基于創(chuàng)新策略的敏感化抗癌免疫檢查點(diǎn)阻斷治療藥物虛擬篩選體系構(gòu)建與驗(yàn)證一、引言1.1研究背景與意義癌癥，作為嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，多年來一直是全球醫(yī)學(xué)領(lǐng)域重點(diǎn)攻克的難題。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)年全球新發(fā)癌癥病例1929萬例，癌癥死亡病例996萬例。傳統(tǒng)的癌癥治療手段，如手術(shù)、化療和放療，在一定程度上能夠控制癌癥的發(fā)展，但對于許多晚期癌癥患者，這些治療方法的效果往往不盡人意，且伴隨著嚴(yán)重的副作用。近年來，腫瘤免疫治療領(lǐng)域取得了突破性進(jìn)展，其中免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）療法成為了癌癥治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。免疫檢查點(diǎn)是免疫系統(tǒng)中的一種調(diào)節(jié)機(jī)制，正常情況下，它可以防止免疫細(xì)胞過度活化，避免對自身組織造成損傷。然而，腫瘤細(xì)胞常常利用免疫檢查點(diǎn)來逃避免疫系統(tǒng)的攻擊。ICB療法通過使用免疫檢查點(diǎn)抑制劑，如程序性細(xì)胞死亡蛋白1（PD-1）抗體、程序性死亡配體1（PD-L1）抗體和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（CTLA-4）抗體等，阻斷免疫檢查點(diǎn)信號通路，解除腫瘤細(xì)胞對免疫細(xì)胞的抑制，從而激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)來攻擊腫瘤細(xì)胞。自2011年CTLA-4抗體伊匹木單抗（Ipilimumab）被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)用于晚期黑色素瘤的治療以來，ICB療法在多種癌癥的治療中都展現(xiàn)出了顯著的療效。例如，在非小細(xì)胞肺癌的治療中，KEYNOTE-024研究顯示，對于腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)≥50%的患者，帕博利珠單抗（Pembrolizumab）單藥治療的無進(jìn)展生存期（PFS）和總生存期（OS）均顯著優(yōu)于傳統(tǒng)化療；在腎癌的治療中，CheckMate025研究表明，納武利尤單抗（Nivolumab）對比依維莫司，可顯著提高患者的OS。這些臨床研究結(jié)果充分證明了ICB療法在癌癥治療中的重要地位，為癌癥患者帶來了新的希望。然而，ICB療法在臨床應(yīng)用中仍面臨著諸多挑戰(zhàn)，其中最突出的問題之一就是耐藥性。研究表明，大部分癌癥患者對ICB療法并不敏感，原發(fā)性耐藥的比例較高。即使在初始治療有效的患者中，也有相當(dāng)一部分會出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥，導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)和進(jìn)展。例如，在黑色素瘤患者中，僅有約20%-40%的患者對ICB療法有較好的響應(yīng)；在非小細(xì)胞肺癌患者中，這一比例約為15%-30%。耐藥機(jī)制的復(fù)雜性使得開發(fā)有效的克服耐藥策略變得極為困難。目前已知的耐藥機(jī)制包括腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸、腫瘤微環(huán)境的免疫抑制、免疫檢查點(diǎn)分子的異常表達(dá)以及信號通路的異常激活等。例如，腫瘤細(xì)胞可以通過下調(diào)PD-L1的表達(dá)，或者激活其他免疫抑制信號通路，如吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）通路、腺苷通路等，來逃避ICB療法的攻擊；腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制細(xì)胞，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）、髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）等，也可以抑制免疫細(xì)胞的活性，導(dǎo)致ICB療法失效。為了克服ICB療法的耐藥問題，提高治療效果，開發(fā)新型的免疫檢查點(diǎn)抑制劑或聯(lián)合治療策略迫在眉睫。藥物虛擬篩選作為一種高效、低成本的藥物研發(fā)技術(shù)，在新藥發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮著越來越重要的作用。藥物虛擬篩選是指利用計算機(jī)技術(shù)，根據(jù)藥物作用靶點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)信息，從大量的化合物數(shù)據(jù)庫中篩選出可能與靶點(diǎn)具有高親和力的化合物，然后再通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這些化合物的活性和有效性。與傳統(tǒng)的高通量實(shí)驗(yàn)篩選方法相比，藥物虛擬篩選具有以下優(yōu)勢：首先，它可以在短時間內(nèi)對海量的化合物進(jìn)行篩選，大大提高了篩選效率，縮短了藥物研發(fā)周期；其次，藥物虛擬篩選不需要進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)操作，減少了實(shí)驗(yàn)成本和時間消耗；此外，虛擬篩選還可以發(fā)現(xiàn)一些新穎結(jié)構(gòu)的化合物，為新藥研發(fā)提供更多的可能性。在癌癥治療藥物研發(fā)領(lǐng)域，藥物虛擬篩選已經(jīng)取得了一些成功的案例。例如，晶泰科技針對GPX4靶點(diǎn)進(jìn)行虛擬篩選，該靶點(diǎn)的催化口袋非常平坦，傳統(tǒng)方法難以靶向。晶泰科技使用特大化合物庫，通過片段對接、FEP計算、主動學(xué)習(xí)等定制化的虛擬篩選策略，在28個工作日內(nèi)完成了虛擬篩選+合成過程，成功得到了活性達(dá)到IC50<10μM的苗頭化合物，為進(jìn)一步的藥物研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。華盛頓大學(xué)研究團(tuán)隊開發(fā)的RosettaVS虛擬篩選方法，整合到開源AI加速虛擬篩選平臺中，針對泛素連接酶靶標(biāo)KLHDC2和人類電壓門控鈉通道NaV1.7篩選數(shù)十億種化合物庫，在不到七天內(nèi)完成篩選，并發(fā)現(xiàn)了結(jié)合親和力為個位數(shù)微摩爾的命中化合物。這些成功案例充分展示了藥物虛擬篩選在癌癥藥物研發(fā)中的巨大潛力。在免疫檢查點(diǎn)阻斷治療耐藥的背景下，開展藥物虛擬篩選體系的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。通過構(gòu)建高效、準(zhǔn)確的藥物虛擬篩選體系，可以從龐大的化合物庫中快速篩選出能夠增強(qiáng)ICB療法敏感性的小分子化合物或生物制劑，為克服免疫檢查點(diǎn)阻斷治療耐藥提供新的藥物候選物和治療策略。這不僅有助于提高癌癥患者的治療效果，延長患者的生存期，改善患者的生活質(zhì)量，還能夠推動腫瘤免疫治療領(lǐng)域的發(fā)展，為攻克癌癥這一重大疾病提供新的思路和方法。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在免疫檢查點(diǎn)阻斷治療敏感化方面，國內(nèi)外學(xué)者開展了大量研究。國外的研究起步較早，取得了一系列重要成果。美國的一些研究團(tuán)隊深入探究了腫瘤微環(huán)境對免疫檢查點(diǎn)阻斷治療耐藥的影響機(jī)制，發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制細(xì)胞、細(xì)胞因子以及代謝產(chǎn)物等因素，都可以通過不同的信號通路來抑制免疫細(xì)胞的活性，導(dǎo)致免疫檢查點(diǎn)阻斷治療失效。例如，哈佛大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中的髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）可以通過分泌精氨酸酶、活性氧等物質(zhì)，抑制T細(xì)胞的增殖和功能，從而導(dǎo)致免疫檢查點(diǎn)阻斷治療耐藥。為了克服免疫檢查點(diǎn)阻斷治療耐藥，國外研究團(tuán)隊嘗試了多種策略。其中，聯(lián)合治療策略成為研究熱點(diǎn)之一。例如，將免疫檢查點(diǎn)抑制劑與化療藥物聯(lián)合使用，通過化療藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，釋放腫瘤相關(guān)抗原，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的識別和攻擊能力，同時免疫檢查點(diǎn)抑制劑可以解除免疫抑制，兩者協(xié)同作用，提高治療效果。美國臨床腫瘤學(xué)會（ASCO）年會上公布的一項研究結(jié)果顯示，在非小細(xì)胞肺癌的治療中，將帕博利珠單抗與卡鉑、培美曲塞聯(lián)合使用，與單純化療相比，顯著提高了患者的無進(jìn)展生存期和總生存期。將免疫檢查點(diǎn)抑制劑與放療聯(lián)合使用，也取得了一定的療效。放療可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫原性死亡，釋放腫瘤抗原，激活免疫系統(tǒng)，而免疫檢查點(diǎn)抑制劑可以增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性，兩者聯(lián)合可以提高腫瘤對免疫治療的敏感性。國內(nèi)在免疫檢查點(diǎn)阻斷治療敏感化研究方面也取得了顯著進(jìn)展。國內(nèi)的研究團(tuán)隊不僅對免疫檢查點(diǎn)阻斷治療耐藥機(jī)制進(jìn)行了深入研究，還積極探索新的治療策略和方法。例如，中國科學(xué)院的研究人員發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中的某些基因突變可以導(dǎo)致免疫檢查點(diǎn)分子的異常表達(dá)，從而影響免疫檢查點(diǎn)阻斷治療的效果。通過對這些基因突變的檢測和分析，可以為患者制定個性化的治療方案，提高治療的精準(zhǔn)性和有效性。國內(nèi)在聯(lián)合治療策略方面也進(jìn)行了大量的臨床研究。一些研究團(tuán)隊將免疫檢查點(diǎn)抑制劑與中藥、小分子靶向藥物等聯(lián)合使用，取得了較好的臨床效果。例如，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院的研究團(tuán)隊開展的一項研究表明，在肝癌的治療中，將阿替利珠單抗與貝伐單抗聯(lián)合使用，顯著提高了患者的客觀緩解率和無進(jìn)展生存期。在藥物虛擬篩選方面，國外的研究處于領(lǐng)先地位。隨著計算機(jī)技術(shù)和算法的不斷發(fā)展，國外開發(fā)了多種先進(jìn)的藥物虛擬篩選技術(shù)和平臺。例如，美國的薛定諤（Schr?dinger）公司開發(fā)的Glide軟件，是一款廣泛應(yīng)用的分子對接軟件，它采用了高精度的對接算法和打分函數(shù)，能夠準(zhǔn)確預(yù)測小分子與靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合模式和親和力，在藥物虛擬篩選中發(fā)揮了重要作用。華盛頓大學(xué)研究團(tuán)隊開發(fā)的RosettaVS虛擬篩選方法，整合到開源AI加速虛擬篩選平臺中，針對泛素連接酶靶標(biāo)KLHDC2和人類電壓門控鈉通道NaV1.7篩選數(shù)十億種化合物庫，在不到七天內(nèi)完成篩選，并發(fā)現(xiàn)了結(jié)合親和力為個位數(shù)微摩爾的命中化合物，展示了該方法在大規(guī)模藥物虛擬篩選中的高效性和準(zhǔn)確性。國外還在不斷探索新的藥物虛擬篩選策略和方法。例如，利用深度學(xué)習(xí)技術(shù)，構(gòu)建基于大數(shù)據(jù)的虛擬篩選模型，能夠更準(zhǔn)確地預(yù)測小分子與靶點(diǎn)的相互作用，提高篩選的成功率。一些研究團(tuán)隊將虛擬篩選與高通量實(shí)驗(yàn)技術(shù)相結(jié)合，通過虛擬篩選初步篩選出潛在的活性化合物，再通過高通量實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證和優(yōu)化，大大提高了藥物研發(fā)的效率。國內(nèi)在藥物虛擬篩選領(lǐng)域也取得了一定的成果。國內(nèi)的科研機(jī)構(gòu)和企業(yè)積極開展藥物虛擬篩選技術(shù)的研究和應(yīng)用，不斷提升自身的技術(shù)水平和創(chuàng)新能力。例如，晶泰科技針對GPX4靶點(diǎn)進(jìn)行虛擬篩選，該靶點(diǎn)的催化口袋非常平坦，傳統(tǒng)方法難以靶向。晶泰科技使用特大化合物庫，通過片段對接、FEP計算、主動學(xué)習(xí)等定制化的虛擬篩選策略，在28個工作日內(nèi)完成了虛擬篩選+合成過程，成功得到了活性達(dá)到IC50<10μM的苗頭化合物，為進(jìn)一步的藥物研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。中國科學(xué)院上海藥物研究所鄭明月課題組利用等變圖神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)來整合蛋白質(zhì)-配體相互作用相關(guān)的物理先驗(yàn)知識，并使用多種數(shù)據(jù)增強(qiáng)、數(shù)據(jù)去冗余策略來避免模型過擬合潛在的數(shù)據(jù)分布偏差，構(gòu)建了通用蛋白質(zhì)-配體相互作用評分方法——EquiScore。在藥物虛擬篩選場景和先導(dǎo)化合物優(yōu)化場景中，對訓(xùn)練未見的新靶標(biāo)表現(xiàn)出良好的泛化性能。國內(nèi)還注重藥物虛擬篩選技術(shù)的平臺建設(shè)和應(yīng)用推廣。一些高校和科研機(jī)構(gòu)建立了藥物虛擬篩選平臺，為藥物研發(fā)提供技術(shù)支持和服務(wù)。同時，國內(nèi)的企業(yè)也在積極應(yīng)用藥物虛擬篩選技術(shù)，加速新藥研發(fā)進(jìn)程，提高企業(yè)的核心競爭力。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在開發(fā)一種高效、準(zhǔn)確的藥物虛擬篩選體系，用于敏感化抗癌免疫檢查點(diǎn)阻斷治療，具體研究目標(biāo)如下：構(gòu)建一個整合多種技術(shù)和算法的藥物虛擬篩選體系，能夠從大規(guī)模化合物庫中篩選出具有潛在增強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)阻斷治療敏感性的小分子化合物；通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證虛擬篩選得到的化合物的活性和有效性，確定其在克服免疫檢查點(diǎn)阻斷治療耐藥方面的作用機(jī)制；為免疫檢查點(diǎn)阻斷治療耐藥的癌癥患者提供新的治療策略和藥物候選物，推動腫瘤免疫治療領(lǐng)域的發(fā)展。圍繞上述研究目標(biāo)，本研究將開展以下內(nèi)容：免疫檢查點(diǎn)阻斷治療耐藥機(jī)制的深入研究：全面分析腫瘤細(xì)胞免疫逃逸、腫瘤微環(huán)境免疫抑制、免疫檢查點(diǎn)分子異常表達(dá)以及信號通路異常激活等耐藥機(jī)制。深入探究腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的相互作用，以及腫瘤微環(huán)境中各種細(xì)胞因子、趨化因子和代謝產(chǎn)物對免疫檢查點(diǎn)阻斷治療效果的影響。通過對臨床樣本的分析和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動物實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，明確耐藥機(jī)制中的關(guān)鍵分子和信號通路，為后續(xù)的藥物虛擬篩選提供精準(zhǔn)的靶點(diǎn)信息。藥物虛擬篩選技術(shù)與算法的優(yōu)化和整合：深入研究分子對接、分子動力學(xué)模擬、量子力學(xué)計算等傳統(tǒng)藥物虛擬篩選技術(shù)的原理和應(yīng)用，結(jié)合深度學(xué)習(xí)、機(jī)器學(xué)習(xí)等人工智能算法，對這些技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)。例如，利用深度學(xué)習(xí)算法優(yōu)化分子對接的打分函數(shù)，提高對接結(jié)果的準(zhǔn)確性；通過機(jī)器學(xué)習(xí)算法對分子動力學(xué)模擬的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和預(yù)測，挖掘小分子與靶點(diǎn)之間的潛在相互作用模式。將優(yōu)化后的虛擬篩選技術(shù)和算法進(jìn)行整合，構(gòu)建一個綜合性的藥物虛擬篩選平臺，使其能夠充分發(fā)揮各種技術(shù)的優(yōu)勢，提高篩選效率和準(zhǔn)確性?；衔飵斓臉?gòu)建與篩選：收集和整理現(xiàn)有公開的化合物數(shù)據(jù)庫，包括ZINC、PubChem等，同時結(jié)合實(shí)驗(yàn)室合成的化合物，構(gòu)建一個包含多種結(jié)構(gòu)類型和化學(xué)多樣性的化合物庫。根據(jù)免疫檢查點(diǎn)阻斷治療耐藥機(jī)制研究確定的靶點(diǎn)信息，利用構(gòu)建的藥物虛擬篩選平臺對化合物庫進(jìn)行篩選，初步篩選出可能與靶點(diǎn)具有高親和力的化合物。對篩選出的化合物進(jìn)行進(jìn)一步的分析和評估，包括分子結(jié)構(gòu)的合理性、藥物相似性、成藥性等方面的評價，去除不符合要求的化合物，得到具有潛在活性的化合物集合。虛擬篩選結(jié)果的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與活性優(yōu)化：對虛擬篩選得到的潛在活性化合物進(jìn)行合成和提取，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其對免疫檢查點(diǎn)阻斷治療敏感性的影響。例如，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，檢測化合物對腫瘤細(xì)胞生長、免疫細(xì)胞活性以及免疫檢查點(diǎn)分子表達(dá)的影響；在動物實(shí)驗(yàn)中，建立免疫檢查點(diǎn)阻斷治療耐藥的腫瘤模型，評估化合物與免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合使用的治療效果。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對活性化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和改造，通過引入不同的官能團(tuán)、改變分子的空間構(gòu)型等方式，提高化合物的活性、選擇性和穩(wěn)定性，為進(jìn)一步的藥物研發(fā)奠定基礎(chǔ)。作用機(jī)制的深入探究：運(yùn)用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物化學(xué)等技術(shù)手段，深入研究活性化合物增強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)阻斷治療敏感性的作用機(jī)制。例如，通過蛋白質(zhì)印跡法（WesternBlot）、實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）等技術(shù)檢測化合物對相關(guān)信號通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)和活性的影響；利用免疫熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)等方法分析化合物對免疫細(xì)胞的增殖、分化和功能的調(diào)節(jié)作用。通過對作用機(jī)制的深入研究，揭示活性化合物與免疫檢查點(diǎn)阻斷治療協(xié)同作用的分子基礎(chǔ)，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。二、免疫檢查點(diǎn)阻斷治療及敏感化機(jī)制2.1免疫檢查點(diǎn)阻斷治療概述免疫檢查點(diǎn)是免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)機(jī)制，在維持免疫穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著不可或缺的作用。其中，程序性細(xì)胞死亡蛋白1（PD-1）及其配體程序性死亡配體1（PD-L1）是研究最為廣泛且深入的免疫檢查點(diǎn)蛋白之一。正常生理狀態(tài)下，T細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)中抵御腫瘤細(xì)胞的核心力量，在識別腫瘤細(xì)胞相關(guān)抗原時，主要組織相容性復(fù)合體（MHCI）會將腫瘤抗原呈遞給T細(xì)胞，T細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體（TCR）與裝載腫瘤抗原的MHCI結(jié)合，從而激活T細(xì)胞，觸發(fā)其對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。而PD-1作為一種主要在活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞以及某些自然殺傷細(xì)胞上表達(dá)的抑制性受體，當(dāng)它與其配體PD-L1或PD-L2結(jié)合時，會向T細(xì)胞傳遞抑制信號，精準(zhǔn)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和持續(xù)時間，避免T細(xì)胞過度活化，進(jìn)而防止對正常組織細(xì)胞造成損傷。然而，在腫瘤微環(huán)境這一復(fù)雜的生態(tài)中，腫瘤細(xì)胞卻巧妙地利用了PD-1/PD-L1這一免疫檢查點(diǎn)機(jī)制來實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。腫瘤細(xì)胞會大量高表達(dá)PD-L1，使其與T細(xì)胞表面的PD-1緊密結(jié)合，如同給T細(xì)胞套上了“枷鎖”，傳遞強(qiáng)烈的抑制信號，導(dǎo)致T細(xì)胞的活化、增殖和細(xì)胞毒性功能受到顯著抑制，無法有效地識別和攻擊腫瘤細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞從而得以在體內(nèi)肆意生長、擴(kuò)散?；趯D-1/PD-L1免疫逃逸機(jī)制的深入理解，免疫檢查點(diǎn)阻斷治療應(yīng)運(yùn)而生。該治療策略的核心是使用免疫檢查點(diǎn)抑制劑，以阻斷PD-1與PD-L1之間的相互作用，解除T細(xì)胞所受到的抑制，重新激活機(jī)體自身強(qiáng)大的免疫系統(tǒng)，使其能夠重新識別并高效攻擊腫瘤細(xì)胞。目前，臨床上已經(jīng)成功開發(fā)并廣泛應(yīng)用了多種針對PD-1和PD-L1的單克隆抗體類抑制劑。例如，針對PD-1的單抗有納武利尤單抗（Nivolumab）、帕博利珠單抗（Pembrolizumab）、西米普利單抗（Cemiplimab）、特瑞普利單抗（Toripalimab）和卡瑞利珠單抗（Camrelizumab）等，這些單抗均屬于IgG4類抗體；針對PD-L1的單抗主要為IgG1型，包括阿特珠單抗（Atezolizumab）、阿維魯單抗（Avelumab）和度伐魯單抗（Durvalumab）等。這些免疫檢查點(diǎn)抑制劑在多種癌癥的臨床治療中都展現(xiàn)出了令人矚目的療效，為眾多癌癥患者帶來了新的生機(jī)與希望。以黑色素瘤為例，作為一種惡性程度極高的皮膚腫瘤，傳統(tǒng)治療方法往往效果不佳。然而，納武利尤單抗和帕博利珠單抗等PD-1抑制劑的出現(xiàn)，顯著改變了黑色素瘤的治療格局。相關(guān)臨床研究數(shù)據(jù)表明，使用PD-1抑制劑治療晚期黑色素瘤患者，部分患者的腫瘤得到了有效的控制，生存期得到了明顯延長，甚至有部分患者實(shí)現(xiàn)了長期生存。在非小細(xì)胞肺癌的治療領(lǐng)域，免疫檢查點(diǎn)阻斷治療同樣成績斐然。對于腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)≥50%的非小細(xì)胞肺癌患者，帕博利珠單抗單藥治療展現(xiàn)出了卓越的療效，其無進(jìn)展生存期（PFS）和總生存期（OS）均顯著優(yōu)于傳統(tǒng)化療，為這部分患者提供了更為有效的治療選擇。免疫檢查點(diǎn)阻斷治療并非一帆風(fēng)順，在臨床應(yīng)用過程中面臨著諸多嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。其中，最為突出的問題便是耐藥性問題。大量的臨床研究和實(shí)踐數(shù)據(jù)顯示，大部分癌癥患者對免疫檢查點(diǎn)阻斷治療并不敏感，原發(fā)性耐藥的比例較高。即使在初始治療有效的患者中，也有相當(dāng)一部分會隨著時間的推移出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥，導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)和進(jìn)一步進(jìn)展。例如，在黑色素瘤患者中，僅有約20%-40%的患者對免疫檢查點(diǎn)阻斷治療有較好的響應(yīng)；在非小細(xì)胞肺癌患者中，這一比例約為15%-30%。耐藥機(jī)制的復(fù)雜性使得克服耐藥成為了腫瘤免疫治療領(lǐng)域亟待解決的難題。目前已知的耐藥機(jī)制涵蓋多個方面，包括腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，如腫瘤細(xì)胞通過下調(diào)PD-L1的表達(dá)，使免疫檢查點(diǎn)抑制劑無法有效發(fā)揮作用；腫瘤微環(huán)境的免疫抑制，腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制細(xì)胞，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）、髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）等，會釋放多種抑制性細(xì)胞因子，抑制免疫細(xì)胞的活性；免疫檢查點(diǎn)分子的異常表達(dá)，除了PD-1/PD-L1之外，腫瘤細(xì)胞還可能上調(diào)其他免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)，形成新的免疫逃逸途徑；以及信號通路的異常激活，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的某些信號通路異常激活，會導(dǎo)致免疫細(xì)胞功能失調(diào)，無法對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行有效的攻擊。這些復(fù)雜的耐藥機(jī)制相互交織，共同影響著免疫檢查點(diǎn)阻斷治療的療效，亟待深入研究以尋找有效的解決策略。2.2免疫檢查點(diǎn)阻斷治療耐藥機(jī)制免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）治療耐藥現(xiàn)象在臨床實(shí)踐中普遍存在，嚴(yán)重制約了其治療效果和患者的生存獲益。耐藥機(jī)制可分為原發(fā)性耐藥和繼發(fā)性耐藥，涉及腫瘤細(xì)胞自身特性、腫瘤微環(huán)境以及機(jī)體免疫系統(tǒng)等多個層面，這些復(fù)雜的機(jī)制相互交織，共同影響著ICB治療的療效。原發(fā)性耐藥是指患者在接受ICB治療初始階段就對治療無響應(yīng)，其發(fā)生機(jī)制主要包括腫瘤細(xì)胞的低免疫原性和抗原呈遞功能障礙。腫瘤細(xì)胞的免疫原性取決于其表面表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原（TAAs）和腫瘤特異性抗原（TSAs）的數(shù)量和質(zhì)量。一些腫瘤細(xì)胞由于基因突變、表觀遺傳改變等原因，導(dǎo)致其表達(dá)的TAAs和TSAs數(shù)量稀少或免疫原性低下，使得免疫系統(tǒng)難以識別和攻擊腫瘤細(xì)胞。例如，在某些肺癌和結(jié)直腸癌患者中，腫瘤細(xì)胞的基因突變負(fù)荷較低，新抗原產(chǎn)生較少，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的免疫原性降低，對ICB治療不敏感?？乖蔬f功能障礙也是導(dǎo)致原發(fā)性耐藥的重要因素。主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子在抗原呈遞過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，MHC-I類分子負(fù)責(zé)將內(nèi)源性抗原呈遞給CD8+T細(xì)胞，MHC-II類分子負(fù)責(zé)將外源性抗原呈遞給CD4+T細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞可以通過多種機(jī)制下調(diào)MHC分子的表達(dá)，從而逃避T細(xì)胞的識別。例如，腫瘤細(xì)胞可以通過基因突變或表觀遺傳修飾，導(dǎo)致MHC分子的編碼基因表達(dá)下調(diào)；腫瘤細(xì)胞還可以分泌一些細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）等，抑制MHC分子的表達(dá)?？乖庸は嚓P(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（TAP）是將抗原肽轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與MHC-I類分子結(jié)合的關(guān)鍵蛋白，腫瘤細(xì)胞可以通過下調(diào)TAP的表達(dá)，影響抗原肽的轉(zhuǎn)運(yùn)和呈遞，導(dǎo)致T細(xì)胞無法識別腫瘤細(xì)胞。繼發(fā)性耐藥是指患者在接受ICB治療初期有效，但隨著治療的進(jìn)行逐漸出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。腫瘤微環(huán)境的免疫抑制是導(dǎo)致繼發(fā)性耐藥的重要原因之一。腫瘤微環(huán)境中存在多種免疫抑制細(xì)胞，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）、髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）等，它們可以通過分泌抑制性細(xì)胞因子、表達(dá)免疫檢查點(diǎn)分子等方式，抑制免疫細(xì)胞的活性，導(dǎo)致ICB治療失效。Tregs是一種具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，其表面高表達(dá)叉頭框蛋白P3（Foxp3），可以通過分泌IL-10、TGF-β等抑制性細(xì)胞因子，抑制CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）的活性，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。MDSCs是一群異質(zhì)性的髓系細(xì)胞，在腫瘤微環(huán)境中大量聚集，具有強(qiáng)大的免疫抑制功能。MDSCs可以通過分泌精氨酸酶1（ARG1）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）等酶類，消耗腫瘤微環(huán)境中的精氨酸、色氨酸等氨基酸，導(dǎo)致T細(xì)胞的增殖和功能受到抑制；MDSCs還可以表達(dá)PD-L1等免疫檢查點(diǎn)分子，與T細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合，抑制T細(xì)胞的活性。TAMs是腫瘤微環(huán)境中數(shù)量最多的免疫細(xì)胞之一，根據(jù)其功能狀態(tài)可分為M1型和M2型。M1型TAMs具有抗腫瘤活性，可以分泌細(xì)胞因子和趨化因子，激活免疫細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的殺傷；而M2型TAMs具有促腫瘤作用，其表面高表達(dá)CD206、CD163等標(biāo)志物，可以分泌IL-10、TGF-β等抑制性細(xì)胞因子，抑制免疫細(xì)胞的活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移和血管生成。在腫瘤微環(huán)境中，TAMs主要以M2型為主，其大量聚集會導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境的免疫抑制，從而引發(fā)ICB治療耐藥。腫瘤細(xì)胞還可以通過上調(diào)其他免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)，形成新的免疫逃逸途徑，導(dǎo)致繼發(fā)性耐藥。除了PD-1/PD-L1通路外，腫瘤細(xì)胞還可以表達(dá)淋巴細(xì)胞活化基因-3（LAG-3）、T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（TIM-3）、吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）等免疫檢查點(diǎn)分子。LAG-3是一種主要表達(dá)在活化T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞表面的免疫檢查點(diǎn)分子，其與MHC-II類分子具有較高的親和力，可以與T細(xì)胞表面的TCR競爭性結(jié)合MHC-II類分子，從而抑制T細(xì)胞的活化和增殖。TIM-3是一種主要表達(dá)在Th1細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞和Tregs表面的免疫檢查點(diǎn)分子，其配體包括半乳凝素-9（Gal-9）、癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子1（CEACAM1）等。TIM-3與配體結(jié)合后，可以激活下游信號通路，導(dǎo)致T細(xì)胞的耗竭和凋亡，抑制免疫細(xì)胞的活性。IDO是一種催化色氨酸代謝的酶，腫瘤細(xì)胞可以通過表達(dá)IDO，將色氨酸代謝為犬尿氨酸，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中色氨酸的缺乏，從而抑制T細(xì)胞的增殖和功能；犬尿氨酸還可以激活芳烴受體（AhR）信號通路，促進(jìn)Tregs的分化和擴(kuò)增，進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境的免疫抑制。腫瘤細(xì)胞內(nèi)的信號通路異常激活也與ICB治療耐藥密切相關(guān)。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路在腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和代謝中發(fā)揮著重要作用。該信號通路的異常激活可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸和ICB治療耐藥。PI3K可以被多種上游信號分子激活，如生長因子受體、Ras蛋白等，激活后的PI3K可以將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3可以招募Akt到細(xì)胞膜上，并使其磷酸化激活。激活的Akt可以通過多種途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)功能，如促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝等。Akt還可以激活mTOR，mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其可以通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞周期進(jìn)程等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和存活。PI3K/Akt/mTOR信號通路的異常激活可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)上調(diào)，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸能力。該信號通路的激活還可以抑制腫瘤細(xì)胞的抗原呈遞功能，導(dǎo)致T細(xì)胞無法識別腫瘤細(xì)胞。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路也是與ICB治療耐藥相關(guān)的重要信號通路之一。MAPK信號通路包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等分支，其在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在腫瘤細(xì)胞中，MAPK信號通路的異常激活可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，同時也可以影響腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸和ICB治療耐藥。例如，BRAF基因突變是黑色素瘤中常見的基因突變之一，突變的BRAF蛋白可以激活下游的MEK/ERK信號通路，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖和存活能力增強(qiáng)。MEK/ERK信號通路的激活還可以上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。免疫檢查點(diǎn)阻斷治療耐藥機(jī)制的復(fù)雜性為克服耐藥帶來了巨大挑戰(zhàn)。深入研究這些耐藥機(jī)制，有助于開發(fā)更加有效的治療策略，提高ICB治療的療效，為癌癥患者帶來更多的生存希望。2.3敏感化免疫檢查點(diǎn)阻斷治療的策略與機(jī)制為了克服免疫檢查點(diǎn)阻斷治療的耐藥問題，提高治療效果，目前研究主要集中在聯(lián)合治療、調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境以及開發(fā)新型免疫檢查點(diǎn)抑制劑等策略上。這些策略旨在增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性，打破腫瘤的免疫逃逸機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)敏感化免疫檢查點(diǎn)阻斷治療的目的。聯(lián)合治療是目前提高免疫檢查點(diǎn)阻斷治療敏感性的重要策略之一。將免疫檢查點(diǎn)抑制劑與化療藥物聯(lián)合使用是一種常見的聯(lián)合治療方案?；熕幬锟梢灾苯託[瘤細(xì)胞，同時釋放腫瘤相關(guān)抗原，激活免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別和攻擊能力。免疫檢查點(diǎn)抑制劑可以解除免疫抑制，兩者協(xié)同作用，提高治療效果。在非小細(xì)胞肺癌的治療中，將帕博利珠單抗與卡鉑、培美曲塞聯(lián)合使用，與單純化療相比，顯著提高了患者的無進(jìn)展生存期和總生存期。這是因?yàn)榛熕幬锟梢允鼓[瘤細(xì)胞發(fā)生免疫原性死亡，釋放大量腫瘤相關(guān)抗原，如熱休克蛋白、高遷移率族蛋白B1（HMGB1）等，這些抗原可以被抗原呈遞細(xì)胞（APCs）攝取、加工和呈遞，激活T細(xì)胞，啟動抗腫瘤免疫反應(yīng)。而免疫檢查點(diǎn)抑制劑可以阻斷PD-1/PD-L1等免疫檢查點(diǎn)信號通路，解除T細(xì)胞的抑制狀態(tài)，增強(qiáng)T細(xì)胞的活性和增殖能力，使其能夠更好地發(fā)揮對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。免疫檢查點(diǎn)抑制劑與放療聯(lián)合使用也能取得較好的療效。放療可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫原性死亡，釋放腫瘤抗原，激活免疫系統(tǒng)，同時放療還可以改變腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的浸潤和活性。免疫檢查點(diǎn)抑制劑可以進(jìn)一步增強(qiáng)免疫細(xì)胞的功能，兩者聯(lián)合可以提高腫瘤對免疫治療的敏感性。例如，在黑色素瘤的治療中，放療聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑可以顯著提高患者的生存率。放療可以通過電離輻射損傷腫瘤細(xì)胞的DNA，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡、壞死等死亡方式，這些死亡的腫瘤細(xì)胞會釋放出腫瘤相關(guān)抗原和損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），如三磷酸腺苷（ATP）、尿酸等，這些物質(zhì)可以吸引和激活A(yù)PCs，促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖。放療還可以改變腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)，如增加干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)免疫細(xì)胞向腫瘤部位的浸潤和聚集。免疫檢查點(diǎn)抑制劑可以阻斷免疫檢查點(diǎn)分子，如PD-1/PD-L1、CTLA-4等，解除免疫抑制，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的殺傷活性，從而提高放療的療效。調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境也是敏感化免疫檢查點(diǎn)阻斷治療的重要策略。腫瘤微環(huán)境中存在多種免疫抑制細(xì)胞和因子，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）、髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）以及轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）等，它們可以抑制免疫細(xì)胞的活性，導(dǎo)致免疫檢查點(diǎn)阻斷治療耐藥。通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，可以減少免疫抑制細(xì)胞的數(shù)量和活性，增加免疫激活細(xì)胞的浸潤，從而提高免疫檢查點(diǎn)阻斷治療的敏感性。針對Tregs，可以使用抗CD25抗體等藥物來清除Tregs，或者使用小分子抑制劑來抑制Tregs的功能?？笴D25抗體可以特異性地結(jié)合Tregs表面的CD25分子，通過抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）等機(jī)制清除Tregs，從而減少Tregs對免疫細(xì)胞的抑制作用。小分子抑制劑如JQ1可以通過抑制Tregs中溴結(jié)構(gòu)域和末端外結(jié)構(gòu)域（BET）蛋白的功能，影響Tregs的分化和存活，降低Tregs在腫瘤微環(huán)境中的比例和活性。對于MDSCs，可以使用小分子抑制劑來抑制其功能，或者通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的代謝產(chǎn)物來減少M(fèi)DSCs的聚集。例如，阿扎胞苷等小分子抑制劑可以抑制MDSCs的增殖和功能，降低其免疫抑制活性。腫瘤微環(huán)境中的代謝產(chǎn)物如精氨酸、色氨酸等的代謝異常與MDSCs的聚集和功能密切相關(guān)。通過調(diào)節(jié)這些代謝產(chǎn)物的水平，可以影響MDSCs的分化和功能。例如，補(bǔ)充精氨酸可以逆轉(zhuǎn)MDSCs對T細(xì)胞的抑制作用，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性。TAMs在腫瘤微環(huán)境中具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用，根據(jù)其功能狀態(tài)可分為M1型和M2型。M1型TAMs具有抗腫瘤活性，而M2型TAMs具有促腫瘤作用。通過調(diào)節(jié)TAMs的極化狀態(tài)，使其向M1型轉(zhuǎn)化，可以增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。可以使用小分子激動劑如Toll樣受體（TLR）激動劑等，來激活TAMs，促進(jìn)其向M1型極化。也可以使用抗體來阻斷TAMs表面的抑制性受體，如CD47抗體可以阻斷TAMs表面的CD47信號通路，增強(qiáng)TAMs對腫瘤細(xì)胞的吞噬作用，促進(jìn)其向M1型轉(zhuǎn)化。除了聯(lián)合治療和調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境外，開發(fā)新型免疫檢查點(diǎn)抑制劑也是提高免疫檢查點(diǎn)阻斷治療敏感性的重要方向。除了常見的PD-1/PD-L1和CTLA-4抑制劑外，目前研究人員正在探索針對其他免疫檢查點(diǎn)分子的抑制劑，如淋巴細(xì)胞活化基因-3（LAG-3）、T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（TIM-3）、吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）等。LAG-3是一種主要表達(dá)在活化T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞表面的免疫檢查點(diǎn)分子，其與MHC-II類分子具有較高的親和力，可以與T細(xì)胞表面的TCR競爭性結(jié)合MHC-II類分子，從而抑制T細(xì)胞的活化和增殖。針對LAG-3的抑制劑可以阻斷LAG-3與MHC-II類分子的結(jié)合，解除對T細(xì)胞的抑制，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性。TIM-3是一種主要表達(dá)在Th1細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞和Tregs表面的免疫檢查點(diǎn)分子，其配體包括半乳凝素-9（Gal-9）、癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子1（CEACAM1）等。TIM-3與配體結(jié)合后，可以激活下游信號通路，導(dǎo)致T細(xì)胞的耗竭和凋亡，抑制免疫細(xì)胞的活性。針對TIM-3的抑制劑可以阻斷TIM-3與配體的結(jié)合，恢復(fù)T細(xì)胞的功能，增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。IDO是一種催化色氨酸代謝的酶，腫瘤細(xì)胞可以通過表達(dá)IDO，將色氨酸代謝為犬尿氨酸，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中色氨酸的缺乏，從而抑制T細(xì)胞的增殖和功能；犬尿氨酸還可以激活芳烴受體（AhR）信號通路，促進(jìn)Tregs的分化和擴(kuò)增，進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境的免疫抑制。針對IDO的抑制劑可以抑制IDO的活性，阻斷色氨酸代謝通路，減少犬尿氨酸的生成，從而解除對T細(xì)胞的抑制，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性。敏感化免疫檢查點(diǎn)阻斷治療的策略旨在通過多種途徑增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性，打破腫瘤的免疫逃逸機(jī)制，提高治療效果。聯(lián)合治療、調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境以及開發(fā)新型免疫檢查點(diǎn)抑制劑等策略都具有重要的研究價值和臨床應(yīng)用前景，為克服免疫檢查點(diǎn)阻斷治療耐藥提供了新的思路和方法。三、藥物虛擬篩選技術(shù)基礎(chǔ)3.1虛擬篩選的基本原理與方法藥物虛擬篩選是藥物研發(fā)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，旨在利用計算機(jī)技術(shù)從海量的化合物庫中高效篩選出具有潛在活性的化合物，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究和藥物開發(fā)提供重要的先導(dǎo)化合物。虛擬篩選的核心原理是基于分子間的相互作用理論，通過計算機(jī)模擬和計算化學(xué)方法，預(yù)測小分子化合物（配體）與生物大分子靶點(diǎn)（受體）之間的結(jié)合模式和親和力，從而快速評估化合物的潛在活性。分子對接是藥物虛擬篩選中最為常用的方法之一，其基本原理基于“鎖鑰模型”，即將受體分子視為“鎖”，配體分子視為“鑰匙”，通過模擬配體在受體活性位點(diǎn)的結(jié)合過程，尋找兩者之間最佳的結(jié)合模式。在分子對接過程中，需要考慮配體和受體之間的幾何互補(bǔ)性、能量互補(bǔ)性以及化學(xué)環(huán)境互補(bǔ)性。幾何互補(bǔ)性要求配體分子的形狀和大小能夠與受體活性位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)相匹配，以確保兩者能夠緊密結(jié)合；能量互補(bǔ)性則關(guān)注配體與受體結(jié)合時的能量變化，通常以結(jié)合自由能來衡量，結(jié)合自由能越低，說明配體與受體的結(jié)合越穩(wěn)定；化學(xué)環(huán)境互補(bǔ)性涉及配體和受體之間的靜電相互作用、氫鍵相互作用、范德華相互作用以及疏水相互作用等，這些相互作用對于維持配體與受體的穩(wěn)定結(jié)合至關(guān)重要。為了實(shí)現(xiàn)分子對接的計算，需要采用一系列的算法和評分函數(shù)。常見的對接算法包括遺傳算法、模擬退火算法、禁忌搜索算法等。遺傳算法借鑒了生物進(jìn)化中的遺傳和變異原理，通過對初始種群中的配體分子進(jìn)行選擇、交叉和變異操作，逐步優(yōu)化配體的構(gòu)象和結(jié)合模式，以尋找最優(yōu)的結(jié)合解；模擬退火算法則模擬了物理系統(tǒng)中退火過程的原理，在搜索過程中允許一定概率接受較差的解，以避免陷入局部最優(yōu)解，從而更有可能找到全局最優(yōu)解；禁忌搜索算法通過設(shè)置禁忌表來記錄已經(jīng)搜索過的解，避免重復(fù)搜索，提高搜索效率。評分函數(shù)是分子對接中評估配體與受體結(jié)合模式優(yōu)劣的關(guān)鍵工具，它將配體與受體之間的各種相互作用能量進(jìn)行量化，轉(zhuǎn)化為一個數(shù)值，即打分值，打分值越高，表示配體與受體的結(jié)合模式越優(yōu)。常見的評分函數(shù)包括基于力場的評分函數(shù)、經(jīng)驗(yàn)評分函數(shù)和知識基于評分函數(shù)等?；诹龅脑u分函數(shù)通過計算配體與受體之間的各種相互作用能量，如靜電能、范德華能、氫鍵能等，來評估結(jié)合模式的穩(wěn)定性；經(jīng)驗(yàn)評分函數(shù)則是根據(jù)大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)，建立起配體與受體的結(jié)構(gòu)特征與結(jié)合親和力之間的數(shù)學(xué)模型，通過該模型計算打分值；知識基于評分函數(shù)則是利用已有的蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，提取其中的相互作用模式和規(guī)律，構(gòu)建評分函數(shù)，以預(yù)測新的配體與受體的結(jié)合親和力。以AutoDock軟件為例，它是一款經(jīng)典的分子對接軟件，采用基于能量的方法對小分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合進(jìn)行模擬。在對接過程中，AutoDock首先定義受體的活性位點(diǎn)，然后將配體分子放置在活性位點(diǎn)附近，通過模擬退火算法對配體的構(gòu)象和位置進(jìn)行搜索和優(yōu)化，尋找與受體結(jié)合能量最低的構(gòu)象。在評分階段，AutoDock使用半經(jīng)驗(yàn)的自由能打分函數(shù)，綜合考慮配體與受體之間的范德華相互作用、靜電相互作用以及氫鍵相互作用等因素，計算配體與受體的結(jié)合自由能，從而對不同的結(jié)合模式進(jìn)行評分和排序。藥效團(tuán)模型是另一種重要的藥物虛擬篩選方法，它是指藥物分子中對活性起重要作用的“藥效特征元素”，如疏水中心、氫鍵供體、氫鍵受體、電荷中心等，在空間上的特定排列方式。藥效團(tuán)模型的構(gòu)建不依賴于受體的三維結(jié)構(gòu)，而是基于已知活性配體的結(jié)構(gòu)信息。通過對一系列具有相似活性的配體分子進(jìn)行分析，提取出共同的藥效特征元素及其空間排列關(guān)系，從而構(gòu)建出藥效團(tuán)模型。在構(gòu)建藥效團(tuán)模型時，通常采用分子相似性搜索、距離幾何算法、機(jī)器學(xué)習(xí)算法等方法。分子相似性搜索是通過計算配體分子之間的結(jié)構(gòu)相似性，找出具有相似活性的分子集合，然后從這些分子中提取藥效特征元素；距離幾何算法則是利用配體分子中原子之間的距離信息，通過幾何計算來確定藥效特征元素的空間位置和相互關(guān)系；機(jī)器學(xué)習(xí)算法，如支持向量機(jī)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等，可以對大量的配體結(jié)構(gòu)和活性數(shù)據(jù)進(jìn)行學(xué)習(xí)和訓(xùn)練，自動提取藥效團(tuán)模型的特征和參數(shù)。構(gòu)建好藥效團(tuán)模型后，就可以利用該模型在化合物數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行篩選。篩選過程中，將數(shù)據(jù)庫中的每個化合物與藥效團(tuán)模型進(jìn)行匹配，計算化合物與藥效團(tuán)模型的契合度，契合度越高，表示化合物與藥效團(tuán)模型的匹配程度越好，其具有潛在活性的可能性也就越大。例如，在DiscoveryStudio軟件中，可以使用AutoPharmacophoreGeneration、CommonFeaturePharmacophoreGeneration等模塊來構(gòu)建藥效團(tuán)模型，然后利用構(gòu)建好的藥效團(tuán)模型在小分子數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索，篩選出與藥效團(tuán)模型匹配的化合物?；谂潴w的篩選方法也是藥物虛擬篩選的重要手段之一，其主要基于分子結(jié)構(gòu)相似性原理，即結(jié)構(gòu)相似的分子可能具有相似的生物活性。該方法通過計算配體分子之間的結(jié)構(gòu)相似性，從已知活性的配體出發(fā)，在化合物數(shù)據(jù)庫中搜索與之結(jié)構(gòu)相似的化合物，這些化合物被認(rèn)為具有潛在的活性。在計算分子結(jié)構(gòu)相似性時，常用的方法包括基于二維結(jié)構(gòu)的相似性計算和基于三維結(jié)構(gòu)的相似性計算?；诙S結(jié)構(gòu)的相似性計算主要利用分子的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、原子類型、鍵類型等信息，通過計算分子指紋（如擴(kuò)展連接指紋ECFP、圓形指紋等）之間的相似度來衡量分子的相似性；基于三維結(jié)構(gòu)的相似性計算則考慮分子的空間構(gòu)象，通過計算分子的空間坐標(biāo)、原子間距離、二面角等信息，采用分子形狀匹配、藥效團(tuán)匹配等方法來評估分子的相似性。在實(shí)際應(yīng)用中，基于配體的篩選方法通常與其他虛擬篩選方法結(jié)合使用。例如，先利用分子對接或藥效團(tuán)模型篩選出一批潛在活性化合物，然后再使用基于配體的篩選方法，對這些化合物進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化和拓展，尋找結(jié)構(gòu)新穎且活性更高的化合物。這種結(jié)合使用的方法可以充分發(fā)揮各種方法的優(yōu)勢，提高虛擬篩選的效率和準(zhǔn)確性。3.2常用虛擬篩選工具與平臺在藥物虛擬篩選領(lǐng)域，眾多工具和平臺發(fā)揮著關(guān)鍵作用，為科研人員提供了多樣化的選擇。這些工具和平臺涵蓋了分子對接軟件、數(shù)據(jù)庫以及計算平臺等多個方面，它們的不斷發(fā)展和完善極大地推動了藥物虛擬篩選技術(shù)的進(jìn)步。分子對接軟件是藥物虛擬篩選的核心工具之一，其能夠模擬小分子配體與生物大分子受體之間的相互作用，預(yù)測兩者的結(jié)合模式和親和力。AutoDock是一款經(jīng)典且應(yīng)用廣泛的分子對接軟件，它采用基于能量的方法來模擬小分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合過程。在對接時，通過模擬退火算法對配體的構(gòu)象和位置進(jìn)行搜索與優(yōu)化，以尋找與受體結(jié)合能量最低的構(gòu)象。同時，使用半經(jīng)驗(yàn)的自由能打分函數(shù)，綜合考量配體與受體之間的范德華相互作用、靜電相互作用以及氫鍵相互作用等因素，進(jìn)而計算出配體與受體的結(jié)合自由能，以此對不同的結(jié)合模式進(jìn)行評分和排序。Glide是由薛定諤（Schr?dinger）公司開發(fā)的一款具有高精度的分子對接軟件，在藥物設(shè)計領(lǐng)域具有重要地位。它采用了準(zhǔn)確的高通量虛擬篩選技術(shù)，可精準(zhǔn)預(yù)測配體與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合模式。Glide提供了SP（標(biāo)準(zhǔn)精度）和XP（額外精度）兩種對接方式。SP模式能夠以高精度對接幾十萬個配體，而XP模式則可對SP的對接結(jié)果做進(jìn)一步檢驗(yàn)，有效減少假陽性結(jié)果。其打分函數(shù)GlideScore充分考慮了親脂性、氫鍵、金屬配位體的貢獻(xiàn)，同時也考慮了不合適的鍵的旋轉(zhuǎn)和原子的空間排斥，這使得它在減少假陽性和提高富集率方面表現(xiàn)出色。除了上述兩款軟件，還有其他一些分子對接軟件也在藥物虛擬篩選中發(fā)揮著重要作用。例如，AutoDockVina是AutoDock的改進(jìn)版本，采用了更快速和準(zhǔn)確的對接算法，在效率和精確度方面表現(xiàn)優(yōu)異，適用于高通量虛擬篩選和藥物設(shè)計研究；GOLD（GeneticOptimizationforLigandDocking）采用遺傳算法對配體的構(gòu)象進(jìn)行優(yōu)化，并通過評分函數(shù)尋找最佳的配體-靶點(diǎn)結(jié)合模式，在藥物發(fā)現(xiàn)和材料科學(xué)領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用；FlexX基于局部二階導(dǎo)數(shù)方法對配體進(jìn)行靈活的構(gòu)象搜索，以獲得最佳的配體-靶點(diǎn)結(jié)合模式，在化學(xué)信息學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用。數(shù)據(jù)庫是藥物虛擬篩選的重要資源，為篩選提供了豐富的化合物來源。ZINC是一個免費(fèi)的可藥用小分子數(shù)據(jù)庫，包含了大量結(jié)構(gòu)多樣的化合物，其化合物庫不斷更新和擴(kuò)充，為藥物研發(fā)提供了豐富的化學(xué)空間?？蒲腥藛T可以根據(jù)自身研究需求，從ZINC數(shù)據(jù)庫中篩選出具有特定結(jié)構(gòu)或性質(zhì)的化合物，用于后續(xù)的虛擬篩選和實(shí)驗(yàn)研究。PubChem是美國國家醫(yī)學(xué)圖書館（NLM）維護(hù)的一個化學(xué)數(shù)據(jù)庫，它包含了海量的化合物信息，包括化合物的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、生物活性等數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)來自于各種科學(xué)文獻(xiàn)、實(shí)驗(yàn)研究以及其他數(shù)據(jù)庫，為藥物虛擬篩選提供了全面而豐富的信息資源。研究人員可以利用PubChem數(shù)據(jù)庫進(jìn)行化合物的檢索和篩選，同時還可以參考其中的生物活性數(shù)據(jù)，評估化合物的潛在藥用價值。除了ZINC和PubChem數(shù)據(jù)庫，還有許多其他常用的數(shù)據(jù)庫，如ChEMBL數(shù)據(jù)庫，它整合了大量的生物活性數(shù)據(jù)和藥物化學(xué)信息，為藥物研發(fā)提供了有價值的參考；DrugBank數(shù)據(jù)庫則是一個綜合的藥物數(shù)據(jù)庫，包含了藥物的結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制、臨床應(yīng)用等多方面的信息，對于藥物虛擬篩選和藥物研發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。計算平臺為藥物虛擬篩選提供了強(qiáng)大的計算能力和便捷的操作界面，使得科研人員能夠高效地進(jìn)行虛擬篩選研究。例如，薛定諤公司的Maestro平臺是一個功能強(qiáng)大的藥物研發(fā)平臺，它整合了多種計算工具和模塊，包括分子對接、分子動力學(xué)模擬、藥效團(tuán)模型構(gòu)建等，為藥物虛擬篩選提供了一站式的解決方案。在Maestro平臺上，科研人員可以方便地進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)的可視化、參數(shù)設(shè)置、計算任務(wù)的提交和結(jié)果分析等操作，大大提高了虛擬篩選的效率和準(zhǔn)確性。DiscoveryStudio也是一款常用的藥物研發(fā)平臺，它提供了豐富的分子建模和分析工具，支持基于分子對接、藥效團(tuán)模型、結(jié)構(gòu)相似度等多種虛擬篩選方法。該平臺具有友好的用戶界面和強(qiáng)大的數(shù)據(jù)管理功能，科研人員可以在平臺上輕松地構(gòu)建虛擬篩選模型，對化合物庫進(jìn)行篩選和分析，并對篩選結(jié)果進(jìn)行可視化展示和深入研究。隨著人工智能技術(shù)的發(fā)展，一些基于人工智能的計算平臺也逐漸應(yīng)用于藥物虛擬篩選領(lǐng)域。例如，華盛頓大學(xué)研究團(tuán)隊開發(fā)的開源AI加速虛擬篩選平臺，整合了RosettaVS虛擬篩選方法，能夠高效地篩選數(shù)十億種化合物庫。該平臺利用主動學(xué)習(xí)技術(shù)在對接計算過程中同時訓(xùn)練目標(biāo)特定的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，以高效地分類和選擇最有希望的化合物進(jìn)行昂貴的對接計算，大大提高了虛擬篩選的效率和準(zhǔn)確性。常用的虛擬篩選工具與平臺為藥物虛擬篩選提供了堅實(shí)的技術(shù)支撐和資源保障。分子對接軟件的不斷優(yōu)化、數(shù)據(jù)庫的日益豐富以及計算平臺的功能升級，使得藥物虛擬篩選能夠更加高效、準(zhǔn)確地進(jìn)行，為敏感化抗癌免疫檢查點(diǎn)阻斷治療的藥物研發(fā)提供了有力的支持。3.3虛擬篩選在抗癌藥物研發(fā)中的應(yīng)用案例虛擬篩選技術(shù)在抗癌藥物研發(fā)領(lǐng)域已取得了一系列令人矚目的成功案例，為抗癌藥物的創(chuàng)新研發(fā)提供了寶貴的經(jīng)驗(yàn)和思路。在針對表皮生長因子受體（EGFR）的抗癌藥物研發(fā)中，虛擬篩選發(fā)揮了關(guān)鍵作用。EGFR是一種跨膜受體酪氨酸激酶，在多種癌癥，如非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌等的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。其過度表達(dá)或突變會導(dǎo)致下游信號通路的異常激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲。傳統(tǒng)的EGFR抑制劑，如吉非替尼（Gefitinib）和厄洛替尼（Erlotinib），雖然在部分患者中取得了一定的療效，但耐藥問題嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用。為了尋找新型的EGFR抑制劑，科研人員運(yùn)用虛擬篩選技術(shù)開展研究。他們首先從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB）中獲取高分辨率的EGFR蛋白晶體結(jié)構(gòu)，對其進(jìn)行預(yù)處理，包括去除水分子、添加氫原子和電荷等，以確保結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。利用分子對接軟件，如Glide，將大規(guī)模化合物庫中的小分子逐一與EGFR的活性位點(diǎn)進(jìn)行對接。在對接過程中，通過優(yōu)化小分子的構(gòu)象和位置，尋找與EGFR結(jié)合親和力高且結(jié)合模式合理的小分子。為了提高篩選的準(zhǔn)確性和效率，還采用了多種評分函數(shù)對對接結(jié)果進(jìn)行評估，如GlideScore、XPScore等，這些評分函數(shù)綜合考慮了小分子與EGFR之間的靜電相互作用、氫鍵相互作用、范德華相互作用以及疏水相互作用等因素。通過虛擬篩選，科研人員從數(shù)十萬種小分子中篩選出了一批潛在的EGFR抑制劑。對這些小分子進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析和藥物相似性評估，去除結(jié)構(gòu)不合理或不具備良好成藥性的分子。對剩余的潛在活性小分子進(jìn)行合成和生物學(xué)活性驗(yàn)證。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，檢測這些小分子對表達(dá)EGFR的腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用；在動物實(shí)驗(yàn)中，建立腫瘤模型，評估小分子的體內(nèi)抗腫瘤活性和安全性。經(jīng)過一系列的研究，成功發(fā)現(xiàn)了一種新型的EGFR抑制劑。該抑制劑與EGFR的結(jié)合親和力顯著高于傳統(tǒng)抑制劑，能夠更有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，它對多種表達(dá)EGFR的腫瘤細(xì)胞系，如A549（非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞）、MDA-MB-231（乳腺癌細(xì)胞）和HT-29（結(jié)直腸癌細(xì)胞）等，均表現(xiàn)出強(qiáng)烈的增殖抑制作用，半數(shù)抑制濃度（IC50）值達(dá)到了納摩爾級別。在動物實(shí)驗(yàn)中，該抑制劑能夠顯著抑制腫瘤的生長，且未觀察到明顯的毒副作用。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，該抑制劑通過與EGFR的ATP結(jié)合位點(diǎn)緊密結(jié)合，阻斷了EGFR的磷酸化和下游信號通路的激活，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。針對熱休克蛋白90（HSP90）的抗癌藥物研發(fā)中，虛擬篩選也取得了重要成果。HSP90是一種分子伴侶，在腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)，參與多種癌蛋白的折疊、穩(wěn)定和激活過程，對腫瘤細(xì)胞的生存和增殖至關(guān)重要。傳統(tǒng)的HSP90抑制劑，如格爾德霉素（Geldanamycin）及其衍生物17-烯丙基氨基-17-脫甲氧基格爾德霉素（17-AAG），由于其毒性較大和藥代動力學(xué)性質(zhì)不理想，限制了其臨床應(yīng)用?？蒲腥藛T利用虛擬篩選技術(shù)尋找新型的HSP90抑制劑。他們基于HSP90的三維結(jié)構(gòu)，從FDA批準(zhǔn)的藥物分子庫中進(jìn)行虛擬篩選。通過分子對接和分子動力學(xué)模擬等技術(shù)，預(yù)測小分子與HSP90的結(jié)合模式和親和力。在分子對接過程中，使用AutoDock軟件，將小分子與HSP90的活性位點(diǎn)進(jìn)行對接，通過模擬退火算法尋找最佳的結(jié)合構(gòu)象。利用分子動力學(xué)模擬，對小分子與HSP90的復(fù)合物進(jìn)行長時間的模擬，分析復(fù)合物的穩(wěn)定性和相互作用細(xì)節(jié)。通過虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)米替福辛（Miltefosine）和奧替尼啶（Octenidine）是新的HSP90抑制劑。實(shí)驗(yàn)研究表明，米替福辛和奧替尼啶均具有較強(qiáng)的廣譜抗癌活性，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中，這兩種化合物能夠顯著下調(diào)HSP90客戶蛋白，如p-AKT、CDK6和ERK等的表達(dá)水平，從而阻斷腫瘤細(xì)胞的生長信號通路。它們沒有上調(diào)熱休克蛋白HSP70和HSP90的表達(dá)水平，避免了因熱休克反應(yīng)導(dǎo)致的耐藥問題。這些應(yīng)用案例充分展示了虛擬篩選在抗癌藥物研發(fā)中的巨大優(yōu)勢和潛力。通過虛擬篩選，可以從海量的化合物中快速、高效地篩選出具有潛在抗癌活性的小分子，為后續(xù)的藥物研發(fā)提供重要的先導(dǎo)化合物。虛擬篩選還能夠深入探究小分子與靶點(diǎn)之間的相互作用機(jī)制，為藥物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和活性提高提供理論依據(jù)。在未來的抗癌藥物研發(fā)中，虛擬篩選技術(shù)有望發(fā)揮更加重要的作用，推動抗癌藥物的創(chuàng)新和發(fā)展，為癌癥患者帶來更多的治療選擇和生存希望。四、敏感化抗癌免疫檢查點(diǎn)阻斷治療藥物虛擬篩選體系設(shè)計4.1靶點(diǎn)選擇與驗(yàn)證在敏感化抗癌免疫檢查點(diǎn)阻斷治療藥物虛擬篩選體系中，精準(zhǔn)的靶點(diǎn)選擇與驗(yàn)證是關(guān)鍵的起始環(huán)節(jié)，直接決定了后續(xù)藥物篩選的方向和效果?；趯γ庖邫z查點(diǎn)阻斷治療耐藥機(jī)制的深入研究，本研究確定了多個與免疫檢查點(diǎn)阻斷治療敏感化相關(guān)的潛在靶點(diǎn)，其中ARIH1和STING備受關(guān)注。ARIH1（AradneRBRE3泛素蛋白連接酶1）在免疫調(diào)節(jié)和腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是克服免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）耐藥的關(guān)鍵調(diào)控因子。浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、良渚實(shí)驗(yàn)室夏宏光教授團(tuán)隊在《NatureCommunications》期刊發(fā)表的研究論文《ARIH1activatesSTING-mediatedT-cellactivationandsensitizestumorstoimmunecheckpointblockade》指出，ARIH1具有降解PD-L1蛋白和改變腫瘤免疫微環(huán)境的雙重功能。從機(jī)制上看，DNA-PKcs是一種調(diào)控DNA非同源末端修復(fù)的重要激酶蛋白，有研究報道其可以通過介導(dǎo)底物cGAS蛋白磷酸化抑制cGAS-STING通路激活。而夏宏光課題組利用生物質(zhì)譜技術(shù)以及系統(tǒng)的生化實(shí)驗(yàn)證明，DNA-PKcs是ARIH1的底物蛋白，ARIH1可以通過增強(qiáng)DNA-PKcs蛋白的泛素化，介導(dǎo)DNA-PKcs蛋白降解，促進(jìn)STING-cGAS通路活化，激活腫瘤免疫。在人源三陰性乳腺癌臨床樣本中，研究發(fā)現(xiàn)ARIH1表達(dá)水平下降，DNA-PKcs水平上調(diào)，并伴隨著STING通路的抑制?；诖?，ARIH1成為本研究中極具潛力的靶點(diǎn)，通過調(diào)節(jié)ARIH1的功能，有望激活腫瘤免疫，提高免疫檢查點(diǎn)阻斷治療的敏感性。STING（Stimulatorofinterferongenes）作為另一個重要的潛在靶點(diǎn)，在先天免疫信號傳導(dǎo)和腫瘤免疫中扮演著核心角色。STING能夠感知細(xì)胞內(nèi)的異常DNA，激活下游信號通路，誘導(dǎo)干擾素和其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而啟動抗腫瘤免疫反應(yīng)。當(dāng)腫瘤細(xì)胞發(fā)生DNA損傷或感染病毒時，會釋放出雙鏈DNA，這些DNA被細(xì)胞內(nèi)的cGAS（CyclicGMP-AMPsynthase）識別，cGAS催化ATP和GTP生成環(huán)鳥苷酸-腺苷酸（cGAMP），cGAMP作為第二信使結(jié)合并激活STING。激活后的STING發(fā)生寡聚化并從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到高爾基體，招募并激活TBK1（TANK-bindingkinase1），TBK1進(jìn)一步磷酸化IRF3（Interferonregulatoryfactor3），使其進(jìn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)干擾素和其他細(xì)胞因子的表達(dá)，激活免疫細(xì)胞，增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。許多腫瘤細(xì)胞通過抑制STING信號通路來逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，因此，激活STING信號通路成為增強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)阻斷治療敏感性的重要策略，STING也成為本研究中重要的藥物作用靶點(diǎn)。為了驗(yàn)證ARIH1和STING作為靶點(diǎn)的有效性，本研究綜合運(yùn)用了多種實(shí)驗(yàn)和生物信息學(xué)分析方法。在實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方面，首先通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建穩(wěn)定敲低或過表達(dá)ARIH1和STING的腫瘤細(xì)胞系以及免疫細(xì)胞系。在腫瘤細(xì)胞系中，檢測敲低或過表達(dá)ARIH1和STING對細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及免疫檢查點(diǎn)分子表達(dá)的影響。通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測免疫檢查點(diǎn)分子如PD-L1的表達(dá)水平。在免疫細(xì)胞系中，觀察ARIH1和STING的變化對免疫細(xì)胞活化、增殖和細(xì)胞因子分泌的影響。利用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞因子如干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α等的分泌水平，通過CFSE標(biāo)記法檢測免疫細(xì)胞的增殖情況。利用動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證靶點(diǎn)的有效性。建立免疫檢查點(diǎn)阻斷治療耐藥的小鼠腫瘤模型，如將4T1三陰性乳腺癌細(xì)胞接種到小鼠體內(nèi)，待腫瘤生長到一定大小后，分別給予針對ARIH1和STING的干預(yù)措施，如注射特異性的激動劑或抑制劑，同時聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑進(jìn)行治療。觀察小鼠腫瘤的生長情況、轉(zhuǎn)移情況以及生存期的變化，通過測量腫瘤體積和重量來評估腫瘤生長，通過組織切片和免疫組化分析腫瘤轉(zhuǎn)移情況，記錄小鼠的生存時間來評估治療效果。在生物信息學(xué)分析方面，本研究收集了大量的腫瘤患者臨床樣本數(shù)據(jù)，包括基因表達(dá)譜、蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)以及臨床治療結(jié)果等。運(yùn)用生物信息學(xué)工具和算法，分析ARIH1和STING基因在不同腫瘤類型中的表達(dá)差異，以及其表達(dá)水平與免疫檢查點(diǎn)阻斷治療療效之間的相關(guān)性。通過基因富集分析（GSEA），研究ARIH1和STING相關(guān)的信號通路在腫瘤組織中的富集情況，進(jìn)一步揭示其在腫瘤免疫中的作用機(jī)制。利用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，探究ARIH1和STING與其他免疫相關(guān)蛋白之間的相互作用關(guān)系，為藥物設(shè)計提供更全面的信息。通過上述實(shí)驗(yàn)和生物信息學(xué)分析，本研究對ARIH1和STING作為敏感化抗癌免疫檢查點(diǎn)阻斷治療藥物靶點(diǎn)的有效性進(jìn)行了全面驗(yàn)證，為后續(xù)的藥物虛擬篩選提供了堅實(shí)的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。4.2化合物庫的構(gòu)建與優(yōu)化化合物庫的構(gòu)建與優(yōu)化是藥物虛擬篩選體系的重要組成部分，其質(zhì)量直接影響著篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性和有效性。本研究致力于構(gòu)建一個結(jié)構(gòu)多樣、類藥性良好且針對免疫檢查點(diǎn)阻斷治療敏感化靶點(diǎn)的化合物庫，并通過一系列優(yōu)化措施提高其篩選價值。在化合物庫的構(gòu)建過程中，廣泛收集和整理現(xiàn)有公開的化合物數(shù)據(jù)庫，包括ZINC、PubChem等，這些數(shù)據(jù)庫包含了海量的化合物信息，涵蓋了豐富的化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性。ZINC數(shù)據(jù)庫作為一個免費(fèi)的可藥用小分子數(shù)據(jù)庫，擁有超過1億個化合物，其化合物庫不斷更新和擴(kuò)充，為藥物研發(fā)提供了廣闊的化學(xué)空間。PubChem數(shù)據(jù)庫則整合了來自全球科研機(jī)構(gòu)和文獻(xiàn)的化合物數(shù)據(jù)，包含了化合物的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、生物活性等多方面信息，為化合物庫的構(gòu)建提供了全面而豐富的資源。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室合成的化合物，進(jìn)一步豐富化合物庫的組成。實(shí)驗(yàn)室合成的化合物往往具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，能夠填補(bǔ)公開數(shù)據(jù)庫中某些結(jié)構(gòu)類型的空白，增加化合物庫的多樣性。通過對公開數(shù)據(jù)庫和實(shí)驗(yàn)室合成化合物的整合，構(gòu)建了一個包含多種結(jié)構(gòu)類型和化學(xué)多樣性的化合物庫，為后續(xù)的虛擬篩選提供了充足的化合物來源。為了提高化合物庫的篩選效率和質(zhì)量，采用類藥性過濾對化合物進(jìn)行初步篩選。類藥性是指化合物具有成為藥物的潛在性質(zhì)，包括合適的分子量、脂水分配系數(shù)、氫鍵供體和受體數(shù)量等。根據(jù)Lipinski提出的“類藥五原則”，即分子量小于500，脂水分配系數(shù)（logP）小于5，氫鍵供體數(shù)目小于5，氫鍵受體數(shù)目小于10，對化合物庫中的化合物進(jìn)行篩選，去除不符合類藥性標(biāo)準(zhǔn)的化合物，保留具有潛在藥物活性的化合物。使用ADMETlab2.0等軟件對化合物的藥代動力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測，包括吸收、分布、代謝、排泄和毒性等方面的評估，進(jìn)一步篩選出具有良好藥代動力學(xué)性質(zhì)的化合物，提高化合物庫的質(zhì)量。進(jìn)行多樣性分析是優(yōu)化化合物庫的關(guān)鍵步驟?；衔锏亩鄻有詫τ诎l(fā)現(xiàn)新穎的活性化合物至關(guān)重要，它能夠確?；衔飵旄采w更廣泛的化學(xué)空間，增加篩選到具有獨(dú)特作用機(jī)制化合物的可能性。采用基于分子指紋的方法進(jìn)行多樣性分析，如計算擴(kuò)展連接指紋（ECFP）等。ECFP是一種基于分子拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的指紋表示方法，它能夠反映分子的結(jié)構(gòu)特征和化學(xué)信息。通過計算化合物之間的ECFP相似度，構(gòu)建化合物的相似性矩陣，使用聚類算法對化合物進(jìn)行聚類分析，將化合物庫劃分為多個不同的簇，每個簇代表一類具有相似結(jié)構(gòu)的化合物。在聚類分析的基礎(chǔ)上，從每個簇中選取代表性的化合物，組成一個多樣性子集。這樣可以在保證化合物庫結(jié)構(gòu)多樣性的前提下，減少化合物的數(shù)量，降低篩選的計算成本。通過多樣性分析和子集選取，得到了一個結(jié)構(gòu)多樣、具有代表性的化合物庫，提高了化合物庫的篩選效率和有效性。為了進(jìn)一步優(yōu)化化合物庫，還考慮了化合物與靶點(diǎn)的相關(guān)性。根據(jù)免疫檢查點(diǎn)阻斷治療耐藥機(jī)制研究確定的靶點(diǎn)信息，如ARIH1和STING等靶點(diǎn)，對化合物庫進(jìn)行篩選，優(yōu)先保留與靶點(diǎn)具有潛在相互作用的化合物。利用分子對接技術(shù)，將化合物庫中的化合物與靶點(diǎn)進(jìn)行對接，計算化合物與靶點(diǎn)的結(jié)合親和力和結(jié)合模式，篩選出與靶點(diǎn)結(jié)合親和力較高且結(jié)合模式合理的化合物，提高化合物庫中化合物的活性潛力?；衔飵斓臉?gòu)建與優(yōu)化是一個系統(tǒng)而復(fù)雜的過程，需要綜合考慮化合物的來源、類藥性、多樣性以及與靶點(diǎn)的相關(guān)性等多個因素。通過上述構(gòu)建和優(yōu)化策略，本研究構(gòu)建了一個高質(zhì)量的化合物庫，為敏感化抗癌免疫檢查點(diǎn)阻斷治療的藥物虛擬篩選提供了堅實(shí)的基礎(chǔ)，有望從該化合物庫中篩選出具有潛在活性的小分子化合物，為克服免疫檢查點(diǎn)阻斷治療耐藥提供新的藥物候選物。4.3虛擬篩選流程的構(gòu)建本研究構(gòu)建了一套全面且高效的虛擬篩選流程，旨在從龐大的化合物庫中精準(zhǔn)篩選出能夠敏感化抗癌免疫檢查點(diǎn)阻斷治療的潛在藥物分子。該流程整合了多種先進(jìn)的虛擬篩選技術(shù)，通過多輪篩選逐步縮小化合物范圍，提高篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。第一輪篩選基于藥效團(tuán)模型展開，這是一種不依賴于受體三維結(jié)構(gòu)，而是從已知活性配體結(jié)構(gòu)信息出發(fā)的篩選方法。首先，收集大量與免疫檢查點(diǎn)阻斷治療敏感化相關(guān)的已知活性化合物，運(yùn)用DiscoveryStudio等專業(yè)軟件中的AutoPharmacophoreGeneration、CommonFeaturePharmacophoreGeneration等模塊，對這些化合物進(jìn)行深入分析。通過提取它們共同的藥效特征元素，如疏水中心、氫鍵供體、氫鍵受體、電荷中心等，并確定這些元素在空間上的特定排列方式，從而構(gòu)建出精準(zhǔn)的藥效團(tuán)模型。構(gòu)建好藥效團(tuán)模型后，將化合物庫中的每一個化合物與該模型進(jìn)行匹配，計算它們之間的契合度。契合度越高，表明該化合物與藥效團(tuán)模型的匹配程度越好，其具有潛在活性的可能性也就越大。通過這一輪篩選，能夠快速從海量化合物中初步篩選出一批與藥效團(tuán)模型高度契合的化合物，為后續(xù)篩選奠定基礎(chǔ)。在第二輪篩選中，采用分子對接技術(shù)對第一輪篩選得到的化合物進(jìn)行進(jìn)一步評估。分子對接基于“鎖鑰模型”，將受體分子視為“鎖”，配體分子視為“鑰匙”，通過模擬配體在受體活性位點(diǎn)的結(jié)合過程，尋找兩者之間最佳的結(jié)合模式。選擇Glide、AutoDock等經(jīng)典的分子對接軟件進(jìn)行操作。以Glide軟件為例，它采用準(zhǔn)確的高通量虛擬篩選技術(shù)，能夠精準(zhǔn)預(yù)測配體與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合模式。在對接過程中，將受體蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)處理，包括去除水分子、添加氫原子和電荷等，以確保結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。將第一輪篩選出的化合物逐一與受體的活性位點(diǎn)進(jìn)行對接，通過優(yōu)化化合物的構(gòu)象和位置，尋找與受體結(jié)合親和力高且結(jié)合模式合理的化合物。為了提高篩選的準(zhǔn)確性和效率，使用GlideScore、XPScore等多種評分函數(shù)對對接結(jié)果進(jìn)行評估，這些評分函數(shù)綜合考慮了化合物與受體之間的靜電相互作用、氫鍵相互作用、范德華相互作用以及疏水相互作用等因素。根據(jù)評分結(jié)果，篩選出結(jié)合親和力較高、結(jié)合模式穩(wěn)定的化合物進(jìn)入下一輪篩選。第三輪篩選利用分子動力學(xué)模擬對第二輪篩選得到的化合物進(jìn)行精篩。分子動力學(xué)模擬能夠在原子水平上模擬分子的動態(tài)行為，深入研究化合物與受體在溶液環(huán)境中的相互作用以及復(fù)合物的穩(wěn)定性。采用GROMACS、Amber等分子動力學(xué)模擬軟件進(jìn)行模擬。在模擬過程中，構(gòu)建包含化合物與受體的系統(tǒng)，并添加合適的溶劑模型和離子，以模擬真實(shí)的生理環(huán)境。對系統(tǒng)進(jìn)行能量最小化、平衡等預(yù)處理步驟后，進(jìn)行長時間的分子動力學(xué)模擬，通常模擬時間在納秒至微秒級別。在模擬過程中，記錄化合物與受體之間的相互作用距離、角度、氫鍵形成情況等信息，分析復(fù)合物的穩(wěn)定性和動態(tài)變化。通過分子動力學(xué)模擬，能夠篩選出在長時間模擬過程中與受體保持穩(wěn)定結(jié)合，且相互作用模式合理的化合物。計算化合物與受體的結(jié)合自由能，結(jié)合自由能越低，表明化合物與受體的結(jié)合越穩(wěn)定，其活性潛力也就越大。通過這三輪篩選，從化合物庫中逐步篩選出具有潛在敏感化抗癌免疫檢查點(diǎn)阻斷治療活性的化合物。每一輪篩選都基于不同的原理和技術(shù)，從不同角度對化合物進(jìn)行評估，從而提高了篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。后續(xù)還將對篩選出的化合物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，進(jìn)一步確定其活性和作用機(jī)制，為免疫檢查點(diǎn)阻斷治療耐藥的癌癥患者提供新的治療策略和藥物候選物。4.4篩選結(jié)果評估指標(biāo)與方法為了全面、準(zhǔn)確地評估敏感化抗癌免疫檢查點(diǎn)阻斷治療藥物虛擬篩選的結(jié)果，本研究確立了一系列科學(xué)合理的評估指標(biāo)，并采用了多種有效的評估方法。這些指標(biāo)和方法的運(yùn)用，有助于深入了解篩選出的化合物的活性、特異性以及與靶點(diǎn)的相互作用特性，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和藥物研發(fā)提供有力的支持?；钚灶A(yù)測準(zhǔn)確性是評估篩選結(jié)果的關(guān)鍵指標(biāo)之一，它直接反映了虛擬篩選模型對化合物活性預(yù)測的可靠程度。在本研究中，通過將虛擬篩選預(yù)測為活性的化合物與已知活性的化合物進(jìn)行對比，計算預(yù)測正確的化合物數(shù)量占總預(yù)測活性化合物數(shù)量的比例，以此來衡量活性預(yù)測準(zhǔn)確性。使用準(zhǔn)確率（Accuracy）、召回率（Recall）和F1值等指標(biāo)進(jìn)行量化評估。準(zhǔn)確率是指預(yù)測正確的活性化合物數(shù)量與預(yù)測為活性的化合物總數(shù)之比，反映了預(yù)測結(jié)果的精確性；召回率是指預(yù)測正確的活性化合物數(shù)量與實(shí)際活性化合物總數(shù)之比，體現(xiàn)了模型對活性化合物的捕捉能力；F1值則是綜合考慮準(zhǔn)確率和召回率的調(diào)和平均數(shù)，能夠更全面地評估模型的性能。通過這些指標(biāo)的計算，可以直觀地了解虛擬篩選模型在活性預(yù)測方面的表現(xiàn)，判斷其是否能夠準(zhǔn)確地篩選出具有潛在活性的化合物。富集因子（EnrichmentFactor，EF）是衡量虛擬篩選效果的重要指標(biāo)，它表示在虛擬篩選得到的化合物集中，活性化合物的富集程度。富集因子的計算方法是將篩選得到的前n%化合物中活性化合物的比例與整個化合物庫中活性化合物的比例相除。例如，若在整個化合物庫中活性化合物的比例為1%，而在篩選得到的前5%化合物中活性化合物的比例為20%，則富集因子為20÷1=20。富集因子越高，說明虛擬篩選能夠更有效地將活性化合物從大量的化合物中富集出來，篩選效果越好。在本研究中，通過計算不同篩選方法和模型得到的化合物集的富集因子，比較它們在富集活性化合物方面的能力，從而選擇出最佳的篩選策略和模型。命中率（HitRate）也是評估篩選結(jié)果的重要指標(biāo)之一，它指的是在虛擬篩選得到的化合物中，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證確實(shí)具有活性的化合物所占的比例。命中率的高低直接反映了虛擬篩選結(jié)果的可靠性和實(shí)用性。在本研究中，對虛擬篩選得到的化合物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，如細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動物實(shí)驗(yàn)等，確定其中具有活性的化合物數(shù)量，然后計算命中率。較高的命中率表明虛擬篩選能夠篩選出真正具有活性的化合物，為后續(xù)的藥物研發(fā)提供有價值的先導(dǎo)化合物。為了確保篩選結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，本研究采用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法對虛擬篩選得到的化合物進(jìn)行進(jìn)一步評估。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，使用多種腫瘤細(xì)胞系和免疫細(xì)胞系，檢測化合物對腫瘤細(xì)胞生長、免疫細(xì)胞活性以及免疫檢查點(diǎn)分子表達(dá)的影響。通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測化合物對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，計算半數(shù)抑制濃度（IC50），IC50值越低，說明化合物對腫瘤細(xì)胞的抑制作用越強(qiáng)；利用流式細(xì)胞術(shù)檢測免疫細(xì)胞的活化、增殖和細(xì)胞因子分泌情況，評估化合物對免疫細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用；通過蛋白質(zhì)印跡法（WesternBlot）檢測免疫檢查點(diǎn)分子如PD-L1、CTLA-4等的表達(dá)水平，分析化合物對免疫檢查點(diǎn)信號通路的影響。在動物實(shí)驗(yàn)中，建立免疫檢查點(diǎn)阻斷治療耐藥的小鼠腫瘤模型，評估化合物與免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合使用的治療效果。將腫瘤細(xì)胞接種到小鼠體內(nèi)，待腫瘤生長到一定大小后，給予化合物和免疫檢查點(diǎn)抑制劑進(jìn)行治療，觀察小鼠腫瘤的生長情況、轉(zhuǎn)移情況以及生存期的變化。通過測量腫瘤體積和重量來評估腫瘤生長，通過組織切片和免疫組化分析腫瘤轉(zhuǎn)移情況，記錄小鼠的生存時間來評估治療效果。通過動物實(shí)驗(yàn)，可以更真實(shí)地模擬人體腫瘤的生長和發(fā)展過程，驗(yàn)證化合物在體內(nèi)的活性和有效性，為臨床應(yīng)用提供重要的參考依據(jù)。本研究還運(yùn)用統(tǒng)計分析方法對篩選結(jié)果進(jìn)行評估。通過統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn)，比較不同篩選方法和模型得到的化合物集在活性預(yù)測準(zhǔn)確性、富集因子和命中率等指標(biāo)上的差異，判斷這些差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。使用t檢驗(yàn)、方差分析等方法，對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，確定不同篩選策略和模型之間的優(yōu)劣，為篩選體系的優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)。利用相關(guān)性分析，研究化合物的結(jié)構(gòu)特征、物理化學(xué)性質(zhì)與活性之間的關(guān)系，探索影響化合物活性的關(guān)鍵因素，為化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和活性提高提供理論指導(dǎo)。通過確立活性預(yù)測準(zhǔn)確性、富集因子、命中率等評估指標(biāo)，并采用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和統(tǒng)計分析等方法，本研究能夠全面、準(zhǔn)確地評估敏感化抗癌免疫檢查點(diǎn)阻斷治療藥物虛擬篩選的結(jié)果，為篩選體系的優(yōu)化和藥物研發(fā)提供有力的支持。五、虛擬篩選體系的實(shí)施與結(jié)果分析5.1虛擬篩選的具體實(shí)施過程在構(gòu)建完成敏感化抗癌免疫檢查點(diǎn)阻斷治療藥物虛擬篩選體系后，嚴(yán)格按照既定的篩選流程開展虛擬篩選工作，以確保篩選過程的科學(xué)性、準(zhǔn)確性和高效性。在第一輪基于藥效團(tuán)模型的篩選中，運(yùn)用DiscoveryStudio軟件對收集到的與免疫檢查點(diǎn)阻斷治療敏感化相關(guān)的已知活性化合物進(jìn)行深入分析。這些化合物涵蓋了多種結(jié)構(gòu)類型和作用機(jī)制，通過對它們的結(jié)構(gòu)特征和活性數(shù)據(jù)的綜合考量，提取出了共同的藥效特征元素，包括疏水中心、氫鍵供體、氫鍵受體、電荷中心等，并確定了這些元素在空間上的特定排列方式，從而構(gòu)建出了精準(zhǔn)的藥效團(tuán)模型。在構(gòu)建過程中