通過瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白測定儀檢測質(zhì)粒濃度和純度。預(yù)期濃度：500-2000ng/μL，OD260