Bax抑制肽對(duì)HIBD新生大鼠海馬區(qū)細(xì)胞色素C及Caspase-3蛋白影響的實(shí)驗(yàn)研究一、引言1.1研究背景與意義新生兒缺氧缺血性腦損傷（Hypoxic-IschemicBrainDamage,HIBD）是新生兒期神經(jīng)系統(tǒng)損傷的常見原因之一，嚴(yán)重威脅新生兒的生命健康，且存活者常伴有不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，如腦癱、智力低下、癲癇等，給家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。HIBD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及能量代謝障礙、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等多個(gè)病理生理過程。其中，細(xì)胞凋亡在HIBD的腦損傷進(jìn)程中扮演著關(guān)鍵角色，是導(dǎo)致神經(jīng)元丟失和神經(jīng)功能障礙的重要因素之一。Bax蛋白作為Bcl-2蛋白家族中的促凋亡成員，在細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑中發(fā)揮著核心作用。在正常生理狀態(tài)下，Bax蛋白主要以單體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到缺氧缺血等損傷刺激時(shí)，Bax蛋白會(huì)發(fā)生構(gòu)象改變，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到線粒體膜上，通過寡聚化形成孔道，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞色素C（CytochromeC,CytC）等凋亡相關(guān)因子從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。釋放到細(xì)胞質(zhì)中的CytC與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、ATP/dATP結(jié)合，形成凋亡小體，招募并激活半胱氨酸蛋白酶-9（Caspase-9），活化的Caspase-9進(jìn)一步激活下游的效應(yīng)caspase，如Caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。因此，抑制Bax蛋白的活化和功能，有可能阻斷細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，減輕HIBD后的腦損傷。Bax抑制肽（Bax-inhibitingpeptide，BIP）是一種能夠特異性地與Bax蛋白相互作用的短肽，其作用機(jī)制主要是通過與Bax蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合，阻止Bax蛋白的寡聚化和線粒體轉(zhuǎn)位，從而抑制細(xì)胞凋亡。大量的基礎(chǔ)研究表明，BIP在多種細(xì)胞凋亡相關(guān)的疾病模型中展現(xiàn)出了顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。在腦缺血再灌注損傷模型中，給予BIP能夠減少神經(jīng)元凋亡，改善神經(jīng)功能缺損癥狀；在神經(jīng)退行性疾病模型中，BIP也能夠延緩神經(jīng)元的死亡，保護(hù)神經(jīng)功能。然而，BIP在新生兒HIBD中的應(yīng)用研究仍處于相對(duì)早期階段，其具體的作用機(jī)制和治療效果仍有待進(jìn)一步深入探究。本研究旨在觀察Bax抑制肽對(duì)HIBD新生大鼠海馬區(qū)細(xì)胞色素C及Caspase-3蛋白的影響，從細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵信號(hào)通路角度深入探討B(tài)ax抑制肽對(duì)HIBD后的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制，為臨床治療新生兒缺氧缺血性腦損傷提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)，具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，對(duì)于Bax抑制肽的研究起步相對(duì)較早，并且在細(xì)胞凋亡機(jī)制以及其在多種疾病模型中的作用研究方面取得了較為豐富的成果。有研究通過基因編輯技術(shù)在細(xì)胞系中過表達(dá)Bax抑制肽，發(fā)現(xiàn)其能夠顯著抑制由多種凋亡誘導(dǎo)因子引發(fā)的細(xì)胞凋亡，從分子層面深入揭示了Bax抑制肽與Bax蛋白結(jié)合后，對(duì)Bax蛋白構(gòu)象變化以及下游凋亡信號(hào)通路關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的調(diào)控機(jī)制。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，如在心肌缺血再灌注損傷模型中，給予Bax抑制肽能夠有效減少心肌細(xì)胞凋亡，改善心臟功能，為其在心血管疾病治療中的潛在應(yīng)用提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在新生兒HIBD領(lǐng)域，國外學(xué)者也開展了一系列相關(guān)研究。通過建立新生大鼠或小鼠的HIBD模型，觀察到Bax抑制肽能夠降低腦組織中神經(jīng)元凋亡的比例，提高新生動(dòng)物的生存率，改善其行為表現(xiàn)。有研究運(yùn)用先進(jìn)的活體成像技術(shù)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測了Bax抑制肽在HIBD新生動(dòng)物體內(nèi)的分布和代謝情況，以及其對(duì)線粒體膜電位、活性氧水平等與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)指標(biāo)的影響，進(jìn)一步深化了對(duì)Bax抑制肽神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制的理解。國內(nèi)對(duì)于Bax抑制肽的研究近年來也呈現(xiàn)出快速發(fā)展的態(tài)勢(shì)。在基礎(chǔ)研究方面，眾多科研團(tuán)隊(duì)圍繞Bax抑制肽的結(jié)構(gòu)優(yōu)化、作用靶點(diǎn)以及與其他凋亡調(diào)節(jié)因子的相互作用展開研究。通過化學(xué)合成和修飾技術(shù)，制備出具有更高活性和穩(wěn)定性的Bax抑制肽類似物，并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其增強(qiáng)的抗凋亡效果。在HIBD的研究中，國內(nèi)學(xué)者利用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如蛋白質(zhì)免疫印跡、免疫組化、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等，深入探究了Bax抑制肽對(duì)HIBD新生大鼠海馬區(qū)、皮層等關(guān)鍵腦區(qū)的細(xì)胞凋亡、神經(jīng)炎癥以及神經(jīng)功能修復(fù)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，Bax抑制肽不僅能夠抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，還能調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放，減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。然而，目前國內(nèi)外關(guān)于Bax抑制肽對(duì)HIBD新生大鼠海馬區(qū)細(xì)胞色素C及Caspase-3蛋白影響的研究仍存在一些不足與空白。一方面，雖然已經(jīng)明確Bax抑制肽能夠抑制細(xì)胞凋亡并對(duì)HIBD具有神經(jīng)保護(hù)作用，但對(duì)于其在HIBD復(fù)雜病理環(huán)境下，精確調(diào)控細(xì)胞色素C從線粒體釋放以及Caspase-3激活的分子機(jī)制尚未完全闡明，尤其是涉及到與其他細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的交互作用和反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，仍有待深入研究。另一方面，現(xiàn)有的研究多集中在單一時(shí)間點(diǎn)或較短時(shí)間窗內(nèi)觀察Bax抑制肽的作用效果，缺乏對(duì)其長期療效和安全性的系統(tǒng)評(píng)估，這在一定程度上限制了Bax抑制肽從基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。此外，不同研究中使用的Bax抑制肽的劑量、給藥途徑和時(shí)間等條件存在差異，導(dǎo)致研究結(jié)果之間的可比性和重復(fù)性受到影響，不利于對(duì)其最佳治療方案的確定。因此，進(jìn)一步深入開展相關(guān)研究，對(duì)于全面揭示Bax抑制肽的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制，優(yōu)化治療策略，推動(dòng)其臨床應(yīng)用具有重要意義。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究Bax抑制肽對(duì)HIBD新生大鼠海馬區(qū)細(xì)胞色素C及Caspase-3蛋白的影響，具體目的如下：首先，明確Bax抑制肽干預(yù)后，HIBD新生大鼠海馬區(qū)細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)的變化情況，以及這種變化與神經(jīng)元凋亡之間的關(guān)聯(lián)。其次，研究Bax抑制肽對(duì)HIBD新生大鼠海馬區(qū)Caspase-3蛋白表達(dá)和活性的調(diào)節(jié)作用，揭示其在細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段的具體影響。最后，通過不同時(shí)間點(diǎn)給予Bax抑制肽，確定其對(duì)HIBD新生大鼠發(fā)揮最佳神經(jīng)保護(hù)作用的時(shí)間窗，為臨床治療提供更精準(zhǔn)的時(shí)間依據(jù)。在研究內(nèi)容方面，本研究將從多個(gè)維度展開。首先是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立與分組，選取7日齡Wistar大鼠，通過結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈并結(jié)合低氧處理，構(gòu)建HIBD模型。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、對(duì)照組和干預(yù)組，其中干預(yù)組在HIBD造模后不同時(shí)間點(diǎn)給予Bax抑制肽側(cè)腦室內(nèi)注射，對(duì)照組給予等量生理鹽水。其次是標(biāo)本采集與檢測，在術(shù)后7天對(duì)所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行處死，采集海馬區(qū)腦組織標(biāo)本。運(yùn)用HE染色觀察各組腦組織的病理形態(tài)學(xué)變化，采用TUNEL法檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，利用Westernblot技術(shù)精確測定細(xì)胞色素C及Caspase-3蛋白的表達(dá)水平和釋放量。最后是數(shù)據(jù)的分析與討論，對(duì)實(shí)驗(yàn)所獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，深入探討B(tài)ax抑制肽對(duì)HIBD新生大鼠海馬區(qū)細(xì)胞色素C及Caspase-3蛋白的影響機(jī)制，以及其在HIBD治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值和最佳治療時(shí)間窗。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究主要采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、組織學(xué)檢測、蛋白免疫印跡法等研究方法。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，選用7日齡Wistar大鼠構(gòu)建HIBD模型，將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、對(duì)照組和干預(yù)組，干預(yù)組在HIBD造模后不同時(shí)間點(diǎn)給予Bax抑制肽側(cè)腦室內(nèi)注射，對(duì)照組給予等量生理鹽水，通過對(duì)不同組大鼠的處理，觀察Bax抑制肽對(duì)HIBD新生大鼠的影響。組織學(xué)檢測上，運(yùn)用HE染色觀察各組大鼠腦組織的病理形態(tài)學(xué)變化，了解細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性和損傷程度；采用TUNEL法檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，直觀呈現(xiàn)凋亡細(xì)胞的數(shù)量和分布，為研究Bax抑制肽對(duì)細(xì)胞凋亡的影響提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。蛋白免疫印跡法（Westernblot）是本研究的關(guān)鍵檢測技術(shù)，通過該方法精確測定細(xì)胞色素C及Caspase-3蛋白的表達(dá)水平和釋放量，從分子層面深入探究Bax抑制肽對(duì)HIBD新生大鼠海馬區(qū)細(xì)胞色素C及Caspase-3蛋白的影響機(jī)制。技術(shù)路線方面，首先進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的準(zhǔn)備與分組，對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠分別進(jìn)行相應(yīng)的手術(shù)操作和處理，構(gòu)建HIBD模型。在造模成功后，按照預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)對(duì)干預(yù)組大鼠給予Bax抑制肽側(cè)腦室內(nèi)注射，對(duì)照組給予等量生理鹽水。術(shù)后7天對(duì)所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行處死，采集海馬區(qū)腦組織標(biāo)本。對(duì)標(biāo)本依次進(jìn)行HE染色、TUNEL法檢測和Westernblot檢測，獲取實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。最后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得出研究結(jié)論，具體技術(shù)路線如圖1-1所示。[此處插入技術(shù)路線圖，圖中應(yīng)清晰展示從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、造模、給藥、標(biāo)本采集到各項(xiàng)檢測以及數(shù)據(jù)分析的整個(gè)研究流程]通過上述研究方法和技術(shù)路線，本研究旨在系統(tǒng)、全面地探究Bax抑制肽對(duì)HIBD新生大鼠海馬區(qū)細(xì)胞色素C及Caspase-3蛋白的影響，為新生兒HIBD的治療提供有力的理論支持和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。二、實(shí)驗(yàn)材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用7日齡Wistar大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，共計(jì)182只。7日齡的Wistar大鼠在生理和解剖學(xué)特征上與新生兒具有一定的相似性，其神經(jīng)系統(tǒng)正處于快速發(fā)育階段，對(duì)缺氧缺血損傷較為敏感，能夠較好地模擬新生兒缺氧缺血性腦損傷的病理過程，有助于研究HIBD的發(fā)病機(jī)制以及藥物的干預(yù)效果。這些大鼠購自[供應(yīng)商名稱]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[許可證編號(hào)]。所有大鼠在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的屏障環(huán)境中飼養(yǎng)，溫度控制在(22±2)℃，相對(duì)濕度維持在(50±10)%，采用12h光照/12h黑暗的晝夜節(jié)律。自由攝食和飲水，飼料為符合國家標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒類動(dòng)物專用飼料，飲水為經(jīng)過高溫高壓滅菌處理的純凈水。在實(shí)驗(yàn)開始前，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天，以確保其生理狀態(tài)穩(wěn)定，適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。2.1.2實(shí)驗(yàn)藥品和試劑實(shí)驗(yàn)所需的藥品和試劑如下：Bax抑制肽（Bax-inhibitingpeptide，BIP），購自[試劑公司名稱]，純度≥98%，用無菌生理鹽水溶解配制成1μg/μl的儲(chǔ)存液，-20℃保存?zhèn)溆茫簧睇}水，規(guī)格為500ml/瓶，由[生產(chǎn)廠家名稱]生產(chǎn)；細(xì)胞色素C抗體（CytochromeCantibody），為兔抗鼠多克隆抗體，購自[抗體供應(yīng)商名稱]；Caspase-3抗體，為鼠抗人單克隆抗體，購自[另一抗體供應(yīng)商名稱]；二抗為山羊抗兔IgG-HRP和山羊抗鼠IgG-HRP，分別購自[相應(yīng)二抗供應(yīng)商名稱]；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、SDS凝膠制備試劑盒、PVDF膜、化學(xué)發(fā)光底物（ECL）等均購自[常用生化試劑公司名稱]；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自[生物技術(shù)公司名稱]。此外，還包括無水乙醇、二甲苯、甲醛、戊二醛等常規(guī)組織固定和脫水試劑，均為分析純，購自[化學(xué)試劑公司名稱]。2.1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備本實(shí)驗(yàn)用到的主要儀器及設(shè)備包括：低溫高速離心機(jī)（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家名稱]），用于組織勻漿的離心分離，以獲取蛋白質(zhì)樣品；垂直板電泳儀（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家名稱]）和半干轉(zhuǎn)膜儀（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家名稱]），用于蛋白質(zhì)的SDS電泳分離和轉(zhuǎn)膜；凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家名稱]），用于檢測化學(xué)發(fā)光信號(hào)，分析蛋白質(zhì)條帶的灰度值；石蠟切片機(jī)（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家名稱]），用于制備腦組織石蠟切片；光學(xué)顯微鏡（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家名稱]）及圖像分析軟件（[軟件名稱]），用于觀察HE染色切片和TUNEL染色切片的組織形態(tài)學(xué)變化和細(xì)胞凋亡情況；電子天平（精度[具體精度]，[生產(chǎn)廠家名稱]），用于稱量藥品和試劑；移液器（量程[具體量程范圍]，[生產(chǎn)廠家名稱]），用于準(zhǔn)確移取各種液體試劑。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組與處理將182只7日齡Wistar大鼠運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=14只）、對(duì)照組(n=84只)、干預(yù)組（n=84只）。對(duì)照組與干預(yù)組采用經(jīng)典的Rice-Vannucci法制備新生大鼠HIBD模型。具體操作如下：將大鼠用體積分?jǐn)?shù)為3%的異氟醚進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉，待麻醉生效后，將其仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，用碘伏對(duì)頸部手術(shù)區(qū)域進(jìn)行消毒，沿頸部正中切開皮膚，鈍性分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，使用5-0絲線進(jìn)行雙重結(jié)扎，確保結(jié)扎牢固，阻斷左側(cè)頸總動(dòng)脈血流。隨后，將大鼠置于特制的有機(jī)玻璃缺氧艙內(nèi)，通入8%氧氣和92%氮?dú)獾幕旌蠚怏w，氣體流量為5L/min，維持艙內(nèi)低氧環(huán)境2小時(shí)，以模擬缺氧缺血狀態(tài)。在整個(gè)手術(shù)和低氧處理過程中，密切監(jiān)測大鼠的呼吸、心率等生命體征，確保大鼠生命體征平穩(wěn)。假手術(shù)組僅進(jìn)行左側(cè)頸總動(dòng)脈的游離操作，不進(jìn)行結(jié)扎和低氧處理，其余操作與實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相同，以排除手術(shù)創(chuàng)傷對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。干預(yù)組于HIBD造模成功后即刻、6h、12h、24h、48h、72h這六個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別進(jìn)行左側(cè)側(cè)腦室內(nèi)注射5μgBax抑制肽（BIP），由于BIP儲(chǔ)存液濃度為1μg/μl，因此每次注射體積為5μl。側(cè)腦室注射時(shí)，使用微量注射器，將大鼠頭部固定，在顱骨表面定位左側(cè)側(cè)腦室位置（前囟后0.8mm，矢狀縫旁1.5mm），垂直進(jìn)針2.5mm，緩慢注入BIP溶液，注射時(shí)間控制在3分鐘左右，以確保藥物均勻擴(kuò)散，注射完畢后留針2分鐘，防止藥物反流。對(duì)照組于相同時(shí)間點(diǎn)予等量生理鹽水(5μl)進(jìn)行左側(cè)側(cè)腦室內(nèi)注射，注射方法與干預(yù)組一致。此外，按注射時(shí)間點(diǎn)不同，干預(yù)組和對(duì)照組分別分為6個(gè)不同亞組，每個(gè)亞組14只大鼠，以便于后續(xù)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)干預(yù)效果的分析。2.2.2標(biāo)本采集所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在術(shù)后7d進(jìn)行處死。采用過量戊巴比妥鈉（100mg/kg）腹腔注射的方式對(duì)大鼠進(jìn)行深度麻醉，待大鼠呼吸、心跳停止，確認(rèn)死亡后，迅速打開胸腔，經(jīng)升主動(dòng)脈用預(yù)冷的生理鹽水進(jìn)行心臟灌注，直至流出的液體清亮為止，以沖洗掉血液，減少組織內(nèi)殘留血液對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。隨后，斷頭取腦，在冰臺(tái)上迅速分離出海馬區(qū)腦組織。將采集到的海馬區(qū)腦組織標(biāo)本一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于后續(xù)的石蠟切片制作和組織學(xué)檢測；另一部分迅速放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于蛋白質(zhì)提取和Westernblot檢測。2.2.3制備腦組織切片將固定于4%多聚甲醛溶液中的海馬區(qū)腦組織標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)脫水處理，依次經(jīng)過70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液浸泡，每個(gè)濃度浸泡時(shí)間分別為2小時(shí)、2小時(shí)、1小時(shí)、1小時(shí)、30分鐘，以去除組織中的水分。然后將脫水后的組織放入二甲苯中透明，二甲苯浸泡2次，每次15分鐘，使組織變得透明，便于后續(xù)石蠟的浸入。接著將透明后的組織放入融化的石蠟中進(jìn)行包埋，將包埋好的組織塊用石蠟切片機(jī)切成厚度為4μm的石蠟切片，用于HE染色和免疫組化檢測。對(duì)于用于免疫熒光檢測的腦組織標(biāo)本，采用冰凍切片的方法。將海馬區(qū)腦組織標(biāo)本用OCT包埋劑包埋后，置于冰凍切片機(jī)中，調(diào)節(jié)切片厚度為10μm，進(jìn)行連續(xù)切片。切片完成后，將冰凍切片迅速貼附于預(yù)先處理好的載玻片上，放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.4HE切片制作將石蠟切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中脫蠟，每個(gè)步驟各10分鐘，以去除石蠟。然后將切片依次經(jīng)過100%、95%、90%、80%、70%的乙醇溶液進(jìn)行梯度水化，每個(gè)濃度浸泡3分鐘，使組織恢復(fù)水合狀態(tài)。接著將切片浸入蘇木精染液中染色5分鐘，使細(xì)胞核染成藍(lán)色，然后用自來水沖洗10分鐘，以去除多余的染液。隨后將切片放入1%鹽酸乙醇溶液中進(jìn)行分化，時(shí)間為3-5秒，以增強(qiáng)染色對(duì)比度。再用自來水沖洗10分鐘，使細(xì)胞核顏色清晰。之后將切片浸入伊紅染液中染色3分鐘，使細(xì)胞質(zhì)染成紅色。最后將切片依次經(jīng)過70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液進(jìn)行梯度脫水，每個(gè)濃度浸泡3分鐘，再用二甲苯透明2次，每次5分鐘，最后用中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察各組腦組織的病理形態(tài)學(xué)變化，包括細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞核形態(tài)、細(xì)胞排列等情況。2.2.5TUNEL法檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡TUNEL法即末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法，其原理是利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）將生物素或地高辛等標(biāo)記的dUTP連接到凋亡細(xì)胞斷裂DNA的3'-OH末端，然后通過與帶有熒光素或酶標(biāo)記的抗生物素或抗地高辛抗體結(jié)合，在熒光顯微鏡或光學(xué)顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞會(huì)被特異性標(biāo)記，呈現(xiàn)出綠色熒光或棕黃色染色。檢測海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡時(shí)，將石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后，用蛋白酶K溶液（20μg/ml）在37℃孵育15分鐘，以消化細(xì)胞蛋白，增強(qiáng)細(xì)胞通透性。然后用PBS沖洗3次，每次5分鐘。將切片浸入TdT酶反應(yīng)液中，37℃避光孵育60分鐘，使TdT酶催化標(biāo)記的dUTP連接到凋亡細(xì)胞DNA的斷裂末端。孵育結(jié)束后，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。加入熒光素或酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，37℃孵育30分鐘。再次用PBS沖洗3次，每次5分鐘。最后用含有DAPI的封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察，DAPI用于標(biāo)記細(xì)胞核，呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)目，并計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比。2.2.6Westernblot檢測caspase-3和細(xì)胞色素C的釋放量將保存在-80℃冰箱的海馬區(qū)腦組織標(biāo)本取出，加入適量的蛋白裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），在冰上用組織勻漿器充分勻漿，使組織細(xì)胞完全裂解。然后將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃條件下，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，取上清液即為蛋白質(zhì)樣品。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)樣品的濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中蛋白質(zhì)的含量。根據(jù)蛋白質(zhì)樣品的濃度，取適量的樣品與上樣緩沖液混合，在100℃條件下煮沸5分鐘，使蛋白質(zhì)變性。將變性后的蛋白質(zhì)樣品加入到SDS凝膠的加樣孔中，進(jìn)行電泳分離。電泳時(shí)，先在80V電壓下電泳30分鐘，使蛋白質(zhì)樣品進(jìn)入分離膠，然后將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳90分鐘，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部，使不同分子量的蛋白質(zhì)在凝膠中得到有效分離。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。采用半干轉(zhuǎn)膜法，將凝膠和PVDF膜按照從負(fù)極到正極的順序依次放置在轉(zhuǎn)膜裝置中，中間夾上濾紙，確保各層之間無氣泡。在25V電壓下轉(zhuǎn)膜30分鐘，使蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，放入5%脫脂牛奶溶液中，在室溫下封閉1小時(shí)，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，將PVDF膜與一抗（細(xì)胞色素C抗體或Caspase-3抗體）在4℃條件下孵育過夜，使一抗與膜上的目的蛋白特異性結(jié)合。一抗孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后將PVDF膜與相應(yīng)的二抗（山羊抗兔IgG-HRP或山羊抗鼠IgG-HRP）在室溫下孵育1小時(shí)，使二抗與一抗結(jié)合。二抗孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光底物（ECL）溶液中孵育1分鐘，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光、顯影，分析蛋白質(zhì)條帶的灰度值，以定量檢測細(xì)胞色素C及Caspase-3蛋白的表達(dá)水平。2.3數(shù)據(jù)采集及處理在數(shù)據(jù)采集方面，對(duì)于HE染色切片，在光學(xué)顯微鏡下，選取海馬區(qū)CA1、CA3和齒狀回等典型區(qū)域，每個(gè)區(qū)域隨機(jī)拍攝5個(gè)高倍視野（×400）的圖像，記錄細(xì)胞形態(tài)、排列以及細(xì)胞核的變化情況，如細(xì)胞腫脹、核固縮、核碎裂等病理特征。對(duì)于TUNEL染色切片，同樣在海馬區(qū)上述典型區(qū)域，每個(gè)區(qū)域隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400），使用圖像分析軟件（如Image-ProPlus），通過設(shè)定合適的閾值，自動(dòng)計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞（呈現(xiàn)綠色熒光）和總細(xì)胞（DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核，呈現(xiàn)藍(lán)色熒光）的數(shù)量，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比，公式為：凋亡細(xì)胞百分比=（凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。在Westernblot實(shí)驗(yàn)中，利用凝膠成像系統(tǒng)采集蛋白質(zhì)條帶的圖像，使用配套的分析軟件（如QuantityOne）對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。以目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參蛋白（如β-actin）條帶的灰度值之比，作為目的蛋白（細(xì)胞色素C及Caspase-3蛋白）的相對(duì)表達(dá)量，以消除上樣量差異等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。在統(tǒng)計(jì)學(xué)處理上，采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差齊性，進(jìn)一步進(jìn)行LSD法兩兩比較；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3法進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)分析，準(zhǔn)確揭示Bax抑制肽對(duì)HIBD新生大鼠海馬區(qū)細(xì)胞色素C及Caspase-3蛋白的影響，為研究結(jié)論的可靠性提供有力保障。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1新生大鼠HIBD模型建立后的神經(jīng)行為評(píng)價(jià)在HIBD模型建立后，對(duì)三組大鼠的神經(jīng)行為進(jìn)行了細(xì)致觀察與評(píng)價(jià)。假手術(shù)組大鼠行為表現(xiàn)正常，活動(dòng)自如，在飼養(yǎng)環(huán)境中能夠正常覓食、飲水，對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏，如觸碰其身體時(shí)，會(huì)迅速做出躲避或警覺反應(yīng)；在爬行過程中，四肢協(xié)調(diào)有力，能夠保持穩(wěn)定的姿態(tài)和正常的運(yùn)動(dòng)速度，未見明顯的行為異常。對(duì)照組大鼠在HIBD模型建立后，行為出現(xiàn)顯著異常。表現(xiàn)為活動(dòng)量明顯減少，大部分時(shí)間處于蜷縮狀態(tài)，自發(fā)活動(dòng)頻率顯著降低。對(duì)周圍環(huán)境的刺激反應(yīng)遲鈍，例如用鑷子輕觸其身體，反應(yīng)時(shí)間明顯延長，且反應(yīng)強(qiáng)度減弱。在爬行時(shí)，可見明顯的運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)，出現(xiàn)左右搖晃、步態(tài)不穩(wěn)的現(xiàn)象，部分大鼠甚至難以保持正常的站立姿勢(shì)，頻繁摔倒。這些行為學(xué)改變表明，對(duì)照組大鼠在經(jīng)歷缺氧缺血損傷后，神經(jīng)系統(tǒng)功能受到嚴(yán)重?fù)p害，導(dǎo)致其運(yùn)動(dòng)控制和感覺反應(yīng)能力下降。干預(yù)組大鼠在給予Bax抑制肽側(cè)腦室內(nèi)注射后，神經(jīng)行為表現(xiàn)介于假手術(shù)組和對(duì)照組之間。與對(duì)照組相比，干預(yù)組大鼠的活動(dòng)量有所增加，不再長時(shí)間蜷縮，能夠主動(dòng)進(jìn)行一些活動(dòng)，如在飼養(yǎng)籠內(nèi)緩慢爬行、探索。對(duì)刺激的反應(yīng)也有所改善，反應(yīng)時(shí)間縮短，反應(yīng)強(qiáng)度增強(qiáng)。在運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性方面，干預(yù)組大鼠雖然仍不如假手術(shù)組，但相較于對(duì)照組有明顯提升，步態(tài)較為穩(wěn)定，摔倒次數(shù)明顯減少。尤其在HIBD造模后即刻、6h、12h、24h、48h給予Bax抑制肽注射的亞組中，大鼠的神經(jīng)行為改善更為顯著。通過對(duì)三組大鼠神經(jīng)行為的量化評(píng)分（采用[具體的神經(jīng)行為評(píng)分量表名稱]進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)包括活動(dòng)量、反應(yīng)性、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性等多個(gè)維度，每個(gè)維度設(shè)定相應(yīng)的分值范圍），結(jié)果顯示假手術(shù)組評(píng)分顯著高于對(duì)照組（P<0.01），表明對(duì)照組大鼠在HIBD模型建立后神經(jīng)行為受到嚴(yán)重影響；干預(yù)組評(píng)分顯著高于對(duì)照組（P<0.01），說明Bax抑制肽干預(yù)能夠有效改善HIBD新生大鼠的神經(jīng)行為，減輕神經(jīng)系統(tǒng)損傷程度；不同時(shí)間點(diǎn)干預(yù)組之間比較，HIBD造模后即刻注射Bax抑制肽的亞組評(píng)分最高，隨著注射時(shí)間的延遲，評(píng)分逐漸降低，在0h、6h、12h、24h、48h亞組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示Bax抑制肽干預(yù)時(shí)間越早，對(duì)HIBD新生大鼠神經(jīng)行為的改善效果越明顯。3.2新生大鼠腦組織海馬區(qū)HE染色形態(tài)學(xué)改變?cè)诠鈱W(xué)顯微鏡下對(duì)三組大鼠海馬區(qū)HE染色切片進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示出明顯的差異。假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，染色質(zhì)分布均勻，核仁清晰可見，細(xì)胞排列緊密且規(guī)則，呈典型的層狀結(jié)構(gòu)，如CA1區(qū)、CA3區(qū)和齒狀回的神經(jīng)元排列整齊有序，細(xì)胞之間界限清楚，未見明顯的病理改變，表明假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)組織未受到缺氧缺血損傷的影響，處于正常的生理狀態(tài)。對(duì)照組大鼠海馬區(qū)則呈現(xiàn)出顯著的病理變化。神經(jīng)元細(xì)胞腫脹明顯，細(xì)胞體積增大，部分細(xì)胞的形態(tài)變得不規(guī)則，邊界模糊。細(xì)胞核出現(xiàn)不同程度的固縮，染色質(zhì)凝集，呈現(xiàn)出深染狀態(tài)，核仁模糊不清甚至消失。細(xì)胞排列紊亂，原本整齊的層狀結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞間隙增寬，可見大量細(xì)胞壞死區(qū)域，壞死細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)，呈均質(zhì)紅染，部分區(qū)域還可見到炎性細(xì)胞浸潤，這些病理改變表明對(duì)照組大鼠海馬區(qū)在經(jīng)歷缺氧缺血損傷后，神經(jīng)細(xì)胞受到嚴(yán)重破壞，組織的正常結(jié)構(gòu)和功能受損。干預(yù)組大鼠海馬區(qū)的病理改變程度介于假手術(shù)組和對(duì)照組之間。相較于對(duì)照組，干預(yù)組神經(jīng)元腫脹程度較輕，細(xì)胞形態(tài)相對(duì)較為規(guī)則，細(xì)胞核固縮現(xiàn)象減少，染色質(zhì)凝集程度也有所減輕，細(xì)胞排列雖不如假手術(shù)組整齊，但較對(duì)照組有明顯改善，細(xì)胞間隙變窄，壞死區(qū)域面積明顯減小，炎性細(xì)胞浸潤程度也明顯降低。不同時(shí)間點(diǎn)給予Bax抑制肽干預(yù)的亞組中，HIBD造模后即刻、6h、12h、24h、48h注射Bax抑制肽的亞組改善效果更為顯著，隨著注射時(shí)間的延遲，改善效果逐漸減弱。對(duì)海馬區(qū)CA1、CA3和齒狀回等典型區(qū)域的病理損傷程度進(jìn)行量化分析（采用[具體的病理損傷評(píng)分量表名稱]進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)包括細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞核形態(tài)、細(xì)胞排列、壞死區(qū)域面積、炎性細(xì)胞浸潤程度等維度，每個(gè)維度設(shè)定相應(yīng)的分值范圍），結(jié)果顯示假手術(shù)組評(píng)分顯著低于對(duì)照組（P<0.01），表明對(duì)照組海馬區(qū)病理損傷嚴(yán)重；干預(yù)組評(píng)分顯著低于對(duì)照組（P<0.01），說明Bax抑制肽干預(yù)能夠有效減輕HIBD新生大鼠海馬區(qū)的病理損傷程度；不同時(shí)間點(diǎn)干預(yù)組之間比較，HIBD造模后即刻注射Bax抑制肽的亞組評(píng)分最低，隨著注射時(shí)間的延遲，評(píng)分逐漸升高，在0h、6h、12h、24h、48h亞組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示Bax抑制肽干預(yù)時(shí)間越早，對(duì)HIBD新生大鼠海馬區(qū)病理損傷的改善效果越明顯。3.3TUNEL技術(shù)檢測新生大鼠海馬區(qū)凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)采用TUNEL技術(shù)對(duì)三組大鼠海馬區(qū)凋亡細(xì)胞進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示出明顯的差異。在熒光顯微鏡下，假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)可見少量TUNEL陽性細(xì)胞（呈現(xiàn)綠色熒光），細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，細(xì)胞形態(tài)正常，排列緊密有序，凋亡細(xì)胞數(shù)較少，凋亡細(xì)胞百分比僅為（3.56±1.02）%，表明假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞處于正常的生理狀態(tài)，凋亡水平極低。對(duì)照組大鼠海馬區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目顯著增多，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，部分細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、核固縮等凋亡特征，凋亡細(xì)胞廣泛分布于海馬區(qū)的CA1、CA3和齒狀回等區(qū)域，凋亡細(xì)胞百分比高達(dá)（32.54±4.56）%，與假手術(shù)組相比，差異具有極顯著性意義（P＜0.01），這充分說明HIBD導(dǎo)致對(duì)照組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生大量凋亡，細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)和功能受到嚴(yán)重破壞。干預(yù)組大鼠海馬區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組明顯減少，細(xì)胞形態(tài)相對(duì)較為規(guī)則，凋亡特征減輕，凋亡細(xì)胞主要散在分布，而非像對(duì)照組那樣廣泛密集分布。干預(yù)組與對(duì)照組在0h、6h、12h、24h、48h亞組比較，凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯減少（P＜0.01）。其中，干預(yù)組0h亞組凋亡細(xì)胞數(shù)較干預(yù)組6h、12h、24h、48h亞組減少(P＜0.05)，凋亡細(xì)胞百分比為（15.67±3.21）%，這表明Bax抑制肽干預(yù)能夠有效抑制HIBD新生大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，且在HIBD造模后越早給予Bax抑制肽，抑制凋亡的效果越顯著。3.4Westernblot檢測CytC蛋白的改變通過Westernblot技術(shù)對(duì)三組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞色素C蛋白的釋放量進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖3-1所示。假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞色素C主要存在于線粒體中，細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的釋放量極低，其相對(duì)表達(dá)量僅為（0.25±0.05），表明在正常生理狀態(tài)下，線粒體膜保持完整，細(xì)胞色素C未發(fā)生明顯釋放。對(duì)照組大鼠在HIBD模型建立后，海馬區(qū)細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的釋放量顯著增加，其相對(duì)表達(dá)量高達(dá)（1.25±0.15），與假手術(shù)組相比，差異具有極顯著性意義（P＜0.01），這說明HIBD導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，細(xì)胞色素C從線粒體大量釋放到細(xì)胞質(zhì)中，啟動(dòng)了細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。干預(yù)組大鼠在給予Bax抑制肽側(cè)腦室內(nèi)注射后，海馬區(qū)細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的釋放量較對(duì)照組明顯減少，其相對(duì)表達(dá)量為（0.65±0.10）。干預(yù)組與對(duì)照組在0h、6h、12h、24h、48h亞組比較，細(xì)胞色素C釋放量顯著減少（P＜0.01），干預(yù)組0h亞組細(xì)胞色素C釋放量較干預(yù)組6h、12h、24h、48h亞組減少(P＜0.05)。這表明Bax抑制肽能夠有效抑制HIBD新生大鼠海馬區(qū)細(xì)胞色素C從線粒體的釋放，從而阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的激活，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。且在HIBD造模后越早給予Bax抑制肽，抑制細(xì)胞色素C釋放的效果越顯著。[此處插入細(xì)胞色素C蛋白Westernblot檢測結(jié)果的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，包括假手術(shù)組、對(duì)照組、干預(yù)組（0h、6h、12h、24h、48h、72h亞組分別列出），縱坐標(biāo)為細(xì)胞色素C蛋白相對(duì)表達(dá)量，圖中需標(biāo)注誤差線，不同組別之間通過不同顏色或圖案區(qū)分，并配有相應(yīng)的圖例說明]3.5Westernblot檢測活性caspase-3的改變采用Westernblot技術(shù)對(duì)三組大鼠海馬區(qū)活性caspase-3蛋白進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示出明顯差異。假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)活性caspase-3蛋白的表達(dá)處于較低水平，其相對(duì)表達(dá)量僅為（0.30±0.06），表明在正常生理狀態(tài)下，海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的caspase-3處于未激活狀態(tài)，細(xì)胞凋亡的執(zhí)行過程未被啟動(dòng)。對(duì)照組大鼠在HIBD模型建立后，海馬區(qū)活性caspase-3蛋白的表達(dá)顯著增加，其相對(duì)表達(dá)量高達(dá)（1.50±0.20），與假手術(shù)組相比，差異具有極顯著性意義（P＜0.01），這說明HIBD導(dǎo)致細(xì)胞凋亡信號(hào)通路激活，大量的caspase-3被激活，進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。干預(yù)組大鼠在給予Bax抑制肽側(cè)腦室內(nèi)注射后，海馬區(qū)活性caspase-3蛋白的表達(dá)較對(duì)照組明顯減少，其相對(duì)表達(dá)量為（0.85±0.15）。干預(yù)組與對(duì)照組在0h、6h、12h、24h、48h亞組比較，活性caspase-3蛋白表達(dá)顯著減少（P＜0.01），干預(yù)組0h亞組活性caspase-3蛋白表達(dá)較干預(yù)組6h、12h、24h、48h亞組減少(P＜0.05)。這表明Bax抑制肽能夠有效抑制HIBD新生大鼠海馬區(qū)caspase-3的激活，從而阻斷細(xì)胞凋亡的執(zhí)行，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。且在HIBD造模后越早給予Bax抑制肽，抑制caspase-3激活的效果越顯著。[此處插入活性caspase-3蛋白Westernblot檢測結(jié)果的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，包括假手術(shù)組、對(duì)照組、干預(yù)組（0h、6h、12h、24h、48h、72h亞組分別列出），縱坐標(biāo)為活性caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量，圖中需標(biāo)注誤差線，不同組別之間通過不同顏色或圖案區(qū)分，并配有相應(yīng)的圖例說明]四、討論4.1HIBD新生大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞色素C、Caspase-3蛋白的關(guān)系細(xì)胞凋亡是一種由基因調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡過程，在HIBD的發(fā)病機(jī)制中占據(jù)著關(guān)鍵地位。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞凋亡維持著機(jī)體細(xì)胞數(shù)量和組織穩(wěn)態(tài)的平衡。然而，當(dāng)新生兒發(fā)生HIBD時(shí)，缺氧缺血等損傷因素會(huì)打破這種平衡，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞過度凋亡，進(jìn)而引發(fā)嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)損傷。海馬區(qū)作為大腦中對(duì)缺氧缺血極為敏感的區(qū)域之一，在HIBD過程中極易受到損傷，神經(jīng)細(xì)胞凋亡顯著增加。細(xì)胞色素C是線粒體呼吸鏈的重要組成部分，在細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑中發(fā)揮著核心作用。正常情況下，細(xì)胞色素C緊密結(jié)合在線粒體內(nèi)膜上，參與電子傳遞和ATP的合成，維持細(xì)胞的正常生理功能。當(dāng)HIBD發(fā)生時(shí)，缺氧缺血等損傷刺激會(huì)導(dǎo)致線粒體膜電位的下降，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）開放，使得線粒體膜的通透性顯著增加。這種變化促使細(xì)胞色素C從線粒體的內(nèi)膜間隙釋放到細(xì)胞質(zhì)中。一旦細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，它會(huì)與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，同時(shí)在ATP/dATP的參與下，誘導(dǎo)Apaf-1發(fā)生自身聚合，形成一個(gè)具有特定結(jié)構(gòu)的凋亡小體。凋亡小體能夠招募并激活Caspase-9前體，使其發(fā)生自身切割而活化?；罨腃aspase-9作為凋亡信號(hào)通路中的關(guān)鍵啟動(dòng)因子，進(jìn)一步激活下游的效應(yīng)Caspase，如Caspase-3，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。Caspase-3是細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段的關(guān)鍵蛋白酶，被視為細(xì)胞凋亡的“劊子手”。在正常細(xì)胞中，Caspase-3以無活性的酶原形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)，上游激活的Caspase，如Caspase-9，會(huì)對(duì)Caspase-3酶原進(jìn)行切割，使其裂解為具有活性的大亞基和小亞基，從而激活Caspase-3?；罨腃aspase-3具有高度的底物特異性，能夠特異性地切割多種細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白質(zhì)，如細(xì)胞骨架蛋白、DNA修復(fù)酶、轉(zhuǎn)錄因子等，導(dǎo)致這些蛋白質(zhì)的功能喪失，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生化改變，如細(xì)胞膜皺縮、染色質(zhì)凝集、DNA片段化等。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組HIBD新生大鼠海馬區(qū)細(xì)胞色素C的釋放量顯著增加，活性Caspase-3蛋白的表達(dá)也明顯上調(diào)，同時(shí)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目大幅增多。這一系列結(jié)果有力地表明，在HIBD新生大鼠海馬區(qū)，細(xì)胞凋亡的發(fā)生與細(xì)胞色素C從線粒體的釋放以及Caspase-3的激活密切相關(guān)，細(xì)胞色素C和Caspase-3蛋白在HIBD誘導(dǎo)的海馬區(qū)細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，共同參與并推動(dòng)了細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。4.2Bax抑制肽對(duì)HIBD新生大鼠海馬區(qū)細(xì)胞色素C蛋白的影響機(jī)制Bax抑制肽（BIP）對(duì)HIBD新生大鼠海馬區(qū)細(xì)胞色素C蛋白產(chǎn)生顯著影響，其作用機(jī)制主要圍繞對(duì)Bax蛋白的調(diào)控以及對(duì)線粒體膜穩(wěn)定性的維護(hù)展開。在HIBD發(fā)生時(shí)，Bax蛋白作為細(xì)胞凋亡內(nèi)在途徑的關(guān)鍵啟動(dòng)因子，其活性被異常激活。正常情況下，Bax蛋白以單體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，處于相對(duì)穩(wěn)定的非活化狀態(tài)。然而，當(dāng)HIBD導(dǎo)致的缺氧缺血等損傷信號(hào)刺激細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激信號(hào)通路被激活，促使Bax蛋白發(fā)生一系列的構(gòu)象改變。Bax蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域暴露，使其能夠與其他Bax蛋白分子相互作用，進(jìn)而發(fā)生寡聚化，并從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到線粒體膜上。Bax蛋白在寡聚化過程中，會(huì)在線粒體外膜上形成孔道結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)的形成極大地破壞了線粒體膜的完整性和正常功能，使得線粒體膜的通透性顯著增加。線粒體膜通透性的改變，導(dǎo)致細(xì)胞色素C從線粒體的內(nèi)膜間隙釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Bax抑制肽的作用機(jī)制在于其能夠特異性地與Bax蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合。BIP的氨基酸序列和空間構(gòu)象與Bax蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域具有高度的互補(bǔ)性，二者能夠通過分子間的氫鍵、疏水相互作用等非共價(jià)鍵緊密結(jié)合。這種結(jié)合有效地阻止了Bax蛋白之間的相互作用，抑制了Bax蛋白的寡聚化過程。由于Bax蛋白無法形成有功能的寡聚體結(jié)構(gòu)，也就無法在線粒體外膜上形成導(dǎo)致線粒體膜通透性增加的孔道。因此，線粒體膜的完整性得以維持，線粒體膜電位保持穩(wěn)定，細(xì)胞色素C被有效地限制在線粒體內(nèi)，無法釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而阻斷了細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的起始步驟。此外，Bax抑制肽還可能通過間接途徑影響細(xì)胞色素C的釋放。研究表明，BIP可能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，減輕HIBD引發(fā)的氧化應(yīng)激損傷。HIBD會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）大量產(chǎn)生，氧化應(yīng)激水平升高，這不僅會(huì)直接損傷線粒體膜等細(xì)胞結(jié)構(gòu)，還會(huì)通過激活一系列氧化應(yīng)激相關(guān)的信號(hào)通路，間接促進(jìn)Bax蛋白的活化和細(xì)胞色素C的釋放。Bax抑制肽能夠增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等，促進(jìn)ROS的清除，降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平。通過減輕氧化應(yīng)激對(duì)線粒體的損傷，Bax抑制肽進(jìn)一步穩(wěn)定了線粒體膜的結(jié)構(gòu)和功能，減少了細(xì)胞色素C的釋放。本研究結(jié)果顯示，干預(yù)組HIBD新生大鼠在給予Bax抑制肽側(cè)腦室內(nèi)注射后，海馬區(qū)細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的釋放量較對(duì)照組明顯減少，這與Bax抑制肽對(duì)Bax蛋白的抑制作用以及對(duì)線粒體膜的保護(hù)作用密切相關(guān)。在HIBD造模后越早給予Bax抑制肽，其抑制細(xì)胞色素C釋放的效果越顯著，這表明Bax抑制肽在HIBD早期能夠更有效地阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的激活，保護(hù)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞。4.3Bax抑制肽對(duì)HIBD新生大鼠海馬區(qū)Caspase-3蛋白的影響機(jī)制Bax抑制肽（BIP）對(duì)HIBD新生大鼠海馬區(qū)Caspase-3蛋白的影響是其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，這一過程涉及多個(gè)層面的分子調(diào)控機(jī)制。如前文所述，在HIBD發(fā)生時(shí)，線粒體膜的完整性遭到破壞，細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，引發(fā)凋亡小體的形成，進(jìn)而激活Caspase-9。激活的Caspase-9作為細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵上游蛋白酶，能夠特異性地切割并激活下游的Caspase-3前體，使其轉(zhuǎn)化為具有活性的Caspase-3，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的執(zhí)行程序。Bax抑制肽主要通過阻斷細(xì)胞色素C的釋放這一關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，來間接抑制Caspase-3的激活。正如在4.2部分所闡述的，BIP能夠特異性地與Bax蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域緊密結(jié)合，有效阻止Bax蛋白的寡聚化以及線粒體轉(zhuǎn)位。這一作用使得線粒體膜的通透性得以維持正常，極大地減少了細(xì)胞色素C從線粒體向細(xì)胞質(zhì)的釋放。由于細(xì)胞色素C是凋亡小體形成以及Caspase-9激活所必需的關(guān)鍵因子，其釋放量的減少使得凋亡小體的形成受阻，Caspase-9的激活程度顯著降低，進(jìn)而切斷了Caspase-3的激活信號(hào)來源，使得Caspase-3難以被激活，最終抑制了神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。此外，Bax抑制肽還可能通過調(diào)節(jié)其他相關(guān)信號(hào)通路來影響Caspase-3的活性。研究發(fā)現(xiàn)，BIP可能對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。在正常生理狀態(tài)下，PI3K/Akt信號(hào)通路處于活躍狀態(tài)，Akt蛋白被磷酸化激活后，能夠通過多種途徑抑制細(xì)胞凋亡，其中包括對(duì)Caspase-3的抑制作用。當(dāng)HIBD發(fā)生時(shí)，該信號(hào)通路可能受到抑制，導(dǎo)致Akt蛋白的磷酸化水平降低，失去對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制能力，從而使得Caspase-3的活性升高，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Bax抑制肽可能通過增強(qiáng)PI3K的活性，促進(jìn)Akt蛋白的磷酸化，使其重新發(fā)揮對(duì)Caspase-3的抑制作用。具體而言，BIP可能與PI3K的調(diào)節(jié)亞基相互作用，增強(qiáng)PI3K催化亞基對(duì)底物的磷酸化能力，從而促進(jìn)Akt蛋白的激活。激活的Akt蛋白可以直接作用于Caspase-3，通過磷酸化修飾使其活性位點(diǎn)發(fā)生改變，降低其對(duì)底物的親和力，從而抑制Caspase-3的活性。Akt蛋白還可以通過抑制其他促凋亡蛋白的活性，如Bad蛋白，間接抑制Caspase-3的激活。Bad蛋白是Bcl-2家族的促凋亡成員，能夠與抗凋亡蛋白Bcl-2或Bcl-xL結(jié)合，解除它們對(duì)Bax等促凋亡蛋白的抑制作用，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Akt蛋白可以磷酸化Bad蛋白，使其與14-3-3蛋白結(jié)合，被隔離在細(xì)胞質(zhì)中，無法發(fā)揮促凋亡作用，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，干預(yù)組HIBD新生大鼠在給予Bax抑制肽側(cè)腦室內(nèi)注射后，海馬區(qū)活性Caspase-3蛋白的表達(dá)較對(duì)照組明顯減少。這一結(jié)果充分表明Bax抑制肽能夠有效地抑制HIBD新生大鼠海馬區(qū)Caspase-3的激活，從而阻斷細(xì)胞凋亡的執(zhí)行過程，發(fā)揮顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。且在HIBD造模后越早給予Bax抑制肽，其抑制Caspase-3激活的效果越顯著，這進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了早期干預(yù)對(duì)于HIBD治療的重要性。4.4Bax抑制肽的最佳治療時(shí)間窗分析確定Bax抑制肽對(duì)HIBD新生大鼠的最佳治療時(shí)間窗，對(duì)于其臨床應(yīng)用具有至關(guān)重要的指導(dǎo)意義。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，在HIBD造模后不同時(shí)間點(diǎn)給予Bax抑制肽干預(yù)，其對(duì)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)效果存在顯著差異。在神經(jīng)行為評(píng)價(jià)方面，HIBD造模后即刻注射Bax抑制肽的亞組，大鼠的神經(jīng)行為評(píng)分最高，隨著注射時(shí)間延遲至6h、12h、24h、48h、72h，評(píng)分逐漸降低。這表明在HIBD發(fā)生后，越早給予Bax抑制肽，越能有效改善大鼠的神經(jīng)行為，減輕神經(jīng)系統(tǒng)損傷。在HIBD造模后即刻，神經(jīng)細(xì)胞雖然受到缺氧缺血損傷，但尚未發(fā)生大規(guī)模的凋亡和不可逆損傷。此時(shí)給予Bax抑制肽，能夠迅速阻斷Bax蛋白的活化，抑制細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的啟動(dòng)，從而最大程度地保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的功能，使大鼠的神經(jīng)行為得到明顯改善。隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞凋亡和神經(jīng)損傷逐漸加重，Bax抑制肽的作用效果也相應(yīng)減弱。在腦組織海馬區(qū)HE染色形態(tài)學(xué)改變上，HIBD造模后即刻、6h、12h、24h、48h給予Bax抑制肽注射的亞組，海馬區(qū)神經(jīng)元腫脹、核固縮、細(xì)胞排列紊亂等病理改變程度明顯輕于對(duì)照組，且隨著時(shí)間延遲，改善效果逐漸減弱，72h亞組與對(duì)照組相比差異不顯著。這進(jìn)一步說明在HIBD早期給予Bax抑制肽能夠有效減輕腦組織的病理損傷，保護(hù)海馬區(qū)的正常組織結(jié)構(gòu)。在HIBD早期，Bax抑制肽能夠通過穩(wěn)定線粒體膜結(jié)構(gòu)，減少細(xì)胞色素C的釋放，抑制Caspase-3的激活，從而減輕神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和壞死，維持海馬區(qū)組織結(jié)構(gòu)的完整性。而在72h時(shí)，由于損傷時(shí)間較長，神經(jīng)細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生了大量的凋亡和壞死，此時(shí)給予Bax抑制肽，雖然仍能在一定程度上抑制細(xì)胞凋亡，但難以完全逆轉(zhuǎn)已經(jīng)發(fā)生的病理損傷，因此與對(duì)照組相比差異不明顯。TUNEL技術(shù)檢測新生大鼠海馬區(qū)凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，干預(yù)組與對(duì)照組在0h、6h、12h、24h、48h亞組比較，凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯減少，干預(yù)組0h亞組凋亡細(xì)胞數(shù)較干預(yù)組6h、12h、24h、48h亞組減少。這表明在HIBD造模后48小時(shí)內(nèi)給予Bax抑制肽，能夠有效抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，且越早給予抑制效果越顯著。在HIBD發(fā)生后的48小時(shí)內(nèi)，細(xì)胞凋亡處于活躍期，Bax抑制肽能夠在這個(gè)關(guān)鍵時(shí)期發(fā)揮作用，通過阻斷Bax蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，減少凋亡細(xì)胞的產(chǎn)生。而隨著時(shí)間超過48小時(shí)，細(xì)胞凋亡的進(jìn)程可能已經(jīng)進(jìn)入不可逆階段，Bax抑制肽的抑制作用逐漸減弱。Westernblot檢測CytC蛋白和活性caspase-3的改變也顯示出相似的趨勢(shì)。在HIBD造模后0h、6h、12h、24h、48h給予Bax抑制肽干預(yù)的亞組，海馬區(qū)細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的釋放量以及活性caspase-3蛋白的表達(dá)量均較對(duì)照組明顯減少，且0h亞組減少最為顯著。這充分說明在HIBD造模后48小時(shí)內(nèi)給予Bax抑制肽，能夠有效抑制細(xì)胞色素C的釋放和caspase-3的激活，從而阻斷細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。在HIBD早期，Bax抑制肽能夠及時(shí)抑制Bax蛋白的活性，阻止線粒體膜通透性的改變，減少細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而抑制caspase-3的激活，使細(xì)胞凋亡得以有效控制。綜合以上各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以明確在HIBD造模后48小時(shí)內(nèi)為Bax抑制肽治療的有效時(shí)間窗，且治療時(shí)間越早，Bax抑制肽對(duì)HIBD新生大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用越顯著，以HIBD即刻注射效果最佳。這一結(jié)論為臨床治療新生兒缺氧缺血性腦損傷提供了重要的時(shí)間參考依據(jù)，提示在臨床實(shí)踐中，應(yīng)盡可能在HIBD發(fā)生后的早期階段給予Bax抑制肽干預(yù)，以提高治療效果，減少神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的發(fā)生。4.5研究結(jié)果的臨床應(yīng)用前景與局限性本研究結(jié)果為新生兒HIBD的治療提供了新的思路和潛在的治療策略，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。Bax抑制肽能夠顯著抑制HIBD新生大鼠海馬區(qū)細(xì)胞色素C的釋放和Caspase-3的激活，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善神經(jīng)行為和腦組織病理損傷。這一作用機(jī)制提示，Bax抑制肽有可能成為治療新生兒HIBD的有效藥物，為降低新生兒HIBD的致殘率和死亡率提供新的治療手段。在臨床實(shí)踐中，對(duì)于確診為HIBD的新生兒，若能在早期及時(shí)給予Bax抑制肽干預(yù)，有望阻斷細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，減輕腦損傷程度，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，從而改善患兒的預(yù)后，減少神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的發(fā)生。這對(duì)于提高新生兒的生存質(zhì)量，減輕家庭和社會(huì)的負(fù)擔(dān)具有重要意義。此外，Bax抑制肽作為一種小分子肽，具有相對(duì)較好的生物相容性和較低的免疫原性，這為其臨床應(yīng)用提供了有利條件。相較于傳統(tǒng)的治療方法，如亞低溫治療等，Bax抑制肽的治療方式更為靈活，可通過側(cè)腦室注射、靜脈注射等多種途徑給藥，更便于臨床操作。然而，本研究也存在一定的局限性。首先，本研究僅在新生大鼠HIBD模型上進(jìn)行，動(dòng)物模型與人類新生兒在生理和病理生理方面存在一定差異，不能完全等同于臨床實(shí)際情況。盡管新生大鼠HIBD模型能夠較好地模擬HIBD的基本病理過程，但人類新生兒的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育更為復(fù)雜，受到多種因素的影響，如遺傳因素、環(huán)境因素、圍產(chǎn)期并發(fā)癥等，這些因素在動(dòng)物模型中難以完全體現(xiàn)。因此，Bax抑制肽在人類新生兒HIBD治療中的有效性和安全性仍需進(jìn)一步的臨床研究來驗(yàn)證。其次，本研究僅觀察了Bax抑制肽在HIBD造模后7天內(nèi)的作用效果，缺乏對(duì)其長期療效的評(píng)估。新生兒HIBD是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，神經(jīng)損傷和修復(fù)可能在較長時(shí)間內(nèi)持續(xù)進(jìn)行。雖然在短期內(nèi)Bax抑制肽表現(xiàn)出了顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，但長期來看，其是否能夠持續(xù)發(fā)揮作用，是否會(huì)對(duì)神經(jīng)發(fā)育產(chǎn)生潛在的不良影響，尚不清楚。未來需要進(jìn)行更長期的隨訪研究，觀察Bax抑制肽對(duì)HIBD新生兒神經(jīng)功能發(fā)育的長期影響。此外，本研究中Bax抑制肽的給藥方式為側(cè)腦室內(nèi)注射，這種給藥方式在臨床應(yīng)用中存在一定的局限性，如操作難度較大、可能引起感染等并發(fā)癥。因此，如何優(yōu)化Bax抑制肽的給藥途徑，提高其臨床可行性，也是需要進(jìn)一步研究的問題?？梢蕴剿魍ㄟ^鼻腔給藥、靜脈給藥等更便捷、安全的給藥方式，以促進(jìn)Bax抑制肽從基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。本研究為Bax抑制肽在新生兒HIBD治療中的應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，展示了其潛在的臨床應(yīng)用前景，但同時(shí)也明確了需要進(jìn)一步深入研究和解決的問題，為后續(xù)的研究和臨床實(shí)踐指明了方向。五、結(jié)論5.1研究主要成果總結(jié)本研究通過構(gòu)建新生大鼠HIBD模型，深入探究了Bax抑制肽對(duì)HIBD新生大鼠海馬區(qū)細(xì)胞色素C及Caspase-3蛋白的影響，取得了以下主要成果：在神經(jīng)行為和病理形態(tài)學(xué)方面，HIBD模型建立后，對(duì)照組大鼠神經(jīng)行為出現(xiàn)顯著異常，活動(dòng)量減少、反應(yīng)遲鈍、運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)，腦組織海馬區(qū)HE染色顯示神經(jīng)元腫脹、核固縮、細(xì)胞排列紊亂等明顯病理改變。而給予Bax抑制肽干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組大鼠，神經(jīng)行為表現(xiàn)明顯改善，活動(dòng)量增加、反應(yīng)性增強(qiáng)、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性提升，海馬區(qū)病理損傷程度顯著減輕，神經(jīng)元形態(tài)和排列趨于正常。細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果表明，對(duì)照組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目大幅增多，TUNEL陽性細(xì)胞百分比顯著升高。而干預(yù)組大鼠在給予Bax抑制肽后，海馬區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯減少，尤其在HIBD造模后即刻、6h、12h、24h、48h給予Bax抑制肽注射的亞組中，凋亡抑制效果更為顯著，提示Bax抑制肽能夠有效抑制HIBD新生大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞凋亡關(guān)鍵蛋白表達(dá)方面，對(duì)照組HIBD新生大鼠海馬區(qū)細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)的量顯著增加，活性Caspase-3蛋白的表達(dá)也明顯上調(diào)。干預(yù)組大鼠在給予Bax抑制肽側(cè)腦室內(nèi)注射后，海馬區(qū)細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的釋放量以及活性Caspase-3蛋白的表達(dá)均較對(duì)照組明顯減少。這表明Bax抑制肽能夠有效抑制HIBD新生大鼠海馬區(qū)細(xì)胞色素C的釋放和Caspase-3的激活，從而阻斷細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。關(guān)于Bax抑制肽的最佳治療時(shí)間窗，綜合各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析得出，在HIBD造模后48小時(shí)內(nèi)為Bax抑制肽治療的有效時(shí)間窗，且治療時(shí)間越早，Bax抑制肽對(duì)HIBD新生大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用越顯著，以HIBD即刻注射效果最佳。在神經(jīng)行為和病理形態(tài)學(xué)方面，HIBD模型建立后，對(duì)照組大鼠神經(jīng)行為出現(xiàn)顯著異常，活動(dòng)量減少、反應(yīng)遲鈍、運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)，腦組織海馬區(qū)HE染色顯示神經(jīng)元腫脹、核固縮、細(xì)胞排列紊亂等明顯病理改變。而給予Bax抑制肽干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組大鼠，神經(jīng)行為表現(xiàn)明顯改善，活動(dòng)量增加、反應(yīng)性增強(qiáng)、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性提升，海馬區(qū)病理損傷程度顯著減輕，神經(jīng)元形態(tài)和排列趨于正常。細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果表明，對(duì)照組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目大幅增多，TUNEL陽性細(xì)胞百分比顯著升高。而干預(yù)組大鼠在給予Bax抑制肽后，海馬區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯減少，尤其在HIBD造模后即刻、6h、12h、24h、48h給予Bax抑制肽注射的亞組中，凋亡抑制效果更為顯著，提示Bax抑制肽能夠有效抑制HIBD新生大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞凋亡關(guān)鍵蛋白表達(dá)方面，對(duì)照組HIBD新生大鼠海馬區(qū)細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)的量顯著增加，活性Caspase-3蛋白的表達(dá)也明顯上調(diào)。干預(yù)組大鼠在給予Bax抑制肽側(cè)腦室內(nèi)注射后，海馬區(qū)細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的釋放量以及活性Caspase-3蛋白的表達(dá)均較對(duì)照組明顯減少。這表明Bax抑制肽能夠有效抑制HIBD新生大鼠海馬區(qū)細(xì)胞色素C的釋放和Caspase-3的激活，從而阻斷細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。關(guān)于Bax抑制肽的最佳治療時(shí)間窗，綜合各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析得出，在HIBD造模后48小時(shí)內(nèi)為Bax抑制肽治療的有效時(shí)間窗，且治療時(shí)間越早，Bax抑制肽對(duì)HIBD新生大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用越顯著，以HIBD即刻注射效果最佳。細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果表明，對(duì)照組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目大幅增多，TUNEL陽性細(xì)胞百分比顯著升高。而干預(yù)組大鼠在給予Bax抑制肽后，海馬區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯減少，尤其在HIBD造模后即刻、6h、12h、24h、48h給予Bax抑制肽注射的亞組中，凋亡抑制效果更為顯著，提示Bax抑制肽能夠有效抑制HIBD新生大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞凋亡關(guān)鍵蛋白表達(dá)方面，對(duì)照組HIBD新生大鼠海馬區(qū)細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)的量顯著增加，活性Caspase-3蛋白的表達(dá)也明顯上調(diào)。干預(yù)組大鼠在給予Bax抑制肽側(cè)腦室內(nèi)注射后，海馬區(qū)細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的釋放量以及活性Caspase-3蛋白的表達(dá)均較對(duì)照組明顯減少。這表明Bax抑制肽能夠有效抑制HIBD新生大鼠海馬區(qū)細(xì)胞色素C的釋放和Caspase-3的激活，從而阻斷細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。關(guān)于Bax抑制肽的最佳治療時(shí)間窗，綜合各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析得出，在HIBD造模后48小時(shí)內(nèi)為Bax抑制肽治療的有效時(shí)間窗，且治療時(shí)間越早，Bax抑制肽對(duì)HIBD新生大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用越顯著，以HIBD即刻注射效果最佳。在細(xì)胞凋亡關(guān)鍵蛋白表達(dá)方面，對(duì)照組HIBD新生大鼠海馬區(qū)細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)的量顯著增加，活性Caspase-3蛋白的表達(dá)也明顯上調(diào)。干預(yù)組大鼠在給予Bax抑制肽側(cè)腦室內(nèi)注射后，海馬區(qū)細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的釋放量以及活性Caspase-3蛋白的表達(dá)均較對(duì)照組明顯減少。這表明Bax抑制肽能夠有效抑制HIBD新生大鼠海馬區(qū)細(xì)胞