ICS

點(diǎn)擊此處添加中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)分類號(hào)

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/CVMAXXXXX—XXXX

動(dòng)物及其制品中細(xì)菌耐藥性的測(cè)定

瓊脂擴(kuò)散法

DeterminationofBacterialResistanceinAnimalsandTheirProducts

AgarDiffusionMethod

點(diǎn)擊此處添加與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識(shí)

（征求意見(jiàn)稿）

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)發(fā)布

T/CVMAXXXXX—2021

動(dòng)物及其制品中細(xì)菌耐藥性的測(cè)定瓊脂擴(kuò)散法

1范圍

本文件規(guī)定了動(dòng)物及其制品中細(xì)菌耐藥性的測(cè)定瓊脂擴(kuò)散法的術(shù)語(yǔ)和定義、原理、試劑

或耗材、抗菌藥物的確定、菌株的選擇、抗菌藥物瓊脂擴(kuò)散法試驗(yàn)、結(jié)果判定的要求。

本文件適用于動(dòng)物及其制品中分離的葡萄球菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌和腸球菌等常

見(jiàn)細(xì)菌耐藥性的檢測(cè)，其他來(lái)源細(xì)菌的耐藥性測(cè)定可參考本方法執(zhí)行。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期

的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括

所有的修改單）適用于本文件。

GB4789.2食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB4789.10食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)

GB4789.4食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品韋微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)

GB/T4789.6食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)

DB51/T2083動(dòng)物源性腸球菌分離鑒定操作規(guī)程

3術(shù)語(yǔ)和定義

以下術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

最低抑菌濃度Minimalinhibitoryconcentration；MIC

在瓊脂或肉湯稀釋法藥物敏感性檢測(cè)試驗(yàn)中能抑制肉眼可見(jiàn)的微生物生長(zhǎng)的最低

抗菌藥物濃度。

3.2

瓊脂擴(kuò)散法AgarDiffusionMethod

將不同劑量的抗菌藥物，分別加于高壓并冷至50℃～60℃的定量瓊脂培養(yǎng)基中，混勻，

傾注成無(wú)菌平板，即為含有藥物濃度遞減的培養(yǎng)基，接種測(cè)試菌于該培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后觀

察被檢菌生長(zhǎng)情況，最低藥物抑制細(xì)菌生長(zhǎng)者，即最小抑菌濃度（MIC）。

4試劑與材料

4.1生理鹽水，7.5%

4.2水，符合GB/T6682二級(jí)水的要求

4.3甲醇

4.4NaOH

4.5磷酸鹽緩沖液，pH6.0

5器材與耗材

5.1微量移液器：0.1μL~2.5μL，0.5μL~10μL，1μL~100μL，100μL~1000μL

T/CVMAXXXXX—2021

5.2電子天平

5.3自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器

5.4電熱恒溫干燥箱

5.5超凈工作臺(tái)

5.6八道移液器（0.5uL-10uL）：溫度精確1℃

5.7分析天平：感量為0.0001g和0.01g

5.8分光光度計(jì)：波長(zhǎng)范圍為190nm～900nm

5.9平皿：直徑為90mm，底部平整

5.10高速冷凍離心機(jī)

5.11冰箱

5.12PCR擴(kuò)增儀

5.13電泳成套設(shè)備

5.14凝膠成像系統(tǒng)

5.15超純水儀

5.16恒溫培養(yǎng)箱：溫度精確1℃

5.17瓶口移液器：5mL～50mL

5.1848孔板重復(fù)鋪板器

6培養(yǎng)基的確定

6.1營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）符合附錄A.1的規(guī)定。

6.2營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂，符合附錄A.2的規(guī)定。

6.3Mueller-Hinton瓊脂（MH肉湯）培養(yǎng)基，符合附錄A.3的規(guī)定。

6.4MH肉湯培養(yǎng)基（Mueller-HintonBroth，MH（B）），符合附錄A.4的規(guī)定。

6.5BP（Baird-Parker）瓊脂，符合附錄A.5的規(guī)定。

6.6亞硫酸鉍卵黃增菌液，符合附錄A.6的規(guī)定。

6.7瓊脂粉，符合附錄A.7的規(guī)定。

6.8麥康凱培養(yǎng)基，符合附錄A.8的規(guī)定。

6.9氯化鎂孔雀綠增菌液（MM），符合附錄A.9的規(guī)定。

6.10SS（SalmonellaShigellaAgar，SS）瓊脂，符合附錄A.10的規(guī)定。

6.11沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，符合附錄A.11的規(guī)定。

6.12BHI肉湯，符合附錄A.12的規(guī)定。

6.13胰酪胨大豆瓊脂（TSA），符合附錄A.13的規(guī)定。

7抗菌藥物的確定

7.1選擇獸醫(yī)臨床常規(guī)使用并報(bào)告的基本抗菌藥物，以及治療效果較好的抗菌藥物，結(jié)合

當(dāng)?shù)氐牟≡卣骱陀盟幰?guī)定、實(shí)驗(yàn)室條件等來(lái)確定，并且予以補(bǔ)充。

8菌株的選擇

8.1實(shí)驗(yàn)菌株

8.1.1主要分為質(zhì)控菌株和臨床分離的病原菌株。

8.2質(zhì)控菌株包括：

8.2.1大腸埃希氏菌（Escherichiacoli）ATCC25922；

8.2.2大腸埃希氏菌（Escherichiacoli）ATCC35218（僅用于β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合藥物的質(zhì)

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控）；

8.2.3金黃色葡萄球菌（Staphyfococcusaureus）ATCC29213；

8.2.4金黃色葡萄球菌（Staphyfococcusaureus）ATCC43300（僅用于耐甲氧西林/苯唑西林的

金黃色葡萄球菌測(cè)定）；

8.2.5糞腸球菌（Enterococcusfaecalis）ATCC29212；

8.3使用穩(wěn)定的質(zhì)控菌株，傳代不得超過(guò)5代。

8.4病原菌株：送檢的待測(cè)菌株在血平板上于37℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h～24h，選擇

符合被檢菌特性的細(xì)菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。

8.5當(dāng)病原菌出現(xiàn)耐藥性時(shí)，應(yīng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)；已確定為敏感的菌株，不必進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

9測(cè)定方法

9.1細(xì)菌的培養(yǎng)、分離和鑒定

9.1.1金黃色葡萄球菌的增菌培養(yǎng)、分離和鑒定按GB4789.10進(jìn)行。

9.1.2沙門氏菌的增菌培養(yǎng)、分離和鑒定按GB4789.4進(jìn)行。

9.1.3大腸埃希氏菌的增菌培養(yǎng)、分離和鑒定按GB/T4789.6進(jìn)行。

9.1.4腸球菌的增菌培養(yǎng)、分離和鑒定按DB51/T2083進(jìn)行。

9.1.5經(jīng)鑒定為金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸埃希氏菌和腸球菌的菌株移種到胰酪胨大

豆瓊脂（TSA）平板上，37℃±1℃培養(yǎng)16h～24h。若不能及時(shí)進(jìn)行耐藥性測(cè)定，應(yīng)置

0℃~4℃冰箱保存。耐藥性測(cè)定前傳代。

9.2瓊脂擴(kuò)散法試驗(yàn)

9.2.1抗菌藥物的制備和儲(chǔ)存稀釋

9.2.1抗菌藥物母液的制備和保存

9.2.1.1采用無(wú)菌試管稀釋抗菌藥物，試管口應(yīng)封閉，利用二倍稀釋法稀釋抗菌藥物，按照

附錄B操作。

9.2.1.2將制備好的試劑在0.22μm微孔濾膜除菌或高壓滅菌，儲(chǔ)備液置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

9.2.1.3阿莫西林/克拉維酸、慶大霉素、阿米卡星、氧氟沙星、氟苯尼考、四環(huán)素、克林霉

素、利福平、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、頭孢噻呋、氨芐西林、安普霉素、卡那霉素、

多黏菌素、氯霉素、紅霉素、米諾霉素、多西環(huán)素、利奈唑胺和萬(wàn)古霉素保存母液濃度為

5120μg/mL，-80℃冰箱備用；利用蒸餾水稀釋終濃度為320μg/mL，-20℃冰箱備用。

9.2.2抗菌藥物的稀釋

9.2.2.1選擇合適的抗菌藥物稀釋液進(jìn)行藥物稀釋，稀釋液需要量按照公式計(jì)算。公式如下：

稀釋液體積=抗菌藥物實(shí)際稱量×效價(jià)/抗菌藥物保存液濃度，按照附錄B操作。

9.3待測(cè)菌株的制備

9.3.1菌懸液制備

9.3.1.1將質(zhì)控菌株與待測(cè)菌株分別接種于MH瓊脂平板并置于37℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)

16h~24h，挑選1個(gè)~2個(gè)典型單菌落用無(wú)菌接種環(huán)接1環(huán)加到10mL生理鹽水，用比濁儀

將菌液調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠁挝唬ù藭r(shí)菌液濃度為108CFU/mL），再用滅菌MH肉湯將菌液稀釋

100倍至106CFU/mL備用。

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9.4檢測(cè)瓊脂平板制備

9.4.1高壓瓊脂培養(yǎng)基

9.4.1.1高壓滅菌MH瓊脂培養(yǎng)基，待冷卻到50℃～60℃，備用。

9.4.2抗菌藥物的稀釋

9.4.2.1取滅菌的90mm平板36個(gè)，用滅菌蒸餾水將藥物依次倍比稀釋成320μg/mL、160

μg/mL、80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625

μg/mL、0.3125μg/mL、0.15625μg/mL12個(gè)濃度梯度，每種濃度3個(gè)平行。藥液現(xiàn)用現(xiàn)配。

9.4.3制備含有抗菌藥物的平皿

9.4.3.1首先在12個(gè)滅菌平板內(nèi)平皿邊側(cè)依次標(biāo)記32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、

2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL、0.0625μg/mL、0.03125μg/mL、

0.015625μg/mL，用5mL移液器吸取1.5mL不同濃度梯度的藥液加至平皿內(nèi)。

9.4.3.2然后用瓶口移液器移取已經(jīng)冷卻至50℃～60℃的MH培養(yǎng)基13.5mL緩慢加入上述

加藥的平皿中輕輕搖勻（加入平皿中的瓊脂不可有小氣泡，如有小氣泡，用移液器將氣泡戳

破盡量轉(zhuǎn)移至平皿壁邊上），使平皿內(nèi)藥液終濃度依次為320μg/mL、160μg/mL、80μg/mL、

40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL、

0.15625μg/mL12個(gè)濃度梯度。

9.4.3.3待瓊脂自然冷卻后，蓋上平皿，加藥瓊脂平皿配制完成。

9.4.3.4同時(shí)需準(zhǔn)備1個(gè)無(wú)藥的MH瓊脂平板做陰性對(duì)照，確保整個(gè)實(shí)驗(yàn)是無(wú)菌操作。

9.4.3.5所有藥物平板應(yīng)保持表面干燥，不可有肉眼可見(jiàn)的水珠。

9.4.4菌液的制備

9.4.4.1將9.3.1制備的菌懸液混合均勻，按照下圖順序一個(gè)96孔培養(yǎng)板加28個(gè)菌樣，每個(gè)

孔加200uL菌液，陽(yáng)性對(duì)照選擇大腸桿菌（ATCC25922）或金黃色葡萄球菌（ATCC29213）

或腸球菌（ATCC29212），陰性對(duì)照只加200uLMH肉湯。

123456789101112

A樣品1樣品3樣品6樣品9樣品11樣品14樣品15樣品17樣品20樣品23樣品25樣品28

B樣品1樣品4樣品6樣品9樣品12樣品14樣品15樣品18樣品20樣品23樣品26樣品28

C樣品1樣品4樣品7樣品9樣品12陽(yáng)性對(duì)照樣品15樣品18樣品21樣品23樣品26陽(yáng)性對(duì)照

D樣品2樣品4樣品7樣品10樣品12陽(yáng)性對(duì)照樣品16樣品18樣品21樣品24樣品26陽(yáng)性對(duì)照

E樣品2樣品5樣品7樣品10樣品13陽(yáng)性對(duì)照樣品16樣品19樣品21樣品24樣品27陽(yáng)性對(duì)照

F樣品2樣品5樣品8樣品10樣品13陰性對(duì)照樣品16樣品19樣品22樣品24樣品27陰性對(duì)照

G樣品3樣品5樣品8樣品11樣品13陰性對(duì)照樣品17樣品19樣品22樣品25樣品27陰性對(duì)照

H樣品3樣品6樣品8樣品11樣品14陰性對(duì)照樣品17樣品20樣品22樣品25樣品28陰性對(duì)照

圖196孔培養(yǎng)板加樣圖

9.4.548孔板重復(fù)鋪板器鋪板

9.4.5.1用圖248孔板重復(fù)鋪板器按圖3瓊脂板菌液鋪板圖示鋪菌液。

9.4.5.248孔板鋪板器底座是直徑為3mm的48個(gè)圓柱體套管，套管長(zhǎng)3/4英寸，直徑0.125

英寸。

9.4.5.3所有套管都為圓形。確保鋪到藥物平板上的菌液量是相同的。

9.4.5.4質(zhì)控菌株作為陽(yáng)性對(duì)照，空白MH肉湯作為陰性對(duì)照。

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9.4.5.5鋪板是從標(biāo)記為0.015625μg/mL、0.03125μg/mL、0.0625μg/mL、0.125μg/mL、0.25

μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL的低濃度

到高濃度的平板順序鋪菌液，鋪板結(jié)束將平板正放15min～20min待菌液凝固后，倒置

37℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h～24h。

圖248孔板重復(fù)鋪板器圖圖3樣品菌液鋪滿瓊脂平板

10結(jié)果判定

10.1按CLSIM100-S212020[1]標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果如果在MIC判斷終點(diǎn)，金黃色葡萄球菌

ATCC29213和大腸埃希氏菌ATCC25922為質(zhì)控菌株和病原菌相應(yīng)的耐藥、中介、敏感值符

合附錄C的規(guī)定。

10.2藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果讀取時(shí)：平板應(yīng)置于黑色不反光的表面上，記錄MIC值，單個(gè)

小點(diǎn)狀菌落或接種物所致的輕微不清晰的菌落可忽略不計(jì)。

10.3如果在MIC值終點(diǎn)附近持續(xù)存在多個(gè)菌落，也就是有俗稱的跳孔現(xiàn)象：如若存在一

個(gè)跳孔現(xiàn)象，應(yīng)讀最高的MIC；多個(gè)跳孔時(shí)則不能報(bào)告結(jié)果，需重新做藥物敏感性試驗(yàn)。

10.4如果出現(xiàn)菌液低濃度不生長(zhǎng)，高濃度生長(zhǎng)的現(xiàn)象，首先考慮鋪菌液的時(shí)候是否按照低

濃度到高濃度的順序制備，其次就是菌液的濃度是否調(diào)整至同一水平也就是0.5麥?zhǔn)蠞岫龋?/p>

調(diào)整這兩個(gè)方面的內(nèi)容后，重新做藥物敏感性試驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)

[1]CLSI.PerformanceStandardsforAntimicrobialSusceptibilityTesting.30thed.CLSI

supplementM100.Wayne,PA:ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute;2020

T/CVMAXXXXX—2021

附錄A

（資料性）

相關(guān)試劑的配制

A.1營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NutrientBroth，NB）

A.1.1成分

名稱數(shù)量

蛋白胨5.0g

牛肉膏3g

氯化鈉5g

蒸餾水1000mL

A.1.2制備

將各成加入1000mL滅菌蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4，于高壓蒸

汽滅菌器中，121℃士1℃滅菌20min。

A.2營(yíng)養(yǎng)瓊脂

A.2.1成分

名稱數(shù)量

蛋白胨5.0g

牛肉膏3g

氯化鈉5g

瓊脂15g

蒸餾水1000mL

A.2.2制備

稱取本品33g，加熱溶解于1000mL蒸餾水中，分裝三角瓶，121℃高壓滅菌15min，

備用。

A.3Mueller-Hinton瓊脂（MH瓊脂）培養(yǎng)基

A.3.1成分

名稱數(shù)量

牛肉粉2.0g

可溶性淀粉1.5g

酸水解酪蛋白17.5g

瓊脂15g

蒸餾水1000mL

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A.3.2制備

準(zhǔn)確稱取牛肉粉2.0g，可溶性淀粉1.5g，酸水解酪蛋白17.5g，瓊脂15g，量取1000

mL蒸餾水，使用攪拌器攪拌使其完全溶解，使用pH酸度計(jì)測(cè)定pH值（pH要求7.2~7.6），

置于121℃，20min高壓滅菌。

A.4Mueller-Hinton肉湯（MH肉湯）培養(yǎng)基

A.4.1成分

名稱數(shù)量

牛肉粉2.0g

可溶性淀粉1.5g

酸水解酪蛋白17.5g

蒸餾水1000mL

A.4.2制備

精確稱取MH肉湯培養(yǎng)基粉末24g，純水完全溶解后，定容至1L，121℃高壓滅

菌20min備用。

A.5BP（Baird-Parker）瓊脂

A.5.1成分

名稱數(shù)量

胰蛋白胨10.0g

牛肉浸粉5g

酵母浸粉1g

丙酮酸鈉10g

甘氨酸12g

氯化理5g

瓊脂20g

蒸餾水1000mL

A.5.2制備

精確稱取本品63g，加熱溶解與950mL蒸餾水，分裝每瓶95mL，121℃高壓滅

15min。臨用前加熱熔化瓊脂，冷卻至50℃左右，與每95mL培養(yǎng)基中加入常溫解凍

的卵黃亞碲酸鉀增菌劑5mL搖勻后傾入無(wú)菌平皿備用。

A.6亞硫酸鉍卵黃增菌液

每95mLBaird-Parker瓊脂基礎(chǔ)添加1支亞硫酸鉍卵黃增菌液。

A.7瓊脂粉

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配制固體培養(yǎng)基時(shí)加入本品含量約為1.2%~15%配制半固體培養(yǎng)基時(shí)，加入本品含

量約為03%~0.6%。

A.8麥康凱培養(yǎng)基

A.8.1成分

名稱數(shù)量

蛋白胨20.0g

乳糖10g

牛膽鹽5g

氯化鈉5g

中性紅0.0075g

瓊脂12g

蒸餾水1000mL

A.8.2制備

稱取本品52.0g，加熱溶解于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15分鐘，備用。

A.9氯化鎂孔雀綠增菌液（MM）

A.9.1成分

名稱數(shù)量

蛋白胨4.5g

氯化鎂16.8g

氯化鈉7.2g

磷酸二氫鉀1.44g

孔雀綠0.036g

蒸餾水1000mL

A.9.2制備

稱取本品30g，加入蒸餾水1000mL，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，121℃

高壓滅菌15min。

A.10SS瓊脂

A.10.1成分

名稱數(shù)量

牛肉浸粉20.0g

月示胨10g

T/CVMAXXXXX—2021

乳糖5g

三號(hào)膽鹽5g

枸櫞酸鹽8.5g

硫代硫酸鈉8.5g

枸櫞酸鐵1g

中性紅0.025g

煌綠0.00033g

瓊脂17.0g

蒸餾水1000mL

A.10.2制備

稱取本品63.53g，溶解于1000mL蒸餾水中，加熱煮至沸，不必高壓蒸氣滅菌，冷至

45℃~50℃，倒成平板。

A.11沙門氏菌顯色培養(yǎng)基

A.11.1成分

名稱數(shù)量

特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)21.0g

顯色劑0.25g

瓊脂15g

蒸餾水200mL

A.11.2制備

稱取本品7.26g加入200mL蒸餾水，加入添加劑3mL，加熱煮沸溶解并不停攪拌，

加熱1min~2min。使用pH酸度計(jì)測(cè)定pH值（pH要求7.2~7.6），冷卻至45℃~50℃時(shí)，

傾入無(wú)菌平皿。

A.12BHI肉湯

A.12.1成分

名稱數(shù)量

牛腦浸粉4.0g

牛肉浸粉月示胨4.0g

蛋白胨5g

酪蛋白胨16g

葡萄糖2g

氯化鈉5g

磷酸氫二鈉2.5g

T/CVMAXXXXX—2021

瓊脂13.5g

蒸餾水1000mL

A.12.2制備

稱取本品52.0g，加熱攪拌溶解于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15分鐘，備

用。

A.13胰酪胨大豆瓊脂（TSA）

A.13.1成分

名稱數(shù)量

胰蛋白胨15g

大豆胨5g

氯化鈉5g

瓊脂15g

蒸餾水200mL

A.13.2制備

稱取本品40.0g，加熱攪拌溶解于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15分鐘，備

用。

T/CVMAXXXXX—2021

附錄B

（資料性）

抗菌藥物母液制備

母液濃度終濃度

抗菌藥物溶劑

μg/mLμg/mL

阿莫西林/

pH6.0磷酸鹽緩沖液5120320

克拉維酸

慶大霉素蒸餾水5120320

阿米卡星蒸餾水5120320

1/2的水，最少量體積的1mol/L的NaOH溶解，用水

氧氟沙星5120320

添加至所需要的體積

氟苯尼考蒸餾水5120320

四環(huán)素蒸餾水5120320

克林霉素蒸餾水5120320

利福平甲醇5120320

環(huán)丙沙星蒸餾水5120320

加入5ml蒸餾水，之后滴加1ml/L的NaOH直到溶

諾氟沙星5120320

解，再用滅菌蒸餾水溶解并定容

加入5ml蒸餾水，之后滴加1ml/L的NaOH直到溶

恩諾沙星5120320

解，再用滅菌蒸餾水溶解并定容

頭孢噻呋pH6.0的0.1mol/L磷酸緩鹽沖液進(jìn)行溶解并定容5120320

pH8.0的0.1mol/L磷酸緩鹽沖液助溶，再用pH6.0

氨芐西林5120320

的0.1mol/L磷酸緩鹽沖液進(jìn)行溶解并定容

安普霉素使用滅菌蒸餾水溶解并定容5120320

卡那霉素使用滅菌蒸餾水溶解并定容5120320

多黏菌素使用滅菌蒸餾水溶解并定容5120320

氯霉素95%乙醇溶解并定容5120320

紅霉素95%乙醇溶解，蒸餾水定容5120320

多西環(huán)素蒸餾水溶解并定容5120320

米諾環(huán)素蒸餾水溶解并定容5120320

利奈唑胺95%乙醇溶解，蒸餾水定容5120320

萬(wàn)古霉素蒸餾水溶解并定容5120320

T/CVMAXXXXX—2021

附錄C

（資料性）

質(zhì)控菌株測(cè)試范圍和判定標(biāo)準(zhǔn)

類別藥物名稱ATCC29212ATCC29213ATCC25922

（μg/mL）（μg/mL）（μg/mL）

青霉素類氨芐西林0.5-20.5-22-8

耐酶青霉素類苯唑西林0.015-0.060.12-0.52-8

頭孢烯類頭孢噻呋--0.25-1

苯丙醇類氯霉素4-162-162-8

酰胺醇類氟苯尼考2-82-82-8

大環(huán)內(nèi)酯類紅霉素1-40.25-1-

阿米卡星64-2561-40.5-4

氨基糖苷類

慶大霉素-0.12-10.25-1

四環(huán)素8-320.12-10.5-2

四環(huán)素類多西環(huán)素2-80.12-0.50.5-2

米諾環(huán)素1-40.06-0.50.25-1

噁唑烷酮類利奈唑胺1-41-40.5-2

糖肽類萬(wàn)古霉素1-40.5-24-8

β-內(nèi)酰胺類阿莫西林-0.12-0.52-8

安普霉素--2-16

氨基糖苷類

卡那霉素16-64-1-4

多肽類多黏菌素--0.25-2

安沙霉素類利福平0.5-40.004-0.016-

林可霉素類克林霉素-0.06-0.25-

環(huán)丙沙星0.25-20.12-0.50.004-0.015

喹諾酮類諾氟沙星2-8-0.004-0.015

恩諾沙星-0.03-0.1250.008-0.03

注：氟苯尼考和阿莫西林/克拉維酸屬于動(dòng)物專用獸藥，參考地方標(biāo)準(zhǔn)DB31/T1160畜禽養(yǎng)殖過(guò)程細(xì)菌

耐藥性監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范里的折點(diǎn)數(shù)值；“-”代表無(wú)。

試驗(yàn)菌株測(cè)試范圍和判定標(biāo)準(zhǔn)（μg/mL）

藥物腸球菌MIC金葡MIC大腸MIC沙門MIC

類別

名稱SIRSIRSIRSIR

青霉氨芐

≤8-≥16≤0.250.25-0.5≥0.5≤1632≥64≤816≥32

素類西林

耐酶青苯唑

≤816≥32≤16-≥32≤816≥32------

霉素類西林

頭孢頭孢

≤816≥32-16≥32≤816≥32≤816≥32

烯類噻呋

苯丙氯霉

≤24≥8-16≥32------------

醇類素

酰胺氟苯

≤0.51-4≥8≤48≥16≤16-≥32≤16-≥32

醇類尼考

大環(huán)內(nèi)紅霉

≤1632≥64≤0.50.5-8≥8------------

酯類素

阿米

≤48≥16≤1632≥64≤1632≥64≤1632≥64

氨基糖卡星

苷類慶大

≤48≥16≤48≥64≤4-≥8≤4-≥8

霉素

四環(huán)

≤48≥16≤48≥16≤48≥16≤48≥16

素

四環(huán)多西

≤24≥8-8≥16≤48≥16------

素類環(huán)素

米諾

≤48-16≥32-8≥16≤48-≥16------

環(huán)素

噁唑烷利奈

≤12≥4≤4--≤12≥4------

酮類唑胺

萬(wàn)古

糖肽類≤1632≥64≤2--≤1632≥64------

霉素

環(huán)丙

≤24≥8≤11-4≥4≤12≥4≤12≥4

沙星

諾氟

-8≥16------≤24≥8≤24≥8

喹諾沙星

酮類恩諾

------------≤0.250.25-1≥2≤0.250.5-1≥2

沙星

氧氟

≤816≥32≤0.51≥2≤0.120.25-1≥2≤816≥32

沙星

β-內(nèi)酰阿莫

≤48≥16≤4--≥8≤48≥16≤816≥32

胺類西林

安普

≤16-≥32---≤1632≥64≤16-≥32

氨基糖霉素

苷類卡那

≤1632≥64------≤1632≥64

霉素

T/CVMAXXXXX—2021

多黏

多肽類≤24≥8---≤24≥8≤24≥8

菌

安沙霉利福

---124---------

素類平

林可霉克林

---≤0.51-2≥4------------

素類霉素

注：“-”表示：無(wú)；“--”表示：未查找到相關(guān)折點(diǎn)值。

T/CVMAXXXXX—2021

前言

本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》

的規(guī)定起草。

本文件由中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)提出并歸口。

本文件起草單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院、新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院

本文件主要起草人：夏利寧、蔡建星、軒慧勇、王蘋蘋、郝智慧、胡龍飛

T/CVMAXXXXX—2021

動(dòng)物及其制品中細(xì)菌耐藥性的測(cè)定瓊脂擴(kuò)散法

1范圍

本文件規(guī)定了動(dòng)物及其制品中細(xì)菌耐藥性的測(cè)定瓊脂擴(kuò)散法的術(shù)語(yǔ)和定義、原理、試劑

或耗材、抗菌藥物的確定、菌株的選擇、抗菌藥物瓊脂擴(kuò)散法試驗(yàn)、結(jié)果判定的要求。

本文件適用于動(dòng)物及其制品中分離的葡萄球菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌和腸球菌等常

見(jiàn)細(xì)菌耐藥性的檢測(cè)，其他來(lái)源細(xì)菌的耐藥性測(cè)定可參考本方法執(zhí)行。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期

的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括

所有的修改單）適用于本文件。

GB4789.2食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB4789.10食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)

GB4789.4食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品韋微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)

GB/T4789.6食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)

DB51/T2083動(dòng)物源性腸球菌分離鑒定操作規(guī)程

3術(shù)語(yǔ)和定義

以下術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

最低抑菌濃度Minimalinhibitoryconcentration；MIC

在瓊脂或肉湯稀釋法藥物敏感性檢測(cè)試驗(yàn)中能抑制肉眼可見(jiàn)的微生物生長(zhǎng)的最低

抗菌藥物濃度。

3.2

瓊脂擴(kuò)散法AgarDiffusionMethod

將不同劑量的抗菌藥物，分別加于高壓并冷至50℃～60℃的定量瓊脂培養(yǎng)基中，混勻，

傾注成無(wú)菌平板，即為含有藥物濃度遞減的培養(yǎng)基，接種測(cè)試菌于該培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后觀

察被檢菌生長(zhǎng)情況，最低藥物抑制細(xì)菌生長(zhǎng)者，即最小抑菌濃度（MIC）。

4試劑與材料

4.1生理鹽水，7.5%

4.2水，符合GB/T6682二級(jí)水的要求

4.3甲醇

4.4NaOH

4.5磷酸鹽緩沖液，pH6.0

5器材與耗材

5.1微量移液器：0.1μL~2.5μL，0.5μL~10μL，1μL~100μL，100μL~1000μL

T/CVMAXXXXX—2021

5.2電子天平

5.3自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器

5.4電熱恒溫干燥箱

5.5超凈工作臺(tái)

5.6八道移液器（0.5uL-10uL）：溫度精確1℃

5.7分析天平：感量為0.0001g和0.01g

5.8分光光度計(jì)