EvaluationOnly.CreatedwithAspose.PDF.Copyright2002-2025AsposePtyLtd.團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/CIFST029—2025PMA-qPcR法Examinationofmicrobialfoodculture—DetectionofLacticaseibacillusparacaseiPMA-qPCRmethod2025-04-11發(fā)布2025-04-11實(shí)施EvaluationOnly.CreatedwithAspose.PDF.Copyright2002-2025AsposePtyLtd.ⅠT/CIFST029—2025本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分:標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)則起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由中國(guó)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)提出并歸口。本文件起草單位:中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司、國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心、湯臣倍健股份有限公司、發(fā)酵行業(yè)生產(chǎn)力促進(jìn)中心、內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團(tuán))股份有限公司、上海上藥信誼微生態(tài)科技有限公司、深圳保時(shí)健生物工程有限公司。1T/CIFST029—2025食品用菌種檢驗(yàn)副干酪乳酪桿菌檢驗(yàn)PMA-qPCR法1范圍本文件規(guī)定了食品中副干酪乳酪桿菌(Lacticaseibacillusparacasei)的PMA-qPCR檢驗(yàn)方法。本文件適用于食品原料和固體飲料中副干酪乳酪桿菌的活菌定量檢驗(yàn)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB4789.35—2023食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)3術(shù)語(yǔ)、定義和縮略語(yǔ)3.1術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1.1實(shí)時(shí)熒光定量PCRquantitativereal-timepolymerasechainreaction在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。3.1.2Ct值cyclethresholdvalue每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。3.2縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。CFU:菌落形成單位(colonyformingunit)DNA:脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)LED:發(fā)光二極管(lightemittingdiode)McF:麥?zhǔn)蠞岫葐挝?McFarland)OD:光密度(opticaldensity)PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction)PMA:疊氮溴化丙錠(propidiummonoazide)qPCR:實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitativereal-timepolymerasechainreaction)EvaluationOnly.CreatedwithAspose.PDF.Copyright2002-2025AsposePtyLtd.2T/CIFST029—2025ROX:一種熒光染料(carboxy-X-rhodmine)4原理PMA是一種具有DNA高親和力的光反應(yīng)染料,在強(qiáng)可見(jiàn)光下可與待測(cè)樣本中死菌或者游離雙鏈DNA形成共價(jià)連接,從而阻止死菌或者游離DNA的后續(xù)PCR擴(kuò)增。樣品經(jīng)PMA染料處理、DNA提取后,采用副干酪乳酪桿菌特異性引物進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整的活菌菌體DNA在qPCR擴(kuò)增反應(yīng)中能夠產(chǎn)生熒光信號(hào)。當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí),可被實(shí)時(shí)檢測(cè)并生成Ct值,將Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中,計(jì)算獲得樣品中副干酪乳酪桿菌的活菌數(shù)量。5儀器設(shè)備5.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。5.2高速臺(tái)式冷凍離心機(jī):0~20000r/min。5.3酶標(biāo)儀。5.4麥?zhǔn)媳葷醿x。5.5恒溫培養(yǎng)箱:36℃±1℃。5.6生物安全柜或超凈工作臺(tái)。5.7冰箱:2℃~8℃、-30℃~-20℃。5.8渦旋振蕩儀。5.9LED光解儀:最大功率60W,頻率50Hz~60Hz,LED輸出波長(zhǎng)465nm~475nm。5.10珠式樣品研磨器:速度0.8m/s~8m/s。5.11拍打式均質(zhì)器。5.12高壓滅菌鍋。5.13天平:感量0.01g。5.14微量可調(diào)移液器及配套吸頭:0.5μL~10μL、10μL~100μL、100μL~1000μL。6試劑或材料除特別說(shuō)明外,僅使用分析純或生化試劑,實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水。6.1無(wú)菌均質(zhì)袋。6.2無(wú)菌離心管:1.5mL。6.3無(wú)菌玻璃珠:粒徑0.1mm。6.4無(wú)菌研磨管:2mL。6.5熒光定量PCR8連排管或96孔板。6.696孔細(xì)胞培養(yǎng)板。6.7麥?zhǔn)媳葷峁堋?.8MRS(ManRogosaSharpe)瓊脂培養(yǎng)基:見(jiàn)GB4789.35—2023附錄A中A.2。6.9PMA溶液:濃度20mmol/L。6.10無(wú)菌超純水。6.110.85%無(wú)菌生理鹽水:見(jiàn)GB4789.35—2023附錄A中A.8。6.12實(shí)時(shí)熒光定量PCR混合試劑。6.13ROX參比染料(50×)。EvaluationOnly.CreatedwithAspose.PDF.Copyright2002-2025AsposePtyLtd.3T/CIFST029—20256.14陽(yáng)性對(duì)照:副干酪乳酪桿菌CICC6263T或等效菌株的DNA,或擴(kuò)增片段的陽(yáng)性克隆分子DNA。6.15陰性對(duì)照:非副干酪乳酪桿菌的DNA,如植物乳植桿菌(Lactiplantibacillusplantarum)CICC6009的DNA。7檢驗(yàn)程序副干酪乳酪桿菌PMA-qPCR法檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖1。養(yǎng)方法,檢測(cè)活圖1副干酪乳酪桿菌PMA-qPCR法檢驗(yàn)程序8檢驗(yàn)步驟8.1樣品制備及前處理8.1.1按照GB4789.35—2023中6.1規(guī)定的方法將待檢測(cè)樣品制備成1∶10的樣品勻液。8.1.2采用微量可調(diào)移液器,以無(wú)菌操作吸取8.1.1制備的1∶10樣品勻液200μL注入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,利用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品OD620值。將1∶10樣品勻液調(diào)整至OD620值為0.3~0.5時(shí),總菌體數(shù)量約為108CFU/mL?；蛘咭詿o(wú)菌操作吸取8.1.1制備的1∶10樣品勻液3mL注入麥?zhǔn)媳葷峁苤?利用麥?zhǔn)媳葷醿x將樣品勻液調(diào)整至McF值為1.0~3.0,總菌體數(shù)量約為108CFU/mL。8.1.3吸取108CFU/mL樣品勻液500μL,注于1.5mL無(wú)菌離心管中。8.2樣品PMA處理8.2.1在避光條件下,以無(wú)菌操作吸取PMA溶液1.25μL,注于8.1.3的無(wú)菌離心管中,顛倒混勻至少10次,制成PMA終濃度為50μmol/L的樣品溶液。8.2.2將樣品溶液置于暗處,室溫孵育5min,每隔1min顛倒混勻一次。EvaluationOnly.CreatedwithAspose.PDF.Copyright2002-2025AsposePtyLtd.4T/CIFST029—20258.2.3將樣品溶液置于LED光解儀內(nèi),曝光照射15min,曝光結(jié)束后于室溫下12000r/min離心15min,棄上清液。8.3樣品DNA模板制備8.3.1吸取無(wú)菌超純水200μL,注于8.2.3的離心管中,反復(fù)吹吸使其混勻。8.3.2吸取8.3.1離心管中的全部菌液,注于裝有0.25g無(wú)菌玻璃珠的2mL無(wú)菌研磨管中。8.3.3將無(wú)菌研磨管置于珠式樣品研磨器中,以6m/s破碎速度破碎10s~15s。于室溫下12000r/min離心15min,獲得DNA粗提液。取50μL上清液,注于1.5mL無(wú)菌離心管中。將提取后的DNA模板置于2℃~8℃立即使用,否則應(yīng)于-20℃以下保存,并于1周內(nèi)使用。8.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增8.4.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系總體積為20μL,其中含:實(shí)時(shí)熒光定量PCR混合試劑(2×)10μL、上下游引物(10μmol/L)各0.4μL、ROX參比染料0.08μL、DNA模板2μL、無(wú)菌超純水7.12μL。每個(gè)反應(yīng)體系應(yīng)設(shè)置至少3個(gè)平行反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)特異性引物序列分別為,上游引物L(fēng)PA-F:5'-ACGCTGGCATCAATAAGGAATT-3',下游引物L(fēng)PA-R:5'-CATCGCTCAGGTCTACATCCA-3',目標(biāo)基因產(chǎn)物約為180bp。注:反應(yīng)體系中各試劑的量根據(jù)不同型號(hào)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀或不同的反應(yīng)總體積作適當(dāng)調(diào)整。8.4.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序?qū)崟r(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)?95℃/30s;95℃/5s,60℃/30s(收集熒光信號(hào)),進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。注:反應(yīng)程序根據(jù)不同型號(hào)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀和所選PCR擴(kuò)增體系不同作適當(dāng)調(diào)整。8.4.3實(shí)驗(yàn)對(duì)照實(shí)驗(yàn)設(shè)立以下對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照:副干酪乳酪桿菌CICC6263T或等效菌株的DNA,或擴(kuò)增片段的陽(yáng)性克隆分子DNA。陰性對(duì)照:非副干酪乳酪桿菌的DNA,如植物乳植桿菌CICC6009的DNA?？瞻讓?duì)照:無(wú)菌超純水。8.5標(biāo)準(zhǔn)曲線8.5.1通用要求制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)需設(shè)置至少5個(gè)濃度點(diǎn),且設(shè)置的最低濃度點(diǎn)宜盡量接近該擴(kuò)增目標(biāo)的定量下限。標(biāo)準(zhǔn)曲線上的每個(gè)濃度應(yīng)進(jìn)行至少3個(gè)平行qPCR檢測(cè)。8.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備8.5.2.1將副干酪乳酪桿菌CICC6263T或從待測(cè)樣品中分離出的目標(biāo)副干酪乳酪桿菌接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基中,于36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h,獲得純培養(yǎng)物。8.5.2.2用無(wú)菌接種環(huán)挑取適量菌體于無(wú)菌生理鹽水中,充分振蕩混勻。8.5.2.3參考8.1.2,用無(wú)菌生理鹽水將8.5.2.2中菌液調(diào)整至菌體濃度為108CFU/mL。根據(jù)GB4789.35—2023中乳桿菌的培養(yǎng)方法,檢測(cè)活菌總數(shù)(CFU/mL)。8.5.2.4按8.2處理8.5.2.3制備的樣品,按8.3提取樣品基因組DNA,利用無(wú)菌超純水對(duì)DNA溶液進(jìn)行10倍梯度稀釋。8.5.2.5利用建立的qPCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序,測(cè)定每個(gè)稀釋度DNA對(duì)應(yīng)的Ct值,根據(jù)樣品活菌總數(shù)對(duì)數(shù)值(lgCFU/mL)和擴(kuò)增Ct值的線性關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以活菌總數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),以Ct值為縱坐標(biāo)作圖,獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。EvaluationOnly.CreatedwithAspose.PDF.Copyright2002-2025AsposePtyLtd.5T/CIFST029—20259結(jié)果分析與表述9.1質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)下述指標(biāo)有一項(xiàng)不符合者,需重新進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增:空白對(duì)照:Ct值>30;陰性對(duì)照:Ct值>30;陽(yáng)性對(duì)照:Ct值<25。被檢驗(yàn)樣品Ct值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定范圍內(nèi),如不在標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定范圍內(nèi),則需對(duì)樣品DNA濃度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整后重新進(jìn)行檢測(cè)。9.2結(jié)果計(jì)算當(dāng)樣品Ct值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi),按式(1)計(jì)算。