中國(guó)醫(yī)科大學(xué)2025年4月《生物技術(shù)制藥》作業(yè)考核試題及答案一、名詞解釋（每題4分，共20分）1.治療性疫苗：通過(guò)激發(fā)或增強(qiáng)患者自身免疫應(yīng)答，針對(duì)已存在的疾病（如腫瘤、慢性感染）發(fā)揮治療作用的生物制品，區(qū)別于預(yù)防性疫苗對(duì)未感染個(gè)體的保護(hù)功能，其核心是誘導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫或體液免疫清除病變細(xì)胞。2.單克隆抗體人源化：通過(guò)基因工程技術(shù)將鼠源單克隆抗體的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）移植到人源抗體框架區(qū)（FR）中，或通過(guò)噬菌體展示技術(shù)篩選人源抗體，降低鼠源抗體在人體內(nèi)引發(fā)的抗抗體（HAMA）反應(yīng)，同時(shí)保留其抗原結(jié)合活性的過(guò)程。3.融合蛋白：通過(guò)基因重組技術(shù)將兩個(gè)或多個(gè)不同蛋白質(zhì)的編碼基因連接，表達(dá)后形成的具有多重功能或新功能的嵌合蛋白。例如，細(xì)胞因子與抗體Fc段融合可延長(zhǎng)半衰期，或酶與靶向肽段融合實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)遞送。4.病毒載體疫苗：以減毒或無(wú)復(fù)制能力的病毒（如腺病毒、痘苗病毒）為載體，將目標(biāo)抗原（如病原體表面蛋白）的編碼基因插入病毒基因組，接種后通過(guò)病毒感染宿主細(xì)胞，表達(dá)抗原并激發(fā)免疫應(yīng)答的疫苗類型。5.生物仿制藥：與已獲批的原研生物藥（參考藥）在質(zhì)量、安全性和有效性上高度相似的生物制品，其開發(fā)需基于詳盡的分析可比性研究、非臨床研究及必要的臨床試驗(yàn)，旨在降低生物藥使用成本并促進(jìn)可及性。二、簡(jiǎn)答題（每題8分，共40分）1.簡(jiǎn)述基因工程藥物的一般生產(chǎn)流程及各環(huán)節(jié)的關(guān)鍵技術(shù)要點(diǎn)。答：基因工程藥物生產(chǎn)流程主要包括以下環(huán)節(jié)：（1）目的基因獲?。和ㄟ^(guò)PCR擴(kuò)增、cDNA文庫(kù)篩選或人工合成（如密碼子優(yōu)化）獲得目標(biāo)基因，需確保序列準(zhǔn)確性及表達(dá)所需調(diào)控元件（如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子）的完整性。（2）表達(dá)載體構(gòu)建：選擇合適的載體（如質(zhì)粒、病毒載體），將目的基因與載體連接，需注意載體的宿主兼容性（如原核/真核系統(tǒng)）、復(fù)制起點(diǎn)、篩選標(biāo)記（如抗生素抗性基因）及表達(dá)調(diào)控元件（如T7啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子）的設(shè)計(jì)。（3）宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染：將重組載體導(dǎo)入宿主（如大腸桿菌、CHO細(xì)胞、酵母），原核系統(tǒng)常用CaCl?法或電轉(zhuǎn)化，真核系統(tǒng)多用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或電穿孔，需篩選高表達(dá)克?。ㄈ缤ㄟ^(guò)有限稀釋法或流式細(xì)胞術(shù)）。（4）大規(guī)模培養(yǎng)：根據(jù)宿主特性選擇培養(yǎng)方式（原核為分批/補(bǔ)料分批發(fā)酵，真核為無(wú)血清懸浮培養(yǎng)），控制溫度、pH、溶氧、剪切力等參數(shù)，優(yōu)化表達(dá)量（如誘導(dǎo)劑IPTG的添加時(shí)機(jī)與濃度）。（5）分離純化：通過(guò)離心/過(guò)濾去除細(xì)胞碎片，采用層析技術(shù)（如親和層析、離子交換、疏水作用層析）分步純化，關(guān)鍵是保持目標(biāo)蛋白活性（如避免變性劑過(guò)度使用）并去除宿主蛋白、DNA、內(nèi)毒素等雜質(zhì)。（6）質(zhì)量控制：包括純度（SDSPAGE、HPLC）、活性（體外功能實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物模型）、安全性（無(wú)菌、熱原、異常毒性）及穩(wěn)定性（加速/長(zhǎng)期留樣觀察）檢測(cè)，需符合《中國(guó)藥典》生物制品相關(guān)規(guī)定。2.列舉三種常用的動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)及其優(yōu)缺點(diǎn)，并說(shuō)明其在生物技術(shù)制藥中的典型應(yīng)用。答：（1）中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO細(xì)胞）：優(yōu)點(diǎn)：可表達(dá)復(fù)雜糖基化蛋白（接近人源），遺傳穩(wěn)定性好，易大規(guī)模培養(yǎng)（無(wú)血清懸浮培養(yǎng)可達(dá)10?cells/mL）；缺點(diǎn)：培養(yǎng)周期較長(zhǎng)（510天），生產(chǎn)成本較高；應(yīng)用：?jiǎn)慰寺】贵w（如曲妥珠單抗）、重組人促紅細(xì)胞生成素（EPO）等治療性蛋白的生產(chǎn)。（2）小鼠骨髓瘤細(xì)胞（NS0/SP2/0）：優(yōu)點(diǎn)：分泌能力強(qiáng)（抗體表達(dá)量可達(dá)15g/L），無(wú)需轉(zhuǎn)染二氫葉酸還原酶（DHFR）基因即可高產(chǎn)；缺點(diǎn)：糖基化模式含半乳糖α1,3半乳糖（αGal）表位，可能引發(fā)人過(guò)敏反應(yīng)；應(yīng)用：早期單克隆抗體制備（如利妥昔單抗早期版本），現(xiàn)逐漸被CHO細(xì)胞替代。（3）人胚胎腎細(xì)胞（HEK293細(xì)胞）：優(yōu)點(diǎn)：人源背景，糖基化更接近天然蛋白（含唾液酸），適合瞬時(shí)轉(zhuǎn)染快速生產(chǎn)（35天獲表達(dá)產(chǎn)物）；缺點(diǎn)：長(zhǎng)期培養(yǎng)易丟失表達(dá)質(zhì)粒，難以大規(guī)模穩(wěn)定生產(chǎn)；應(yīng)用：腺病毒載體疫苗（如COVID19腺病毒載體疫苗）、重組病毒類生物藥的研發(fā)階段生產(chǎn)。3.簡(jiǎn)述噬菌體展示技術(shù)在抗體藥物開發(fā)中的應(yīng)用策略。答：噬菌體展示技術(shù)通過(guò)將抗體可變區(qū)（scFv或Fab）與噬菌體外殼蛋白（如pIII或pVIII）融合，展示于噬菌體表面，形成大容量抗體庫(kù)（10?1011克?。?，其應(yīng)用策略包括：（1）全人源抗體庫(kù)構(gòu)建：從健康人或免疫人群外周血B細(xì)胞中提取mRNA，擴(kuò)增VH和VL基因，連接成scFv并克隆至噬菌體載體，避免鼠源抗體的免疫原性。（2）抗原篩選（淘選）：將噬菌體庫(kù)與靶抗原（如腫瘤細(xì)胞表面受體、病毒蛋白）孵育，洗脫未結(jié)合噬菌體，擴(kuò)增結(jié)合陽(yáng)性克隆，重復(fù)35輪富集高親和力克隆。（3）親和力成熟：通過(guò)易錯(cuò)PCR、DNA改組等方法引入突變，構(gòu)建突變體庫(kù)，篩選親和力更高（KD<1nM）的抗體克隆，優(yōu)化藥代動(dòng)力學(xué)特性。（4）雙特異性抗體開發(fā)：通過(guò)展示兩種不同抗原結(jié)合域的噬菌體共感染或串聯(lián)表達(dá)，獲得同時(shí)結(jié)合兩個(gè)靶點(diǎn)（如T細(xì)胞CD3與腫瘤抗原）的雙抗分子，用于腫瘤免疫治療。4.分析mRNA疫苗的關(guān)鍵技術(shù)挑戰(zhàn)及當(dāng)前主要解決方案。答：關(guān)鍵技術(shù)挑戰(zhàn)及解決方案：（1）mRNA穩(wěn)定性差：易被RNA酶降解，需通過(guò)化學(xué)修飾（如N1甲基假尿苷替換尿苷）降低免疫原性并提高穩(wěn)定性；采用脂質(zhì)納米顆粒（LNP）包載，形成保護(hù)層并介導(dǎo)胞內(nèi)遞送。（2）遞送效率低：mRNA需進(jìn)入胞質(zhì)才能翻譯，LNP的配方優(yōu)化（如陽(yáng)離子脂質(zhì)種類、PEG修飾比例）可增強(qiáng)細(xì)胞攝?。ㄈ绨邢蚩乖f呈細(xì)胞）；微針貼片等新型遞送系統(tǒng)可提高局部濃度。（3）免疫原性調(diào)控：未修飾mRNA可能激活TLR3/7/8引發(fā)炎癥反應(yīng)，通過(guò)核苷酸修飾（如假尿苷、5甲基胞苷）減少模式識(shí)別受體（PRR）識(shí)別，平衡免疫應(yīng)答強(qiáng)度與安全性。（4）儲(chǔ)存運(yùn)輸限制：傳統(tǒng)mRNA疫苗需70℃超低溫保存，通過(guò)優(yōu)化LNP配方（如使用可電離脂質(zhì)）或開發(fā)凍干技術(shù)，已實(shí)現(xiàn)28℃穩(wěn)定保存（如Moderna的mRNA1273升級(jí)版本）。5.簡(jiǎn)述生物藥物質(zhì)量控制中“關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）”的定義及其主要類別。答：CQA是指對(duì)生物藥物的安全性、有效性有直接影響的物理、化學(xué)、生物或微生物屬性，需在整個(gè)生命周期（研發(fā)、生產(chǎn)、流通）中嚴(yán)格控制。主要類別包括：（1）結(jié)構(gòu)相關(guān)屬性：一級(jí)結(jié)構(gòu)（氨基酸序列、二硫鍵位置）、高級(jí)結(jié)構(gòu)（二級(jí)/三級(jí)構(gòu)象、糖基化位點(diǎn)及修飾類型如巖藻糖基化、唾液酸化）；（2）功能相關(guān)屬性：生物活性（如受體結(jié)合能力、酶活性）、效價(jià)（體內(nèi)外活性測(cè)定）；（3）純度與雜質(zhì)：宿主細(xì)胞蛋白（HCP）、宿主細(xì)胞DNA、殘留培養(yǎng)基成分（如抗生素）、工藝相關(guān)雜質(zhì)（如蛋白酶、病毒滅活劑）；（4）物理屬性：分子量（多聚體/片段化）、電荷異質(zhì)性（脫酰胺、氧化導(dǎo)致的pI變化）、顆粒度（亞可見顆粒）；（5）安全性相關(guān)屬性：內(nèi)毒素、無(wú)菌性、異常毒性（如細(xì)胞因子釋放風(fēng)險(xiǎn)）。三、論述題（每題15分，共30分）1.結(jié)合當(dāng)前技術(shù)進(jìn)展，論述抗體藥物的發(fā)展趨勢(shì)及代表性技術(shù)突破。答：抗體藥物歷經(jīng)鼠源、人源化、全人源階段，當(dāng)前發(fā)展趨勢(shì)及技術(shù)突破體現(xiàn)在以下方面：（1）多特異性抗體：傳統(tǒng)單抗僅結(jié)合單一靶點(diǎn)，而雙特異性（BsAb）或三特異性抗體可同時(shí)結(jié)合腫瘤抗原（如HER2）與免疫細(xì)胞激活分子（如CD3、CD16），介導(dǎo)定向殺傷。代表性突破：Amgen的Blincyto（CD19×CD3雙抗）用于急性淋巴細(xì)胞白血病，以及Zymeworks的Zanidatamab（HER2×HER2雙抗）通過(guò)雙價(jià)結(jié)合增強(qiáng)內(nèi)吞效應(yīng)。（2）抗體偶聯(lián)藥物（ADC）：將細(xì)胞毒性藥物（如拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、微管抑制劑）通過(guò)可裂解/不可裂解linker與單抗偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)靶向遞送。技術(shù)突破包括：新型payload（如DNA烷化劑PBD二聚體）提高毒性強(qiáng)度；定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)（如酶催化的非天然氨基酸插入）控制DAR（藥物抗體比）均一性（如Seagen的TDXd，DAR≈8）；pH敏感或酶敏感l(wèi)inker減少脫靶毒性。（3）納米抗體（VHH）：源自駱駝科動(dòng)物重鏈抗體的可變區(qū)，分子量?。?5kDa）、組織穿透性強(qiáng)、穩(wěn)定性高。代表性應(yīng)用：Ablynx（現(xiàn)諾華）的Caplacizumab（靶向vWFA1結(jié)構(gòu)域）用于血栓性血小板減少性紫癜，以及正在開發(fā)的腦靶向納米抗體（如治療阿爾茨海默病的Aβ結(jié)合納米抗體）。（4）雙功能抗體融合蛋白：將抗體與細(xì)胞因子（如IL2、IFNγ）或酶（如尿激酶）融合，賦予免疫激活或溶栓功能。例如，羅氏的RG7813（抗PDL1×IL2變體）通過(guò)局部IL2釋放增強(qiáng)T細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)避免全身毒性。（5）新型作用機(jī)制：除中和、ADCC/ADCP外，抗體可介導(dǎo)受體激動(dòng)（如抗CD40激動(dòng)抗體激活樹突狀細(xì)胞）或降解（如PROTAC抗體通過(guò)招募E3泛素連接酶誘導(dǎo)靶蛋白降解）。代表性突破：Arvinas的ARV471（ER靶向PROTAC）雖為小分子，但其設(shè)計(jì)理念已延伸至抗體領(lǐng)域。2.以重組人胰島素為例，論述基因工程制藥中“密碼子優(yōu)化”與“蛋白折疊”的關(guān)鍵作用及技術(shù)策略。答：重組人胰島素是首個(gè)獲批的基因工程藥物，其生產(chǎn)中密碼子優(yōu)化與蛋白折疊直接影響表達(dá)量與活性，具體分析如下：（1）密碼子優(yōu)化的關(guān)鍵作用及策略：原核宿主（如大腸桿菌）與人類的密碼子使用偏好差異大，若直接使用人胰島素基因（含稀有密碼子），會(huì)導(dǎo)致核糖體停滯、翻譯效率低下甚至錯(cuò)誤折疊。優(yōu)化策略包括：①替換稀有密碼子為宿主高頻密碼子（如大腸桿菌偏好使用AGA/AGG（精氨酸）的頻率低，替換為CGT/CGC）；②避免連續(xù)重復(fù)密碼子（如GGG×3可能導(dǎo)致核糖體滑動(dòng)）；③調(diào)整mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，降低5’端GC含量（<60%）以減少莖環(huán)結(jié)構(gòu)，提高翻譯起始效率；④引入沉默突變消除內(nèi)部調(diào)控元件（如原核的SD序列或終止子），防止提前終止。通過(guò)密碼子優(yōu)化，重組胰島素在大腸桿菌中的表達(dá)量可從初始的10mg/L提升至5g/L以上。（2）蛋白折疊的關(guān)鍵作用及技術(shù)策略：人胰島素含A、B兩條鏈（A鏈21aa，B鏈30aa）及3個(gè)二硫鍵（A7B7，A20B19，A6A11），在原核中直接表達(dá)易形成包涵體（無(wú)活性），需通過(guò)體外復(fù)性恢復(fù)正確構(gòu)象。技術(shù)策略包括：①融合表達(dá)：將胰島素前體（如Proinsulin）與分子伴侶（如硫氧還蛋白Trx）或可溶性標(biāo)簽（如GST）融合，促進(jìn)胞內(nèi)正確折疊；②分泌表達(dá)：利用信號(hào)肽（如OmpA）將蛋白分泌至周質(zhì)空間（氧化環(huán)境），借助周質(zhì)中的二硫鍵異構(gòu)酶（DsbA/DsbC）形成正確二硫鍵；③包涵體復(fù)性：通過(guò)變性劑（8M尿素或6M鹽酸胍）溶解包涵體，稀釋或透析去除變性劑，同時(shí)添加氧化還原對(duì)（如GSH/GSSG）介導(dǎo)二硫鍵重排；優(yōu)化復(fù)性條件（pH8.08.5，溫度425℃，蛋白濃度<0.1mg/mL）以減少聚集；④酶促切割：復(fù)性后的Proinsulin需經(jīng)胰蛋白酶/羧肽酶B切割去除C肽，形成有活性的胰島素，需控制酶切時(shí)間與溫度（如4℃防止過(guò)度水解）。通過(guò)上述策略，重組人胰島素的復(fù)性效率可從早期的30%提升至70%以上，確保了工業(yè)化生產(chǎn)的可行性。四、案例分析題（10分）案例背景：某生物制藥公司計(jì)劃開發(fā)一款靶向PD1的人源化單克隆抗體，用于實(shí)體瘤治療。在臨床前研究中發(fā)現(xiàn)，該抗體在恒河猴體內(nèi)的半衰期僅3天（同類藥物通常710天），且存在低水平的抗藥抗體（ADA）應(yīng)答。問(wèn)題：分析可能的原因，并提出優(yōu)化策略。答：可能原因及優(yōu)化策略：（1）半衰期短的可能原因：①Fc段與FcRn受體結(jié)合能力弱：IgG的半衰期主要由Fc段與新生兒Fc受體（FcRn）在pH6.0（內(nèi)體）的結(jié)合介導(dǎo)，若Fc段突變或糖基化異常（如高甘露糖型）可能降低結(jié)合親和力；②抗原介導(dǎo)的清除（AMC）：PD1在恒河猴淋巴細(xì)胞表面高表達(dá)，抗體與抗原結(jié)合后形成免疫復(fù)合物，被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES）快速清除；③抗體聚合：溶液中存在多聚體（>0.1%），可通過(guò)Fcγ受體被巨噬細(xì)胞攝取，縮短半衰期。（2）ADA應(yīng)答的可能原因：①抗體序列存在T細(xì)胞表位：人源化過(guò)程中框架區(qū)（FR）可能保留鼠源氨基酸，被恒河猴免疫系統(tǒng)識(shí)別為異源表位；②糖基化異常：如含αGal表位（若使用NS0細(xì)胞生產(chǎn)）或高巖藻糖基化（降低ADCC但可能增加免疫原性）；③制劑因素：殘留宿主蛋白（HCP）或佐劑（如聚山梨酯降解產(chǎn)物）作為免疫佐劑，增強(qiáng)ADA產(chǎn)生。優(yōu)化策略：①Fc段工程化：引入YTE突變（M252Y/S254T/T256E）增強(qiáng)與FcRn的結(jié)合（pH6.0時(shí)親和力提高10倍），延長(zhǎng)半衰期至1421天（如阿替利珠單抗的Fc優(yōu)化）；②降低抗原介導(dǎo)清除：通過(guò)親和力優(yōu)化（如將KD從pM級(jí)調(diào)整至nM級(jí)），平衡結(jié)合強(qiáng)度與解離速率，減少免疫復(fù)合物形成；或開發(fā)Fab片段（無(wú)