PLEASEADDTITLEINHERE多重核酸檢測系統(tǒng)(MULAN)用于快速、便攜、多重檢測SARS-CoV-2和流感病毒的ArgAert集成等溫擴增ADDTITLEINHERE匯報提綱總結4.研究內容3.2.目的與意義1.多重核酸檢測系統(tǒng)(MULAN)目的與意義

核酸檢測在新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）感染診療中發(fā)揮著重要作用,目前對快速、高靈敏、設備依賴度低的病毒核酸技術需求尤為迫切，以解決專業(yè)人員短缺、檢測結果等候時間長和假陽性等問題。

此外，SARS-CoV-2感染的臨床癥狀與許多呼吸道病毒的癥狀相似，且具有更高傳染性的突變毒株不斷出現，多重檢測和突變基因分型對于評估病毒的傳播能力和致病性越來越重要。檢測技術優(yōu)缺點檢測技術檢測時間最低檢測限特異性多重性引導鏈便攜可視化SHERLOCK1-1.542高是＞50ntRNA是PAND210高是16ntssDNA否LAMP110低否N/A是RPA0.515低否N/A是RT-qPCR1.5-210高是N/A否多重核酸檢測系統(tǒng)(MULAN)

1.

RT-LAMP2.高溫菌Argonaute（Ago）基因編輯酶的級聯

剪切機制組成多重核酸檢測系統(tǒng)(MULAN)Ago蛋白1.Ago是一種靶向剪切DNA的基因編輯酶，它采用短DNA引導鏈（gDNA）對互補靶標鏈進行特異性剪切。2.在高溫下Ago具有級聯剪切活性，即在初始gDNA指導下的剪切產物可進一步指導互補ssDNA的剪切。3.Ago酶可依靠特異性gDNA序列精準識別多個靶標基因，實現單酶多基因靶向剪切，更適合于核酸多重檢測和突變檢測。1.建立了等溫擴增-Ago剪切偶聯體系，通過Ago對擴增產物的精準級聯剪切，解決了等溫擴增中非特異性產物造成的假陽性問題。2.通過設計特制反應耗材和配套小型等溫熒光檢測儀，實現了擴增-剪切“一管式”便攜式檢測，簡化了操作步驟，避免了核酸氣溶膠污染。3.結合膠體金免疫層析技術和藍光激發(fā)熒光效應，建立了高靈敏的可視

化新冠病毒核酸快檢。4.建立了新冠病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒的多重檢測體系，臨床樣本檢測的結果與實時熒光PCR方法一致；同時，基于gDNA單堿基差異影響Ago剪切效率的特性，實現了對SARS-CoV-2與其突變毒株的區(qū)分檢測。提供了四方面的突破與進展LAMP引物gDNA1gDNA2熒光信標分子介導的等溫擴增試劑盒1.等溫擴增與Ago剪切體系偶聯實現快速精準檢測所需試劑1.等溫擴增與Ago剪切體系偶聯實現快速精準檢測以SARS-CoV-2為研究對象，在ORF1ab基因的保守區(qū)域設計并篩選出一組靈敏度較高的LAMP引物。（1）LAMP引物（1）gDNA1和gDNA2利用LAMP引物，獲得擴增產物；隨后，設計兩條與擴增產物DNA一條鏈互補的間隔16nt的gDNA1.等溫擴增與Ago剪切體系偶聯實現快速精準檢測一條與剪切產物互補的熒光信標分子（5’熒光基團和3’淬滅基團）（3）熒光信標分子（4）PfAgo裂解液1.等溫擴增與Ago剪切體系偶聯實現快速精準檢測1.利用LAMP引物，獲得擴增產物.2.兩條gDNA引導Ago對擴增產物進行初級剪切，并形成16nt的ssDNA剪切產物。3..ssDNA剪切產物引導對熒光信標分子的次級剪切，從而釋放熒光信號。2

設計“一管式”便攜式熒光檢測為避免兩步法檢測的中途開蓋造成的氣溶膠污染，在反應管中嵌入了一個特制的內襯管，將擴增與酶切反應體系分開。擴增結束后，只需瞬時離心或用手甩動即可將擴增產物與酶切體系混合，無需開蓋。同時，配套小型的恒溫熒光檢測儀，實現了擴增剪切“一管式”便攜式檢測。1.為了提高PfAgo催化裂解效率，系統(tǒng)優(yōu)化PfAgo、gDNA和金屬離子的濃度。2.PfAgo裂解溫度為95℃。3.RT-LAMP檢測時間為35分鐘，PfAgo裂解檢測時間為15分鐘。整個反應時間較RT-qPCR時間更短.4.檢出限(LoD)為每個反應5個拷貝，在每個反應1.6個拷貝時，檢測到3個重復中的2個。2

設計“一管式”便攜式熒光檢測3

MULAN在可視化檢測中的應用1.膠體金免疫層析技術2.藍光激發(fā)熒光效應3

MULAN在可視化檢測中的應用膠體金免疫層析技術1.C線固定了抗FITC/FAM抗體2.T線固定了抗鼠抗體3.熒光信標分子兩端分別標記FAM和Biotin（生物素）4.在結合墊中熒光信標分子Biotin端會與金標（膠體金顆粒標記）鼠抗Biotin抗體結合。1.無靶標擴增產物熒光信標分子由于FAM端與抗FAM抗體結合被C線攔截，形成膠體金聚集顯色2.有靶標擴增產物熒光信標分子的FAM被C線攔截，攜帶膠體金的Biotin端則繼續(xù)流向C線并被抗鼠抗體攔截顯色（圖a）。3

MULAN在可視化檢測中的應用該方法可直接通過肉眼觀察判定檢測結果，靈敏度為15拷貝/反應（相當于Ct值為35左右）（圖b）。3

MULAN在可視化檢測中的應用3

MULAN在可視化檢測中的應用MULAN產物在藍光(波長450nm)照射下，每次反應得到15拷貝的LoD。MULAN在現場檢測方面展示了重要的應用潛力。藍光激發(fā)熒光效應

4

MULAN在突變病毒檢測中的應用高效的分型檢測方法以新冠病毒及其D614G突變株為對象，巧妙地在熒光報告基因上引入單點錯配，提高Ago的靶標精準識別能力，實現了區(qū)分野生型和突變毒株的分型診斷（圖a）。

4

MULAN在突變病毒檢測中的應用在WT株和突變株基因不同混合比例的樣本測試中，MULAN可檢出5%的突變頻率，即可區(qū)分20：1混合樣本中有一份的突變病毒，具有高度特異性（圖b）。為了驗證該基因分型是否可以用于檢測不同頻率攜帶的突變。5

新冠及流感病毒單管三重檢測體系的設計

與應用以SARS-CoV-2、甲型流感病毒和乙型流感病毒為檢測對象，優(yōu)化三組不同引物之間的組合配比，通過設計三組不同的特異性gDNA與探針，建立MULAN多重檢測平臺技術，實現了單酶對多重等溫擴增產物的精準識別。5

新冠及流感病毒單管三重檢測體系的設計

與應用評估了三重MULAN的LoD，用滴定質粒檢測每個病毒個體。通過相應的熒光圖可以精確地檢測到每個目標在每次反應中存在1.5個拷貝。5

新冠及流感病毒單管三重檢測體系的設計

與應用由于三種病毒中存在兩種病毒合并感染的臨床病例。三倍MULAN正交檢測每反應150或1500份雙感染或三次共感染樣本未觀察到病毒的交叉活性。MULAN使LAMP在單個核酸內切酶的輔助下實現了準確的三聯體檢測。5

新冠及流感病毒單管三重檢測體系的設計

與應用設計不同濃度的SARS-CoV-2假病毒進行檢測假病毒最低檢測濃度可達100拷貝/毫升5

新冠及流感病毒單管三重檢測體系的設計

與應用33例經qPCR檢測試劑盒檢測為甲流或乙流陽性的臨床樣本進行檢測甲流和乙流臨床樣本檢測符合率為100%（33/33）且未觀察到交叉熒光讀出6

總結

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總結

MU