鹽酸帕羅西汀原料藥含量測定方法學(xué)驗(yàn)證摘要目的：對鹽酸帕羅西汀原料藥進(jìn)行含量測定方法學(xué)驗(yàn)證。方法：通過采用高效液相色譜法來對鹽酸帕羅西汀原料藥進(jìn)行含量測定方法學(xué)驗(yàn)證，采用破壞性試驗(yàn)來考察藥物專屬性；通過該變色譜條件來考察耐用性；通過稀釋藥物的濃度考察線性與范圍；通過考察進(jìn)樣精密度，中間精密度和重復(fù)性進(jìn)行儀器精密度的驗(yàn)證。結(jié)果：考察的指標(biāo)得到的結(jié)果都符合規(guī)定；結(jié)論：該方法測得鹽酸帕羅西汀原料藥的專屬性，耐用性，線性與范圍，精密度良好。關(guān)鍵詞：帕羅西汀；高效液相色譜法；含量測定Abstract:Objective:TodeterminethecontentofPalosihydrochlorideAPIbyhighperformanceliquidchromatography.Methods:Thedrugspecificitytestwasinvestigatedbyusingthedestructionexperiment,thedurabilitywasbychangingthechromatographiccondition,thelinearityandrangeweredilutedbytheconcentrationofthedrug,andtheprecisionwasbyinvestigatingthesampleprecision,intermediateprecisionandrepeatability.Results:Thismethodconformstothepharmacopoeiaregulation,andthespecificity,durability,linearityandrangeofparoxetinehydrochlorideAPIsmeasuredinthismethodaregood.Keywords:paroxetine;HighPerformanceliquidchromatography(HPLC);contentdetermination.1前言1.1選題背景隨著社會的進(jìn)步，人們的壓力也在不斷增加，年輕人的壓力來自于生活和工作如高的離譜從不停的漲房價，競爭超激烈的就業(yè)壓力，人際壓力，學(xué)術(shù)壓力，感情的撲朔迷離，甚至是孩子學(xué)習(xí)和生活的問題。老年人身體的不適，親朋好友的離世，缺少兒女的關(guān)心心情會低落?，F(xiàn)在很多人都會出現(xiàn)迷茫，焦慮，恐慌，焦躁甚至是抑郁癥。在如今社會很多人得抑郁病，流調(diào)研究結(jié)果顯示[1]，西方國家患抑郁癥的概率遠(yuǎn)高于東方國家，農(nóng)村人群收入低負(fù)擔(dān)重相比于城市人群得抑郁癥的概率要大，女性瑣事多，心胸狹窄，壓力大，相比于男性來說患抑郁癥的概率要高，很多女性的抑郁是在產(chǎn)后，在衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)調(diào)查顯示：目前心腦血管患病人群不斷增加，抑郁癥的患病率緊追其后，這種疾病往往會使人自殘和自傷死亡，人們的生命財產(chǎn)安全以及生活質(zhì)量嚴(yán)重的受到了影響。抑郁癥是一種很難以治療的疾病，患病后患者常會反反復(fù)復(fù)的發(fā)作，病程時好時壞。在疾病不發(fā)作的時候精神活動和正常人一樣，無明顯癥狀，當(dāng)疾病的發(fā)作時的主要癥狀包括心煩意亂，沒精神，對性生活不感興趣和對生活缺乏興趣，常想是跳樓割腕自殺。軀體癥狀變現(xiàn)為睡眠障礙（失眠和覺醒次數(shù)多），軀體消瘦，重癥的抑郁癥患者每日禁水禁食，不與人交流，每天想著都是些煩心事越想越難受經(jīng)常淚流滿面[2]。1.1.1傳統(tǒng)抑郁藥與新型抑郁藥物的比較治療抑郁癥傳統(tǒng)三環(huán)類藥物（TcAs）的基本母核是吩噻嗪，這類藥物光毒性較強(qiáng)，因此服用該藥物時應(yīng)避光減少戶外運(yùn)動。兩類（傳統(tǒng)性和新型）抑郁藥作用機(jī)制是無明顯差別的，經(jīng)過上市后臨床反應(yīng)傳統(tǒng)型抑郁藥類藥物的副作用比較大，安全范圍比較窄。在抑郁藥病因?qū)W方面的不斷完善研發(fā)出新型的抗抑郁藥5-羥色（SSRI）,經(jīng)過臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)新型的抗抑郁藥耐受性程度比較好，安全性高。因此新型的抑郁成為臨床常用的一線藥物[3]。1.1.2新型抗抑郁藥物的比較專一性好，安全性和選擇性較高是帕羅西汀在同類藥物中最大的優(yōu)點(diǎn)，能高效的選擇性阻斷5-羥色胺（5-HT）重攝取，因此成為了臨床抗抑郁藥物中最常用的藥物。1.1.3原料藥的含義原料藥的含義：在用于藥品制造中的任何一種物質(zhì)或物質(zhì)的混合物，而且在用于制藥時，成為藥品的一種活性成分。原料藥是發(fā)揮藥理活性的有效成分。1.2選題目的和意義隨著技術(shù)的進(jìn)步發(fā)現(xiàn)通過改善原料藥的苦味是可以影響掩蓋劑型的苦味，在原料藥含水的聚合物涂層材料是可以達(dá)到原料藥的釋放。當(dāng)前測定原料藥的方法有高效液相色譜法，氣相色譜法，滴定法[4]。采用高效液相色譜法測定原料藥的優(yōu)點(diǎn)是：分離效率高，選擇性好，穩(wěn)定性好，檢測靈敏度高，操作自動化，應(yīng)用范圍廣；與氣相色譜法相比具有的優(yōu)點(diǎn)：不受試樣的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性限制，應(yīng)用范圍廣；流動相種類多，可通過流動相的優(yōu)化達(dá)到高的分離效率；一般在啊室溫下分析即可，不需高柱溫。鹽酸帕洛西汀抗抑郁癥的作用是通過增加激動性遞質(zhì)5-羥色胺（5-HT）在突觸間隙的濃度，從而增加了遞質(zhì)傳遞功能，在治療各種抑郁癥及焦慮癥，都有一定的療效。2藥物的基本情況2.1藥品名稱通用名稱：鹽酸帕羅西汀原料藥商品名稱：賽樂特英文名稱：ParoxetineHydrochlorideTablets化學(xué)結(jié)構(gòu)：屬于哌啶類衍生物，包含兩個手性中心。2.2藥代動力學(xué)該藥物的服用方法一般是口服，有首關(guān)效應(yīng)。2.3臨床應(yīng)用及不良反應(yīng)應(yīng)用：帕羅西汀用于治療各種類型的抑郁癥及焦慮癥、失眠癥、腸易激綜合征,驚恐障礙等。對伴有焦慮癥狀的重癥抑郁癥患者帕羅西汀的藥效作用很強(qiáng)、起效時間及痊愈時間短。在臨床上一些難治療的抑郁癥以及服用傳統(tǒng)的抗抑郁藥，新型的抗抑郁藥都沒有療效的患者服用帕羅西汀后能夠很明顯的改善病人抑郁效果。不良反應(yīng)：1.帕洛西汀引起低鈉血癥的原因是5-羥色胺的重攝取減少，而突觸間隙5羥色胺的濃度大量增加從而導(dǎo)致抗利尿激素分泌異常[5]。2.帕羅西汀口服治療后會出現(xiàn)過敏性反應(yīng)如過敏性紫癜和皮疹水腫，但是只要停用帕羅西汀并服用些抗過敏藥物對癥治療后，過敏癥狀立馬消失［6]。3.癲癇樣發(fā)作。年齡在18-57歲服用帕羅西汀后，會出現(xiàn)癲癇最常見的癥狀如四肢抽搐，沒有意識最怕的是咬舌自盡，出現(xiàn)這些癥狀應(yīng)對癥治療或換藥后不在有癲癇樣癥狀[7-8]。2.4注意事項(xiàng)服用鹽酸帕羅西汀藥物會對肝腎功能造成一定傷害，因此服用該藥物時要檢測肝腎功能,吡啶環(huán)的4為有氟苯基，服用該藥物時盡量減少戶外運(yùn)動。3實(shí)驗(yàn)試劑試藥、儀器、方法3.1試藥與試劑表1試藥與試劑試劑試藥批號生產(chǎn)商家帕羅西汀20180506浙江尖峰醋酸銨H1807006阿拉丁冰醋酸20140329天津市永大化學(xué)試劑有限公司甲醇LQ10591北京百靈威科技有限公司純化水——自制鹽酸121120洛陽市化學(xué)試劑廠氫氧化鈉20150505天津市永大化學(xué)試劑有限公司3.2儀器與設(shè)備表2儀器與設(shè)備名稱型號生產(chǎn)廠家電子分析天平T-214TB-215D北京賽多利斯北京賽多利斯十八烷基硅烷鍵合硅膠柱SB-C18Agilent高效液相色譜儀1260AgilentPH計(jì)PB-10北京賽多利斯3.3實(shí)驗(yàn)方法色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：色譜柱：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；254nm檢測波長1.2ml·min-1流速45℃柱溫A、0.05mol·L-1醋酸銨溶液（精密稱取醋酸銨3.86g，加適量水溶解并稀釋至1000mL，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.5）B、甲醇流動相A∶B=60∶40精密量取對照品溶液20uL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。理論塔板數(shù)按帕羅西汀峰計(jì)算應(yīng)不得小于3000。供試品和對照品溶液：取供試品約10mg，精密稱定，置100mL容量瓶中，用少于甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，精密量取5mL溶液，用流動相稀釋至刻度置50mL量瓶中，搖勻，作為供試品溶液；取對照品約10mg，精密稱定，同法制成對照品溶液。測定：分別精密量取對照品溶液、供試品溶液各20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積的計(jì)算。公式：含量%=m3.4含量方法的建立含量測定是采用高效液相色譜法[9-10]，色譜條件：依據(jù)藥典帕羅西汀溶出度測定條件，0.05mol·L-1醋酸銨溶液、甲醇分別為流動相A、B,兩者的比例為60∶40，檢測波長設(shè)為254nm，流速為1.2mL·min，柱溫為25℃，進(jìn)樣量20μL。4含量測定的方法學(xué)驗(yàn)證4.1專屬性4.1.1強(qiáng)制降解試驗(yàn)未破壞試驗(yàn)溶液：精密稱取鹽酸帕羅西汀12.76mg（約相當(dāng)于帕羅西汀10mg），用20mL甲醇溶解，再用流動相稀釋定容至100mL容量瓶中，搖勻，精密量取5mL溶液用流動相定容至50mL容量瓶中，混勻。酸破壞試驗(yàn)溶液：取鹽酸帕羅西汀12.76mg（約相當(dāng)于帕羅西汀10mg），先少加甲醇使溶解，為了充分的溶解多次加入甲醇，加入甲醇的總量為20mL，加酸破壞選用的試劑1mol·L-1鹽酸溶液8mL，在37℃水浴條件下，水浴1小時，在常溫下放冷用1mol·L-1氫氧化鈉溶液8mL中和，用甲醇稀釋定容至100mL容量瓶中，搖勻，精密量取5mL溶液用流動相稀釋至50mL容量瓶中，搖勻[11-12]。堿破壞試驗(yàn)溶液：取鹽酸帕羅西汀12.75mg（約相當(dāng)于帕羅西汀10mg），先少加甲醇使溶解，為了充分的溶解多次加入甲醇，加入甲醇的總量為20mL，加堿破壞的試劑1mol·L-1氫氧化鈉溶液8mL后是在37℃水浴條件下加熱0.5小時，取出放冷用1mol·L-1鹽酸溶液8mL中和用甲醇稀釋定容至100mL容量瓶中，搖勻，精密量取5mL，用流動相來稀釋定容至50mL容量瓶中，搖勻[11-12]。氧破壞試驗(yàn)溶液：取鹽酸帕羅西汀12.76mg（約相當(dāng)于帕羅西汀10mg），先少加甲醇使溶解，為了充分的溶解多次加入甲醇，加入甲醇的總量為20mL，在加3mL氧破壞的試劑過氧化氫溶液（30%），在常溫（25℃）下連續(xù)放置14小時，用甲醇稀釋定容至100mL容量瓶中，搖勻，精密量取5mL，用流動相稀釋定容至50mL容量瓶，搖勻。光照破壞試驗(yàn)溶液：取鹽酸帕羅西汀12.77mg（約相當(dāng)于帕羅西汀10mg），先少加甲醇使溶解，為了充分的溶解多次加入甲醇，加入甲醇的總量為20mL，光照25小時是在光照強(qiáng)度為4500Lx條件下，取出放冷，并用甲醇稀釋定容至100mL容量瓶中，搖勻，精密量取5mL，用流動相稀釋定容至50mL容量瓶中，搖勻。高溫破壞試驗(yàn)溶液：取在130℃條件下加熱6小時的樣品12.77mg（約相當(dāng)于帕羅西汀10mg），精密稱定，用甲醇溶解定容至100mL容量瓶中，搖勻，精密量取5mL溶液用流動相稀釋定容至50mL容量瓶中，搖勻?？瞻兹芤海▔A、酸、氧）的制備方法同上。精密量取上述溶液各20μL，進(jìn)樣，結(jié)果見下表。表3強(qiáng)降解試驗(yàn)結(jié)果名稱回收量(%)主峰保留時間(分鐘)降解產(chǎn)物峰保留時間(分鐘)與帕羅西汀的分離度未破壞100.0013.01————酸破壞100.0012.91————堿破壞97.8013.002.0340.99氧化破壞93.7313.042.9835.08光破壞100.0012.97————高溫破壞100.0012.97————由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，藥物的穩(wěn)定性是在堿破壞和氧化破壞條件下，降解雜質(zhì)與帕羅西汀峰分離良好；在高溫，光照，酸破壞條件下無明顯雜質(zhì)產(chǎn)生是比較穩(wěn)定的。4.2線性與范圍取帕羅西汀對照品約10mg，精密稱定，用甲醇20mL使其溶解，用流動相稀釋制成一系列不同濃度的對照品溶液，按含量測定法，精密量取20μL注入色譜儀，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性每個濃度都需要進(jìn)樣兩次。線性回歸是以濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)來考察線性關(guān)系。試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果y=38.338x-10.094，相關(guān)系數(shù)R2=1表4氫鹽酸帕羅西汀含量測定線性試驗(yàn)結(jié)果濃度（ug·mL-1）平均峰面積11.0137.5122.0273.4835.06187.91410.11373.00520.22757.14650.551911.387101.103875.79圖1氫鹽酸帕羅西汀含量方法學(xué)線性關(guān)系圖上述試驗(yàn)結(jié)果可表明，在含量測定條件下，在一定濃度范圍內(nèi),峰面積與濃度的線性關(guān)系良好。4.3精密度4.3.1進(jìn)樣精密度精密量取供試品溶液20μL注入液相色譜儀中，同一溶液進(jìn)樣6次，來考察儀器進(jìn)樣的精密度。下表的數(shù)據(jù)是由實(shí)驗(yàn)得出的5。表5氫鹽酸帕羅西汀含量測定進(jìn)樣精密度試驗(yàn)結(jié)果精密度峰面積平均峰面積RSD(%)1376.45————2377.76————3377.18377.230.164378.02————5377.25————6376.70————4.3.2重復(fù)性同一批號的樣品平行配制6份。對照品和供試品溶液的配制同上，對照品和供試品溶液各精密量取20μL后分別注入液相色譜儀中來測定供試品的含量。結(jié)果如下表6。表6重復(fù)性試驗(yàn)測得的結(jié)果次數(shù)含量（%）平均含量（%）RSD(%)199.17————298.51————398.18————498.7098.580.40598.13————698.81————4.3.3中間精密度取重復(fù)性測定項(xiàng)下同批樣品，同一個實(shí)驗(yàn)室由兩個分析人員，使用不同設(shè)備進(jìn)行操作，每個實(shí)驗(yàn)員做的時候平行配制6份供試品溶液，依據(jù)含量測定法測定其含量為中間精密度的考察方法。實(shí)驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)見表7。表7氫鹽酸帕羅西汀中間精密度試驗(yàn)結(jié)果次數(shù)含量（%）平均含量（%）RSD(%)199.17————298.51————第一人398.18————498.70————598.13————698.81————198.3198.860.58第二人298.81————398.71————499.63————599.35————699.95————由上表得出的結(jié)論：，在同一實(shí)驗(yàn)室不同日期由不同的分析人員對同一批樣品進(jìn)行含量測定RSD值小于2.0%，符合藥典規(guī)定說明本方法中間精密度良好。以上試驗(yàn)結(jié)果顯示，進(jìn)樣精密度，重復(fù)性、中間精密度結(jié)果的RSD值均小于2.0%，表明采用該方法的精密度良好符合帕羅西汀原料藥含量的測定。84.4耐用性檢測波長為254±2nm、水相比例40%±2%、流速為1.2±20%、不同品牌及填料的色譜柱來評估測定條件有微小變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度，柱溫為45℃±5℃。由實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果見表8[13]。表8色譜條件變動的參數(shù)色譜條件規(guī)定值變動范圍波長254nm252nm與256nm水相比例40%38%與42%流速1.2ml/min1.0ml/mi1.4ml/min色譜柱菲羅門不同品牌及填料柱溫45℃40與50℃4.4.1波長耐用性試驗(yàn)照含量測定法，調(diào)整波長±2nm，對同一批樣品進(jìn)行含量測。表9鹽酸帕羅西汀含量測定耐用性試驗(yàn)結(jié)果（波長差異）波長nm含量（%）平均含量（%）RSD(%)25299.78————25499.9799.850.125699.81————4.4.3流速耐用性試驗(yàn)照含量測定法，調(diào)整流速±20%，對同一批樣品進(jìn)行含量測定。表10鹽酸帕羅西汀含量測定耐用性試驗(yàn)結(jié)果（流速差異）流速mL·min-1含量（%）平均含量（%）RSD(%)1.099.86————1.299.97100.000.161.5100.17————4.4.4改變水相比例按照含量測定法，對水相比例做適當(dāng)調(diào)整，對同一批樣品進(jìn)行含量測定。表11鹽酸帕羅西汀含量測定耐用性試驗(yàn)結(jié)果（流動相比例）水相比例含量（%）平均含量（%）RSD（%）38%99.40————40%99.9799.730.2942%99.81————4.4.5柱溫耐用性試驗(yàn)按照含量測定法，調(diào)整柱溫±5℃，對同一批樣品進(jìn)行含量測定。表12鹽酸帕羅西汀含量測定耐用性試驗(yàn)結(jié)果（柱溫差異）柱溫45℃含量（%）平均含量（%）RSD(%)40100.05————4599.97100.020.0750100.07————4.4.6色譜柱耐用性試驗(yàn)按照含量測定法，更換不同品牌及填料的色譜柱，對同一批樣品進(jìn)行含量測定。表13鹽酸帕羅西汀含量測定耐用性試驗(yàn)結(jié)果（色譜柱差異）色譜柱品牌含量（%）平均含量(%)RSD(%)菲羅門99.97——0.46-761007-13100.45————Waters99.54————由上表可知，通過在一定的范圍內(nèi)改變色譜條件測定得出RSD小于2.0%，符合規(guī)定，該方法的耐用性良好。5討論采用高效液相色譜法測定奧硝唑片含量,用此方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為R2=0.9998，在2.024-20.24ug·mL-1的濃度范圍內(nèi)線性良好。精密度實(shí)驗(yàn)RSD%為0.18,重復(fù)性試驗(yàn)RSD%為0.40，中間精密度實(shí)驗(yàn)RSD%為0.85，通過在一定范圍內(nèi)改變色譜條件下測得RSD小于2.0%。同樣采用高效液相色譜法測定鹽酸帕羅西汀含量，用此方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2=1，在一定的濃度（1.0ug·mL-1～101.1ug·mL-1）范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系。精密度實(shí)驗(yàn)RSD%為.16，重復(fù)性試驗(yàn)RSD%=0.40，中間精密度實(shí)驗(yàn)RSD%為0.58，通過在一定范圍內(nèi)改變色譜條件下測得RSD小于2.0%。采用同一種方法測定不同藥物時，帕羅西汀原料藥的含量方法學(xué)驗(yàn)證測定的結(jié)果更精準(zhǔn)。6結(jié)論經(jīng)過以上含量測定的方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果可得出，通過采用破壞性試驗(yàn)測的專屬性良好，空白溶劑無干擾，氫鹽酸帕羅西汀峰理論塔板數(shù)符合要求。氫鹽酸帕羅西汀在一定的濃度范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系。通過對進(jìn)樣精密度、重復(fù)性、中間精密度試驗(yàn)測得RSD值均小于2.0%，可得該方法的精密度良好，在改變色譜條件下測得均具有良好的耐用性。高效液相色譜法下測的該方法的耐用性、精密度、專屬性均符合規(guī)定適用于帕羅西汀原料藥的含量測定。10參考文獻(xiàn)：[1]SmithAL,WeissmanMM.Epidemiology[M].InHandbookofAffectiveDisordersEdinburgh:Churc