《醇脫氫酶活力的測(cè)定分光光度法》中國(guó)產(chǎn)學(xué)研

合作促進(jìn)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)編制說(shuō)明

一、工作簡(jiǎn)況

（一）任務(wù)來(lái)源

醇脫氫酶（ADH）（EC1.1.1.X，X=1或2）是一類(lèi)重要的氧化還

原酶，催化醇和醛/酮的相互轉(zhuǎn)化。它們廣泛分布于各種生物當(dāng)中，對(duì)

維持生物的正常生理功能有著重要作用。絕大多數(shù)的醇脫氫酶都依賴(lài)

于尼克酰胺輔酶，即尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）或尼克酰胺

腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）。醇脫氫酶的催化需要輔酶的參與才

能完成。醇脫氫酶的最重要的用途之一是生產(chǎn)手性醇，而手性醇是化

學(xué)及藥物工業(yè)中最重要的基礎(chǔ)原料之一，常用于藥物、液晶、香料等

高附加值產(chǎn)品的生產(chǎn)。利用醇脫氫酶生產(chǎn)手性醇具有高度的化學(xué)、區(qū)

位和立體選擇性，反應(yīng)條件溫和，催化過(guò)程環(huán)境友好等一系列化學(xué)法

很難比擬的優(yōu)勢(shì)。

醇脫氫酶的酶活力是其質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。鑒于目前我國(guó)并無(wú)

統(tǒng)一的醇脫氫酶活力測(cè)定的方法標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品的實(shí)際酶活力和包裝標(biāo)識(shí)

的酶活力是否一致還缺乏相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行規(guī)范約束和驗(yàn)證，因此研制

醇脫氫酶活力的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)將為醇脫氫酶的生產(chǎn)、流通及監(jiān)管提供依據(jù)，

促進(jìn)我國(guó)醇脫氫酶相關(guān)的化學(xué)工業(yè)的健康發(fā)展，具有非常重要的現(xiàn)實(shí)

意義。根據(jù)行業(yè)的現(xiàn)實(shí)需求，中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院于2024年3月提出《醇

脫氫酶活力的測(cè)定分光光度法》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃，并牽頭承擔(dān)標(biāo)準(zhǔn)起

草任務(wù)。

2024年5月，經(jīng)中國(guó)產(chǎn)學(xué)研合作促進(jìn)會(huì)組織專(zhuān)家通過(guò)批準(zhǔn)立項(xiàng)，

立項(xiàng)名稱(chēng)為《醇脫氫酶活力的測(cè)定分光光度法》。

（二）標(biāo)準(zhǔn)的起草單位及起草人

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：

（三）主要工作過(guò)程

1.預(yù)階段

2024年3月至2024年5月標(biāo)準(zhǔn)起草單位組織相關(guān)技術(shù)人員對(duì)《醇脫

氫酶活力的測(cè)定分光光度法》標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目進(jìn)行了預(yù)研，對(duì)醇脫氫酶的

活力測(cè)定條件進(jìn)行了摸索，初步確立了醇脫氫酶活力的測(cè)定方法。標(biāo)

準(zhǔn)起草組向中國(guó)產(chǎn)學(xué)研合作促進(jìn)會(huì)提交了標(biāo)準(zhǔn)建議書(shū)與標(biāo)準(zhǔn)草案，進(jìn)

行申報(bào)立項(xiàng)。

2.立項(xiàng)階段

2024年5月，中國(guó)產(chǎn)學(xué)研合作促進(jìn)會(huì)正式通過(guò)本團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的立項(xiàng)。

3.起草階段

針對(duì)該標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目，正式成立了標(biāo)準(zhǔn)起草工作小組，明確了任務(wù)要

求，安排了工作進(jìn)度，根據(jù)單位參與的人員的專(zhuān)業(yè)、技能、人數(shù)將任

務(wù)合理分配。依據(jù)GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)

化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》對(duì)標(biāo)準(zhǔn)草案進(jìn)一步完善的同時(shí)，開(kāi)展技術(shù)

指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證工作。

在此期間，通過(guò)線(xiàn)上和線(xiàn)下會(huì)議結(jié)合的形式開(kāi)展了3次工作會(huì)議。

會(huì)議就標(biāo)準(zhǔn)制定的相關(guān)問(wèn)題進(jìn)行了協(xié)商與研究，并對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的框架及內(nèi)

容進(jìn)行了認(rèn)真研究和討論。由此形成了最終的《醇脫氫酶活力的測(cè)定

分光光度法》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿和編制說(shuō)明。

二、確定標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容

（一）標(biāo)準(zhǔn)編制原則

堅(jiān)持嚴(yán)要求、適宜性與可操作性相結(jié)合的原則。嚴(yán)要求即標(biāo)準(zhǔn)的

編制嚴(yán)格遵循GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文

件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》及相關(guān)法規(guī)的要求進(jìn)行；適宜性既要充分考慮

到本行業(yè)的發(fā)展現(xiàn)狀與特點(diǎn)，又要有一個(gè)適宜的范圍與程度,從而提

高標(biāo)準(zhǔn)貫徹實(shí)施的可操作性。

（二）本標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容

1.主體內(nèi)容

本標(biāo)準(zhǔn)的主體內(nèi)容包括：范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語(yǔ)和定義、

原理、試劑、儀器設(shè)備、試樣制備和試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理以及精

密度。

2.范圍

本文件描述了測(cè)定醇脫氫酶活力的分光光度法。本文件適用于生

化試劑、工業(yè)酶制劑中依賴(lài)輔酶NAD+或NADP+的醇脫氫酶活力的測(cè)

定。

3.規(guī)范性引用文件

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法。

4.術(shù)語(yǔ)和定義

對(duì)醇脫氫酶活力單位進(jìn)行了定義，是在30℃、pH8.5的條件下，

每分鐘氧化1μmol乙醇生成乙醛所需的酶量為一個(gè)酶活力單位，單位

為U。

5.原理

醇脫氫酶催化底物乙醇的氧化生成乙醛，此過(guò)程依賴(lài)于尼克酰胺

輔酶NAD(P)+，NAD(P)+在340nm下無(wú)吸收，而NAD(P)H有吸收，其

-1-1

ε340=6.22mMcm，通過(guò)監(jiān)測(cè)340nm下吸光度的變化來(lái)測(cè)定NAD(P)H

的生成從而計(jì)算乙醇的消耗速率，計(jì)算酶活力。

6.醇脫氫酶活力測(cè)定方法的確立

由于酶活會(huì)受到反應(yīng)底物濃度、pH、緩沖液以及溫度的影響，因

此選取不同底物濃度、不同pH、不同緩沖液、不同溫度條件對(duì)醇脫氫

酶的活力進(jìn)行測(cè)定，以確定酶的活力測(cè)定的幾項(xiàng)重要參數(shù)。

6.1反應(yīng)底物濃度的確定

在反應(yīng)底物未飽和的條件下，酶活隨著底物濃度的增加而增加，

當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥揭欢ǔ潭群螅富畈辉僮兓蛘叱霈F(xiàn)底物抑制作用

而降低。醇脫氫酶在不同NAD+濃度下的活性如圖1所示。當(dāng)NAD+的

濃度高于0.4mM時(shí)，醇脫氫酶的活性不再隨著底物濃度的增加而增

加，已經(jīng)達(dá)到飽和。因此，應(yīng)選取高于0.4mM的底物濃度用于酶活的

測(cè)定，在本標(biāo)準(zhǔn)中選取1.0mM為酶活力的底物測(cè)定濃度。

5.0

4.0

)

-1

3.0

mg

·

-1

2.0

min

·

mole1.0

(

V

0.0

0.00.20.40.60.81.0

+

NAD(mM)

圖1醇脫氫酶的活性隨底物濃度的變化

6.2反應(yīng)pH的確定

反應(yīng)體系pH值對(duì)于醇脫氫酶等酶的活性影響很大，pH的改變能

影響酶活性中心上必須基團(tuán)的解離程度，同時(shí)也能影響底物的解離程

度，從而影響酶分子對(duì)底物分子的結(jié)合和催化。而當(dāng)pH過(guò)小（過(guò)酸）

或者過(guò)大（過(guò)堿）都有可能使蛋白變性而失活。

不同pH對(duì)醇脫氫酶活性的影響如圖2所示。該醇脫氫酶的最適pH

為8.5，而大多數(shù)醇脫氫酶的氧化反應(yīng)在pH8.5均具有活性，因此本標(biāo)

準(zhǔn)選擇pH8.5作為活力測(cè)定方法的pH。

Tris-HClbuffer

100Gly-NaOHbuffer

NaH2PO4-NaOHbuffer

80

(%)

60

40

RelativeactivityRelative20

0

7.08.09.010.011.012.0

pH

圖2醇脫氫酶在不同pH下的活性

6.3反應(yīng)緩沖液的確定

在相同pH的條件下，緩沖液的類(lèi)型也會(huì)對(duì)酶活產(chǎn)生影響。在pH

8.5的條件下，醇脫氫酶在不同緩沖液中的酶活力如圖3所示，其在三

羥基甲基氨基甲烷（Tris）-HCl緩沖液中具有最高的活力，因此選擇

該緩沖液作為醇脫氫酶活力測(cè)定的緩沖液。

120

100

80

60

40

Relativeactivity(%)activityRelative

20

0

waterphosphatepotassiumTEATris-HCl

Buffer

圖3.醇脫氫酶在不同緩沖液中的活性

6.4反應(yīng)溫度的確定

由于不同來(lái)源的醇脫氫酶的最適反應(yīng)溫度差異較大，考慮到方法

的實(shí)用性，本標(biāo)準(zhǔn)選取了大多數(shù)醇脫氫酶均具有活性的溫度作為活力

測(cè)定方法的溫度，即為30℃。

7.試劑

本標(biāo)準(zhǔn)給出了醇脫氫酶活力的測(cè)定方法中所使用的試劑的清單，

包括乙醇、NAD+、NADP+、Tris-HCl緩沖液以及醇脫氫酶的反應(yīng)底物

溶液。描述了試劑的主要特性，并給出了溶液的制備方法。

對(duì)于醇脫氫酶活力的測(cè)定，反應(yīng)底物溶液含100mmol/L乙醇、1

mmol/LNAD+或NADP+、以及50mmol/LTris，pH8.5。

8.儀器設(shè)備

本標(biāo)準(zhǔn)給出了醇脫氫酶活力的測(cè)定方法中所使用的儀器設(shè)備的

清單，并描述了主要特性。儀器設(shè)備包括分析天平、pH計(jì)、紫外-可

見(jiàn)分光光度計(jì)、石英比色皿以及移液器。

9.試樣制備和試驗(yàn)步驟

由于市售的醇脫氫酶包含液體樣品和固體樣品兩種形態(tài)，因此在

試樣酶液的制備中分為液體樣品待測(cè)酶液制備和固體樣品待測(cè)酶液

制備兩部分。

酶活的測(cè)定步驟為：準(zhǔn)確移取1000μL反應(yīng)底物溶液于石英比色

皿中，置于分光光度計(jì)的溫控比色皿槽內(nèi)，待溫度穩(wěn)定于30℃±1℃

后，迅速加入10μL待測(cè)酶液，加蓋顛倒混勻后立即放入分光光度計(jì)，

在340nm下掃描1min，保存吸光度曲線(xiàn)。通過(guò)線(xiàn)性回歸方程計(jì)算斜

率。

10.試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

分為液體樣品和固體樣品兩部分。

10.1液體樣品

試樣中醇脫氫酶活力按式（1）計(jì)算：

(?1+?2)×?×?

?1=························(1)

?×?2

式中：

X1——醇脫氫酶活力，單位為酶活力單位每毫升（U/mL）

V1——反應(yīng)底物溶液的體積，單位為微升（μL）；

V2——酶活力測(cè)定中加入酶液的體積，單位為微升（μL）；

k——酶活力測(cè)定中吸光度曲線(xiàn)斜率，單位為吸光度每分鐘

（Abs/min）；

D——稀釋倍數(shù)；

ε——吸光系數(shù)，單位為mM-1cm-1（取值為6.22mM-1cm-1）。

以三次平行測(cè)定結(jié)果的算數(shù)平均值作為最終的酶活力測(cè)定值，計(jì)

算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

10.2固體樣品

試樣中醇脫氫酶活力按式（2）計(jì)算：

(?1+?2)×??0

?2=×·······················(2)

?×?2m

式中：

X2——醇脫氫酶活力，單位為酶活力單位每克（U/g）

V1——反應(yīng)底物溶液的體積，單位為微升（μL）；

V2——酶活力測(cè)定中加入酶液的體積，單位為微升（μL）；

k——酶活力測(cè)定中吸光度曲線(xiàn)斜率，單位為吸光度每分鐘

（Abs/min）；

ε——吸光系數(shù)，單位為mM-1cm-1（取值為6.22mM-1cm-1）；

V0——溶解酶粉的液體體積，單位為毫升（mL）；

m——稱(chēng)取酶粉的質(zhì)量，質(zhì)量為克（g）。

以三次平行測(cè)定結(jié)果的算數(shù)平均值作為最終的酶活力測(cè)定值，計(jì)

算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

11.精密度

取同一樣品，相同條件下連續(xù)測(cè)定3次，結(jié)果如表1所示。醇脫氫

酶活力的RSD為4.46%，說(shuō)明重復(fù)性好。基于以上重復(fù)性結(jié)果，在標(biāo)

準(zhǔn)文本中規(guī)定了精密度為：在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果

的絕對(duì)差值不得超過(guò)算數(shù)平均值10%。

表1重復(fù)性條件下的酶活測(cè)定數(shù)據(jù)

酶酶活1酶活2酶活3平均酶活RSD

（U/mg）（U/mg）（U/mg）（U/mg）

醇脫氫酶4.54.94.64.74.46%

（三）本標(biāo)準(zhǔn)制定參考的主要依據(jù)

本標(biāo)準(zhǔn)制定過(guò)程中參考了以下相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)：GB/T33409-2016《β-半

乳糖苷酶活力檢測(cè)方法分光光度法》、GB/T34222-2017《核糖核酸

酶活力檢測(cè)方法》、GB/T35538-2017《工業(yè)酶制劑測(cè)定技術(shù)導(dǎo)則》。

三、主要試驗(yàn)（驗(yàn)證）的分析、綜述報(bào)告，技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證，預(yù)期

的經(jīng)濟(jì)效果；

（一）主要試驗(yàn)（驗(yàn)證）的分析

起草組依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)草案中擬定的醇脫氫酶活力檢測(cè)方法開(kāi)展了驗(yàn)

證實(shí)驗(yàn)。收集了市場(chǎng)上兩個(gè)不同廠(chǎng)家的醇脫氫酶，按照本標(biāo)準(zhǔn)的方法

對(duì)其酶活進(jìn)行了測(cè)定，測(cè)得的酶