獸醫(yī)檢驗(yàn)練習(xí)題及答案一、臨床檢驗(yàn)基礎(chǔ)練習(xí)題1.某犬血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果：RBC3.2×1012/L（參考值5.5-8.5×1012/L），Hb80g/L（參考值120-180g/L），HCT25%（參考值37-55%），MCV78fl（參考值60-77fl），MCH25pg（參考值19-24pg），MCHC320g/L（參考值320-360g/L）。請(qǐng)分析該犬貧血類型及可能病因。2.貓尿液常規(guī)檢測(cè)中，鏡檢發(fā)現(xiàn)大量透明管型（>5個(gè)/HPF），同時(shí)尿蛋白（+++），尿比重1.010（參考值1.035-1.060）。結(jié)合檢測(cè)結(jié)果，推測(cè)可能的疾病并說明依據(jù)。3.豬糞便檢查采用飽和鹽水漂浮法，鏡檢發(fā)現(xiàn)圓形、雙層卵殼、內(nèi)含單個(gè)卵細(xì)胞的蟲卵，大小約80μm×60μm。該蟲卵最可能屬于哪種寄生蟲？簡(jiǎn)述飽和鹽水漂浮法的操作要點(diǎn)及適用蟲種。4.牛血液涂片經(jīng)瑞氏染色后，顯微鏡油鏡下觀察到中性粒細(xì)胞胞漿內(nèi)有大量桿狀、紫藍(lán)色顆粒，細(xì)胞核分葉不明顯（3葉以下）。請(qǐng)判斷該現(xiàn)象的名稱，并分析可能的病理意義。---答案及解析1.貧血類型為正細(xì)胞正色素性貧血（MCV、MCH、MCHC均在參考值范圍內(nèi)）。可能病因：急性失血（如外傷、內(nèi)臟出血）、溶血性貧血（如巴貝斯蟲感染、藥物性溶血）或骨髓造血功能暫時(shí)抑制（如感染早期）。需結(jié)合病史（是否有外傷史、蜱蟲接觸史）及其他指標(biāo)（網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、總膽紅素）進(jìn)一步確認(rèn)。2.可能疾病為慢性腎小球腎炎。依據(jù)：①透明管型大量出現(xiàn)（正常尿液偶見，>5個(gè)/HPF提示腎小管功能障礙）；②尿蛋白強(qiáng)陽性（腎小球?yàn)V過膜損傷導(dǎo)致大分子蛋白漏出）；③低比重尿（腎小管濃縮功能受損，無法重吸收水分）。需進(jìn)一步檢測(cè)血肌酐、尿素氮（BUN）評(píng)估腎功能。3.最可能為豬蛔蟲（Ascarissuum）卵。飽和鹽水漂浮法操作要點(diǎn)：①取5-10g糞便加10倍量飽和鹽水（NaCl溶液，比重1.20）充分?jǐn)噭颍虎谟勉~篩過濾至試管，補(bǔ)加飽和鹽水至液面略高于管口；③覆蓋載玻片靜置15-20分鐘；④輕輕提起載玻片，翻轉(zhuǎn)后鏡檢。適用于檢測(cè)比重小于飽和鹽水的蟲卵（如蛔蟲、鉤蟲、球蟲卵囊），不適用于吸蟲卵（比重大，需沉淀法）。4.該現(xiàn)象為“中毒性顆粒”（中性粒細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)的異常深染顆粒）。病理意義：提示嚴(yán)重感染（如敗血癥、化膿性炎癥）或內(nèi)毒素血癥，中性粒細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下胞漿內(nèi)嗜天青顆粒異常聚集。若同時(shí)出現(xiàn)核左移（桿狀核粒細(xì)胞比例>5%），則更支持嚴(yán)重細(xì)菌感染的診斷。---二、病原微生物檢驗(yàn)練習(xí)題1.某雞場(chǎng)爆發(fā)急性死亡病例，病雞表現(xiàn)呼吸困難、冠髯發(fā)紺。無菌采集肝臟組織進(jìn)行細(xì)菌分離，接種于血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24小時(shí)后觀察到圓形、光滑、邊緣整齊的菌落，周圍有β溶血環(huán)。挑取菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡下見革蘭氏陰性短桿菌。該菌最可能是？需進(jìn)一步做哪些鑒定試驗(yàn)？2.檢測(cè)犬瘟熱病毒時(shí)，若采集病犬眼鼻分泌物作為樣本，可選擇哪些實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法？簡(jiǎn)述每種方法的原理及注意事項(xiàng)。3.奶牛乳房炎病例中，采集乳汁進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)前需做哪些預(yù)處理？若培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)兩種以上優(yōu)勢(shì)菌（如葡萄球菌和鏈球菌），如何判斷是否為混合感染？4.豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV）檢測(cè)中，RT-PCR與抗原捕獲ELISA的主要區(qū)別是什么？哪種方法更適用于早期感染診斷？---答案及解析1.最可能為多殺性巴氏桿菌（Pasteurellamultocida）。進(jìn)一步鑒定試驗(yàn)：①氧化酶試驗(yàn)（陽性）；②麥康凱培養(yǎng)基生長情況（不生長，因該菌為非發(fā)酵菌）；③生化試驗(yàn)（觸酶陽性、吲哚陽性、尿素酶陰性）；④動(dòng)物回歸試驗(yàn)（小鼠腹腔接種后24小時(shí)內(nèi)死亡，可復(fù)分離到該菌）。2.可選方法：①免疫熒光試驗(yàn)（IFA）：用熒光標(biāo)記的抗犬瘟熱病毒抗體與樣本中的病毒抗原結(jié)合，熒光顯微鏡下觀察到亮綠色熒光為陽性。注意樣本需新鮮（避免病毒降解），涂片需薄而均勻。②RT-PCR：提取樣本RNA，通過反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增病毒特異性基因片段（如N蛋白基因）。注意避免RNA酶污染，需設(shè)置陽性/陰性對(duì)照。③快速試紙條（膠體金法）：利用雙抗體夾心法，樣本中的病毒抗原與試紙條上的金標(biāo)抗體結(jié)合，形成肉眼可見的條帶。注意檢測(cè)窗口期（感染后3-10天靈敏度最高，后期可能因病毒載量下降出現(xiàn)假陰性）。3.預(yù)處理步驟：①擠棄前3-5滴乳汁（減少外界污染）；②用75%酒精消毒乳頭，待干后采集5-10mL乳汁于無菌試管；③4℃保存（24小時(shí)內(nèi)送檢）或加入0.02%疊氮鈉防腐。判斷混合感染的依據(jù)：①兩種菌的分離數(shù)量均超過10?CFU/mL（乳房炎致病菌的臨界值）；②重復(fù)采樣培養(yǎng)結(jié)果一致；③結(jié)合臨床癥狀（如乳汁中有凝塊、乳房紅腫熱痛）排除污染菌（如表皮葡萄球菌，通常數(shù)量<103CFU/mL）。4.主要區(qū)別：①檢測(cè)目標(biāo)：RT-PCR檢測(cè)病毒核酸（RNA），抗原捕獲ELISA檢測(cè)病毒結(jié)構(gòu)蛋白（如N蛋白）；②靈敏度：RT-PCR可檢測(cè)低至102拷貝數(shù)的病毒，ELISA需病毒載量>10?拷貝數(shù)才能檢出；③操作時(shí)間：RT-PCR需2-4小時(shí)（含RNA提?。?，ELISA需1-2小時(shí)；④設(shè)備要求：RT-PCR需PCR儀和核酸提取儀，ELISA僅需酶標(biāo)儀。早期感染（病毒復(fù)制初期，載量低）更適合RT-PCR，因其靈敏度更高。---三、血清學(xué)檢驗(yàn)練習(xí)題1.牛布魯氏菌病診斷常用試管凝集試驗(yàn)（SAT），某牛血清1:50稀釋孔出現(xiàn)+++凝集（液體澄清，顆粒沉淀），1:100稀釋孔++凝集，1:200稀釋孔+凝集，1:400稀釋孔-（無凝集）。判定該牛是否為陽性？簡(jiǎn)述SAT的操作步驟及結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)。2.犬細(xì)小病毒（CPV）抗體檢測(cè)采用血凝抑制試驗(yàn)（HI），已知病毒液的血凝價(jià)為1:64（即能使紅細(xì)胞完全凝集的最高稀釋度）。待檢血清1:20稀釋孔完全抑制（無凝集），1:40稀釋孔部分抑制（有少量凝集），1:80稀釋孔完全凝集。計(jì)算該血清的HI效價(jià)，并說明其免疫狀態(tài)。3.豬偽狂犬?。≒RV）gE抗體ELISA檢測(cè)中，陰性對(duì)照OD值0.15，陽性對(duì)照OD值1.20，待檢樣本OD值0.85。計(jì)算S/P值并判斷結(jié)果（S/P=（樣本OD-陰性對(duì)照OD）/（陽性對(duì)照OD-陰性對(duì)照OD））。若檢測(cè)目的是區(qū)分野毒感染與疫苗免疫（疫苗株缺失gE基因），該結(jié)果有何意義？4.馬傳染性貧血（EIA）瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGID）中，中心孔加標(biāo)準(zhǔn)抗原，周圍孔分別加待檢血清、陽性血清、陰性血清。24小時(shí)后觀察到中心孔與待檢血清孔之間出現(xiàn)清晰沉淀線，與陽性血清孔沉淀線融合，與陰性血清孔無沉淀線。請(qǐng)解釋該結(jié)果。---答案及解析1.判定為陽性。SAT操作步驟：①待檢血清56℃滅活30分鐘；②取小試管6支，第1管加0.5mL生理鹽水，第2-5管各加0.5mL生理鹽水；③第1管加0.5mL血清，混勻后取0.5mL至第2管，依次倍比稀釋至第5管（稀釋度1:25、1:50、1:100、1:200、1:400）；④每管加0.5mL布魯氏菌抗原（濃度1:20），振蕩混勻，37℃孵育24小時(shí)；⑤觀察凝集程度（++++：完全凝集，液體澄清；+++：大部分凝集；++：中等凝集；+：少量凝集；-：無凝集）。結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：牛血清1:100稀釋孔++及以上凝集為陽性，1:50稀釋孔++及以上為可疑（需復(fù)檢）。本例中1:100孔++，符合陽性標(biāo)準(zhǔn)。2.HI效價(jià)為1:20。HI試驗(yàn)中，能完全抑制紅細(xì)胞凝集的血清最高稀釋度即為效價(jià)。本例中1:20孔完全抑制，1:40孔部分抑制（未完全抑制），故效價(jià)為1:20。免疫狀態(tài)：CPV母源抗體保護(hù)閾值為≥1:80，若為幼犬（<12周齡），該效價(jià)提示母源抗體不足，需接種疫苗；若為成年犬，可能未接種疫苗或免疫失敗，需加強(qiáng)免疫。3.S/P=（0.85-0.15）/（1.20-0.15）=0.70/1.05≈0.67。通常S/P≥0.4判為陽性，故該樣本gE抗體陽性。意義：PRV疫苗株缺失gE基因，感染野毒后動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生gE抗體，而疫苗免疫動(dòng)物無gE抗體。因此，該結(jié)果提示該豬感染過野毒（非單純疫苗免疫）。4.結(jié)果解釋：待檢血清與標(biāo)準(zhǔn)抗原之間的沉淀線與陽性血清沉淀線融合，說明兩者含有相同抗原（EIA病毒抗體），且待檢血清為陽性。陰性血清無沉淀線，排除非特異性反應(yīng)。該結(jié)果確認(rèn)待檢馬感染馬傳染性貧血病毒。---四、分子生物學(xué)檢驗(yàn)練習(xí)題1.設(shè)計(jì)豬瘟病毒（CSFV）RT-PCR檢測(cè)引物時(shí)，應(yīng)選擇病毒的哪個(gè)基因區(qū)域？簡(jiǎn)述引物設(shè)計(jì)的基本原則（至少5條）。若PCR擴(kuò)增后電泳出現(xiàn)非特異性條帶，可能的原因有哪些？2.熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)犬冠狀病毒（CCV）時(shí)，采用TaqMan探針法。已知標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.32，擴(kuò)增效率是多少？若樣本Ct值為25，標(biāo)準(zhǔn)品Ct=20時(shí)拷貝數(shù)為10?，計(jì)算樣本的病毒拷貝數(shù)。3.某實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行禽流感病毒（AIV）核酸檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增曲線（Ct=35），可能的污染來源有哪些？如何避免？4.牛結(jié)核分枝桿菌（M.bovis）的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)中，內(nèi)參基因（如β-actin）的作用是什么？若樣本內(nèi)參基因Ct值>30，可能的原因是什么？---答案及解析1.應(yīng)選擇保守的5’非編碼區(qū)（5’UTR）或E2基因（抗原決定簇區(qū)域，特異性高）。引物設(shè)計(jì)原則：①長度18-25bp（避免過短導(dǎo)致非特異性結(jié)合）；②GC含量40-60%（避免過高導(dǎo)致引物二聚體）；③退火溫度（Tm）55-65℃（上下游引物Tm差≤2℃）；④避免3’端互補(bǔ)（防止引物二聚體）；⑤引物與模板特異性匹配（通過BLAST比對(duì)排除同源序列）。非特異性條帶的可能原因：①引物設(shè)計(jì)不當(dāng)（存在錯(cuò)配）；②退火溫度過低（允許非特異性結(jié)合）；③模板濃度過高（增加非特異性擴(kuò)增）；④Taq酶量過多（擴(kuò)增效率過強(qiáng)）；⑤污染（如基因組DNA污染）。2.擴(kuò)增效率（E）=10^(-1/斜率)-1=10^(-1/-3.32)-1≈10^0.301-1≈2-1=1（即100%）。樣本拷貝數(shù)=標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)×2^(標(biāo)準(zhǔn)品Ct-樣本Ct)=10?×2^(20-25)=10?×2^(-5)=10?×1/32≈3125拷貝/mL。3.污染來源：①氣溶膠污染（PCR產(chǎn)物揮發(fā)形成的微滴殘留于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境）；②試劑污染（引物、dNTP、水等被陽性模板污染）；③操作污染（移液器、離心管未徹底消毒）；④交叉污染（樣本間混合）。避免措施：①分區(qū)操作（試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)嚴(yán)格分隔）；②使用帶濾芯的移液器吸頭；③定期用紫外線照射實(shí)驗(yàn)室及設(shè)備；④設(shè)置空白對(duì)照（無模板反應(yīng)管）監(jiān)測(cè)污染；⑤使用UNG酶（尿嘧啶-N-糖基化酶）降解前次PCR產(chǎn)物中的dUTP（需在引物合成時(shí)用dUTP代替dTTP）。4.內(nèi)參基因的作用：①監(jiān)測(cè)樣本核酸提取效率（若內(nèi)參Ct值異常，說明提取失敗或樣本降解）；②校正不同樣本間的加樣誤差（通過ΔCt法標(biāo)準(zhǔn)化目標(biāo)基因表達(dá)量）。樣本內(nèi)參Ct值>30的可能原因：①樣本核酸降解（如保存不當(dāng)、反復(fù)凍融）；②提取過程中核酸丟失（裂解不充分、吸附柱結(jié)合效率低）；③內(nèi)參引物失效（降解或設(shè)計(jì)錯(cuò)誤）；④樣本中細(xì)胞數(shù)量極少（如血漿樣本白細(xì)胞不足）。---五、綜合案例分析題某寵物醫(yī)院接診1只3月齡未免疫柯基犬，主訴：嘔吐3天，腹瀉2天（黃色稀便帶血），精神沉郁，食欲廢絕。體格檢查：體溫39.8℃（正常38.5-39.2℃），心率120次/分（正常70-120次/分），脫水程度約8%（皮膚彈性差，眼窩凹陷）。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果：-血常規(guī)：WBC2.1×10?/L（參考值6-17×10?/L），中性粒細(xì)胞比例45%（參考值60-77%），淋巴細(xì)胞比例50%（參考值12-30%），PLT80×10?/L（參考值200-500×10?/L）。-糞便快速檢測(cè)試紙條（CPV抗原）：陽性（T線顯色）。-血生化：BUN15mmol/L（參考值5-10mmol/L），CRE180μmol/L（參考值60-120μmol/L）。問題：1.結(jié)合臨床癥狀與檢測(cè)結(jié)果，最可能的診斷是什么？需與哪些疾病鑒別？2.為進(jìn)一步確認(rèn)診斷，應(yīng)補(bǔ)充哪些實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)？簡(jiǎn)述各檢測(cè)的目的。3.分析血常規(guī)中白細(xì)胞、血小板降低的可能機(jī)制。4.血生化指標(biāo)異常提示何種并發(fā)癥？需采取哪些治療措施？---答案及解析1.最可能診斷：犬細(xì)小病毒?。ǔ鲅阅c炎型）。需鑒別疾?。孩偃跔畈《靖腥荆ǜ篂a但嘔吐較輕，白細(xì)胞多正常）；②沙門氏菌感染（糞便帶黏液，白細(xì)胞升高，細(xì)菌培養(yǎng)可鑒別）；③腸套疊（腹部可觸及臘腸樣包塊，X線或B超可見腸管重疊）；④急性胰腺炎（嘔吐劇烈，血淀粉酶升高）。2.補(bǔ)充檢測(cè)：①RT-PCR檢測(cè)CPV核酸（確認(rèn)試紙條結(jié)果，排除假陽性）；②糞便常規(guī)鏡檢（觀察是否有寄生蟲卵，排除球蟲?。?；③血?dú)夥治觯ㄔu(píng)估酸堿平衡，脫水導(dǎo)致代謝性酸中毒）；④電解質(zhì)檢測(cè)（檢測(cè)K?、Na?水平，腹瀉易導(dǎo)致低血鉀）。3.白細(xì)胞降低機(jī)制：CPV主要攻擊快速分裂的細(xì)胞（如腸上皮細(xì)胞、骨髓造血干細(xì)胞），抑制骨髓中性粒細(xì)胞生成，導(dǎo)