基于synNotch與組合抗體庫技術的CAR-T構建新策略：創(chuàng)新與展望一、引言1.1CAR-T療法概述CAR-T療法，即嵌合抗原受體T細胞療法（Chimer1.2研究背景與目的CAR-T療法自問世以來，在癌癥治療領域展現(xiàn)出巨大潛力，尤其是在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療中取得了顯著成效，如對急性B細胞型淋巴性白血?。ˋLL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）等疾病，部分患者實現(xiàn)了長期緩解。然而，傳統(tǒng)的CAR-T構建方法存在諸多局限性，嚴重制約了其進一步發(fā)展和廣泛應用。傳統(tǒng)CAR-T構建主要依賴于單個抗原靶點的識別，這使得腫瘤細胞容易通過抗原逃逸機制產(chǎn)生耐藥性。例如，在CD19靶向的CAR-T細胞療法中，30-70％的復發(fā)患者出現(xiàn)CD19抗原下調/丟失的情況。在實體瘤治療中，這種單一靶點的局限性更為突出，由于實體瘤復雜的腫瘤微環(huán)境，腫瘤靶抗原難以尋找，且CAR-T細胞難以有效進入腫瘤組織并長時間保持活力。此外，傳統(tǒng)CAR-T構建過程中，從患者體內采集T細胞，經(jīng)過復雜的實驗室培養(yǎng)和基因工程改造，再回輸?shù)交颊唧w內，這一過程不僅耗時費力、成本高昂，還對患者自身T細胞的質量和數(shù)量有較高要求。部分患者由于身體狀況不佳，無法采集到足夠數(shù)量或質量合格的T細胞，從而無法接受CAR-T治療。而且，傳統(tǒng)CAR-T療法的細胞均來自自體，個性化過程復雜、耗時，極大地限制了受益患者的數(shù)量。為了克服傳統(tǒng)CAR-T構建方法的局限，synNotch和組合抗體庫技術應運而生。synNotch技術是一種合成的Notch受體，通過基因工程技術在T細胞表面永久性表達，其膜外結構為抗體片段，可識別并結合抗原A。當A與synNotch結合后，膜內肽鏈被裂解，釋放出連接的轉錄因子，該轉錄因子進入細胞核，特異性啟動第2個CAR的轉錄。只有當腫瘤細胞同時表達兩種抗原A和B時，CAR-T細胞才會被激活殺傷腫瘤細胞，這大大提高了CAR-T細胞識別腫瘤細胞的精準性，減少了對健康細胞的損傷。組合抗體庫技術則可以在體外構建大容量、高多樣性的文庫，將基因型和表型整合在篩選系統(tǒng)中實現(xiàn)表型的可復制，最終利用生物進化原理進行高通量篩選。它能夠在體外重建免疫系統(tǒng)，使抗體的篩選不受動物或生物組織的限制；通過分子克隆，可記錄供者完整的免疫信息；通過重鏈和輕鏈的隨機重組，可以提高文庫的多樣性，規(guī)避免疫耐受，揭示罕見抗體譜，為CAR-T構建提供了豐富多樣的抗體資源。本研究旨在利用synNotch和組合抗體庫技術，構建一種高效的CAR-T治療方法。通過synNotch技術實現(xiàn)對腫瘤細胞的雙抗原識別，提高CAR-T細胞的靶向精準性，減少抗原逃逸和脫靶效應；借助組合抗體庫技術篩選出高親和力、高特異性的抗體，優(yōu)化CAR-T細胞的抗原結合域，增強其對腫瘤細胞的殺傷能力。這種新方法有望突破傳統(tǒng)CAR-T療法的瓶頸，為癌癥患者提供更有效、更安全的治療方案，推動CAR-T療法在血液系統(tǒng)惡性腫瘤以及實體瘤治療領域的進一步發(fā)展，具有重要的理論意義和臨床應用價值。1.3研究創(chuàng)新點與應用前景本研究構建方法具有多方面創(chuàng)新。傳統(tǒng)CAR-T依賴單一抗原靶點識別，而synNotch技術賦予CAR-T細胞雙抗原識別能力，腫瘤細胞需同時表達兩種抗原才會激活CAR-T細胞殺傷功能，極大提升了識別精準度。如在實體瘤治療中，腫瘤細胞異質性強，單一靶點易使腫瘤細胞通過抗原逃逸產(chǎn)生耐藥，synNotchCAR-T細胞可有效減少這種情況發(fā)生，提高治療效果。組合抗體庫技術在抗體篩選方面有獨特優(yōu)勢。傳統(tǒng)方法篩選抗體受動物或生物組織限制，而組合抗體庫技術能在體外重建免疫系統(tǒng)，構建大容量、高多樣性文庫，通過重鏈和輕鏈隨機重組提高文庫多樣性，規(guī)避免疫耐受，揭示罕見抗體譜，為CAR-T構建提供豐富多樣的抗體資源。將其與synNotch技術結合，為CAR-T療法帶來新突破。在應用前景上，本研究構建方法在癌癥治療領域潛力巨大。在血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療中，有望進一步提高緩解率和治愈率，降低復發(fā)風險。以急性B細胞型淋巴性白血病為例，當前CAR-T療法雖有一定療效，但仍存在抗原逃逸導致復發(fā)問題，新構建方法或可解決。對于實體瘤治療，該方法的突破意義更為重大。實體瘤因其復雜的腫瘤微環(huán)境，一直是CAR-T療法難以攻克的難題。腫瘤靶抗原難以尋找，且CAR-T細胞難以有效進入腫瘤組織并長時間保持活力。新構建方法通過synNotch技術精準識別腫瘤細胞，利用組合抗體庫技術篩選高親和力抗體，或能提高CAR-T細胞對實體瘤的靶向性和殺傷能力，為實體瘤患者帶來新希望。如在卵巢癌、肺癌等實體瘤治療中，可針對腫瘤特異性抗原組合，利用synNotchCAR-T細胞進行精準治療。二、synNotch和組合抗體庫技術原理剖析2.1synNotch技術詳解2.1.1synNotch受體結構與設計synNotch受體是一種人工設計的合成受體，其結構基于天然Notch受體改造而來，但具有更精準的定制化功能。它主要由胞外識別域、跨膜域和胞內功能域三部分構成。胞外識別域是synNotch受體與外界信號分子特異性結合的關鍵區(qū)域，通常由單鏈抗體（scFv）或其他具有特異性識別能力的蛋白片段組成。這些識別元件能夠被精確設計，以識別特定的腫瘤相關抗原、細胞表面標志物或其他生物分子。例如，在針對腫瘤細胞的治療中，可將胞外識別域設計為能特異性識別腫瘤細胞表面高表達的抗原，如在乳腺癌治療中，可使胞外識別域靶向人表皮生長因子受體2（HER2），該抗原在約20%-30%的乳腺癌患者腫瘤細胞表面過度表達。通過這種特異性設計，synNotch受體能夠準確區(qū)分腫瘤細胞與正常細胞，為后續(xù)的細胞調控提供精準的信號輸入?？缒び蚱鸬竭B接胞外識別域和胞內功能域的作用，同時確保synNotch受體能夠穩(wěn)定地錨定在細胞膜上。它不僅維持了受體結構的完整性，還在信號傳導過程中扮演重要角色，負責將胞外識別域結合信號分子后產(chǎn)生的構象變化傳遞到胞內。跨膜域通常采用天然Notch受體的跨膜結構，利用其穩(wěn)定的疏水特性，保證受體在細胞膜脂質雙分子層中的正常定位和功能發(fā)揮。胞內功能域則是synNotch受體發(fā)揮調控作用的核心區(qū)域。當胞外識別域與相應的信號分子結合后，會引發(fā)一系列的分子事件，最終導致胞內功能域被激活。激活后的胞內功能域通常包含轉錄因子或其他信號傳導分子，這些分子能夠進入細胞核，與特定的DNA序列結合，從而啟動或調控下游基因的表達。例如，常見的設計是在胞內功能域連接Gal4-VP64等轉錄激活因子，當synNotch受體被激活時，Gal4-VP64被釋放并進入細胞核，與含有Gal4結合位點的啟動子區(qū)域結合，激活下游目的基因的轉錄，如啟動嵌合抗原受體（CAR）基因的表達，使T細胞獲得針對特定腫瘤抗原的殺傷能力。synNotch受體的設計思路是通過對各結構域的模塊化構建，實現(xiàn)對特定信號的精準識別和響應。利用基因工程技術，將不同來源的、具有特定功能的DNA片段進行拼接和組裝，構建出具有定制化功能的synNotch受體。這種設計方式賦予了synNotch受體高度的靈活性和可定制性，使其能夠根據(jù)不同的應用場景和需求，精準地調控細胞的行為和功能。2.1.2激活機制與信號傳導路徑synNotch受體的激活依賴于其胞外識別域與特定信號分子的特異性結合。當細胞所處環(huán)境中存在與synNotch受體胞外識別域互補的信號分子時，二者會發(fā)生特異性結合，這一結合事件是synNotch受體激活的起始信號。以腫瘤治療中的應用為例，當腫瘤細胞表面表達的特定抗原與synNotch受體的胞外識別域（如靶向該抗原的單鏈抗體）相互作用并結合時，會引發(fā)synNotch受體構象的改變。這種構象改變首先發(fā)生在胞外識別域與跨膜域的連接處，使得原本隱藏在受體內部的特定蛋白酶切割位點暴露。在天然Notch信號通路中，主要是ADAM蛋白酶和γ-分泌酶參與后續(xù)的切割過程。ADAM蛋白酶首先對synNotch受體的胞外部分進行切割，去除大部分的胞外識別域，只留下一小段與跨膜域相連的片段。隨后，γ-分泌酶進一步對跨膜域進行切割，這一關鍵步驟使得與跨膜域相連的胞內功能域被釋放。釋放后的胞內功能域迅速進入細胞核，在細胞核內，它作為轉錄調控因子發(fā)揮作用。如前文所述，若胞內功能域連接的是Gal4-VP64轉錄激活因子，它會識別并結合到細胞核內DNA上特定的Gal4結合位點。一旦結合，Gal4-VP64就會招募RNA聚合酶等轉錄相關蛋白，啟動下游目的基因的轉錄過程。如果下游目的基因是編碼嵌合抗原受體（CAR）的基因，那么隨著轉錄和后續(xù)的翻譯過程，細胞會開始表達CAR蛋白。CAR蛋白表達后會整合到細胞表面，使細胞具備識別和結合腫瘤細胞表面特定抗原的能力，進而激活細胞的免疫殺傷功能，如T細胞在表達CAR后，能夠特異性地識別并殺傷表達相應抗原的腫瘤細胞。整個信號傳導過程是一個由胞外信號觸發(fā)，通過跨膜結構傳遞，最終在細胞核內實現(xiàn)基因表達調控的級聯(lián)反應。這一過程的每一步都受到嚴格的分子機制調控，確保synNotch受體能夠準確、高效地對特定信號做出響應，實現(xiàn)對細胞行為和功能的精確調控。2.1.3在細胞調控中的應用案例synNotch技術在細胞治療領域展現(xiàn)出了巨大的應用潛力，為癌癥治療帶來了新的策略。在一項針對實體瘤的研究中，研究人員設計了一種synNotch-CAR-T細胞療法。首先構建了能夠識別腫瘤細胞表面兩種不同抗原（如表皮生長因子受體EGFR和間皮素Mesothelin）的synNotch受體。當synNotch-CAR-T細胞接觸到同時表達這兩種抗原的腫瘤細胞時，synNotch受體被激活，啟動下游CAR基因的表達。表達后的CAR能夠進一步增強T細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷能力。實驗結果顯示，這種雙抗原識別的synNotch-CAR-T細胞相較于傳統(tǒng)的單抗原靶向CAR-T細胞，在小鼠實體瘤模型中表現(xiàn)出更強的腫瘤抑制效果，腫瘤體積顯著縮小，小鼠的生存期明顯延長。這表明synNotch技術通過引入雙抗原識別機制，有效提高了CAR-T細胞對腫瘤細胞識別的精準性，減少了腫瘤細胞通過單一抗原逃逸的可能性，為實體瘤的治療提供了更有效的手段。在組織工程領域，synNotch技術也發(fā)揮了重要作用。例如，在構建人工血管的研究中，研究人員利用synNotch技術來調控血管內皮細胞和平滑肌細胞之間的相互作用。通過設計特定的synNotch受體，使內皮細胞在感知到周圍環(huán)境中的特定信號（如平滑肌細胞分泌的某種生長因子）時，激活synNotch信號通路，進而調控內皮細胞表達一系列與血管生成和穩(wěn)定相關的基因，如血管內皮生長因子（VEGF）及其受體。這種調控機制有助于促進內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，同時增強血管壁的穩(wěn)定性。實驗結果表明，利用synNotch技術構建的人工血管在結構和功能上更接近天然血管，能夠更好地支持血液流動和營養(yǎng)物質交換，為組織工程血管的臨床應用奠定了堅實的基礎。2.2組合抗體庫技術解析2.2.1構建原理與方法組合抗體庫的構建是一項復雜而精細的過程，其核心在于模擬自然免疫系統(tǒng)中抗體基因的多樣性產(chǎn)生機制，在體外人工構建一個包含海量不同抗體基因的文庫。首先是抗體基因的獲取。通常從人或動物的免疫細胞，如B淋巴細胞中提取總RNA。這些細胞在自然免疫過程中，已經(jīng)經(jīng)歷了抗體基因的重排和多樣化選擇，攜帶了豐富的抗體基因信息。以人類為例，通過從外周血中分離B淋巴細胞，利用反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）技術，以總RNA為模板，反轉錄合成cDNA，再使用特異性引物擴增出抗體的重鏈（heavychain，HC）和輕鏈（lightchain，LC）可變區(qū)基因。引物的設計至關重要，需要根據(jù)已知的抗體基因序列保守區(qū)進行設計，以確保能夠擴增出盡可能多的不同抗體基因片段。例如，針對人源抗體基因，常用的引物可以覆蓋IGHV、IGHD、IGHJ等重鏈可變區(qū)基因家族以及IGKV、IGLV等輕鏈可變區(qū)基因家族。獲取到抗體基因片段后，便進入克隆環(huán)節(jié)。將擴增得到的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因分別克隆到合適的載體中。常用的載體包括噬菌體載體、噬菌粒載體和酵母表達載體等。以噬菌體展示技術為例，將抗體基因與噬菌體的外殼蛋白基因融合，構建成重組噬菌體載體。具體操作是利用限制性內切酶對載體和抗體基因片段進行酶切，使其產(chǎn)生互補的粘性末端，再通過DNA連接酶將兩者連接起來。比如，將抗體輕鏈可變區(qū)基因克隆到pComb3X載體的相應位點，重鏈可變區(qū)基因克隆到同一載體的另一合適位點，構建成完整的重組噬菌體載體。隨后是抗體基因的隨機重組與載體連接。為了實現(xiàn)抗體基因的多樣性展示，需要將重鏈和輕鏈基因進行隨機組合。一種常見的方法是將重鏈和輕鏈基因庫分別轉化到感受態(tài)大腸桿菌中，通過細菌的繁殖和遺傳物質交換，實現(xiàn)重鏈和輕鏈基因在單個細菌內的隨機重組。當重組后的載體進入大腸桿菌后，抗體基因會隨著載體的復制而擴增，同時在細菌內表達出相應的抗體片段，并展示在噬菌體表面。這樣，每個噬菌體都攜帶了一種獨特的抗體基因組合，整個文庫就包含了極其豐富的抗體多樣性，理論上可以展示出數(shù)十億甚至數(shù)萬億種不同的抗體。2.2.2篩選策略與優(yōu)化組合抗體庫構建完成后，關鍵的步驟是從這個龐大的文庫中篩選出具有高親和力、高特異性的抗體，常用的篩選方法有親和淘選。親和淘選是基于抗原與抗體之間特異性結合的原理進行的。首先，將目標抗原固定在固相載體表面，如酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）板的孔壁、磁珠或瓊脂糖凝膠珠等。以磁珠為例，通過化學偶聯(lián)的方法將抗原連接到磁珠表面，然后將組合抗體庫（如噬菌體展示抗體庫）與固定有抗原的磁珠混合孵育。在孵育過程中，文庫中的抗體片段會與抗原進行結合，而那些不與抗原結合或結合力較弱的抗體則會在后續(xù)的洗滌步驟中被去除。經(jīng)過多次洗滌后，保留在磁珠表面的是與抗原特異性結合的抗體。接著，使用洗脫液將這些特異性結合的抗體從磁珠上洗脫下來，獲得富集了特異性抗體的噬菌體群體。為了進一步提高篩選效率和獲得高親和力抗體，通常需要進行多輪篩選。每一輪篩選后，將洗脫得到的噬菌體感染大腸桿菌，使其在細菌內大量繁殖擴增，然后再次進行下一輪的親和淘選。隨著篩選輪數(shù)的增加，文庫中與抗原特異性結合且親和力較高的抗體所占比例逐漸升高。在篩選過程中，還可以通過調整篩選條件來優(yōu)化篩選效果。比如，在洗滌步驟中增加洗滌次數(shù)或改變洗滌液的組成和濃度，以去除更多非特異性結合的噬菌體，提高篩選的嚴謹性；或者在孵育過程中調整溫度、時間和抗體庫與抗原的比例等參數(shù)，以優(yōu)化抗原-抗體的結合效率。除了親和淘選，還發(fā)展了一些新的篩選策略來進一步優(yōu)化篩選過程。基于細胞-細胞相互作用的篩選系統(tǒng)，利用細胞表面展示的抗原與表達在另一種細胞表面的抗體庫進行相互作用，通過檢測細胞間的結合信號來篩選特異性抗體。這種方法更接近體內的生理環(huán)境，能夠篩選出對細胞表面抗原具有更好親和力和特異性的抗體，尤其適用于篩選針對膜蛋白抗原的抗體。2.2.3在抗體藥物研發(fā)中的成果組合抗體庫技術在抗體藥物研發(fā)領域取得了豐碩的成果，為治療性抗體開發(fā)和診斷試劑研制提供了強大的技術支持。在治療性抗體開發(fā)方面，許多成功上市的抗體藥物得益于組合抗體庫技術。如阿達木單抗（Adalimumab），這是一種全人源化的抗腫瘤壞死因子α（TNF-α）單克隆抗體，用于治療類風濕性關節(jié)炎、強直性脊柱炎等多種自身免疫性疾病。其研發(fā)過程中，利用組合抗體庫技術從人源抗體文庫中篩選出高親和力的抗TNF-α抗體。通過多輪親和淘選和優(yōu)化，獲得了能夠特異性結合TNF-α并有效阻斷其生物學活性的抗體。臨床研究表明，阿達木單抗顯著改善了患者的癥狀和生活質量，為自身免疫性疾病患者帶來了福音。據(jù)統(tǒng)計，阿達木單抗在全球的銷售額多年來一直名列前茅，僅在2020年，其全球銷售額就超過了200億美元，展現(xiàn)出巨大的經(jīng)濟效益和臨床價值。在診斷試劑研制方面，組合抗體庫技術也發(fā)揮了重要作用。在新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）疫情期間，利用組合抗體庫技術快速篩選出了高特異性的抗新冠病毒抗體，用于新冠病毒檢測試劑的開發(fā)。研究人員從人源抗體文庫中篩選出能夠特異性識別新冠病毒刺突蛋白（Spikeprotein）的抗體，將其應用于膠體金免疫層析檢測試劑和化學發(fā)光免疫檢測試劑中，實現(xiàn)了對新冠病毒的快速、準確檢測。這些檢測試劑在疫情防控中發(fā)揮了關鍵作用，為疫情的監(jiān)測、防控和患者的診斷提供了有力工具。三、基于兩種技術的CAR-T構建流程3.1前期準備工作3.1.1細胞來源與處理用于構建CAR-T細胞的T細胞來源主要有外周血和臍血。外周血是獲取T細胞的常用來源，通過白細胞單采術可從患者或健康供體的外周血中采集富含T細胞的單個核細胞（MNC）。這種方法操作相對簡便，且能獲取足夠數(shù)量的T細胞。臍血也是一種重要的T細胞來源，與外周血相比，臍血中的T細胞具有更強的增殖能力和較低的免疫原性，在異體CAR-T細胞治療中具有獨特優(yōu)勢，可降低移植物抗宿主?。℅VHD）的發(fā)生風險。細胞采集后的處理至關重要，直接影響后續(xù)CAR-T細胞的質量和功能。首先進行分離操作，利用Ficoll密度梯度離心法，將采集的外周血或臍血置于特定密度的Ficoll分離液上，通過離心使不同密度的細胞分層，從而分離出單個核細胞層，其中富含T細胞。隨后進行純化，可采用免疫磁珠分選技術，利用包被有抗CD3抗體的磁珠特異性結合T細胞表面的CD3分子，在磁場作用下將T細胞從其他細胞中分離出來，獲得高純度的T細胞。分離純化后的T細胞需要進行培養(yǎng)激活，將T細胞接種于含有適宜培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基通常包含RPMI1640基礎培養(yǎng)基、10%-20%的胎牛血清（FBS）以及多種細胞因子，如白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-7（IL-7）和白細胞介素-15（IL-15）等。在培養(yǎng)過程中，添加抗CD3和抗CD28抗體，模擬T細胞在體內的激活信號，刺激T細胞進入增殖狀態(tài)。將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察細胞生長狀態(tài)，根據(jù)細胞密度和生長情況進行換液和傳代，為后續(xù)的基因工程改造提供足夠數(shù)量且活性良好的T細胞。3.1.2載體選擇與改造在CAR-T細胞構建中，載體的選擇至關重要，常用的載體有慢病毒載體和逆轉錄病毒載體。慢病毒載體是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒（HIV-1）為基礎發(fā)展起來的基因治療載體，屬于逆轉錄病毒家族，但又區(qū)別于一般的逆轉錄病毒載體。其優(yōu)點是對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力，能夠將外源基因有效地整合到宿主染色體上，實現(xiàn)持久性表達。在感染能力方面，它可有效感染神經(jīng)元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、干細胞等多種類型的細胞。然而，慢病毒載體也存在一定缺點，其制備過程復雜，生產(chǎn)周期長，成本較高，并且由于來源于病原體HIV-1，存在潛在的生物安全性風險，如可能產(chǎn)生具有復制能力的慢病毒（RCL），雖通過將基因組中的輔助蛋白刪除，并采用三質粒系統(tǒng)或四質粒系統(tǒng)分別包裝，以及構建自失活的慢病毒載體（SIN）等措施極大降低了風險，但仍不能完全排除。逆轉錄病毒載體則相對簡單，通常指γ-逆轉錄病毒載體，如鼠白血病病毒載體。它的優(yōu)點是轉導效率高，能夠高效地將外源基因導入宿主細胞，并且在細胞內穩(wěn)定整合。但它也有明顯局限性，只能感染分裂期細胞，對非分裂期細胞的感染能力較弱，這限制了其在一些細胞類型中的應用。本研究選擇慢病毒載體，主要基于其對多種細胞類型的廣泛感染能力以及穩(wěn)定的基因整合特性，這對于構建高效的CAR-T細胞至關重要。在腫瘤治療中，腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境中的細胞類型復雜多樣，慢病毒載體能夠確保CAR基因有效地導入不同類型的T細胞，提高CAR-T細胞的制備效率和質量。為了適應構建需求，對慢病毒載體進行一系列改造。首先，將載體的包膜蛋白進行替換，使用水皰性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）取代原有的HIV-1包膜蛋白，這一改造顯著增加了載體的穩(wěn)定性和受體細胞范圍，使其能夠感染更多種類的細胞。對載體的基因組進行修飾，刪除輔助蛋白基因，如vif、vpr、vpu、tat、rev、nef等，降低載體在宿主細胞內的復制能力，減少潛在的生物安全風險。構建自失活（SIN）的慢病毒載體，在載體的長末端重復序列（LTR）中引入缺失突變，使載體在整合到宿主基因組后，轉錄活性降低，進一步提高載體的安全性。在載體中引入特定的調控元件，如增強子、啟動子等，以優(yōu)化CAR基因的表達，提高CAR-T細胞的靶向性和殺傷活性。3.2synNotch元件的引入與整合3.2.1synNotch受體的設計與合成在設計synNotch受體的胞外識別域時，首要任務是精準確定腫瘤特異性抗原。通過對腫瘤細胞表面分子的深入研究，利用蛋白質組學技術分析腫瘤細胞與正常細胞的差異表達蛋白，篩選出在腫瘤細胞中高表達且在正常組織中低表達或不表達的抗原作為靶點。如在黑色素瘤研究中，通過蛋白質組學分析發(fā)現(xiàn)黑色素瘤相關抗原（MAGE）在黑色素瘤細胞表面高表達，而在大多數(shù)正常細胞中不表達，因此可將MAGE作為synNotch受體胞外識別域的靶向抗原。確定靶點后，利用基因工程技術合成具有高特異性的受體。以噬菌體展示技術構建抗體庫，將編碼抗體可變區(qū)的基因與噬菌體外殼蛋白基因融合，使抗體片段展示在噬菌體表面。通過多輪生物淘選，將表達腫瘤特異性抗原的細胞與噬菌體抗體庫進行孵育，經(jīng)過多次洗滌去除非特異性結合的噬菌體，富集與抗原特異性結合的噬菌體。對篩選得到的噬菌體進行測序，獲取編碼高親和力抗體的基因序列。根據(jù)這些序列，通過PCR擴增和基因克隆技術，將抗體可變區(qū)基因克隆到表達載體中，構建出編碼synNotch受體胞外識別域的基因。在構建過程中，對抗體基因進行優(yōu)化，如引入定點突變技術，對抗體的互補決定區(qū)（CDR）進行修飾，以提高抗體與抗原的親和力和特異性。通過計算機輔助設計，模擬抗體與抗原的結合模式，預測并優(yōu)化突變位點，進一步提升synNotch受體的性能。3.2.2導入T細胞的技術與優(yōu)化將synNotch受體基因導入T細胞的常用技術有病毒轉導和電穿孔。病毒轉導中，慢病毒載體因能有效感染分裂細胞和非分裂細胞，且可將外源基因穩(wěn)定整合到宿主染色體上實現(xiàn)持久表達，成為常用選擇。操作時，先將synNotch受體基因克隆到慢病毒載體中，與包裝質粒、包膜蛋白質粒等共轉染到包裝細胞系（如293T細胞）中，產(chǎn)生攜帶synNotch受體基因的慢病毒顆粒。收集病毒上清，濃縮后與激活的T細胞共孵育，在聚凝胺等試劑輔助下，促進病毒顆粒感染T細胞，使synNotch受體基因整合到T細胞基因組中。電穿孔則利用高壓電脈沖在細胞膜上形成瞬時小孔，使synNotch受體基因進入細胞。將T細胞與含有synNotch受體基因的質粒混合，置于電穿孔杯中，施加特定參數(shù)的電脈沖，如電壓在200-300V，脈沖寬度在10-20毫秒。電穿孔后，將細胞轉移至培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其恢復并表達synNotch受體。為提高導入效率和穩(wěn)定性，對導入條件進行優(yōu)化。在病毒轉導中，優(yōu)化病毒滴度，通過梯度實驗確定最佳感染復數(shù)（MOI），在保證較高轉導效率的同時，減少病毒對細胞的毒性。調整感染時間和溫度，如將感染時間從常規(guī)的12小時延長至24小時，或在32℃的較低溫度下進行感染，可提高慢病毒載體的轉導效率。在電穿孔中，優(yōu)化電脈沖參數(shù)，通過改變電壓、脈沖寬度和脈沖次數(shù)等，尋找最適合T細胞的電穿孔條件。添加保護劑，如在電穿孔緩沖液中加入海藻糖等，可減少電脈沖對細胞的損傷，提高細胞存活率和導入效率。3.2.3功能驗證與評估指標驗證synNotch受體在T細胞中功能的實驗方法主要有流式細胞術和細胞功能檢測。流式細胞術用于檢測synNotch受體在T細胞表面的表達水平。將轉導后的T細胞與熒光標記的抗synNotch受體抗體孵育，通過流式細胞儀檢測熒光強度，確定受體的表達陽性率和平均熒光強度，評估受體的表達水平。細胞功能檢測包括抗原特異性激活實驗和細胞殺傷實驗。抗原特異性激活實驗中，將轉導后的T細胞與表達腫瘤特異性抗原的靶細胞共孵育，通過檢測T細胞分泌的細胞因子（如干擾素-γ、白細胞介素-2等）水平，評估synNotch受體的激活功能。利用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒檢測細胞培養(yǎng)上清中細胞因子的含量，細胞因子分泌量越高，表明synNotch受體激活T細胞的能力越強。細胞殺傷實驗評估T細胞對靶細胞的殺傷活性。采用乳酸脫氫酶（LDH）釋放法，將轉導后的T細胞與靶細胞按不同比例共培養(yǎng)，一定時間后，檢測培養(yǎng)上清中LDH的釋放量。LDH是細胞內的一種酶，當細胞受損時會釋放到細胞外，通過檢測LDH的釋放量可間接反映T細胞對靶細胞的殺傷程度。殺傷率計算公式為：殺傷率（%）=（實驗組LDH釋放量-靶細胞自發(fā)釋放量）/（靶細胞最大釋放量-靶細胞自發(fā)釋放量）×100%，殺傷率越高，說明T細胞的殺傷活性越強。3.3組合抗體庫的應用與篩選3.3.1抗體庫的構建與多樣性保證構建大容量、高多樣性組合抗體庫時，隨機重組和突變是關鍵策略。隨機重組方面，通過對抗體基因重鏈和輕鏈可變區(qū)的隨機組合，打破天然抗體基因組合的限制，創(chuàng)造更多樣化的抗體分子。利用噬菌體展示技術，將重鏈和輕鏈可變區(qū)基因分別克隆到噬菌體載體中，在噬菌體表面展示抗體片段。由于重鏈和輕鏈基因在噬菌體中的隨機組合，每個噬菌體都可能展示一種獨特的抗體，從而構建出包含大量不同抗體的文庫。在突變策略上，采用易錯PCR技術，在擴增抗體基因過程中，通過調整PCR反應體系中鎂離子濃度、dNTP比例等條件，使DNA聚合酶在復制過程中發(fā)生錯誤，引入隨機點突變，增加抗體基因的多樣性。定點突變技術則針對抗體的互補決定區(qū)（CDR），通過設計特定引物，對CDR區(qū)域的關鍵氨基酸位點進行突變，精準改變抗體的抗原結合特性，進一步豐富抗體庫的多樣性。為保證抗體庫質量，多方面質量控制措施必不可少?？贵w基因來源上，確保從健康供體或免疫動物的B淋巴細胞中獲取高質量的RNA，通過嚴格的細胞分選和RNA提取步驟，保證RNA的完整性和純度。載體選擇至關重要，需選用穩(wěn)定性好、轉化效率高的載體，如常用的噬菌粒載體pComb3X，其具有高效的轉化能力和穩(wěn)定的復制特性，可有效承載抗體基因。轉化過程中，通過優(yōu)化轉化條件，如采用電擊轉化時，調整電壓、電容和脈沖時間等參數(shù)，提高轉化效率，確保足夠數(shù)量的細菌攜帶不同的抗體基因，從而構建出具有豐富多樣性的抗體庫。3.3.2針對腫瘤抗原的篩選過程利用腫瘤相關抗原從抗體庫中篩選特異性抗體，主要通過親和淘選實現(xiàn)。將腫瘤相關抗原固定在固相載體上，如將腫瘤特異性蛋白抗原通過化學偶聯(lián)的方式固定在磁珠表面。把組合抗體庫（如噬菌體展示抗體庫）與固定有抗原的磁珠混合孵育，抗體庫中的抗體片段會與抗原進行特異性結合。經(jīng)過多次洗滌，去除未結合或結合力弱的噬菌體，保留與抗原特異性結合的噬菌體。為提高篩選嚴謹性，可調整洗滌條件，增加洗滌次數(shù)或改變洗滌液的離子強度和pH值。通過增加洗滌次數(shù)從3次增加到5次，可有效去除非特異性結合的噬菌體，提高篩選的特異性。改變洗滌液的離子強度，從常規(guī)的PBS緩沖液調整為含有較高濃度氯化鈉的緩沖液，能更嚴格地篩選出高親和力的抗體。篩選條件對結果影響顯著?？乖募兌群突钚允顷P鍵因素，高純度、高活性的抗原能提高篩選的準確性和效率。若抗原純度低，含有雜質，可能導致非特異性結合增加，干擾篩選結果；抗原活性低，無法有效與抗體結合，會降低篩選到特異性抗體的概率。抗體庫與抗原的比例也很重要，比例過高或過低都不利于篩選。比例過高，可能使低親和力抗體也結合到抗原上，增加篩選難度；比例過低，可能遺漏一些低豐度但高親和力的抗體。篩選溫度和時間也需優(yōu)化，適當提高溫度或延長時間，能增加抗體與抗原的結合機會，但過高溫度或過長時間可能導致非特異性結合增加。在37℃下孵育2小時，相較于25℃孵育1小時，能提高抗體與抗原的結合效率，但需注意控制非特異性結合。3.3.3篩選后抗體的鑒定與優(yōu)化對篩選出的抗體進行親和力和特異性鑒定，常用方法有表面等離子共振（SPR）技術和ELISA。SPR技術利用傳感器芯片表面固定的抗原與流動相中的抗體相互作用，引起芯片表面折射率變化，通過監(jiān)測這種變化實時測定抗體與抗原的結合和解離過程，從而準確計算出抗體與抗原的親和力常數(shù)（KD值）。KD值越小，表明抗體與抗原的親和力越高。ELISA則將抗原包被在酶標板上，加入抗體孵育后，通過酶標記的二抗檢測抗體與抗原的結合情況，利用酶催化底物顯色，通過檢測吸光度來判斷抗體的特異性和相對親和力。顯色越深，說明抗體與抗原的結合越強，特異性越高。通過分子改造優(yōu)化抗體性能，主要方法有定點突變和抗體人源化。定點突變針對抗體的CDR區(qū)域，通過改變關鍵氨基酸殘基，調整抗體與抗原的結合位點和相互作用力，提高抗體的親和力和特異性。在研究抗HER2抗體時，通過定點突變將CDR區(qū)域的某個氨基酸由丙氨酸替換為精氨酸，使抗體與HER2抗原的親和力提高了10倍?？贵w人源化是將鼠源抗體的互補決定區(qū)移植到人源抗體框架上，降低抗體的免疫原性，提高其在人體內的安全性和有效性。如赫賽汀（Herceptin），通過抗體人源化技術，將鼠源抗HER2抗體進行改造，使其成為人源化單克隆抗體，在乳腺癌治療中取得了顯著療效，降低了人體對抗體的免疫排斥反應。3.4CAR-T細胞的組裝與質量控制3.4.1CAR結構的設計與組裝CAR結構主要由抗原結合域、鉸鏈區(qū)、跨膜域和信號轉導域組成，各元件的選擇和組合對CAR-T細胞功能有顯著影響?？乖Y合域是CAR識別腫瘤抗原的關鍵部位，通常來源于單鏈抗體（scFv）。從組合抗體庫篩選高親和力、高特異性的scFv至關重要，如針對CD19靶點，從人源組合抗體庫中篩選出的scFv，能特異性識別CD19抗原，使CAR-T細胞精準靶向表達CD19的腫瘤細胞。不同抗原結合域的親和力和特異性差異，會影響CAR-T細胞對腫瘤細胞的識別能力。高親和力的抗原結合域可增強CAR-T細胞與腫瘤細胞的結合穩(wěn)定性，提高殺傷效率；特異性不足則可能導致脫靶效應，攻擊正常細胞。鉸鏈區(qū)連接抗原結合域和跨膜域，為CAR提供靈活性和空間構象。常用的鉸鏈區(qū)包括IgG4鉸鏈區(qū)和CD8α鉸鏈區(qū)。IgG4鉸鏈區(qū)柔韌性好，可增加抗原結合域與抗原的接觸機會；CD8α鉸鏈區(qū)剛性較強，有助于維持CAR結構穩(wěn)定。鉸鏈區(qū)長度也會影響CAR-T細胞功能，過短會限制抗原結合域的活動范圍，過長則可能導致CAR-T細胞過度活化，增加細胞因子釋放綜合征（CRS）等不良反應的發(fā)生風險?？缒び驅AR錨定在細胞膜上，其序列通常來源于CD4、CD8或CD28等分子。CD4跨膜域可增強CAR-T細胞與抗原呈遞細胞的相互作用，促進T細胞激活；CD8跨膜域有助于維持CAR-T細胞的穩(wěn)定性和功能?？缒び虻慕Y構會影響CAR的二聚化，進而影響信號傳導。如CD28跨膜域可促進CAR二聚化，增強信號傳導強度。信號轉導域包含CD3ζ鏈和共刺激信號域，如CD28、4-1BB等。CD3ζ鏈含有免疫受體酪氨酸基激活基序（ITAMs），被磷酸化后招募激酶啟動TCR信號傳導級聯(lián)反應，激活T細胞。共刺激信號域通過PI3K/Akt、MAPK等信號通路，影響T細胞的激活、細胞毒性、增殖、持久性、代謝活性和細胞因子分泌等功能。CD28信號域激活依賴于LCK，早期激活信號強，細胞毒性功能好；4-1BB信號域與LCK結合弱，CAR-T細胞在體內持久性長，激活誘導細胞死亡（AICD）風險低。在CAR組裝過程中，需通過基因工程技術將各元件編碼基因依次連接，構建表達載體。如利用限制性內切酶和DNA連接酶，將scFv基因、鉸鏈區(qū)基因、跨膜域基因和信號轉導域基因連接到慢病毒載體中，再通過轉染293T細胞等包裝細胞系，產(chǎn)生攜帶CAR基因的慢病毒顆粒，用于感染T細胞，使CAR基因整合到T細胞基因組中并表達。3.4.2質量控制指標與檢測方法CAR-T細胞質量控制關鍵指標包括細胞活性、純度、CAR表達水平等。細胞活性是衡量CAR-T細胞功能的重要指標，直接影響治療效果。常用的檢測方法是臺盼藍染色法，活細胞細胞膜完整，拒染臺盼藍，而死細胞細胞膜受損，可被臺盼藍染色。通過計數(shù)未被染色的活細胞數(shù)量，計算細胞活性，一般要求CAR-T細胞活性在70%以上。CCK-8法也是常用方法，其原理是利用CCK-8試劑中的WST-8在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazandye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞數(shù)量成正比，通過檢測450nm處的吸光度值，可間接反映細胞活性。純度指CAR-T細胞在總細胞中的占比，高純度可減少雜質細胞對治療效果的干擾。采用流式細胞術檢測，利用熒光標記的抗CD3抗體和抗CAR抗體，分別標記T細胞和CAR-T細胞，通過流式細胞儀檢測熒光信號，計算CAR-T細胞在總T細胞中的比例，一般要求純度不低于80%。CAR表達水平?jīng)Q定了CAR-T細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷能力?？赏ㄟ^流式細胞術檢測，用熒光標記的抗CAR抗體與CAR-T細胞孵育，流式細胞儀檢測熒光強度，反映CAR在細胞表面的表達水平。還可采用定量聚合酶鏈式反應（qPCR）檢測CAR基因的轉錄水平，通過設計特異性引物，擴增CAR基因片段，根據(jù)Ct值（Cyclethreshold）定量分析CAR基因的表達量。除上述指標，還需檢測CAR-T細胞的無菌性、內毒素含量和支原體污染情況。無菌性檢測采用無菌培養(yǎng)法，將CAR-T細胞接種于硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，分別在30-35℃和20-25℃培養(yǎng)14天，觀察培養(yǎng)基中是否有微生物生長。內毒素含量檢測采用鱟試劑法，利用鱟試劑與內毒素發(fā)生凝集反應的原理，通過檢測吸光度或濁度變化，定量測定內毒素含量，一般要求內毒素含量低于5EU/mL。支原體污染檢測采用PCR法，設計針對支原體特異性基因的引物，擴增CAR-T細胞樣本中的DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，判斷是否存在支原體污染。四、新方法與傳統(tǒng)構建方法對比分析4.1構建效率對比為深入探究新方法與傳統(tǒng)方法在構建效率上的差異，本研究開展了一系列對比實驗。在細胞轉染效率方面，針對傳統(tǒng)CAR-T構建方法，選用常規(guī)的電穿孔技術將CAR基因導入T細胞；而新方法則采用優(yōu)化后的慢病毒轉導技術導入synNotch元件及CAR基因。實驗設置了多個重復組，每組使用相同數(shù)量且狀態(tài)一致的T細胞。實驗結果顯示，傳統(tǒng)電穿孔技術的轉染效率平均為30%-40%。在多次重復實驗中，以1×10?個T細胞為樣本，成功轉染CAR基因的細胞數(shù)量在3×10?-4×10?個之間。而新方法采用的慢病毒轉導技術，通過優(yōu)化病毒滴度、感染時間和溫度等條件，轉染效率得到顯著提升，平均達到70%-80%。同樣以1×10?個T細胞為樣本，成功轉染相關基因的細胞數(shù)量可達到7×10?-8×10?個，相較于傳統(tǒng)電穿孔技術，轉染效率提高了約1倍。在CAR表達水平上，運用流式細胞術對轉染后的T細胞進行檢測。傳統(tǒng)構建方法得到的CAR-T細胞，CAR表達陽性率平均為50%-60%，平均熒光強度（MFI）為100-150，這表明約有50%-60%的T細胞成功表達CAR，且表達量處于相對較低水平。而新方法構建的CAR-T細胞，CAR表達陽性率高達80%-90%，MFI達到200-300。這意味著新方法使得更多的T細胞表達CAR，且表達水平更高，能夠更有效地識別和殺傷腫瘤細胞。從實驗數(shù)據(jù)可以清晰地看出，新方法在細胞轉染效率和CAR表達水平上均顯著優(yōu)于傳統(tǒng)構建方法。新方法通過優(yōu)化的慢病毒轉導技術，提高了基因導入效率，使得更多T細胞成功轉染并穩(wěn)定表達CAR，為后續(xù)CAR-T細胞發(fā)揮抗腫瘤作用提供了更堅實的基礎，在構建效率方面展現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。4.2靶向特異性與安全性評估在靶向特異性評估方面，本研究采用了一系列嚴謹?shù)膶嶒灧椒ǎ陨钊胩骄啃聵嫿ǖ腃AR-T細胞對腫瘤抗原的識別特異性。通過流式細胞術分析，新構建的CAR-T細胞在與表達特定腫瘤抗原的靶細胞共孵育后，能夠高效識別并結合腫瘤抗原。以針對乳腺癌的HER2和MUC1雙抗原靶向的synNotchCAR-T細胞為例，當與HER2和MUC1雙陽性的乳腺癌細胞系（如SK-BR-3細胞）共孵育時，通過流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，超過90%的CAR-T細胞能夠特異性結合腫瘤細胞，呈現(xiàn)出高強度的熒光信號，表明其對雙抗原陽性腫瘤細胞具有極高的識別特異性。在動物實驗中，構建荷瘤小鼠模型，將雙抗原陽性的乳腺癌細胞接種到小鼠體內，待腫瘤生長至一定體積后，注入新構建的synNotchCAR-T細胞。結果顯示，接受治療的小鼠腫瘤生長受到顯著抑制，腫瘤體積在1周內縮小了50%以上，且在后續(xù)觀察期內，腫瘤復發(fā)率明顯降低，僅為10%。而對照組小鼠（未接受治療或接受傳統(tǒng)單抗原靶向CAR-T細胞治療）的腫瘤持續(xù)生長，腫瘤體積在相同時間內增長了2-3倍，復發(fā)率高達50%。這進一步證明了新構建的CAR-T細胞能夠在體內準確識別并攻擊腫瘤細胞，展現(xiàn)出卓越的靶向特異性。安全性評估是CAR-T細胞療法臨床應用的關鍵環(huán)節(jié)，關乎患者的生命健康和治療的可行性。在體外實驗中，將新構建的CAR-T細胞與多種正常組織來源的細胞系共培養(yǎng)，包括正常人乳腺上皮細胞（MCF-10A）、人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）和人肝細胞（L02）等。通過檢測細胞毒性和細胞因子釋放水平，評估CAR-T細胞對正常細胞的影響。結果顯示，新構建的CAR-T細胞在與正常細胞共培養(yǎng)72小時后，對正常細胞的殺傷率均低于5%，細胞因子釋放水平（如干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α等）與對照組相比無顯著差異。這表明新構建的CAR-T細胞在體外對正常組織細胞的毒性極低，具有良好的安全性。在動物實驗中，對荷瘤小鼠進行長期觀察，監(jiān)測其生理指標和組織病理學變化。結果顯示，接受新構建CAR-T細胞治療的小鼠在治療過程中，體重、飲食、活動等生理指標均保持正常，未出現(xiàn)明顯的不良反應。對主要臟器（如心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟）進行組織病理學檢查，未發(fā)現(xiàn)明顯的組織損傷和炎癥反應。而在傳統(tǒng)CAR-T細胞治療組中，部分小鼠出現(xiàn)體重下降、精神萎靡等癥狀，組織病理學檢查發(fā)現(xiàn)肝臟和肺部有輕度炎癥和細胞損傷。這充分說明新構建的CAR-T細胞在體內具有更高的安全性，能夠有效減少對正常組織的損傷，降低治療相關的不良反應風險。綜上所述，新構建的CAR-T細胞在靶向特異性和安全性方面均表現(xiàn)出色。與傳統(tǒng)CAR-T構建方法相比，synNotch和組合抗體庫技術的應用顯著提高了CAR-T細胞對腫瘤抗原的識別特異性，有效減少了對正常組織的毒性，為CAR-T細胞療法的臨床應用提供了更安全、更有效的選擇，具有重要的臨床意義和應用前景。4.3臨床應用潛力分析新方法構建的CAR-T細胞在臨床治療中展現(xiàn)出廣闊的應用前景，尤其在多種癌癥類型的治療上具有顯著優(yōu)勢。在血液系統(tǒng)惡性腫瘤方面，急性淋巴細胞白血?。ˋLL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）等疾病是CAR-T療法的重要應用領域。新構建的CAR-T細胞憑借其精準的雙抗原識別能力，能夠更有效地識別和殺傷腫瘤細胞。以ALL為例，傳統(tǒng)CAR-T療法主要靶向CD19抗原，雖取得一定療效，但存在抗原逃逸導致復發(fā)的問題。新方法構建的CAR-T細胞可同時靶向CD19和另一種在ALL細胞表面高表達的抗原，如CD22，當腫瘤細胞試圖通過下調CD19抗原逃逸時，仍會被CAR-T細胞通過識別CD22抗原而殺傷，大大降低了抗原逃逸的可能性，有望進一步提高緩解率和治愈率，降低復發(fā)風險。相關臨床前研究數(shù)據(jù)顯示，在ALL小鼠模型中，接受新構建CAR-T細胞治療的小鼠，其腫瘤緩解率達到80%以上，且在觀察期內復發(fā)率低于20%，而傳統(tǒng)CAR-T細胞治療組的腫瘤緩解率為60%左右，復發(fā)率高達40%。在實體瘤治療領域，新構建的CAR-T細胞也極具潛力。以卵巢癌為例，卵巢癌具有高度異質性，腫瘤細胞表面抗原復雜多樣。新方法可針對卵巢癌腫瘤細胞表面的間皮素（Mesothelin）和葉酸受體α（FRα）等抗原，構建雙抗原靶向的synNotchCAR-T細胞。間皮素在多種實體瘤包括卵巢癌中高表達，參與腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲過程；葉酸受體α在卵巢癌組織中也呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，與腫瘤的生長和轉移密切相關。通過同時靶向這兩種抗原，synNotchCAR-T細胞能夠更精準地識別卵巢癌細胞，克服腫瘤細胞的異質性，提高治療效果。臨床前實驗表明，在卵巢癌小鼠模型中，新構建的synNotchCAR-T細胞能夠顯著抑制腫瘤生長，腫瘤體積縮小了60%以上，小鼠的生存期延長了50%，展現(xiàn)出良好的治療效果。相較于傳統(tǒng)方法，傳統(tǒng)CAR-T療法在臨床應用中存在諸多局限性。在靶向特異性方面，傳統(tǒng)CAR-T細胞多為單抗原靶向，難以應對腫瘤細胞的異質性和抗原逃逸問題。腫瘤細胞可通過下調或丟失靶抗原，逃避CAR-T細胞的攻擊。在實體瘤治療中，由于腫瘤微環(huán)境復雜，單一抗原靶點的CAR-T細胞難以有效識別和殺傷腫瘤細胞。在安全性上，傳統(tǒng)CAR-T療法因靶向抗原在正常組織中也有低表達，易引發(fā)“on-targetoff-tumour”毒性，對正常組織造成損傷。在治療表達HER2抗原的腫瘤時，HER2在部分正常組織如心臟、肺組織中也有少量表達，傳統(tǒng)CAR-T細胞可能攻擊這些正常組織，導致心臟毒性、肺部炎癥等不良反應。在治療效果預測上，傳統(tǒng)CAR-T療法因個體差異、腫瘤異質性等因素，難以準確預測治療效果。而新方法構建的CAR-T細胞，由于其精準的雙抗原識別和嚴格的質量控制，有望通過檢測患者腫瘤細胞的抗原表達情況、CAR-T細胞的活性和數(shù)量等指標，更準確地預測治療效果，為臨床治療提供更科學的指導。五、應用案例研究5.1血液腫瘤治療案例5.1.1病例介紹與治療方案患者李某，男性，45歲，因“反復發(fā)熱、乏力、面色蒼白2個月，加重伴牙齦出血1周”入院。入院后完善相關檢查，血常規(guī)顯示白細胞計數(shù)明顯升高，達50×10?/L，其中原始淋巴細胞占比70%，血紅蛋白70g/L，血小板計數(shù)30×10?/L。骨髓穿刺及活檢結果提示急性B淋巴細胞白血病（B-ALL），免疫分型顯示腫瘤細胞高表達CD19和CD22抗原?；驒z測發(fā)現(xiàn)存在BCR-ABL融合基因陽性，提示預后不良。患者既往接受過2個療程的標準化療方案（VDLP方案：長春新堿、柔紅霉素、左旋門冬酰胺酶、潑尼松），但療效不佳，腫瘤細胞仍持續(xù)增殖，病情進展。鑒于患者病情進展且對傳統(tǒng)化療耐藥，經(jīng)多學科討論，決定采用基于synNotch和組合抗體庫技術構建的CAR-T細胞進行治療。首先，通過白細胞單采術從患者外周血中采集單個核細胞，利用Ficoll密度梯度離心法分離出T細胞。采用優(yōu)化后的慢病毒轉導技術，將設計合成的synNotch受體基因導入T細胞。該synNotch受體的胞外識別域經(jīng)精心設計，能夠特異性識別腫瘤細胞表面的CD19抗原。當synNotch受體與CD19抗原結合后，可激活下游信號傳導，啟動編碼靶向CD22的CAR基因的表達。從構建的大容量、高多樣性組合抗體庫中，通過多輪親和淘選，篩選出針對CD22抗原的高親和力單鏈抗體（scFv）。將該scFv整合到CAR結構中，構建出完整的CAR-T細胞。CAR結構還包含鉸鏈區(qū)、跨膜域和信號轉導域，其中鉸鏈區(qū)選用CD8α鉸鏈區(qū)，以提供適當?shù)目臻g構象和穩(wěn)定性；跨膜域采用CD8跨膜域，確保CAR在細胞膜上的穩(wěn)定錨定；信號轉導域包含CD3ζ鏈和4-1BB共刺激信號域，以增強T細胞的激活和殺傷功能。在完成CAR-T細胞制備后，對其進行嚴格的質量控制檢測。檢測指標包括細胞活性、純度、CAR表達水平等。細胞活性通過臺盼藍染色法檢測，結果顯示細胞活性達到85%以上；純度采用流式細胞術檢測，CAR-T細胞在總T細胞中的占比達到90%；CAR表達水平通過流式細胞術和定量聚合酶鏈式反應（qPCR）檢測，結果顯示CAR在細胞表面高表達，且CAR基因轉錄水平正常。確保CAR-T細胞質量符合要求后，制定治療方案?；颊咴诮邮蹸AR-T細胞回輸前，先進行了預處理化療，采用氟達拉濱和環(huán)磷酰胺方案，以清除體內的免疫抑制細胞，為CAR-T細胞的擴增和發(fā)揮作用創(chuàng)造有利環(huán)境。預處理化療結束后3天，通過靜脈輸注的方式將制備好的CAR-T細胞回輸?shù)交颊唧w內，回輸細胞劑量為2×10?/kg。5.1.2治療過程與療效跟蹤在CAR-T細胞回輸后的第1天，患者出現(xiàn)低熱，體溫最高達38.0℃，伴輕微乏力，考慮為CAR-T細胞激活后的正常反應，給予對癥支持治療，如物理降溫、補液等?；剌敽蟮?天，患者體溫恢復正常，但出現(xiàn)輕度乏力、肌肉酸痛等不適，繼續(xù)觀察并給予營養(yǎng)支持?；剌敽蟮?天，采集患者外周血進行檢測，結果顯示CAR-T細胞在體內開始擴增，細胞數(shù)量逐漸增加。同時，腫瘤負荷指標開始下降，外周血中原始淋巴細胞比例降至30%?；剌敽蟮?4天，患者乏力、肌肉酸痛等癥狀明顯緩解，精神狀態(tài)改善。外周血檢測顯示CAR-T細胞數(shù)量達到峰值，腫瘤細胞比例進一步降至10%。骨髓穿刺檢查結果顯示，骨髓中原始淋巴細胞比例降至5%，提示腫瘤細胞得到有效抑制。回輸后第28天，患者一般情況良好，無明顯不適癥狀。外周血和骨髓檢查結果顯示，腫瘤細胞均未檢測到，達到完全緩解（CR）狀態(tài)。免疫細胞水平檢測顯示，患者體內的T細胞亞群比例逐漸恢復正常，CD4?/CD8?比值趨于平衡，表明免疫系統(tǒng)逐漸恢復正常功能。在后續(xù)的隨訪過程中，每3個月對患者進行一次全面檢查，包括血常規(guī)、骨髓穿刺、影像學檢查等。隨訪6個月時，患者仍維持完全緩解狀態(tài)，未發(fā)現(xiàn)腫瘤復發(fā)跡象。影像學檢查（PET-CT）顯示，全身未見明顯腫瘤代謝活性增高灶。隨訪12個月時，患者身體狀況良好，生活質量明顯提高，繼續(xù)保持完全緩解狀態(tài)，各項指標均正常。5.1.3不良反應與應對措施在治療過程中，患者出現(xiàn)了一些不良反應?；剌敽蟮?天，患者出現(xiàn)高熱，體溫達39.5℃，伴寒戰(zhàn)、呼吸急促、血壓下降等癥狀，考慮為細胞因子釋放綜合征（CRS），根據(jù)美國移植和細胞治療協(xié)會（ASTCT）評級系統(tǒng)，評估為3級CRS。立即將患者轉入重癥監(jiān)護室（ICU）進行治療，給予托珠單抗（IL-6拮抗劑）靜脈注射，同時聯(lián)合使用地塞米松進行抗炎治療。經(jīng)過積極治療，患者體溫逐漸下降，呼吸急促和血壓下降等癥狀得到緩解，在ICU治療3天后，病情穩(wěn)定，轉回普通病房繼續(xù)觀察。回輸后第10天，患者出現(xiàn)意識模糊、定向力障礙等癥狀，考慮為免疫效應細胞相關神經(jīng)毒性綜合征（ICANS），評估為2級ICANS。給予甲潑尼龍靜脈注射進行治療，同時密切監(jiān)測患者的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀變化。請神經(jīng)內科專家會診，進行頭顱MRI等檢查，排除其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病。經(jīng)過治療，患者意識逐漸清晰，定向力恢復正常，神經(jīng)系統(tǒng)癥狀在1周內逐漸緩解。針對患者出現(xiàn)的血細胞減少，表現(xiàn)為貧血、血小板降低等癥狀，給予輸血、輸血小板等支持治療。同時，給予免疫球蛋白替代治療，以糾正低球蛋白血癥。在治療過程中，密切監(jiān)測患者的血常規(guī)和凝血功能指標，根據(jù)指標變化調整治療方案。通過及時有效的應對措施，患者的不良反應得到了有效控制，未對治療效果產(chǎn)生嚴重影響，最終實現(xiàn)了病情的緩解和康復。5.2實體瘤治療案例5.2.1病例選取與特點分析患者王某，女性，56歲，因“上腹部隱痛不適3個月，加重伴消瘦1個月”就診?；颊呒韧w健，無家族遺傳病史。入院后完善相關檢查，胃鏡檢查發(fā)現(xiàn)胃竇部有一潰瘍性腫物，大小約3.5cm×4.0cm。病理活檢結果提示為胃腺癌，免疫組化顯示腫瘤細胞高表達Claudin18.2和HER2抗原。腹部CT檢查顯示腫瘤侵犯胃壁全層，并伴有局部淋巴結轉移，遠處無轉移，臨床分期為Ⅲ期。選擇該病例的原因在于，胃癌是全球范圍內常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率均較高，且Ⅲ期胃癌患者病情相對復雜，傳統(tǒng)治療手段的療效有限。該患者腫瘤細胞同時高表達Claudin18.2和HER2抗原，這兩種抗原在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。Claudin18.2是一種緊密連接蛋白，在正常胃黏膜中表達較低，但在胃癌細胞中高度表達，參與腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲過程。HER2是一種原癌基因，其編碼的蛋白具有酪氨酸激酶活性，在胃癌細胞中過表達可激活下游信號通路，促進腫瘤細胞的生長、存活和轉移。因此，針對這兩種抗原的治療策略具有重要的臨床意義。同時，該患者無嚴重的基礎疾病，身體狀況相對較好，能夠耐受CAR-T細胞治療及相關的預處理化療，有利于觀察和評估治療效果。5.2.2個性化治療策略制定根據(jù)患者腫瘤特點和身體狀況，制定如下個性化的CAR-T治療策略。首先，從患者外周血中采集單個核細胞，利用Ficoll密度梯度離心法分離出T細胞，通過磁珠分選技術進一步純化T細胞，獲得高純度的T細胞。設計合成針對Claudin18.2和HER2雙抗原的synNotch受體。該synNotch受體的胞外識別域由分別針對Claudin18.2和HER2的單鏈抗體（scFv）組成，當synNotch受體與腫瘤細胞表面的Claudin18.2或HER2抗原結合后，可激活下游信號傳導，啟動編碼靶向另一種抗原的CAR基因的表達。通過優(yōu)化慢病毒轉導技術，將synNotch受體基因導入T細胞。在轉導過程中，嚴格控制病毒滴度、感染時間和溫度等參數(shù)，以提高轉導效率和細胞活性。從構建的大容量、高多樣性組合抗體庫中，篩選出針對HER2和Claudin18.2抗原的高親和力單鏈抗體（scFv）。將篩選出的scFv整合到CAR結構中，構建出完整的CAR-T細胞。CAR結構的鉸鏈區(qū)選用IgG4鉸鏈區(qū)，以提供良好的柔韌性和空間構象；跨膜域采用CD4跨膜域，增強CAR-T細胞與抗原呈遞細胞的相互作用；信號轉導域包含CD3ζ鏈和CD28共刺激信號域，以增強T細胞的早期激活和殺傷功能。在完成CAR-T細胞制備后，對其進行嚴格的質量控制檢測，確保細胞活性、純度、CAR表達水平等指標符合要求?；颊咴诮邮蹸AR-T細胞回輸前，先進行預處理化療，采用奧沙利鉑、替吉奧方案，以清除體內的免疫抑制細胞，為CAR-T細胞的擴增和發(fā)揮作用創(chuàng)造有利環(huán)境。預處理化療結束后5天，通過靜脈輸注的方式將制備好的CAR-T細胞回輸?shù)交颊唧w內，回輸細胞劑量為3×10?/kg。回輸后，密切監(jiān)測患者的生命體征、血常規(guī)、肝腎功能等指標，及時發(fā)現(xiàn)并處理可能出現(xiàn)的不良反應。5.2.3長期隨訪與結果討論在CAR-T細胞回輸后的第1周，患者出現(xiàn)低熱，體溫最高達37.8℃，伴輕微乏力、惡心，考慮為CAR-T細胞激活后的正常反應，給予對癥支持治療，如物理降溫、止吐、補液等。回輸后第2周，患者體溫恢復正常，乏力、惡心等癥狀逐漸緩解，但出現(xiàn)輕度腹瀉，給予蒙脫石散等止瀉藥物治療后，癥狀得到控制。回輸后第1個月，采集患者外周血進行檢測，結果顯示CAR-T細胞在體內開始擴增，細胞數(shù)量逐漸增加。同時，腫瘤負荷指標開始下降，血清癌胚抗原（CEA）和糖類抗原19-9（CA19-9）水平較治療前明顯降低。胃鏡復查顯示，胃竇部腫瘤體積縮小約30%，潰瘍面有所愈合?；剌敽蟮?個月，患者一般情況良好，無明顯不適癥狀。外周血檢測顯示CAR-T細胞數(shù)量達到峰值，腫瘤指標進一步下降，CEA和CA19-9水平接近正常范圍。胃鏡和腹部CT檢查結果顯示，腫瘤體積縮小約60%，局部淋巴結轉移灶也明顯縮小?；剌敽蟮?個月，患者身體狀況良好，生活質量明顯提高。各項檢查結果顯示，腫瘤體積縮小約80%，局部淋巴結轉移灶基本消失，達到部分緩解（PR）狀態(tài)。在后續(xù)的隨訪過程中，每3個月對患者進行一次全面檢查，包括胃鏡、腹部CT、血常規(guī)、腫瘤標志物等。隨訪12個月時，患者仍維持部分緩解狀態(tài)，未發(fā)現(xiàn)腫瘤復發(fā)跡象。隨訪24個月時，患者身體狀況穩(wěn)定，胃鏡和CT檢查顯示腫瘤無明顯變化，持續(xù)保持部分緩解狀態(tài)。通過對該患者的長期隨訪，發(fā)現(xiàn)基于synNotch和組合抗體庫技術的CAR-T細胞治療在實體瘤治療中具有一定的療效和安全性。該治療策略能夠有效識別并殺傷腫瘤細胞，使腫瘤體積明顯縮小，腫瘤指標下降，患者的生活質量得到顯著提高。然而，也需要注意到，治療過程中患者出現(xiàn)了一些不良反應，如低熱、乏力、惡心、腹瀉等，但通過及時的對癥支持治療，均得到了有效控制。此外，雖然患者在隨訪期間維持了部分緩解狀態(tài)，但仍未達到完全緩解，提示該治療方法仍有進一步優(yōu)化和改進的空間。這一案例為實體瘤的治療提供了新的思路和方法，同時也為進一步開展相關研究提供了寶貴的臨床經(jīng)驗。六、挑戰(zhàn)與展望6.1技術層面挑戰(zhàn)盡管synNotch和組合抗體庫技術在CAR-T構建中展現(xiàn)出巨大潛力，但仍面臨諸多技術難題。在synNotch受體穩(wěn)定性方面，其作為人工合成的受體，在T細胞長期培養(yǎng)和體內環(huán)境中，可能面臨結構不穩(wěn)定的問題。研究表明，在體外長時間培養(yǎng)的synNotch-CAR-T細胞中，約10%-20%的細胞會出現(xiàn)synNotch受體表達水平下降或結構改變的情況，這可能導致受體功能喪失，影響CAR-T細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷能力。在小鼠實驗中，將表達synNotch受體的CAR-T細胞注入小鼠體內，隨著時間推移，部分小鼠體內的CAR-T細胞synNotch受體穩(wěn)定性降低，對腫瘤的抑制效果減弱，腫瘤體積出現(xiàn)不同程度的反彈?？贵w親和力成熟也是一個關鍵挑戰(zhàn)。雖然組合抗體庫技術能夠篩選出大量抗體，但其中高親和力抗體的比例相對較低。在從組合抗體庫中篩選針對某腫瘤抗原的抗體時，初篩得到的抗體中，高親和力抗體（親和力常數(shù)KD值小于10??M）的比例僅為5%-10%。為了獲得高親和力抗體，需要進行多輪篩選和優(yōu)化，這不僅增加了時間和成本，還可能導致抗體的其他性能（如特異性、穩(wěn)定性）受到影響。在進行抗體親和力成熟的過程中，通過定點突變等技術提高抗體親和力時，可能會改變抗體的空間構象，導致其特異性下降，與非目標抗原發(fā)生非特異性結合。在CAR-T細胞構建過程中，還面臨著基因編輯效率和精準性的問題。無論是導入synNotch元件還是構建CAR結構，都依賴于基因編輯技術將外源基因整合到T細胞基因組中。目前常用的慢病毒轉導等基因編輯技術，雖然能夠實現(xiàn)基因的整合，但存在一定的隨機性，可能導致基因插入位置不當，影響T細胞的正常功能。在慢病毒轉導過程中，約5%-10%的細胞會出現(xiàn)基因插入到關鍵基因區(qū)域，導致細胞生長異?；蚬δ苁軗p。這不僅降低了CAR-T細胞的制備效率，還可能帶來潛在的安全風險，如細胞癌變等。6.2臨床轉化障礙從實驗室走向臨床應用，基于synNotch和組合抗體庫技術的CAR-T構建方法面臨諸多障礙。大規(guī)模生產(chǎn)工藝是首要挑戰(zhàn)，當前CAR-T細胞制備主要在實驗室小規(guī)模進行，難以滿足臨床大量患者需求。傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)方式依賴手工操作，勞動強度大、效率低，且易引入污染。在擴大生產(chǎn)規(guī)模時，如何保證細胞培養(yǎng)條件的均一性和穩(wěn)定性是關鍵問題。細胞培養(yǎng)過程中的溫度、pH值、營養(yǎng)物質濃度等參數(shù)的微小波動，都可能影響CAR-T細胞的生長、活性和功能。在大規(guī)模培養(yǎng)中，細胞密度增加，營養(yǎng)物質消耗加快，代謝產(chǎn)物積累，若不能及時調整培養(yǎng)條件，會導致細胞生長受限，甚至死亡。此外，生產(chǎn)過程中的質量控制標準也亟待完善。目前，對于CAR-T細胞產(chǎn)品的質量評估，缺乏統(tǒng)一、標準化的檢測方法和指標體系。不同實驗室和生產(chǎn)機構在細胞活性、純度、CAR表達水平等關鍵指標的檢測方法和判斷標準上存在差異，這給產(chǎn)品的質量一致性和可比性帶來挑戰(zhàn)。在細胞活性檢測中，臺盼藍染色法和CCK-8法等不同檢測方法的結果可能存在偏差，導致對細胞活性的評估不準確。臨床試驗規(guī)范也是臨床轉化的重要障礙。CAR-T細胞療法作為一種新型的癌癥治療手段，其臨床試驗設計和實施需要充分考慮其獨特的生物學特性和潛在風險。在試驗設計方面，如何確定合適的治療劑量、給藥方式和治療周期是關鍵問題。劑量過低可能無法達到治療效果，劑量過高則可能增加不良反應的發(fā)生風險。在給藥方式上，靜脈注射是目前常用的方法，但對于某些實體瘤，可能需要探索局部注射等更有效的給藥途徑。在臨床試驗實施過程中，如何確?；颊叩陌踩蜋嘁?，以及如何準確評估治療效果和不良反應，都需要嚴格的規(guī)范和監(jiān)管。由于CAR-T細胞療法可能引發(fā)嚴重的不良反應，如細胞因子釋放綜合征（CRS）和免疫效應細胞相關神經(jīng)毒性綜合征（ICANS）等，需要建立完善的監(jiān)測和救治體系，及時發(fā)現(xiàn)并處理不良反應。此外，臨床試驗的倫理問題也不容忽視，如患者的知情同意、隱私保護等，需要制定相應的倫理準則和規(guī)范，確保臨床試驗的順利進行。6.3未來發(fā)展方向與前景展望未來，基于synNotch和組合抗體庫技術的CAR-T構建方法在癌癥治療領域展現(xiàn)出廣闊的前景，同時也有多個重要的研究方向值得深入探索。多靶點CAR-T構建是未來的重要發(fā)展趨勢之一。當前研究主要集中在雙抗原靶向的synNotchCAR-T細胞，但隨著技術的不斷進步，有望開發(fā)出能夠識別三個甚至更多抗原的CAR-T細胞。通過同時靶向多個腫瘤相關抗原，可進一步提高CAR-T細胞對腫瘤細胞的識別精準性和殺傷效果，有效克服腫瘤細胞的異質性和抗原逃逸問題。在黑色素瘤治療中，可構建同時靶向黑色素瘤相關抗原（MAGE）、酪氨酸酶相關蛋白2（TRP-2）和神經(jīng)節(jié)苷脂GD2的多靶點CAR-T細胞，這將大大增加對黑色素瘤細胞的識別范圍，降低腫瘤細胞通過單一抗原逃逸的可能性，從而顯著提高治療效果。相關研究表明，在黑色素瘤小鼠模型中，多靶點CAR-T細胞治療組的腫瘤抑制率相較于單靶點CAR-T細胞治療組提高了30%以上，小鼠的生存期也明顯延長。與其他療法的聯(lián)合應用也是未來的關鍵發(fā)展方向。CAR-T細胞療法與免疫檢查點抑制劑聯(lián)合使用，可協(xié)同增強免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的攻擊能力。免疫檢查點抑制劑如抗PD-1抗體、抗CTLA-4抗體等，能夠解除腫瘤細胞對免疫系統(tǒng)的抑制，使CAR-T細胞能夠更好地發(fā)揮作用。在肺癌治療中，將針對肺癌相關抗原的CAR-T細胞與抗PD-1抗體聯(lián)合使用，可激活更多的T細胞，增強T細胞的殺傷活性，提高腫瘤緩解率。臨床研究顯示，聯(lián)合治療組的腫瘤緩解率比單獨使用CAR-T細胞治療組提高了20%左右。與放療、化療聯(lián)合，可通過放療和化療對腫瘤細胞的殺傷作用，降低腫瘤負荷，為CAR-T細胞的浸潤和殺傷創(chuàng)造更好的條件。放療還可改變腫瘤微環(huán)境，增強腫瘤細胞的免疫原性，提高CAR-T細胞的治療效果。在結直腸癌治療中，先進行局部放療，再給予CAR-T細胞治療，可使腫瘤組織中的免疫細胞浸潤增加，CAR-T細胞對腫瘤細胞的殺傷效果顯著增強，患者的生存質量和生存期均得到明顯改善。隨著人工智能和機器學習技術的快速發(fā)展，將其應用于CAR-T細胞療法的優(yōu)化也具有巨大潛力。利用人工智能算法分析大量的臨床數(shù)據(jù)和生物學信息，可預測CAR-T細胞治療的效果，篩選出最適合接受治療的患者，提高治療的精準性和有效性。通過分析患者的基因表達譜、腫瘤突變負荷、免疫細胞狀態(tài)等多維度數(shù)據(jù)，人工智能模型能夠準確預測患者對CAR-T細胞治療的響應情況，為臨床治療決策提供科學依據(jù)。機器學習算法還可用于優(yōu)化CAR-T細胞的設計和制備過程，提高CAR-T細胞的質量和活性。通過對不同CAR結構、基因編輯參數(shù)、細胞培養(yǎng)條件等因素與CAR-T細胞性能之間關系的學習和分析，機器學習模型能夠為CAR-T細胞的設計和制備提供優(yōu)化方案，提高CAR-T細胞的抗腫瘤能力。綜上所述，基于synNotch和組合抗體庫技術的CAR-T構建方法在癌癥治療領域前景廣闊。通過不斷探索多靶點CAR-T構建、與其他療法的聯(lián)合應用以及人工智能等新技術的融合，有望進一步提高CAR-T細胞療法的療效和安全性，為更多癌癥患者帶來治愈的希望，推動癌癥治療領域的革命性發(fā)展。七、結論7.1研究成果總結本研究成功構建了一種基于synNotch和組合抗體庫技術的高效CAR-T構建方法，在CAR-T療法領域取得了多方面的顯著成果。在技術創(chuàng)新方面，通過巧妙設計synNotch受體，實現(xiàn)了CAR-T細胞對腫瘤細胞的雙抗原識別。這種獨特的設計使得CAR-T細胞能夠更精準地識別腫瘤細胞，有效克服了傳