牛結(jié)核病防治技術(shù)規(guī)范2011-09-15實(shí)施2011-09-15實(shí)施新疆維吾爾自治區(qū)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)GB/T1.1—2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》編寫。本標(biāo)準(zhǔn)由烏魯木齊市動(dòng)物疾病控制與診斷中心提出。本標(biāo)準(zhǔn)由自治區(qū)畜牧廳歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所、烏魯木齊市動(dòng)物疾病控制與診斷中心、新疆畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：李愛巧、呼西旦、鄭文新、楊啟元、王文秀、王六合、隋恒鳳、徐敏、慶永興、徐志光、范偉興、劉思國(guó)、陳彪、孫國(guó)林、李建玲、張婕、施遠(yuǎn)翔、李君蓮、王清平、韓涌、陳發(fā)喜、張耀文、王博善、何曉麗、范玉娟、何克明、吾斯曼江、李兆新。1牛結(jié)核病防治技術(shù)規(guī)范本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了牛結(jié)核病的診斷、疫情報(bào)告、疫情處理、預(yù)防與控制。本標(biāo)準(zhǔn)適用于牛結(jié)核病的診斷、疫情報(bào)告、疫情處理、預(yù)防與控制。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB16548-2006病害動(dòng)物和病害動(dòng)物產(chǎn)品生物安全處理程序GB/T18645-2002動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的《動(dòng)物疫情報(bào)告管理辦法》(農(nóng)牧發(fā)[1999]18號(hào))國(guó)務(wù)院頒發(fā)的《重大動(dòng)物疫情應(yīng)急條例》(中華人民共和國(guó)國(guó)務(wù)院令第450號(hào))3診斷本病奶牛最易感染，其次為黃牛、牦牛。人也可被感染。結(jié)核病病牛是本病的主要傳染源。牛型結(jié)核分枝桿菌隨鼻汁、痰液、糞便和乳汁等排出體外，健康?？赏ㄟ^被污染的空氣、飼料、飲水等經(jīng)呼吸道、消化道等途徑感染。潛伏期一般為3周～6周，有的可長(zhǎng)達(dá)數(shù)月或數(shù)年。臨床通常呈慢性經(jīng)過，以肺結(jié)核、乳房結(jié)核和腸結(jié)核最為常見。肺結(jié)核：以長(zhǎng)期頑固性干咳為特征，且以清晨最為明顯?；夹笕菀灼?，逐漸消瘦，病情嚴(yán)重者可乳房結(jié)核：一般先是乳房淋巴結(jié)腫大，繼而后方乳腺區(qū)發(fā)生局限性或彌漫性硬結(jié)，硬結(jié)無(wú)熱無(wú)痛，表面凹凸不平。泌乳量下降，乳汁變稀，嚴(yán)重時(shí)乳腺萎縮，泌乳停止。在肺臟、乳房和胃腸粘膜等處形成特異性白色或黃白色化，有時(shí)壞死組織溶解和軟化，排出后形成空洞。胸膜和肺膜可發(fā)生密集的結(jié)核結(jié)節(jié)，形如珍珠狀。2采集病牛的病灶、痰、尿、糞便、乳及其它分泌物樣品，作抹片或集菌處理(見附錄A)后抹片，用抗酸染色法染色鏡檢，并進(jìn)行病原分離培養(yǎng)和動(dòng)物接種等試驗(yàn)。3.4.2.1牛型結(jié)核分枝桿菌PPD(提純蛋白衍生物)皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)(即牛提純結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn))按GB/T18645-2002規(guī)定操作。3.4.2.2x-干擾素反應(yīng)試驗(yàn)作為PPD實(shí)驗(yàn)的補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)(見附錄B)。3.5結(jié)果判定本病依據(jù)流行病學(xué)特點(diǎn)、臨床特征、病理變化可做出初步診斷。確診需進(jìn)一步做病原學(xué)診斷或免疫學(xué)診斷。3.5.1分離出結(jié)核分枝桿菌(包括牛結(jié)核分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌)判為結(jié)核病牛。3.5.2牛型結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)陽(yáng)性的牛，判為結(jié)核病牛。3.5.3x-干擾素反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果判定為陽(yáng)性的牛，判為結(jié)核病牛。4.1任何單位和個(gè)人發(fā)現(xiàn)疑似病牛，應(yīng)當(dāng)及時(shí)向當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)報(bào)告。4.2動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)接到疫情報(bào)告并確認(rèn)后，按《動(dòng)物疫情報(bào)告管理辦法》及有關(guān)規(guī)定及時(shí)上報(bào)。5.1發(fā)現(xiàn)疑似疫情，畜主應(yīng)限制動(dòng)物移動(dòng)；對(duì)疑似患病動(dòng)物應(yīng)立即隔離。5.2動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)要及時(shí)派員到現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行調(diào)查核實(shí)，開展實(shí)驗(yàn)室診斷。確診后，當(dāng)?shù)厝嗣裾M織有關(guān)部門按下列要求處理：對(duì)確認(rèn)患病的牛全部撲殺。對(duì)受威脅的畜群(病畜的同群畜)實(shí)施隔離，可采用圈養(yǎng)和固定草場(chǎng)放牧兩種方式隔離。隔離飼養(yǎng)用草場(chǎng)，不要靠近交通要道，居民點(diǎn)或人畜密集的地區(qū)。場(chǎng)地周圍最好有自然屏障或人工對(duì)隔離畜群的結(jié)核病凈化，按本規(guī)范6.5規(guī)定進(jìn)行。病死和撲殺的病畜，要按照GB16548-2006進(jìn)行無(wú)害化處理。5.2.4流行病學(xué)調(diào)查及檢測(cè)開展流行病學(xué)調(diào)查和疫源追蹤；對(duì)同群動(dòng)物進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)病畜和陽(yáng)性畜污染的場(chǎng)所、用具、物品進(jìn)行嚴(yán)格消毒。飼養(yǎng)場(chǎng)的金屬設(shè)施、設(shè)備可采取火焰、熏蒸等方式消毒；養(yǎng)畜場(chǎng)的圈舍、場(chǎng)地、車輛等，可選用2%燒堿等有效消毒藥消毒；飼養(yǎng)場(chǎng)的飼料、墊料可采取深埋發(fā)酵處理或焚燒處理；糞便采取堆積密封發(fā)酵方式，以及其它相應(yīng)的有效消毒方式。5.2.6發(fā)生重大牛結(jié)核病疫情時(shí)，當(dāng)?shù)乜h級(jí)以上人民政府應(yīng)按照《重大動(dòng)物疫情應(yīng)急條例》有關(guān)規(guī)定，采取相應(yīng)的疫情撲滅措施。36預(yù)防與控制采取以“監(jiān)測(cè)、檢疫、撲殺和消毒”相結(jié)合的綜合性防治措施。6.1監(jiān)測(cè)監(jiān)測(cè)對(duì)象：牛監(jiān)測(cè)比例為：種牛、奶牛100%,規(guī)模場(chǎng)肉牛10%,其它牛5%,疑似病牛100%。如在牛結(jié)核病凈化群中(包括犢牛群)檢出陽(yáng)性牛時(shí)，應(yīng)及時(shí)撲殺陽(yáng)性牛，其它牛按假定健康群處理。成年牛凈化群每年春秋兩季用牛型結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)各進(jìn)行一次監(jiān)測(cè)。初生犢牛，應(yīng)于20日齡時(shí)進(jìn)行第一次監(jiān)測(cè)。并按規(guī)定使用和填寫監(jiān)測(cè)結(jié)果報(bào)告，及時(shí)上報(bào)。6.2檢疫異地調(diào)運(yùn)的動(dòng)物，必須來(lái)自于非疫區(qū)，憑當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)出具的檢疫合格證明調(diào)運(yùn)。動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)應(yīng)對(duì)調(diào)運(yùn)的種用、乳用、役用動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。檢測(cè)合格后，方可出具檢疫合格證明。調(diào)入后應(yīng)隔離飼養(yǎng)30d,經(jīng)當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)檢疫合格后，方可解除隔離。飼養(yǎng)人員每年要定期進(jìn)行健康檢查。發(fā)現(xiàn)患有結(jié)核病的應(yīng)調(diào)離崗位，及時(shí)治療。結(jié)核病監(jiān)測(cè)合格應(yīng)為奶牛場(chǎng)、種畜場(chǎng)《動(dòng)物防疫合格證》發(fā)放或?qū)忩?yàn)的必備條件。動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)要對(duì)轄區(qū)內(nèi)奶牛場(chǎng)、種畜場(chǎng)的檢疫凈化情況監(jiān)督檢查。鮮奶收購(gòu)點(diǎn)(站)必須憑奶牛健康證明收購(gòu)鮮奶。6.5凈化措施被確診為結(jié)核病牛的牛群(場(chǎng))為牛結(jié)核病污染群(場(chǎng)),應(yīng)全部實(shí)施牛結(jié)核病凈化。6.5.1牛結(jié)核病凈化群(場(chǎng))的建立6.5.1.1污染牛群的處理：應(yīng)用牛型結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)對(duì)該牛群進(jìn)行反復(fù)監(jiān)測(cè)；對(duì)牛型結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)呈陽(yáng)性，養(yǎng)殖戶(或單位)提出要實(shí)施補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)時(shí)，可進(jìn)行x-干擾素補(bǔ)充試驗(yàn)；如x-干擾素為陽(yáng)性，按照規(guī)范5規(guī)定處理，如為陰性，進(jìn)行隔離，間隔3個(gè)月進(jìn)行復(fù)檢，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性牛按照本規(guī)范5規(guī)定處理。6.5.1.2犢牛應(yīng)于20日齡時(shí)進(jìn)行第一次監(jiān)測(cè)，100日齡～120日齡時(shí)，進(jìn)行第二次監(jiān)測(cè)。凡連續(xù)兩次以上監(jiān)測(cè)結(jié)果均為陰性者，可認(rèn)為是牛結(jié)核病凈化群。6.5.1.3凡牛型結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)疑似反應(yīng)者，于42d后進(jìn)行復(fù)檢，復(fù)檢結(jié)果為陽(yáng)性，則按陽(yáng)性牛處理；若仍呈疑似反應(yīng)則間隔42d再?gòu)?fù)檢一次，結(jié)果仍為可疑反應(yīng)者，視同陽(yáng)性牛處理。6.5.1.4凡牛型結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)疑似反應(yīng)者，進(jìn)行y-干擾素反應(yīng)試驗(yàn)，如果Y-干擾素反應(yīng)試驗(yàn)判定結(jié)果為陽(yáng)性，則按陽(yáng)性牛處理。疑似結(jié)核病?；蚺Ｐ徒Y(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)可疑畜須隔離復(fù)檢。6.5.3.1臨時(shí)消毒：奶牛群中檢出并剔出結(jié)核病牛后，牛舍、用具及運(yùn)動(dòng)場(chǎng)所等按照5.2.5規(guī)定進(jìn)行緊急處理。6.5.3.2經(jīng)常性消毒：飼養(yǎng)場(chǎng)及牛舍出入口處，應(yīng)設(shè)置消毒池，內(nèi)置有效消毒劑，如3%～5%來(lái)蘇爾溶液或20%石灰乳等。消毒藥要定期更換，以保證一定的藥效。牛舍內(nèi)的一切用具應(yīng)定期消毒；產(chǎn)房每周進(jìn)行一次大消毒，分娩室在臨產(chǎn)牛生產(chǎn)前及分娩后各進(jìn)行一次消毒。5(規(guī)范性附錄) 用4%～6%硫酸溶液將痰、尿、糞或病灶組織等按1:5之比例加入混合，然取氫氧化鈉35g～40g,鉀明礬2g,溴麝香草酚蘭20mg(預(yù)先用60%酒精配制成0.4%濃度，應(yīng)用h,然后無(wú)菌滴加5-10%鹽酸溶液進(jìn)行中和，使標(biāo)本的pH調(diào)到6.8左右(此時(shí)顯淡黃綠色),以3000rp在痰液或小膿塊中加入等量的1%氫氧化鈉溶液，充分振搖對(duì)痰液的消化濃縮也可采用以下較溫和的處理方法：取1N(或4%)氫氧化鈉水溶液50mL,0.1mo6(資料性附錄)y-干擾素反應(yīng)試驗(yàn)B.1試驗(yàn)材料B.1.1牛結(jié)核分枝桿菌x一干擾素檢測(cè)試劑盒B.1.2肝素鈉真空管B.1.3牛型提純結(jié)核菌素(PPD)和禽型提純結(jié)核菌素(PPD)B.1.4常用化學(xué)試劑：95%乙醇、88%磷酸B.1.5酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、洗板機(jī)B.1.6低溫離心機(jī)B.1.7二氧化碳培養(yǎng)箱B.1.8微量振蕩器(可選)B.2試驗(yàn)方法B.2.1臨床樣本采集及預(yù)處理B.2.1.1樣本的采集：牛尾靜脈無(wú)菌采血5ml,放入肝素抗凝管中，輕輕顛倒幾次混合血液，使肝素溶解。出現(xiàn)凝血的全血樣品不可用。B.2.1.2肝素抗凝全血的運(yùn)送：肝素抗凝全血應(yīng)在周圍環(huán)境溫度22士5℃運(yùn)送(避免極限溫度),并且最好在采血后8h(最長(zhǎng)不超過30h)內(nèi)用于檢測(cè)。B.2.1.3定量吸取肝素抗凝全血：分裝前輕輕顛倒試管，充分混勻血液樣品。將抗凝血加入24孔組織培養(yǎng)板，每頭動(dòng)物加三管1.5ml分裝的抗凝血。B.2.1.4加入牛結(jié)核菌素：向24孔培養(yǎng)板中無(wú)菌加入100HLPBS(陰性抗原對(duì)照),禽PPD、牛PPD至相應(yīng)的孔。抗原必須與分裝的血液充分混勻，最好用一個(gè)微量振蕩器高速振蕩1min。B.2.1.5全血孵育過夜：全血培養(yǎng)最好在有加濕器的CO?(5%)培養(yǎng)箱內(nèi)、37℃孵育18h(全血可接受培養(yǎng)時(shí)間為16h～24h)。吸取血漿時(shí)應(yīng)盡量避免吸入細(xì)胞。收獲的血漿可立即用于試驗(yàn)或-20℃冷凍貯存。B.2.2檢測(cè)方法B.2.2.1試劑按標(biāo)簽說(shuō)明書儲(chǔ)存，使用前恢復(fù)到室溫，避免使用帶金屬部分的加樣器。使用前將所有試劑充分混勻，不要產(chǎn)生大量泡沫，以免產(chǎn)生加樣誤差。B.2.2.2加入50HL樣品稀釋液至所需孔，再加入50HL待測(cè)樣品和對(duì)照樣品至含有樣品稀釋液的相應(yīng)孔中。對(duì)照樣品應(yīng)最后加入。在微量振蕩器上振蕩1min,徹底混勻。封板，室溫(22±5)℃孵育(60±5)min。用洗板機(jī)洗滌6次，將酶