ICS65.020.30

CCSB41

33

浙江省地方標準

DB33/T2492—2022

蝦肝腸胞蟲核酸檢測技術規(guī)范

TechnicalspecificationfornucleicaciddetectionofEnterocytozoon

hepatopenaei

2022-05-17發(fā)布2022-06-17實施

浙江省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB33/T2492—2022

前言

本標準按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請注意本標準的某些內(nèi)容可能涉及專利。本標準的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。

本標準由浙江省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并組織實施。

本標準由浙江省水產(chǎn)標準化技術委員會歸口。

本標準起草單位：浙江省水產(chǎn)技術推廣總站、浙江省休閑觀賞漁業(yè)行業(yè)協(xié)會、杭州市農(nóng)業(yè)技術推廣

中心。

本標準主要起草人：朱凝瑜、鄭曉葉、梁倩蓉、葉鍵、黃家慶、周凡、許婷、丁雪燕、吳洪喜。

I

DB33/T2492—2022

蝦肝腸胞蟲核酸檢測技術規(guī)范

1范圍

本標準規(guī)定了蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoonhepatopenaei，EHP）套式PCR檢測、熒光定量PCR檢測、

環(huán)介導等溫擴增（LAMP）檢測方法所需試劑和材料、儀器和設備，樣品采集、樣品前處理、操作步驟和

結果判定。

本標準適用于蝦類、餌料生物、養(yǎng)殖水體等樣品中蝦肝腸胞蟲的檢測和監(jiān)測，其他甲殼類和浮游動

物參照執(zhí)行。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本標準必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本標準；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

標準。

SC/T7103水生動物產(chǎn)地檢疫采樣技術規(guī)范

3術語和定義

本標準沒有需要界定的術語和定義。

4縮略語

下列縮略語適用于本標準

BstDNA聚合酶：嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶（BacillusstearothermophilusDNApolymerase）

bp：堿基對（basepair）

Ct值：反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（cyclethreshold）

DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）

EHP：蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoonheppenatoaei）

LAMP：環(huán)介導等溫擴增（Loop-mediatedisothermalamplification）

PCR：聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction）

PEG：聚乙二醇（polyethyleneglycol）

SWP：孢子壁蛋白（sporewallprotein）

SYBRGreenIqPCRMix：含雙鏈嵌合熒光染色劑的熒光定量PCR預混液

5試劑和材料

除非另有說明，在分析中僅使用確認為分析純的化學試劑和蒸餾水或去離子水或相當純度的水。

1

DB33/T2492—2022

5.1無水乙醇。

5.295%乙醇：95mL無水乙醇，加水定容至100mL。

5.370%乙醇：70mL無水乙醇，加水定容至100mL。

5.40.45μm硝酸纖維素膜。

5.53%牛肉膏洗脫液：30.0g牛肉浸膏加水溶解，調(diào)節(jié)pH至9.0，定容至1000mL，高壓滅菌15min，

室溫保存。

5.616%PEG8000：160.0gPEG8000、17.5gNaCl加水溶解，定容至1000mL，高壓滅菌15min，室溫

保存。

5.7磷酸氫二鈉(Na2HPO4）（0.2mol/L）：71.6gNa2HPO4·12H2O加水溶解，調(diào)節(jié)pH至9.0，定容至1

000mL，高壓滅菌15min，室溫保存。

5.8抽提緩沖液：1mL1mol/LTris·HCl(pH8.0)、20mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)、2mL1mg/mL胰RNA

酶、5mL10%SDS加水溶解，定容至100mL，室溫貯存。

5.9蛋白酶K（20mg/mL）：-20℃保存。

5.10This平衡酚（飽和酚）、10mol/L乙酸銨、酚/三氯甲烷/異戊醇（25:24:1）、三氯甲烷/異戊

醇（24:1）。

5.11TE緩沖液：10mL1mol/LTris·HCl(pH8.0)、2mL0.5mol/LEDTA（pH8.0）加水定容至1000mL，

高壓滅菌后4℃保存。

5.12TaqDNA聚合酶（5U/μL）：-20℃保存，避免反復凍融。

5.1310×PCR緩沖液：隨TaqDNA聚合酶提供，-20℃保存。

5.14氯化鎂（MgCl2）溶液（25mmol/L）：-20℃保存。

5.15dNTP：生化試劑，含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L的混合物，-20℃保存。

5.16套式PCR引物：兩對引物（F514和R514、F147和R147）序列及其在靶基因中的位置見附錄A

中的A.1，-20℃保存。

5.171×TAE電泳緩沖液：242gTris、100mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)、57.1mL冰乙酸，加水定容至1

000mL，室溫保存，使用時稀釋50倍。

5.18瓊脂糖：電泳級。

5.19樣品緩沖液：40g蔗糖加水溶解，定容至1000mL，加入0.25g溴酚藍溶解后，4℃保存。

5.20電泳核酸染料：溴化乙錠或4SGreen等商品化染料。

5.21DNAMarker2000，-20℃保存。

5.22SYBRGreenIqPCRMix。

5.23熒光定量PCR引物：引物（F118和R118）序列及其在靶基因中的位置見附錄A中的A.2，-20℃

保存。

5.2410×thermolPol緩沖液：含200mmol/LTris·HCl(pH8.0)、100mmol/L硫酸銨（（NH4）2SO4）、

100mmol/L氯化鉀（KCl）、20mmol/L硫酸鎂（MgSO4）、1%TritonX-100。

5.25甜菜堿，5mol/L。

5.26MgSO4，150mmol/L。

5.27BstDNA聚合酶，8U/μL。

5.28LAMP引物：三對引物（F3和B3、FIP和BIP、FLP和BLP）序列及其在靶基因中的位置見附錄A

中的A.3，-20℃保存。

5.29陽性對照：已知受EHP感染的對蝦樣品提取的DNA，-20℃保存。

5.30陰性對照：已知未受EHP感染的對蝦樣品提取的DNA，-20℃保存。

5.31空白對照：無菌雙蒸水。

2

DB33/T2492—2022

6儀器和設備

6.1PCR擴增儀。

6.2熒光定量PCR儀。

6.3恒溫熒光擴增檢測儀。

6.4電泳儀：輸出直流電壓0V～600V。

6.5水平電泳槽：50mL～500mL，帶有凝膠船及樣孔梳。

6.6微量移液器及適配吸頭，建議使用帶濾芯的吸頭。

6.7凝膠成像儀。

6.8水浴鍋或金屬浴。

6.9普通冰箱：具冷藏箱，并帶-18℃以下冷凍箱體。

6.10離心機：轉速可達12000r/min以上。

6.11超聲波破碎儀：20kHz±2kHz。

6.120.2mLPCR管及1.5mL、2.0mL、5.0mL離心管：經(jīng)高壓滅菌，一次性使用。

6.13無菌研磨棒：適用于1.5mL離心管，經(jīng)高壓滅菌，一次性使用。

6.14分析天平：最小分度值為1mg。

6.15真空抽濾泵。

7樣品采集和處理

7.1樣品的采集

7.1.1生物樣品

7.1.1.1樣品采集的要求和數(shù)量按SC/T7103的規(guī)定。

7.1.1.2對蝦受精卵、幼體、仔蝦及體長3cm以下稚蝦取完整個體；幼蝦至成蝦取肝胰腺、腸道；鹵

蟲、豐年蟲等餌料生物樣品取完整個體，冷藏運輸進行核酸抽提。或置于滅菌采樣容器內(nèi)，加入待檢

樣三倍體積的95%乙醇沒過待檢樣，-20℃保存。

7.1.2水樣

用無菌容器采集500mL，冷藏運輸進行核酸抽提?；?20℃保存待檢。

7.2樣品處理

7.2.1通用要求

樣品處理過程中應避免交叉污染。

7.2.2生物樣

將采集樣品用研磨棒研磨均勻，取10mg～100mg組織勻漿液，置于滅菌1.5mL的離心管中，用于

核酸提取。

7.2.3水樣

7.2.3.1取100mL水樣經(jīng)0.45μm硝酸纖維素膜抽濾后，取出硝酸纖維素膜并剪碎，放入裝有1.5mL

的3%牛肉膏洗脫液及鋯珠的2mL離心管中，震蕩20min～30min，或用超聲破碎儀破碎15min。

3

DB33/T2492—2022

7.2.3.2取出上清轉移至無菌的5mL離心管中。加入等體積的16%PEG8000溶液，震蕩充分混勻，

調(diào)節(jié)pH至7.0，4℃靜置3h或過夜。

7.2.3.34℃下12000r/min離心5min，棄上清。加入Na2HPO4500μL，震蕩至重懸沉淀。

7.2.3.44℃下12000r/min離心5min，取上清用于核酸抽提。

8核酸抽提

8.1經(jīng)7.2處理樣品，按以下方法進行核酸抽提。

8.2加入抽提緩沖液450μL、蛋白酶K3μL，混勻，56℃孵育3h。

8.3冷卻至室溫，加入等體積平衡酚，顛倒混合10min，于10000r/min離心3min，取上層水相至新

1.5mL離心管中。

8.4加入等體積酚/三氯甲烷/異戊醇（25:24:1），顛倒混合10min，于10000r/min離心1min，取

上層水相至新1.5mL離心管中。

8.5加溶液等體積三氯甲烷/異戊醇(24:1)，顛倒混合10min，于10000r/min離心1min，取上層水

相至新1.5mL離心管中。

8.6加入乙酸銨100μL，混勻后，再加入兩倍體積預冷無水乙醇(-20℃）混勻，-20℃放置2h。10000

r/min離心10min，棄上清。

8.7用70%乙醇洗滌沉淀2次，每次洗滌后10000r/min離心5min，小心傾去上清，沉淀于室溫晾干。

8.8加入滅菌雙蒸水50μL～100μL溶解DNA。若DNA樣品需保存，宜用TE緩沖液50μL～100μL溶解

并保存于-20℃。

8.9也可采用同等效果商業(yè)化DNA提取試劑盒抽提DNA。

9PCR檢測方法

9.1通用要求

樣品的PCR擴增應在PCR反應區(qū)獨立完成，避免造成區(qū)域間污染。PCR實驗室分區(qū)要求按附錄B執(zhí)行。

9.2套式PCR

9.2.1第一輪PCR反應

9.2.1.1PCR反應體系：在0.2mLPCR管中加入10×PCR緩沖液2.5μL，MgCl21.5μL，dNTP0.5μL，

引物F514和R514各1μL，Taq酶0.1μL，檢測樣品DNA1μL，最后加滅菌雙蒸水至25μL體積（或者

按商品化預混液說明書配制反應體系）。同時設陽性對照、陰性對照及空白對照。短暫離心后將PCR

管置于PCR儀中。

9.2.1.2PCR反應條件：95℃5min；95℃30s，58℃30s，68℃45s，30次循環(huán)；68℃5min；

4℃保溫。

9.2.2第二輪PCR反應

9.2.2.1PCR反應體系為：在0.2mLPCR管中加入10×PCR緩沖液2.5μL，MgCl21.5μL，dNTP0.5μL，

引物F147和R147各1μL，Taq酶0.1μL，第一輪反應產(chǎn)物1μL，最后加滅菌雙蒸水至25μL體積（或

按商品化預混液說明書配制反應體系）。短暫離心后將PCR管置于PCR儀中。

9.2.2.2PCR反應條件為：95℃5min；95℃30s，64℃30s，68℃20s，20次循環(huán)；68℃5min；

4℃保溫。

4

DB33/T2492—2022

9.2.3瓊脂糖凝膠電泳

用1×TAE電泳緩沖液配制1.5%且含1μg/mL核酸染料的瓊脂糖凝膠。將該凝膠平板放入水平電泳槽，

加樣孔朝負極，加入1×TAE電泳緩沖液至沒過膠面1mm～2mm。將PCR擴增產(chǎn)物6μL和樣品緩沖液2μL混

勻后加入加樣孔，同時設立DNA分子量標準對照。5V/cm電泳30min，當溴酚藍遷移至瓊脂糖凝膠的1/2～

2/3處時停止電泳，凝膠成像儀觀察并判斷結果。若條帶未區(qū)分開，可適當增加電泳時間。

9.2.4結果判定

9.2.4.1陽性對照第一輪PCR在514bp處有條帶，或/和第二輪PCR在147bp處有條帶，陰性對照和

空白對照沒有相應條帶，實驗有效。

9.2.4.2待測樣品第一輪PCR在514bp處有條帶，或/和第二輪PCR在147bp處有條帶的，判定為陽

性。

9.2.4.3待測樣品第一輪PCR在514bp處無條帶，且第二輪PCR在147bp處無條帶的，可判定為樣品

陰性。

9.2.4.4結果判定可疑時，應用其他檢測方法進行確認。

9.3熒光定量PCR

9.3.1反應體系

在熒光PCR管中加入2×SYBRGreenIqPCRMix10μL，引物F118和R118各0.8μL，檢測樣品DNA1

μL，最后加滅菌雙蒸水至20μL體積（或者按商品化預混液說明書配制反應體系）。同時設陽性對照、

陰性對照及空白對照。短暫離心后將PCR管置于熒光定量PCR儀中。

9.3.2反應條件

95℃30s；95℃5s，60℃30s，40個循環(huán)。

9.3.3結果判定

9.3.3.1陽性對照Ct值≤30且有明顯S型擴增曲線，同時陰性對照和空白對照Ct值＞30且無明顯S

型擴增曲線，判斷結果有效。

9.3.3.2待測樣品Ct值≤30且有明顯S型擴增曲線，結果為陽性。

9.3.3.3待測樣品Ct值＞35或無明顯S型擴增曲線，結果為陰性。

9.3.3.4待測樣品Ct值30＜Ct≤35時，樣品為疑似陽性，應用其他檢測方法確認。

9.4LAMP法

9.4.1反應體系

在熒光PCR管中加入10×ThermoPol緩沖液2.5μL、外側引物F3和B3各0.5μL，內(nèi)測引物FIP和BIP各

1μL，環(huán)引物FLP和BLP各0.5μL，dNTP4μL，甜菜堿4μL，MgSO41μL，BstDNA聚合酶1μL，DNA模板2μL，

最后加滅菌雙蒸水至25μL體積（或者按商品化預混液說明書配制反應體系）。同時設陽性對照、陰性

對照及空白對照。短暫離心后將PCR管置于恒溫熒光PCR儀中或熒光定量PCR儀中選擇SYBR通道。

9.4.2反應條件

63℃擴增40min。

9.4.3結果判定

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9.4.3.1陽性對照反應產(chǎn)生典型S型擴增曲線且陰性對照和空白對照反應產(chǎn)生非S型擴增曲線時，結

果有效。

9.4.3.2待測樣品反應產(chǎn)生典型S型擴增曲線，結果為陽性。

9.4.3.3待測樣品反應產(chǎn)生類似平直的非S型擴增曲線，則結果為陰性。

9.4.3.4結果判定可疑時，應用其他檢測方法進行確認。

10綜合判定

10.1套式PCR結果陽性、或熒光定量PCR結果陽性、或LAMP結果陽性，符合其中一項則判定為樣品

EHP核酸陽性。

10.2當套式PCR、熒光定量PCR、LAMP中的一種檢測方法結果判定可疑時，應選擇另一種方法進行確

認。

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AA

附錄A

（資料性）

EHP檢測方法引物序列及其在靶基因中的位置

A.1EHP套式PCR引物序列及其在靶基因中的位置

A.1.1套式PCR引物序列

套式PCR引物序列及濃度見表A.1。

表A.1EHP套式PCR引物序列

引物名稱引物序列（5’→3’）引物濃度擴增片段長度

F514TTGCAGAGTGTTGTTAAGGGTTT10μmol/L

514bp

R514CACGATGTGTCTTTGCAATTTTC10μmol/L

F147TTGGCGGCACAATTCTCAAACA10μmol/L

147bp

R147GCTGTTTGTCTCCAACTGTATTTGA10μmol/L

A.1.2套式PCR引物在靶基因中的位置

套式PCR引物在EHP靶基因中的位置見圖A.1。

圖A.1EHP套式PCR引物在靶基因中的位置

A.2EHP熒光定量PCR引物序列及其在靶基因中的位置

A.2.1熒光定量PCR引物序列

熒光定量PCR引物序列及濃度見表A.2。

7

DB33/T2492—2022

表A.2EHP熒光定量PCR引物序列

引物名稱引物序列（5’→3’）引物濃度擴增片段長度

F118ACAAAGTTACCAGAAGGTTATGAAG10μmol/L

118bp

R118TTGTGCCGCCAAACTCGTA10μmol/L

A.2.2熒光定量PCR引物在靶基因中的位置

熒光定量PCR引物在EHP靶基因中的位置見圖A.2。

圖A.2EHP熒光定量PCR引物在靶基因中的位置

A.3EHPLAMP引物序列及其在靶基因中的位置

A.3.1LAMP引物序列

LAMP引物序列及濃度見表A.3。

表A.3EHPLAMP引物序列

引物名稱引物序列（5’→3’）引物濃度

F3TAGAAGATGCAAAGAGATATGTTGA10μmol/L

B3GTTTGTCTCCAACTGTATTTGAAA10μmol/L

FIP（FIP1+FIP2）TTACTTAAACCCTTAACAACACTCTAAGTTACCAGAAGGTTATGAAGAA40μmol/L