2306I 2 2 2 9 本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構和起草規(guī)則》的規(guī)定請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別這些專利的責任。楠楠，闕桃林，倪宏波，聞曉波，張曉軒，侯喜林1牛呼吸道疾病綜合征病原PCR檢測技術規(guī)范本文件規(guī)定了牛呼吸道疾病綜合征病原PCR檢測技術的環(huán)境與設施、儀器設備、試劑與材料、樣本GB/T18637牛病毒性腹瀉/粘膜病診斷技術GB/T27981牛傳染性鼻氣管炎病毒實時熒光PCR檢測NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范NY/T3234牛支原體PCR檢測方法SN/T1129牛病毒性腹瀉/粘膜牛呼吸道疾病綜合癥bovinerespiratorydisease4環(huán)境與設施具有與采集病料相適應的動物病原微生物實驗室條件和生物安全防護水平相適應的設備，以及防2生物安全柜、4℃離心機、PCR儀、漩渦震蕩器、水平電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、恒溫水浴鍋、實細菌總DNA提取試劑盒、PBS溶液、TrizolReagent試劑、玻璃平皿，玻璃燒杯(100mL、500mL、1000mL),量筒(100mL、200mL、500mL、1000mL)、鑷子(含彎頭鑷子),手術刀，組織研磨棒，剪刀(含彎頭剪刀),載玻片，酒精燈，移液槍(10μL、200μL、1000μL)等。離心管(1.5mL、2mL、15mL、50mL),采樣管(5mL),移液器吸頭(10μL、200μL、1000μL),棉拭子，注射器(5mL、10mL、20mL),一次性采血管(含針頭),PCR管(200μL)等。樣本采集遵循NY/T541的規(guī)定，見附錄1。擴增體系：上、下游引物各50pM,脫氧核糖核苷酸三磷酸(dNTPs)20mM,PCR緩沖液(MgCl?50mM)20mM,TaqDNA聚合酶0.75μL,樣品DNA體積5μL;加入無菌的不含核糖核酸酶的雙重蒸餾水，使其總?cè)莘e為50μL。3反應條件：共進行35個循環(huán)；每個溫度循環(huán)由95℃60s、57℃60s和72℃60s組成。最后1用IBRV特異性引物對分離培養(yǎng)物和IBRV標準株準株均能擴增出與目的基因片段大小一致的特異性條帶，擴增結(jié)果清晰，無雜帶，則為上游引物：5ˊ-TGTGGACCTAAACCTCACGGT-3ˊ(57499–下游引物：5ˊ-GTAGTCGAGCAGACCCGTGTC-3ˊ(探針序列：5ˊ-FAM-AGGACCGCGAGTTCTTGCCGC-TAMRA-3ˊ(57525–57通常根據(jù)所選擇的設備分析軟件說明設定閾值，來自陰性動物病毒分離陰性樣本，用做檢測系統(tǒng)的背景信號。每次檢測反應應該包括陰性對照、陽性對照和試劑對照。來自陰性牛的肺組織或者值應該在可接受的范圍內(nèi)(±3Ct值），為了盡量減少陽性對照造成的污染風險，應采用稀釋使CT值陰性結(jié)果：未檢測出Ct值的樣本應判定為陰性。陰性對照和未添加模板應檢測不出Ct值。根據(jù)BVDV病毒株基因序列5ˊUTR設計合成一對特異性引物上游引物：5ˊ-AGGCTAGCCATGCC24如被檢樣品有條帶，大小為244bp，與陽性樣品相同，即可8.2.2逆轉(zhuǎn)錄-實時熒光定量（R根據(jù)BVDV的5ˊUTR非編碼區(qū)合成引物和探針，序上游引物：5ˊ-CCGCGAMGGCCGA下游引物：5ˊ-TGACGACTNCCC探針序列：5ˊ-FAM-CCATGCCCTTAGTAGGACTAGCA-BH）；核酸，判為陽性；Ct（或Cp）值>35，且出現(xiàn)典型的擴增曲線的樣品需復檢。復檢仍出現(xiàn)上述結(jié)果的，58.3.2逆轉(zhuǎn)錄-實時熒光定量（RT-qPCR探針序列：5ˊ-FAM-TTGCGCTTGCACC-M通常根據(jù)所選擇的設備分析軟件說明設定閾值，來自陰性動物病毒分離陰性樣本，用做檢測系統(tǒng)根據(jù)Ct（或Cp）值對試驗結(jié)果進行描述及判定，描述和判定分為：無Ct（或Cp）值，且線，表示樣品中無BPIV3核酸，判為陰性；Ct（或Cp）值<35，且出現(xiàn)典型的擴增曲線在BPIV3核酸，判為陽性；Ct（或Cp）值>35，且出現(xiàn)典型的擴增曲線的樣品需復檢。復檢仍6），8.4.2逆轉(zhuǎn)錄-實時熒光定量PCR（RT-qPCR根據(jù)Ct（或Cp）值對試驗結(jié)果進行描述及判定，描述和判定分為：無Ct（或Cp）值，且線，表示樣品中無BRSV核酸，判為陰性；當Ct（或Cp）值<35，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，表示樣存在BRSV核酸，判為陽性；Ct（或Cp）值>35，且出現(xiàn)典型的擴增曲線的樣品需復檢。復檢仍出上游引物：5ˊ-GACGAGCTCTTAGCAGTCGCAGCAGTA-3ˊ下游引物：5ˊ-GGGGTCGACTTAGACATTGCCTTTTGTTGTTACG-3ˊ7上游引物：5ˊ-GGGGCTTTTTGTTTTGGTGG-3ˊ(70-8.7.1聚合酶鏈反應（PCR）檢測，遵上游引物：5ˊ-TTTTAGCTCTTTTTGAA擴增基因片段長度1.9kb。8擴增體系：上、下游引物（10μM）各0.5μL，5U/μLrTaqDNA聚合酶0.5μL，25反應條件：95℃預變性5min；95℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸120s，30個循環(huán)；最后72℃取PCR產(chǎn)物經(jīng)EB染色的0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳和成像。待檢樣品擴增出的DNA片段為1.9kb，可判定為支原體核酸陽性；未出現(xiàn)1.9kb的DNA片段，則9搖動，充分混合?？鼓齽┎捎脵幟仕徕c緩沖液，或0.5moL/LEDTA。每6mL血液加1mL抗凝劑。