動(dòng)物組織細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)則一、動(dòng)物組織細(xì)胞培養(yǎng)概述

動(dòng)物組織細(xì)胞培養(yǎng)是指在體外條件下，利用特定的培養(yǎng)基和生長(zhǎng)環(huán)境，使動(dòng)物組織或細(xì)胞增殖、分化并維持其生理活性的技術(shù)。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究、藥物篩選、細(xì)胞治療等領(lǐng)域。為確保培養(yǎng)過(guò)程的安全、高效和標(biāo)準(zhǔn)化，需遵循以下規(guī)則。

二、細(xì)胞培養(yǎng)前的準(zhǔn)備

（一）實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求

1.工作區(qū)域應(yīng)保持潔凈，避免污染。

2.溫度應(yīng)控制在22-26℃之間，濕度維持在50%-60%。

3.空氣流通需良好，建議使用空氣凈化系統(tǒng)。

（二）設(shè)備與耗材準(zhǔn)備

1.使用超凈工作臺(tái)或生物安全柜，確保無(wú)菌操作。

2.培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等需高壓滅菌（121℃，15分鐘）。

3.培養(yǎng)基需新鮮配制，并經(jīng)過(guò)除菌處理（如0.22μm濾膜過(guò)濾）。

（三）個(gè)人防護(hù)措施

1.操作人員需穿戴潔凈工作服、手套和口罩。

2.定期進(jìn)行手部消毒，避免交叉污染。

三、細(xì)胞培養(yǎng)操作步驟

（一）細(xì)胞復(fù)蘇與接種

1.將凍存細(xì)胞解凍，迅速置于37℃水浴中融化。

2.加入適量預(yù)溫培養(yǎng)基（如含10%胎牛血清的DMEM），混勻。

3.將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，密度控制在1×10?-1×10?cells/mL。

（二）日常培養(yǎng)管理

1.每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，記錄形態(tài)變化（如貼壁率、匯合度）。

2.每隔1-2天更換培養(yǎng)基，避免代謝產(chǎn)物積累影響生長(zhǎng)。

3.使用pH試紙檢測(cè)培養(yǎng)基酸堿度，維持在7.2-7.4。

（三）傳代與凍存

1.當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代。

-步驟：用胰蛋白酶消化（0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA，37℃消化3-5分鐘），用培養(yǎng)基終止消化后收集細(xì)胞。

2.凍存時(shí)，細(xì)胞懸液需加入等量?jī)龃嬉海ê?0%DMSO和90%培養(yǎng)基），緩慢降至-80℃保存。

四、質(zhì)量控制與安全規(guī)范

（一）污染防控

1.定期檢測(cè)培養(yǎng)環(huán)境中的微生物（如細(xì)菌、真菌），確保無(wú)菌。

2.操作前后用75%酒精擦拭臺(tái)面和設(shè)備表面。

（二）廢棄物處理

1.培養(yǎng)基和細(xì)胞懸液需經(jīng)高壓滅菌后丟棄。

2.使用一次性耗材減少交叉污染風(fēng)險(xiǎn)。

（三）記錄與保存

1.詳細(xì)記錄培養(yǎng)過(guò)程（如培養(yǎng)基配比、傳代次數(shù)），存檔備查。

2.細(xì)胞系信息需明確標(biāo)注，避免混淆。

五、注意事項(xiàng)

1.所有操作需在超凈環(huán)境下進(jìn)行，避免空氣中的微生物污染。

2.不同細(xì)胞類型需根據(jù)其生理特性調(diào)整培養(yǎng)參數(shù)（如CO?濃度、pH值）。

3.定期校準(zhǔn)培養(yǎng)設(shè)備（如培養(yǎng)箱、CO?孵育器），確保性能穩(wěn)定。

一、動(dòng)物組織細(xì)胞培養(yǎng)概述

動(dòng)物組織細(xì)胞培養(yǎng)是指在體外可控的條件下，模擬細(xì)胞在體內(nèi)的生理環(huán)境，使動(dòng)物組織或從組織中分離出的細(xì)胞能夠生存、增殖并保持其特定功能的一種生物技術(shù)方法。它已成為現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究、藥物開發(fā)與篩選、細(xì)胞治療、疾病模型構(gòu)建以及組織工程等領(lǐng)域的核心技術(shù)之一。通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)，研究人員能夠深入探究細(xì)胞的生命活動(dòng)規(guī)律、信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制、遺傳特性以及對(duì)外界刺激的響應(yīng)。為了確保細(xì)胞培養(yǎng)的成功、結(jié)果的可靠性以及操作的安全性，必須嚴(yán)格遵守一系列規(guī)范化的操作規(guī)則和流程。這些規(guī)則涵蓋了從實(shí)驗(yàn)室環(huán)境準(zhǔn)備、設(shè)備耗材管理、細(xì)胞操作技術(shù)到廢棄物處理等各個(gè)環(huán)節(jié)，旨在最大限度地減少污染風(fēng)險(xiǎn)，維持細(xì)胞的正常生理狀態(tài)，并保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

二、細(xì)胞培養(yǎng)前的準(zhǔn)備

（一）實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求

1.空間布局與潔凈度：細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)選擇獨(dú)立、安靜的區(qū)域。內(nèi)部布局應(yīng)合理，區(qū)分清潔區(qū)、半清潔區(qū)和污染區(qū)，并設(shè)置緩沖間。理想的環(huán)境是層流潔凈實(shí)驗(yàn)室（LaminarFlowHood），能夠提供單向、層流式的潔凈空氣，有效控制空氣中的塵埃和微生物粒子。若使用生物安全柜（BiosafetyCabinet），需根據(jù)操作的生物安全等級(jí)選擇合適類型（如II級(jí)或III級(jí)）。

2.溫濕度控制：培養(yǎng)室溫度需嚴(yán)格控制在22-26℃，波動(dòng)范圍不應(yīng)超過(guò)±1℃。濕度維持在50%-60%之間，過(guò)高或過(guò)低的濕度都可能影響培養(yǎng)效果和環(huán)境穩(wěn)定性。需配備恒溫恒濕設(shè)備（如空調(diào)系統(tǒng)）并進(jìn)行定期校準(zhǔn)。

3.空氣過(guò)濾與壓差：實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備高效空氣過(guò)濾器（HEPA），過(guò)濾空氣中的微生物和顆粒物。室內(nèi)壓力需保持相對(duì)正壓，防止外界污染空氣進(jìn)入。壓差監(jiān)測(cè)是關(guān)鍵，需定期檢查并記錄。

4.光照管理：培養(yǎng)室應(yīng)避免直射陽(yáng)光，使用柔和的全光譜照明，光照強(qiáng)度需適宜，避免對(duì)細(xì)胞造成光損傷。對(duì)于某些需要光周期調(diào)控的研究，需使用特定控制的光源。

（二）設(shè)備與耗材準(zhǔn)備

1.培養(yǎng)設(shè)施：

CO?培養(yǎng)箱：用于維持培養(yǎng)環(huán)境中的CO?濃度在5%-7%。需定期校準(zhǔn)CO?傳感器和溫度傳感器，確保讀數(shù)準(zhǔn)確。箱內(nèi)應(yīng)清潔，定期消毒（如使用70-75%酒精擦拭內(nèi)壁）。

超凈工作臺(tái)/生物安全柜：是進(jìn)行無(wú)菌操作的核心設(shè)備。使用前需進(jìn)行空間滅菌（如紫外線照射30分鐘，或使用超純水蒸汽循環(huán)消毒）。操作時(shí)需確保紫外燈關(guān)閉，風(fēng)速適宜。

水浴鍋/恒溫金屬?。河糜诩?xì)胞的復(fù)蘇、消化終止、凍存液配制等需要精確恒溫的操作。需校準(zhǔn)溫度控制精度。

2.玻璃器皿：培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、離心管、移液管等必須使用高質(zhì)量的硅化玻璃或塑料（如聚苯乙烯）制品。新購(gòu)入的器皿在使用前必須徹底清洗并滅菌。清洗流程通常包括：自來(lái)水沖洗->多酶洗液浸泡（如含SDS的清洗劑，按說(shuō)明操作）->自來(lái)水徹底沖洗->蒸餾水或去離子水沖洗->高壓蒸汽滅菌（通常121℃，15-20分鐘）。塑料制品除需清洗外，有時(shí)還需使用70-75%酒精進(jìn)行二次消毒。

3.移液器械：吸管、移液器是關(guān)鍵耗材。吸管需根據(jù)不同容積選擇合適類型（如大肚吸管、刻度吸管）。移液器需定期進(jìn)行校準(zhǔn)，確保其量程準(zhǔn)確性。建議使用無(wú)熱原處理的吸管和移液器芯。

4.培養(yǎng)基與血清：

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：根據(jù)細(xì)胞類型選擇合適的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如DMEM、MEM、RPMI-1640、F12等）。需檢查生產(chǎn)日期、批號(hào)，并妥善儲(chǔ)存（通常是4℃）。使用前需用無(wú)菌水或培養(yǎng)基稀釋到工作濃度。

血清（FBS）：胎牛血清（FetalBovineSerum,FBS）是最常用的天然添加劑，提供生長(zhǎng)因子、激素、維生素等。需選擇質(zhì)量可靠、來(lái)源清晰、經(jīng)過(guò)嚴(yán)格測(cè)試（如無(wú)菌、內(nèi)毒素、支原體檢測(cè)）的產(chǎn)品。通常需在4℃預(yù)冷后再使用。小批量可分裝后凍存?zhèn)溆谩?/p>

其他添加劑：根據(jù)需要添加非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、雙抗（青霉素-鏈霉素）等。雙抗用于預(yù)防細(xì)菌污染，但長(zhǎng)期或高水平使用可能影響細(xì)胞行為，需謹(jǐn)慎使用。

5.過(guò)濾裝置：培養(yǎng)基、細(xì)胞懸液等在無(wú)菌分裝或傳代前，需通過(guò)適當(dāng)孔徑的濾膜（常用0.22μm或0.3μm）進(jìn)行除菌處理。

6.凍存管與凍存液：用于細(xì)胞凍存。凍存管需能耐受凍融循環(huán)，底部平整。凍存液通常包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清和一定濃度的保護(hù)劑（如DMSO，常用濃度0.5%-5%）。需根據(jù)細(xì)胞類型優(yōu)化凍存液配方。

（三）個(gè)人防護(hù)措施

1.著裝：進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域必須穿戴潔凈工作服（通常為一次性或可重復(fù)使用的潔凈服）。長(zhǎng)發(fā)需束起，避免接觸操作區(qū)域。

2.手部衛(wèi)生：操作前后必須用肥皂和流動(dòng)水徹底清洗雙手，或使用有效的含酒精的洗手液/消毒劑進(jìn)行手部消毒。避免用手直接接觸細(xì)胞和培養(yǎng)皿。

3.防護(hù)眼鏡/面屏：防止培養(yǎng)液、細(xì)胞懸液或消毒劑濺入眼睛。必要時(shí)可佩戴面屏。

4.手套：是最重要的防護(hù)措施。應(yīng)根據(jù)操作需求選擇合適材質(zhì)（如丁腈橡膠、聚氯乙烯）和厚度。每次更換手套前和脫手套后都必須洗手。發(fā)現(xiàn)手套破損立即更換。

三、細(xì)胞培養(yǎng)操作步驟

（一）細(xì)胞復(fù)蘇與接種

1.解凍：從液氮罐中取出凍存管，迅速放入37℃水浴中，輕輕搖晃，直至完全融化（通常需5-10分鐘）。整個(gè)過(guò)程需快速，避免細(xì)胞因溫度劇變或暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而損傷。解凍時(shí)產(chǎn)生的氣泡無(wú)需刻意去除。

2.稀釋與觀察：解凍后，立即加入預(yù)溫（37℃）的含血清的培養(yǎng)基（體積比約為1:10稀釋），混合均勻。將細(xì)胞懸液置于顯微鏡下觀察，檢查細(xì)胞活力（通?；盍?gt;90%為宜）、形態(tài)和有無(wú)污染跡象。

3.接種：

計(jì)算接種密度：根據(jù)細(xì)胞類型、生長(zhǎng)速度以及期望的匯合度，計(jì)算合適的接種細(xì)胞數(shù)。常用單位為細(xì)胞/mL或每皿/瓶的細(xì)胞數(shù)。例如，對(duì)于貼壁細(xì)胞，常用接種密度為1×10?-1×10?cells/mL。

加入培養(yǎng)基：將計(jì)算好的細(xì)胞懸液加入已預(yù)熱（37℃）的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，同時(shí)加入適量的預(yù)溫培養(yǎng)基，使總體積達(dá)到要求（通常使細(xì)胞終濃度在所需范圍內(nèi)）。

混勻與放置：輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿或瓶身，使細(xì)胞均勻分布。將接種好的細(xì)胞放入37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（二）日常培養(yǎng)管理

1.生長(zhǎng)觀察：每日或每隔數(shù)日通過(guò)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。記錄的關(guān)鍵指標(biāo)包括：

貼壁與伸展：細(xì)胞是否快速貼壁并開始伸展偽足。

匯合度（Confluency）：細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)皿/瓶底面積的百分比。需定期評(píng)估匯合度，決定是否傳代。

形態(tài)學(xué)：細(xì)胞形態(tài)是否正常，有無(wú)變異、畸形或聚集現(xiàn)象。

污染跡象：密切關(guān)注有無(wú)細(xì)菌、真菌或支原體污染的跡象（如培養(yǎng)基變渾濁、出現(xiàn)菌落、細(xì)胞溶解、形態(tài)異常等）。

2.培養(yǎng)基更換：培養(yǎng)基更換是維持細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵。

時(shí)機(jī)：通常在細(xì)胞匯合度達(dá)到70%-90%時(shí)更換，過(guò)早或過(guò)晚都可能影響細(xì)胞狀態(tài)。對(duì)于快速生長(zhǎng)的細(xì)胞可能需要每1-2天更換一次，慢生長(zhǎng)細(xì)胞可能3-5天更換一次。更換前可觀察培養(yǎng)基顏色（如變黃可能提示酸性增強(qiáng)）。

操作步驟：

預(yù)熱新培養(yǎng)基至37℃。

在超凈臺(tái)內(nèi)，小心打開培養(yǎng)瓶蓋，用酒精燈外焰火焰燒灼瓶口邊緣進(jìn)行消毒。

吸出舊培養(yǎng)基，盡量避免攪動(dòng)細(xì)胞。吸管口可接觸細(xì)胞表面少量，但避免劃傷。

用預(yù)溫的新培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞1-2次（吸出，再加入適量新培養(yǎng)基，再次吸出）。

加入適量新鮮預(yù)溫培養(yǎng)基，使液面達(dá)到適宜高度。

輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，確保培養(yǎng)基均勻接觸所有細(xì)胞。

蓋好瓶蓋（若為透氣蓋），放入培養(yǎng)箱。

3.pH監(jiān)測(cè)與調(diào)節(jié)：培養(yǎng)基的pH值對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)至關(guān)重要，通常維持在7.2-7.4之間?？赏ㄟ^(guò)以下方法監(jiān)測(cè)和調(diào)節(jié)：

監(jiān)測(cè)：定期使用pH試紙或pH計(jì)（需校準(zhǔn)）檢測(cè)培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)基的pH值。

調(diào)節(jié)：若pH偏離范圍，可通過(guò)加入少量5MNaHCO?（需預(yù)溫并混勻）或HCl溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)后需再次檢測(cè)確認(rèn)。注意，頻繁大幅度調(diào)節(jié)pH可能對(duì)細(xì)胞不利。

（三）傳代與凍存

1.傳代（Passaging/Subculturing）：當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到所需閾值（如80%-90%）時(shí)，需將其從原培養(yǎng)容器中取出，接種到新的培養(yǎng)容器中，以提供更多生長(zhǎng)空間，防止過(guò)度擁擠影響生長(zhǎng)。這是維持細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)的重要步驟。

消化：

計(jì)算細(xì)胞數(shù)量和所需消化面積/容器體積。

吸去舊培養(yǎng)基。

加入適量預(yù)溫的胰蛋白酶-EDTA消化液（常用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA，濃度和消化時(shí)間需根據(jù)細(xì)胞類型優(yōu)化，通常37℃消化3-10分鐘，期間可在超凈臺(tái)內(nèi)輕柔搖晃或吹打幾次以促進(jìn)分散）。對(duì)于某些敏感細(xì)胞，可使用膠原酶等其他消化酶。

監(jiān)測(cè)消化程度：通過(guò)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞邊緣是否開始變圓，失去貼壁能力。消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，以免損傷細(xì)胞。

終止消化：待細(xì)胞大部分變圓后，沿培養(yǎng)皿/瓶壁加入適量含血清的培養(yǎng)基（血清能有效中和消化酶活性），輕輕晃動(dòng)或吹打，使細(xì)胞懸浮。

收集細(xì)胞：吸取細(xì)胞懸液，置于離心管中。根據(jù)后續(xù)需求，可進(jìn)行離心（如1000rpm，離心5分鐘）以去除上清液。

重懸與計(jì)數(shù)：向離心后的細(xì)胞沉淀中加入適量新鮮培養(yǎng)基，用吸管吹打均勻制成細(xì)胞懸液。必要時(shí)使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板或細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力檢測(cè)（如臺(tái)盼藍(lán)染色法）。

接種新容器：根據(jù)計(jì)算好的接種密度，將細(xì)胞懸液接種到新的培養(yǎng)容器中，并加入適量培養(yǎng)基。

凍存（Freezing）：為保存細(xì)胞系或進(jìn)行長(zhǎng)期備份，需將細(xì)胞凍存。

計(jì)算凍存體積：根據(jù)細(xì)胞濃度和目標(biāo)凍存管容量，計(jì)算所需細(xì)胞懸液體積。通常要求最終細(xì)胞濃度在1×10?-1×10?cells/mL范圍內(nèi)。

加入凍存液：將細(xì)胞懸液與預(yù)冷的凍存液按比例混合。凍存液通常含90%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%DMSO+10%血清?；旌暇鶆?。

分裝：將混合好的細(xì)胞懸液分裝到無(wú)菌凍存管中，每管約1-2mL。盡量減少管內(nèi)體積，以增加細(xì)胞濃度，縮短冷凍時(shí)間。

預(yù)冷：將分裝好的凍存管在-20℃冰箱中放置30-60分鐘，使DMSO緩慢降溫。

冷凍：將預(yù)冷的凍存管放入程序冷凍盒中，按以下速率降溫：0-{-40}℃以1-2℃/分鐘速率，{-40}℃-{-80}℃以每分鐘5-10℃速率。最常用的是直接放入-80℃冰箱或液氮中。若使用-80℃冰箱，通常需要24小時(shí)才能達(dá)到穩(wěn)定溫度。

儲(chǔ)存：凍存管可短期存于-80℃冰箱，長(zhǎng)期則建議存于液氮罐（-196℃）中，安全性更高。

四、質(zhì)量控制與安全規(guī)范

（一）污染防控

1.環(huán)境監(jiān)控：定期（如每周或每月）對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)室的空氣塵埃粒子數(shù)、溫濕度、壓差進(jìn)行檢測(cè)，并記錄數(shù)據(jù)。必要時(shí)進(jìn)行生物負(fù)荷檢測(cè)（如空氣沉降菌、表面菌落總數(shù)）。

2.無(wú)菌操作規(guī)范：

所有進(jìn)入超凈臺(tái)或生物安全柜的操作必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌原則。

操作前超凈臺(tái)或生物安全柜需開啟至少15-30分鐘，使其達(dá)到穩(wěn)定風(fēng)量和潔凈狀態(tài)。

身體保持距離，避免背對(duì)氣流方向操作。

手臂在有效工作區(qū)域內(nèi)移動(dòng)，避免快速揮動(dòng)或跨越培養(yǎng)物。

使用酒精燈進(jìn)行操作區(qū)域和器械的消毒。

培養(yǎng)皿/瓶蓋打開時(shí)間盡量短，操作完成后立即蓋好。

3.培養(yǎng)基與耗材檢測(cè)：對(duì)新購(gòu)入的培養(yǎng)基、血清、試劑等關(guān)鍵耗材進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè)和內(nèi)毒素檢測(cè)。使用過(guò)程中注意觀察有無(wú)異常變化。

4.生物安全：嚴(yán)格區(qū)分不同細(xì)胞系，防止交叉污染。使用明確標(biāo)記的容器和標(biāo)簽。廢棄培養(yǎng)物和耗材需經(jīng)高壓滅菌后處理。

（二）廢棄物處理

1.分類收集：將廢棄物分為一般廢棄物（如廢棄培養(yǎng)基、擦手紙等）、感染性廢棄物（如被細(xì)胞污染的銳器、培養(yǎng)基）、化學(xué)廢棄物（如消毒劑空瓶、廢過(guò)濾膜）等。使用符合標(biāo)準(zhǔn)的帶蓋垃圾桶收集。

2.滅菌處理：含細(xì)胞或潛在生物污染的廢棄物必須經(jīng)過(guò)高壓蒸汽滅菌（121℃，15-20分鐘）后才能丟棄。

3.