PAGE1《漢灘病毒和漢城病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法》編制說明工作簡介（一）任務(wù)來源2024年9月30日，江西省市場監(jiān)督管理局下達(dá)了2024年第九批江西省地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃的通知文件，其中批準(zhǔn)《漢灘病毒和漢城病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法》（計(jì)劃編號：DB36-2024-9-40）地方標(biāo)準(zhǔn)由江西省疾病預(yù)防控制中心負(fù)責(zé)制定。（二）起草單位起草單位：江西省疾病預(yù)防控制中心。（三）主要起草人姓名性別職務(wù)/職稱工作單位任務(wù)分工標(biāo)準(zhǔn)修訂的必要性和意義近年來，新發(fā)傳染?。‥ID）的頻繁出現(xiàn)，引發(fā)重大公共衛(wèi)生及生物安全風(fēng)險(xiǎn)，多數(shù)EID以人獸共患病為主。嚙齒動(dòng)物是全球分布最廣泛，種類最多的哺乳動(dòng)物，同時(shí)也是多種人獸共患病原的自然宿主，嚙齒類動(dòng)物病原監(jiān)測是多種人畜共患病防控的重要手段。漢灘病毒（Hantaanvirus，HTNV））和漢城病毒（Seoulvirus，SEOV）均屬漢坦病毒科的RNA病毒，主要以嚙齒類動(dòng)物為自然宿主，其中HTNV自然宿主主要為黑線姬鼠，SEOV自然宿主主要為褐家鼠。人類可通過接觸、吸入受感染嚙齒類動(dòng)物的排泄物感染病毒，導(dǎo)致腎綜合征出血熱(HFRS)。HTNV和SEOV的致死率為1%~15%。嚙齒類動(dòng)物HTNV和SEOV監(jiān)測對人間HFRS疫情預(yù)測、預(yù)警以有重要的指示作用，為HFRS精準(zhǔn)防控措施制定提供數(shù)據(jù)支撐。國內(nèi)外嚙齒類動(dòng)物中HTNV和SEOV感染檢測方法主要是針對抗原或抗體檢測的免疫學(xué)方法（如：免疫熒光法）、病毒分離、這些方法特異性不強(qiáng)、無法實(shí)現(xiàn)病毒基因分型，或需要特殊設(shè)備和專業(yè)技術(shù)，難以推廣應(yīng)用。常規(guī)RT-PCR也有應(yīng)用于嚙齒類動(dòng)物中HTNV和SEOV感染檢測，需通過電泳PCR產(chǎn)物檢測目的條帶大小或者基因測序判斷病毒型別，操作復(fù)雜，檢測時(shí)間長，靈敏度低，可操作性不強(qiáng)。如現(xiàn)有行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《輸入性嚙齒動(dòng)物攜帶流行性出血熱病毒的巢式RT-PCR檢測方法》（SN/T2777-2011）為常規(guī)RT-PCR方法，該法RCR檢測分為逆轉(zhuǎn)錄、第一次PCR、第二次PCR，通過電泳PCR產(chǎn)物，根據(jù)目的條帶大小判定病毒型別，操作非常復(fù)雜，易污染，靈敏度低，檢測時(shí)間長，對設(shè)備要求高，難以向基層推廣。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法是在常規(guī)RT-PCR的基礎(chǔ)上，在反應(yīng)體系中加入一對特異性引物和一條特異性探針，探針兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'→3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，淬滅作用消失，熒光信號產(chǎn)生并被檢測儀器接受。隨著PCR反應(yīng)的循環(huán)進(jìn)行，PCR產(chǎn)物與熒光信號的增長呈對應(yīng)關(guān)系，通過檢測熒光信號對核酸模板進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測。該方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒檢測等多個(gè)領(lǐng)域。目前國內(nèi)外尚無嚙齒類動(dòng)物中針對HTNV和SEOV一管雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法，也未見相關(guān)的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)規(guī)范。本標(biāo)準(zhǔn)建立后，將填補(bǔ)我省在改項(xiàng)技術(shù)上的空白，運(yùn)用本標(biāo)準(zhǔn)可對我省嚙齒類動(dòng)物HTNV和SEOV進(jìn)行快速檢測，為我省HFRS精準(zhǔn)防控提供準(zhǔn)確的監(jiān)測數(shù)據(jù)。主要起草過程（一）標(biāo)準(zhǔn)起草2020年10月，江西省科技廳批準(zhǔn)了2020年度江西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目“腎綜合征出血熱病原遺傳變異和早期快速診斷關(guān)鍵技術(shù)的研究”（項(xiàng)目編號：2020BBGL73052）。在該項(xiàng)目支撐下，2020-2022年期間，初步建立了HTNV和SEOV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法，并于2023年8月份順利通過科技廳的項(xiàng)目驗(yàn)收。2024年1月-7月，在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過查閱文獻(xiàn)，收集資料，參考國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)起草小組起草了《漢灘病毒和漢城病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法》（標(biāo)準(zhǔn)草案），并提交了項(xiàng)目立項(xiàng)建議材料至江西省衛(wèi)生健康標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)秘書處（以下簡稱秘書處）。（二）標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)2024年7月5日，秘書處組織相關(guān)專家對本標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了立項(xiàng)論證預(yù)審查。通過預(yù)審查后，起草小組根據(jù)專家意見修改了標(biāo)準(zhǔn)草案，同項(xiàng)目申報(bào)表一并報(bào)送至江西省標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)評審中心。8月29日，參加了江西省標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)評審中心組織召開的立項(xiàng)評估會(huì)。通過專家評審、公示和審批等環(huán)節(jié)，9月30日，江西省市場監(jiān)督管理局下達(dá)了該項(xiàng)目的制定計(jì)劃。（三）征求意見為進(jìn)一步增強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性和可行性，隨后起草小組再次優(yōu)化了試驗(yàn)方法，修改和完善標(biāo)準(zhǔn)草案，起草編制說明，形成征求意見稿，并在衛(wèi)生健康單位、行業(yè)學(xué)（協(xié)）會(huì)以及高校廣泛征求意見。制定標(biāo)準(zhǔn)的原則和依據(jù)，與現(xiàn)行法律、法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系（一）標(biāo)準(zhǔn)的制定與起草原則本標(biāo)準(zhǔn)的編制遵循以下原則，以確保標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性、適用性和可操作性：1、科學(xué)性原則起草小組成員長期從事病毒性傳染病監(jiān)測，具有豐富的病毒檢測工作經(jīng)驗(yàn)。團(tuán)隊(duì)成員緊密協(xié)作，參考國內(nèi)外最新研究成果，結(jié)合HTNV和SEOV病原學(xué)特征、流行病學(xué)特點(diǎn)、省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目的前期基礎(chǔ)以及實(shí)時(shí)熒光RT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證確保本標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容科學(xué)、準(zhǔn)確、可靠。2、適用性原則江西地區(qū)嚙齒類動(dòng)物種類和數(shù)量繁多，且分布廣泛。嚙齒類動(dòng)物病原監(jiān)測是多種人畜共患病防控的重要手段。由于缺乏嚙齒類動(dòng)物中HTNV和SEOV統(tǒng)一的檢測方法，導(dǎo)致監(jiān)測數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確，無法實(shí)現(xiàn)腎綜合征出血熱的精準(zhǔn)防控，存在較大的公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)。本標(biāo)準(zhǔn)緊密結(jié)合江西本地HTNV和SEOV病原學(xué)特征、各市縣疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室均具備實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測能力和條件以及對嚙齒類動(dòng)物中HTNV和SEOV檢測需求的防控實(shí)際，制定相應(yīng)的檢測方法和結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，確保標(biāo)準(zhǔn)實(shí)用、可操作、易推廣。3、規(guī)范性原則本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草，從檢測原理、試劑和材料、生物安全要求、檢測步驟和結(jié)果判定等五個(gè)方面進(jìn)行規(guī)定和明確，使得標(biāo)準(zhǔn)易于理解和執(zhí)行。4、先進(jìn)性原則實(shí)時(shí)熒光PCR已廣泛應(yīng)用于病原體檢測領(lǐng)域，而目前尚無HTNV和SEOV的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)，本標(biāo)準(zhǔn)采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法，方法簡單易行、靈敏度高、準(zhǔn)確可靠，具有先進(jìn)性。（二）與現(xiàn)行法律、法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系本標(biāo)準(zhǔn)在編制過程中嚴(yán)格遵循現(xiàn)行相關(guān)法律、法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的要求，并與之保持協(xié)調(diào)一致，具體體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：1、與現(xiàn)行法律、法規(guī)的關(guān)系本標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格遵循《中華人民共和國標(biāo)準(zhǔn)化法》、《中華人民共和國生物安全法》、《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》等相關(guān)法律法規(guī)要求，確保標(biāo)準(zhǔn)的制定和實(shí)施符合國家法律法規(guī)的規(guī)定。本標(biāo)準(zhǔn)旨在為嚙齒類動(dòng)物HTNV和SEOV的實(shí)驗(yàn)室檢測提供技術(shù)規(guī)范、為相關(guān)傳染病的預(yù)防、控制提供支撐依據(jù)，符合《中華人民共和國傳染病防治法》關(guān)于加強(qiáng)傳染病監(jiān)測、預(yù)警和實(shí)驗(yàn)室檢測能力的相關(guān)要求。2、與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系目前尚無HTNV和SEOV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法相關(guān)現(xiàn)行國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)參考了GB/T6682《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》、GB19489《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》、GB/T28940《病媒生物感染病原體采樣規(guī)程鼠類》等相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)，在實(shí)驗(yàn)用水質(zhì)量控制、實(shí)驗(yàn)室生物安全、樣本采集方面與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)保持一致。本標(biāo)準(zhǔn)在遵循現(xiàn)行法律、法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合本地區(qū)HTNV和SEOV病原學(xué)特點(diǎn)和防控需求，對嚙齒類動(dòng)物中HTNV和SEOV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法進(jìn)行了詳細(xì)的規(guī)定，具有較強(qiáng)的針對性和實(shí)用性，能夠給嚙齒類動(dòng)物中HTNV和SEOV檢測提供有效的技術(shù)支撐。主要條款的說明本標(biāo)準(zhǔn)圍繞漢灘病毒和漢城病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法，結(jié)合技術(shù)特點(diǎn)與江西地區(qū)嚙齒類動(dòng)物鞋帶病原體監(jiān)測的實(shí)際需求，對核心條款進(jìn)行規(guī)范，具體說明如下：（一）適用范圍條款內(nèi)容：規(guī)定了漢灘病毒和漢城病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測的原理、試劑和材料、生物安全要求、檢測步驟和結(jié)果判定等內(nèi)容。明確適用于疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)對嚙齒類動(dòng)物中漢灘病毒和漢城病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測。說明：依據(jù)江西地區(qū)漢灘病毒/漢坦病毒的基因組特征，選定高度保守的S基因作為靶標(biāo)基因，確保檢測的特異性。結(jié)合本地嚙齒類動(dòng)物種類多，漢灘病毒和漢城病毒攜帶率高，各級疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)需對嚙齒類動(dòng)物中漢灘病毒和漢城病毒進(jìn)行檢測的實(shí)際，明確了該適用范圍。（二）檢測方法和步驟條款內(nèi)容：詳細(xì)規(guī)范了樣本采集、樣本處理、核酸提取、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測等流程。說明：通過比對文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，優(yōu)化了反應(yīng)體系，退火溫度、引物探針濃度等條件。（三）檢測結(jié)果判定條款內(nèi)容：規(guī)定實(shí)驗(yàn)成立、檢測結(jié)果判定包括閾值設(shè)定、陰性、單陽、雙陽判定標(biāo)準(zhǔn)以及可疑樣本的處理。說明：多次試驗(yàn)表明，高于最低檢出線濃度的樣本Ct均小于35，因此設(shè)定≤35.0為陽性判斷閾值，提高檢測靈敏度的同時(shí)避免假陽性。同時(shí)要求每批次的試驗(yàn)包含陰性對照、陽性對照，確保實(shí)驗(yàn)過程無污染。六、重大意見分歧的處理依據(jù)和結(jié)果本標(biāo)準(zhǔn)征求了衛(wèi)生健康單位、行業(yè)學(xué)（協(xié)）會(huì)以及高校意見,無重大意見分歧.七、貫徹標(biāo)準(zhǔn)的措施建議本標(biāo)準(zhǔn)雖為推薦性文件，但執(zhí)行本標(biāo)準(zhǔn)可對我省嚙齒類動(dòng)物HTNV和SEOV進(jìn)行快速檢測，為我省HFRS精準(zhǔn)防控提供準(zhǔn)確