基于化學(xué)蛋白質(zhì)組方法解析萜類天然產(chǎn)物：靶點(diǎn)與合成途徑的深度探索一、引言1.1研究背景與意義萜類天然產(chǎn)物是一類廣泛存在于自然界中的有機(jī)化合物，其結(jié)構(gòu)多樣，生物活性廣泛，在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價值。萜類化合物的基本結(jié)構(gòu)單元是異戊二烯（C_5H_8），通過不同的組合和修飾方式，可以形成多種多樣的萜類化合物，根據(jù)分子中異戊二烯單元的數(shù)量，可分為單萜、倍半萜、二萜、三萜等。萜類化合物是許多植物的重要組成部分，如精油、樹脂和色素等，同時還具有廣泛的生物活性，如抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等作用。在醫(yī)藥領(lǐng)域，萜類天然產(chǎn)物展現(xiàn)出巨大的藥用潛力，是創(chuàng)新藥物研發(fā)的重要源泉。許多萜類化合物具有顯著的藥理活性，能夠治療人類的各種疾病。例如，青蒿素作為一種倍半萜內(nèi)酯類天然產(chǎn)物，是治療瘧疾的一線藥物，自其被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于臨床以來，拯救了無數(shù)生命，極大地降低了瘧疾的死亡率；紫杉醇是一種二萜類化合物，具有獨(dú)特的抗癌機(jī)制，能夠促進(jìn)微管蛋白聚合，抑制其解聚，從而穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)，阻礙細(xì)胞有絲分裂，被廣泛應(yīng)用于乳腺癌、卵巢癌、肺癌等多種癌癥的治療，顯著改善了癌癥患者的生存狀況和預(yù)后。然而，許多萜類天然產(chǎn)物在自然界中的含量較低，提取分離困難，限制了其進(jìn)一步的研究和應(yīng)用。在食品領(lǐng)域，萜類化合物也有著重要的應(yīng)用。一些萜類化合物具有獨(dú)特的香氣和味道，被廣泛用于食品添加劑、香料和香精的生產(chǎn)中，能夠?yàn)槭称吩鎏碡S富的風(fēng)味。例如，檸檬烯具有清新的檸檬香氣，常用于飲料、糖果、烘焙食品等中，提升食品的感官品質(zhì)，增強(qiáng)消費(fèi)者的食欲和喜愛度；香葉醇具有玫瑰香氣，常用于食品和飲料的調(diào)味，賦予產(chǎn)品獨(dú)特的香味；薄荷醇具有清涼的口感和香氣，常用于口香糖、薄荷糖、牙膏等產(chǎn)品中，給人帶來清涼舒爽的感覺。此外，一些萜類化合物還具有抗氧化、抗菌等功能，能夠延長食品的保質(zhì)期，保障食品的質(zhì)量和安全。例如，生育三烯酚是一種天然的抗氧化劑，能夠有效抑制食品中的油脂氧化，防止食品變質(zhì)和產(chǎn)生異味，提高食品的穩(wěn)定性和貨架期。盡管萜類天然產(chǎn)物具有重要的應(yīng)用價值，但目前對于大多數(shù)萜類化合物的生物合成途徑和調(diào)控機(jī)制仍不清楚，這限制了我們對其生物活性的深入理解和有效利用。此外，萜類天然產(chǎn)物的分離鑒定和結(jié)構(gòu)解析往往需要耗費(fèi)大量的時間和精力，傳統(tǒng)方法效率較低，難以滿足快速發(fā)展的研究需求。因此，尋找高效、準(zhǔn)確的研究方法，深入解析萜類天然產(chǎn)物的作用靶點(diǎn)和合成途徑，對于充分挖掘其潛在價值，推動其在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用具有重要意義。化學(xué)蛋白質(zhì)組方法作為一種新興的研究手段，能夠系統(tǒng)、動態(tài)和高效地檢測藥物對于蛋白質(zhì)豐度、翻譯后修飾、活性等各個維度的影響，為解析萜類天然產(chǎn)物的作用靶點(diǎn)和合成途徑提供了新的策略和方法。該方法旨在利用一系列功能各異的化學(xué)探針，結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)，解決復(fù)雜體系（細(xì)胞裂解液，活細(xì)胞，組織等）中小分子如何與蛋白質(zhì)相互作用的問題。在萜類天然產(chǎn)物研究中，化學(xué)蛋白質(zhì)組方法可以通過設(shè)計合成與萜類化合物結(jié)構(gòu)相似的分子探針，將其與蛋白質(zhì)組孵育，使探針與潛在的靶標(biāo)蛋白特異性結(jié)合，然后通過各種分離技術(shù)和質(zhì)譜分析，鑒定出與探針結(jié)合的蛋白質(zhì)，從而確定萜類天然產(chǎn)物的作用靶點(diǎn)。通過比較不同條件下蛋白質(zhì)組的變化，還可以深入了解萜類天然產(chǎn)物對細(xì)胞代謝途徑和信號傳導(dǎo)通路的影響，進(jìn)而揭示其作用機(jī)制。在合成途徑解析方面，化學(xué)蛋白質(zhì)組方法可以用于研究萜類合成酶的活性和功能，通過檢測酶與底物、產(chǎn)物之間的相互作用，以及酶在不同反應(yīng)條件下的變化，解析萜類化合物的合成步驟和調(diào)控機(jī)制，為萜類天然產(chǎn)物的生物合成和代謝工程研究提供關(guān)鍵信息。綜上所述，本研究基于化學(xué)蛋白質(zhì)組方法對萜類天然產(chǎn)物作用靶點(diǎn)及合成途徑進(jìn)行解析，不僅有助于深入理解萜類天然產(chǎn)物的生物活性和作用機(jī)制，為其在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，還能夠?yàn)檩祁愄烊划a(chǎn)物的合成生物學(xué)研究和代謝工程改造提供指導(dǎo)，推動其大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用，具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，萜類天然產(chǎn)物的研究在國內(nèi)外均取得了顯著進(jìn)展，在作用靶點(diǎn)和合成途徑解析方面不斷涌現(xiàn)新的成果和方法。在作用靶點(diǎn)研究方面，國外起步相對較早，運(yùn)用多種前沿技術(shù)深入探索萜類化合物與生物大分子的相互作用。美國Scripps研究所的研究團(tuán)隊運(yùn)用基于活性的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)（ABPP），針對一系列萜類天然產(chǎn)物展開研究，成功鑒定出多個關(guān)鍵的作用靶點(diǎn)蛋白，為揭示萜類化合物的作用機(jī)制提供了重要線索。他們通過設(shè)計特異性的化學(xué)探針，與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)組進(jìn)行孵育，利用探針與靶點(diǎn)蛋白的特異性結(jié)合，再結(jié)合質(zhì)譜分析技術(shù)，精準(zhǔn)地識別出與萜類化合物相互作用的蛋白質(zhì)，極大地推動了對萜類化合物作用機(jī)制的理解。歐洲的一些研究小組則借助X射線晶體學(xué)和核磁共振等結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)，解析了萜類化合物與靶點(diǎn)蛋白的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，從原子層面闡述了二者的結(jié)合模式和作用機(jī)制，為藥物設(shè)計和優(yōu)化提供了堅實(shí)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。例如，他們通過對特定萜類化合物與靶點(diǎn)蛋白復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)解析，詳細(xì)揭示了二者之間的氫鍵、疏水相互作用等關(guān)鍵作用力，為后續(xù)藥物改造提供了明確的方向。國內(nèi)在萜類天然產(chǎn)物作用靶點(diǎn)研究方面也發(fā)展迅速。中國科學(xué)院的科研團(tuán)隊結(jié)合化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)方法，對多種具有藥用價值的萜類化合物進(jìn)行系統(tǒng)研究，不僅鑒定出多個潛在的作用靶點(diǎn)，還通過生物信息學(xué)分析揭示了這些靶點(diǎn)參與的信號通路和生物學(xué)過程，為深入理解萜類化合物的藥理作用提供了全面的視角。他們利用化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出與萜類化合物結(jié)合的蛋白質(zhì)，再運(yùn)用生物信息學(xué)工具對這些蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋和通路分析，成功揭示了萜類化合物在細(xì)胞內(nèi)的作用網(wǎng)絡(luò)。一些高校的研究小組也積極開展相關(guān)研究，運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，驗(yàn)證和深入研究這些靶點(diǎn)的功能和作用機(jī)制，進(jìn)一步豐富了對萜類化合物作用靶點(diǎn)的認(rèn)識。例如，通過基因敲除、過表達(dá)等實(shí)驗(yàn)手段，在細(xì)胞水平上驗(yàn)證靶點(diǎn)蛋白對萜類化合物生物活性的影響，深入探討其作用機(jī)制。在合成途徑解析方面，國外利用合成生物學(xué)和代謝工程技術(shù)，對微生物或植物細(xì)胞進(jìn)行改造，以實(shí)現(xiàn)萜類天然產(chǎn)物的高效合成和途徑解析。美國加州大學(xué)伯克利分校的研究人員在釀酒酵母中成功構(gòu)建并優(yōu)化了多種萜類化合物的生物合成途徑，通過對關(guān)鍵酶的表達(dá)調(diào)控和代謝途徑的優(yōu)化，大幅提高了萜類產(chǎn)物的產(chǎn)量。他們通過基因工程手段導(dǎo)入外源基因，強(qiáng)化關(guān)鍵酶的表達(dá)，同時優(yōu)化代謝途徑中的碳流分配，使釀酒酵母能夠高效合成目標(biāo)萜類化合物。德國的科研團(tuán)隊則通過對植物萜類合成相關(guān)基因的克隆和功能驗(yàn)證，深入解析了植物中萜類化合物的合成途徑和調(diào)控機(jī)制，為利用植物生產(chǎn)萜類天然產(chǎn)物提供了理論基礎(chǔ)。他們從植物中克隆出萜類合成酶基因，在體外和體內(nèi)系統(tǒng)中驗(yàn)證其功能，并研究其在植物體內(nèi)的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。國內(nèi)在萜類天然產(chǎn)物合成途徑解析方面同樣成果豐碩。大連化物所的周雍進(jìn)團(tuán)隊在釀酒酵母中構(gòu)建并優(yōu)化二萜香紫蘇醇生物合成途徑，通過全局調(diào)控中心代謝途徑，實(shí)現(xiàn)了香紫蘇醇的高效合成，產(chǎn)量達(dá)到11.4g/L，為目前已有報道的二萜類最高產(chǎn)量。該團(tuán)隊還發(fā)展了代謝切換策略，將前期構(gòu)建的高產(chǎn)脂肪酸菌株快速切換為香紫蘇醇合成細(xì)胞工廠，節(jié)約了基因操作步驟，縮短了構(gòu)建時間。武漢大學(xué)魯麗/劉天罡課題組利用萜類前體高效供應(yīng)酵母底盤，解析了藥用植物益智中圓柚酮的生物合成途徑，并在酵母中成功重構(gòu)。他們通過邊篩選邊構(gòu)建的方式，不僅解析了合成途徑，還揭示了植物代謝的網(wǎng)絡(luò)性和復(fù)雜性，體現(xiàn)了工程酵母底盤在高通量篩選中的獨(dú)特優(yōu)勢。盡管國內(nèi)外在萜類天然產(chǎn)物作用靶點(diǎn)和合成途徑研究方面取得了顯著成果，但仍存在一些不足和空白。在作用靶點(diǎn)研究方面，目前大多數(shù)研究集中在少數(shù)具有顯著生物活性的萜類化合物上，對于大量結(jié)構(gòu)新穎但活性尚未明確的萜類化合物的作用靶點(diǎn)研究較少，缺乏系統(tǒng)性和全面性。此外，現(xiàn)有的研究方法在鑒定低親和力靶點(diǎn)和瞬時相互作用靶點(diǎn)方面仍存在一定的局限性，難以準(zhǔn)確捕捉和鑒定這些靶點(diǎn)，影響了對萜類化合物作用機(jī)制的全面理解。在合成途徑解析方面，雖然通過合成生物學(xué)和代謝工程技術(shù)取得了一些進(jìn)展，但萜類產(chǎn)物的產(chǎn)量和穩(wěn)定性還需要進(jìn)一步提升，以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。代謝工程改造對細(xì)胞生長和代謝的影響尚需深入研究，以減少對細(xì)胞正常生理功能的負(fù)面影響，提高細(xì)胞工廠的生產(chǎn)效率和可持續(xù)性。此外，對于一些復(fù)雜萜類化合物的合成途徑，仍存在部分步驟和調(diào)控機(jī)制不明確的情況，限制了對其合成過程的精準(zhǔn)控制和優(yōu)化。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在利用化學(xué)蛋白質(zhì)組方法，系統(tǒng)地解析萜類天然產(chǎn)物的作用靶點(diǎn)及合成途徑，為萜類天然產(chǎn)物的深入研究和開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。具體研究內(nèi)容如下：萜類天然產(chǎn)物的收集與活性篩選：廣泛收集多種具有代表性的萜類天然產(chǎn)物，建立萜類天然產(chǎn)物庫。采用多種生物活性測試方法，如細(xì)胞活性檢測、酶活性抑制測定、抗氧化能力評估等，對收集的萜類天然產(chǎn)物進(jìn)行生物活性篩選，確定具有顯著生物活性的萜類化合物，為后續(xù)作用靶點(diǎn)和合成途徑的研究提供目標(biāo)化合物。例如，通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)篩選出對腫瘤細(xì)胞具有明顯抑制作用的萜類化合物，或通過抗氧化實(shí)驗(yàn)篩選出具有強(qiáng)抗氧化活性的萜類化合物。基于化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的作用靶點(diǎn)鑒定：針對篩選出的具有生物活性的萜類天然產(chǎn)物，設(shè)計并合成相應(yīng)的化學(xué)探針。這些探針需保留萜類化合物的關(guān)鍵活性結(jié)構(gòu)，同時引入可用于標(biāo)記和富集的功能基團(tuán)，如生物素、熒光基團(tuán)或親和標(biāo)簽等，以確保探針能夠特異性地與靶標(biāo)蛋白結(jié)合，并便于后續(xù)的分離和鑒定。將化學(xué)探針與細(xì)胞裂解液或活細(xì)胞進(jìn)行孵育，使探針與潛在的靶標(biāo)蛋白相互作用并結(jié)合。利用親和富集技術(shù)，如生物素-鏈霉親和素親和層析、免疫共沉淀等，將與探針結(jié)合的蛋白質(zhì)從復(fù)雜的蛋白質(zhì)組中分離出來。對富集得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解處理，將其消化成肽段，然后采用高分辨質(zhì)譜技術(shù)對肽段進(jìn)行分析，通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)匹配蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，鑒定出與萜類天然產(chǎn)物結(jié)合的靶標(biāo)蛋白。對鑒定出的靶標(biāo)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括功能注釋、蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、信號通路富集分析等，深入了解靶標(biāo)蛋白的生物學(xué)功能及其在細(xì)胞內(nèi)參與的信號傳導(dǎo)通路和生物學(xué)過程，揭示萜類天然產(chǎn)物的作用機(jī)制。萜類天然產(chǎn)物合成途徑的解析：選擇具有重要生物活性且合成途徑研究較少的萜類天然產(chǎn)物，通過基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)分析，挖掘與萜類合成相關(guān)的基因和酶。對候選基因進(jìn)行克隆、表達(dá)和純化，獲得相應(yīng)的萜類合成酶蛋白。在體外構(gòu)建酶促反應(yīng)體系，研究萜類合成酶的底物特異性、催化活性和反應(yīng)機(jī)制，確定萜類化合物合成過程中的關(guān)鍵酶和中間產(chǎn)物。通過基因敲除、過表達(dá)等遺傳操作技術(shù)，在微生物或植物細(xì)胞中對萜類合成相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)控，觀察萜類產(chǎn)物的生成變化，驗(yàn)證基因與萜類合成途徑的關(guān)聯(lián)性，進(jìn)一步明確萜類天然產(chǎn)物的合成步驟和調(diào)控機(jī)制。合成途徑的驗(yàn)證與優(yōu)化：在明確萜類天然產(chǎn)物合成途徑的基礎(chǔ)上，利用合成生物學(xué)和代謝工程技術(shù)，對微生物或植物細(xì)胞進(jìn)行改造，構(gòu)建高效的萜類合成細(xì)胞工廠。通過優(yōu)化基因表達(dá)調(diào)控元件、調(diào)整代謝途徑中的碳流分配、解除反饋抑制等策略，提高萜類產(chǎn)物的產(chǎn)量和純度。對改造后的細(xì)胞工廠進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)或植物組織培養(yǎng)，通過監(jiān)測萜類產(chǎn)物的生成情況，評估合成途徑優(yōu)化的效果，并進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件和發(fā)酵工藝，以實(shí)現(xiàn)萜類天然產(chǎn)物的大規(guī)模生產(chǎn)。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運(yùn)用多種先進(jìn)的研究方法，深入解析萜類天然產(chǎn)物的作用靶點(diǎn)及合成途徑，具體如下：化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)：根據(jù)萜類天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，利用有機(jī)合成化學(xué)方法，在保留其關(guān)鍵活性基團(tuán)的基礎(chǔ)上，引入可用于標(biāo)記和富集的官能團(tuán)，如生物素、熒光基團(tuán)或親和標(biāo)簽等，設(shè)計并合成高特異性的化學(xué)探針。將化學(xué)探針與細(xì)胞裂解液或活細(xì)胞在適宜的條件下孵育，確保探針能夠與潛在的靶標(biāo)蛋白充分結(jié)合。孵育完成后，采用生物素-鏈霉親和素親和層析、免疫共沉淀等親和富集技術(shù)，將與探針結(jié)合的蛋白質(zhì)從復(fù)雜的蛋白質(zhì)組中高效分離出來，去除非特異性結(jié)合的雜質(zhì)蛋白。對富集得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解處理，常用的酶如胰蛋白酶等，將蛋白質(zhì)消化成肽段，以便后續(xù)進(jìn)行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜技術(shù)：使用高分辨質(zhì)譜儀對酶解后的肽段進(jìn)行精確分析，獲取肽段的質(zhì)量、序列等信息。通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，利用專業(yè)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件，如MaxQuant、ProteomeDiscoverer等，鑒定出與萜類天然產(chǎn)物結(jié)合的靶標(biāo)蛋白。結(jié)合定量質(zhì)譜技術(shù)，如TMT（TandemMassTag）、iTRAQ（IsobaricTagsforRelativeandAbsoluteQuantitation）等，對不同處理條件下的蛋白質(zhì)組進(jìn)行定量分析，準(zhǔn)確篩選出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，深入研究萜類天然產(chǎn)物對蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響。生物信息學(xué)分析：運(yùn)用生物信息學(xué)工具和數(shù)據(jù)庫，如GeneOntology（GO）、KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes（KEGG）等，對鑒定出的靶標(biāo)蛋白進(jìn)行全面的功能注釋，分析其生物學(xué)功能、分子功能和細(xì)胞組成等。通過構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，使用STRING、BioGRID等在線數(shù)據(jù)庫和Cytoscape等軟件，直觀展示靶標(biāo)蛋白與其他蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，深入挖掘潛在的信號傳導(dǎo)通路和生物學(xué)過程。利用KEGG等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行信號通路富集分析，明確靶標(biāo)蛋白參與的主要信號通路，揭示萜類天然產(chǎn)物的作用機(jī)制。多組學(xué)技術(shù)：采用基因組學(xué)技術(shù)，對含有目標(biāo)萜類天然產(chǎn)物合成基因的生物進(jìn)行全基因組測序，獲取完整的基因序列信息，為后續(xù)挖掘萜類合成相關(guān)基因提供基礎(chǔ)。利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，如RNA-seq，分析不同生長階段、不同處理條件下生物體內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化，篩選出與萜類合成密切相關(guān)的差異表達(dá)基因。運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，結(jié)合質(zhì)譜分析，對生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行全面鑒定和定量分析，研究萜類合成相關(guān)酶的表達(dá)水平和修飾狀態(tài)。整合基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)分析，構(gòu)建全面的萜類天然產(chǎn)物合成途徑模型，深入理解其合成機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)?；蚬こ碳夹g(shù)：根據(jù)多組學(xué)分析和生物信息學(xué)預(yù)測的結(jié)果，設(shè)計特異性引物，通過PCR等技術(shù)從生物基因組中擴(kuò)增出候選的萜類合成相關(guān)基因。將擴(kuò)增得到的基因克隆到合適的表達(dá)載體上，如pET系列、pGEX系列等，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主中，如大腸桿菌、釀酒酵母等，通過誘導(dǎo)表達(dá)，獲得大量的萜類合成酶蛋白。利用親和層析、離子交換層析等蛋白質(zhì)純化技術(shù)，對表達(dá)的萜類合成酶蛋白進(jìn)行純化，去除雜質(zhì)蛋白，獲得高純度的酶蛋白，用于后續(xù)的酶學(xué)性質(zhì)研究。酶學(xué)性質(zhì)研究：在體外構(gòu)建酶促反應(yīng)體系，優(yōu)化反應(yīng)條件，如溫度、pH值、底物濃度、金屬離子等，研究萜類合成酶的底物特異性，確定其能夠催化的底物種類和最適底物濃度。通過監(jiān)測反應(yīng)過程中底物的消耗和產(chǎn)物的生成，利用高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）等分析技術(shù)，測定萜類合成酶的催化活性和反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)，如米氏常數(shù)（Km）、最大反應(yīng)速率（Vmax）等，深入了解其催化機(jī)制。采用定點(diǎn)突變、結(jié)構(gòu)生物學(xué)等技術(shù)，研究萜類合成酶的關(guān)鍵氨基酸殘基和結(jié)構(gòu)域?qū)ζ浯呋钚院偷孜锾禺愋缘挠绊?，進(jìn)一步揭示其作用機(jī)制。遺傳操作技術(shù)：利用CRISPR-Cas9等基因編輯技術(shù)，對微生物或植物細(xì)胞中萜類合成相關(guān)基因進(jìn)行敲除，阻斷相應(yīng)的合成途徑，觀察萜類產(chǎn)物的生成變化，驗(yàn)證基因在萜類合成途徑中的必要性。通過基因過表達(dá)技術(shù)，將萜類合成相關(guān)基因?qū)胛⑸锘蛑参锛?xì)胞中，使其過量表達(dá)，增強(qiáng)相應(yīng)的合成途徑，觀察萜類產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量變化，驗(yàn)證基因?qū)祁惡铣傻拇龠M(jìn)作用。結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù)，分析遺傳操作前后生物體內(nèi)代謝物的變化，全面了解萜類合成途徑的調(diào)控機(jī)制和代謝網(wǎng)絡(luò)的變化。本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示：首先廣泛收集萜類天然產(chǎn)物并進(jìn)行活性篩選，確定目標(biāo)萜類化合物；針對目標(biāo)化合物設(shè)計合成化學(xué)探針，利用化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜分析鑒定作用靶點(diǎn)，通過生物信息學(xué)分析揭示作用機(jī)制；同時，運(yùn)用多組學(xué)技術(shù)挖掘萜類合成相關(guān)基因，通過基因工程和酶學(xué)性質(zhì)研究解析合成途徑，利用遺傳操作技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證和優(yōu)化；最后，利用合成生物學(xué)和代謝工程技術(shù)構(gòu)建高效的萜類合成細(xì)胞工廠，實(shí)現(xiàn)萜類天然產(chǎn)物的大規(guī)模生產(chǎn)。[此處插入技術(shù)路線圖，圖中清晰展示各步驟的操作流程、使用的技術(shù)和方法以及各步驟之間的邏輯關(guān)系和先后順序]圖1-1技術(shù)路線圖[此處插入技術(shù)路線圖，圖中清晰展示各步驟的操作流程、使用的技術(shù)和方法以及各步驟之間的邏輯關(guān)系和先后順序]圖1-1技術(shù)路線圖圖1-1技術(shù)路線圖二、化學(xué)蛋白質(zhì)組方法原理與技術(shù)2.1化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)概述化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)是化學(xué)與生物學(xué)交叉融合形成的新興研究領(lǐng)域，它以蛋白質(zhì)組為研究對象，借助化學(xué)手段和技術(shù)，從分子層面全面解析蛋白質(zhì)的化學(xué)組成、修飾狀態(tài)、表達(dá)調(diào)控以及蛋白質(zhì)與其他生物分子之間的相互作用，從而深入理解蛋白質(zhì)在生命過程中的功能和機(jī)制?；瘜W(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的核心在于利用化學(xué)探針和化學(xué)反應(yīng)，特異性地標(biāo)記和研究蛋白質(zhì)組中的特定蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)修飾，實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)組的系統(tǒng)分析和功能闡釋?；瘜W(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展歷程緊密伴隨著化學(xué)、生物學(xué)和分析技術(shù)的不斷進(jìn)步。20世紀(jì)90年代，隨著人類基因組計劃的順利推進(jìn)，生命科學(xué)研究進(jìn)入了“組學(xué)”時代，蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)運(yùn)而生。早期的蛋白質(zhì)組學(xué)主要依賴于雙向凝膠電泳（2-DE）和質(zhì)譜技術(shù)，對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離和鑒定，但這些方法在分析復(fù)雜蛋白質(zhì)組時存在一定的局限性。隨著化學(xué)合成技術(shù)、生物正交化學(xué)和質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展，化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)逐漸興起，為蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了新的思路和方法。通過設(shè)計和合成各種功能獨(dú)特的化學(xué)探針，化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)能夠特異性地標(biāo)記和富集目標(biāo)蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)對低豐度蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)修飾的高效檢測和分析，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的不足。在研究范疇方面，化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)涵蓋了多個重要領(lǐng)域。其一，蛋白質(zhì)修飾分析是化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的重要研究內(nèi)容之一。蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTMs）是蛋白質(zhì)功能調(diào)控的關(guān)鍵機(jī)制，包括磷酸化、甲基化、乙?；⑻腔榷喾N修飾形式，這些修飾能夠顯著改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、活性、定位和相互作用，進(jìn)而影響細(xì)胞的生理功能和疾病的發(fā)生發(fā)展?；瘜W(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)通過開發(fā)特異性的化學(xué)探針和富集技術(shù)，能夠?qū)Ω鞣N蛋白質(zhì)修飾進(jìn)行系統(tǒng)分析，鑒定修飾位點(diǎn)，定量修飾水平，揭示蛋白質(zhì)修飾在細(xì)胞信號傳導(dǎo)、代謝調(diào)節(jié)、疾病發(fā)生等過程中的作用機(jī)制。例如，利用磷酸化特異性抗體或化學(xué)探針，結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，可以大規(guī)模鑒定和定量蛋白質(zhì)的磷酸化修飾位點(diǎn)，深入研究磷酸化信號通路在癌癥、神經(jīng)退行性疾病等疾病中的異常調(diào)控機(jī)制。其二，蛋白質(zhì)-小分子相互作用研究也是化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的核心領(lǐng)域。小分子化合物如藥物、天然產(chǎn)物、代謝物等與蛋白質(zhì)之間的相互作用在生命活動和藥物研發(fā)中具有至關(guān)重要的作用?；瘜W(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)通過構(gòu)建小分子探針庫，結(jié)合親和富集和質(zhì)譜分析技術(shù)，能夠全面鑒定與小分子相互作用的蛋白質(zhì)，確定小分子的作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制，為藥物設(shè)計和開發(fā)提供關(guān)鍵信息。在藥物研發(fā)中，利用化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以快速鑒定藥物的作用靶點(diǎn)，研究藥物與靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合模式和親和力，評估藥物的療效和安全性，加速新藥研發(fā)進(jìn)程。例如，通過將藥物分子與生物素等標(biāo)記物連接，制備成化學(xué)探針，與細(xì)胞裂解液或活細(xì)胞孵育后，利用親和富集技術(shù)分離與藥物結(jié)合的蛋白質(zhì)，再通過質(zhì)譜鑒定這些蛋白質(zhì)，從而確定藥物的作用靶點(diǎn)，為藥物的優(yōu)化和改進(jìn)提供依據(jù)。其三，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究也是化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的重要方向。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能，而蛋白質(zhì)的功能又受到其與其他生物分子相互作用的影響。化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)通過化學(xué)交聯(lián)、定點(diǎn)突變、小分子探針等技術(shù)，研究蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)、動態(tài)變化以及蛋白質(zhì)與其他生物分子的相互作用，揭示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，為蛋白質(zhì)功能的深入理解和調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。例如，利用化學(xué)交聯(lián)劑將蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間的特定氨基酸殘基連接起來，通過質(zhì)譜分析交聯(lián)肽段的序列，推斷蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用界面，為研究蛋白質(zhì)的功能機(jī)制提供重要信息?；瘜W(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)在解析生物分子相互作用中發(fā)揮著舉足輕重的作用。它能夠在復(fù)雜的生物體系中，系統(tǒng)、全面地研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與小分子之間的相互作用，為揭示生命過程的分子機(jī)制提供關(guān)鍵線索。在細(xì)胞信號傳導(dǎo)研究中，化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)可以鑒定參與信號通路的關(guān)鍵蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物，研究它們之間的相互作用和調(diào)控機(jī)制，深入了解細(xì)胞如何感知外界信號并做出相應(yīng)的反應(yīng)。在疾病研究領(lǐng)域，化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)能夠發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物和藥物作用靶點(diǎn)，為疾病的早期診斷、治療和藥物研發(fā)提供重要依據(jù)。在腫瘤研究中，通過化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以鑒定腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)或修飾的蛋白質(zhì)，以及與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，為腫瘤的精準(zhǔn)診斷和靶向治療提供新的靶點(diǎn)和策略。2.2常用化學(xué)蛋白質(zhì)組技術(shù)在萜類天然產(chǎn)物的研究中，化學(xué)蛋白質(zhì)組技術(shù)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，能夠有效揭示其作用靶點(diǎn)和合成途徑。根據(jù)是否對蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，化學(xué)蛋白質(zhì)組技術(shù)可分為基于標(biāo)記的技術(shù)和非標(biāo)記技術(shù)。2.2.1基于標(biāo)記的技術(shù)基于標(biāo)記的化學(xué)蛋白質(zhì)組技術(shù)是通過對蛋白質(zhì)或小分子配體進(jìn)行特異性標(biāo)記，利用標(biāo)記物與靶標(biāo)蛋白之間的特異性相互作用，實(shí)現(xiàn)對靶標(biāo)蛋白的富集和鑒定。這種技術(shù)能夠顯著提高檢測的靈敏度和特異性，有效降低背景干擾，在萜類天然產(chǎn)物作用靶點(diǎn)的研究中具有廣泛的應(yīng)用。親和標(biāo)記是基于標(biāo)記的化學(xué)蛋白質(zhì)組技術(shù)中的一種重要方法，其原理是利用具有特定結(jié)構(gòu)的小分子配體，與靶標(biāo)蛋白上的活性位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合，形成穩(wěn)定的共價鍵或非共價復(fù)合物。為了便于后續(xù)的分離和鑒定，小分子配體通常會被標(biāo)記上易于檢測和富集的標(biāo)簽，如生物素、熒光基團(tuán)或放射性同位素等。以生物素標(biāo)記為例，生物素與鏈霉親和素之間具有極高的親和力，通過生物素-鏈霉親和素親和層析，可以高效地將與生物素標(biāo)記的小分子配體結(jié)合的靶標(biāo)蛋白從復(fù)雜的蛋白質(zhì)組中分離出來。在萜類天然產(chǎn)物研究中，親和標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于鑒定其作用靶點(diǎn)。研究人員可以設(shè)計與萜類天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相似的小分子探針，將其標(biāo)記上生物素，然后與細(xì)胞裂解液或活細(xì)胞孵育，使探針與潛在的靶標(biāo)蛋白結(jié)合。經(jīng)過親和層析富集后，對富集得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析，從而鑒定出與萜類天然產(chǎn)物相互作用的靶標(biāo)蛋白?；钚蕴结槝?biāo)記是另一種常用的基于標(biāo)記的技術(shù)，其原理是利用具有化學(xué)反應(yīng)活性的探針分子，與蛋白質(zhì)組中的特定蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)修飾發(fā)生特異性反應(yīng)，形成共價結(jié)合?；钚蕴结樛ǔ０粋€能夠與目標(biāo)蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的識別基團(tuán)和一個具有化學(xué)反應(yīng)活性的官能團(tuán)，如親電試劑、親核試劑或光反應(yīng)基團(tuán)等。當(dāng)活性探針與目標(biāo)蛋白質(zhì)接觸時，識別基團(tuán)會特異性地結(jié)合到目標(biāo)蛋白質(zhì)上，而化學(xué)反應(yīng)活性基團(tuán)則會與蛋白質(zhì)上的特定氨基酸殘基發(fā)生共價反應(yīng)，從而將探針標(biāo)記到蛋白質(zhì)上。與親和標(biāo)記不同，活性探針標(biāo)記能夠直接反映蛋白質(zhì)的活性狀態(tài)，對于研究蛋白質(zhì)的功能和活性調(diào)節(jié)具有重要意義。在萜類天然產(chǎn)物合成途徑相關(guān)酶的研究中，活性探針標(biāo)記技術(shù)可用于檢測酶的活性和鑒定酶的底物。例如，設(shè)計一種含有特定反應(yīng)活性基團(tuán)的活性探針，使其能夠與萜類合成酶的活性位點(diǎn)結(jié)合并發(fā)生共價反應(yīng)。通過這種方式，可以將探針標(biāo)記到活性萜類合成酶上，然后利用質(zhì)譜分析等技術(shù)鑒定與探針結(jié)合的蛋白質(zhì)，從而確定萜類合成酶的身份和其在合成途徑中的作用。在實(shí)際應(yīng)用中，基于標(biāo)記的技術(shù)展現(xiàn)出了顯著的優(yōu)勢。親和標(biāo)記和活性探針標(biāo)記技術(shù)能夠提高檢測的靈敏度和特異性，有效地從復(fù)雜的蛋白質(zhì)組中富集和鑒定出與萜類天然產(chǎn)物相互作用的靶標(biāo)蛋白。這些技術(shù)能夠提供關(guān)于蛋白質(zhì)-小分子相互作用的詳細(xì)信息，包括結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合親和力等，為深入理解萜類天然產(chǎn)物的作用機(jī)制提供了關(guān)鍵線索。例如，在對某種具有抗腫瘤活性的萜類天然產(chǎn)物的研究中，研究人員運(yùn)用親和標(biāo)記技術(shù)，成功鑒定出其作用靶點(diǎn)為細(xì)胞內(nèi)的一種關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該萜類天然產(chǎn)物通過與靶點(diǎn)蛋白的特定結(jié)構(gòu)域結(jié)合，抑制了其信號傳導(dǎo)活性，從而阻斷了腫瘤細(xì)胞的增殖信號通路，發(fā)揮抗腫瘤作用?；钚蕴结槝?biāo)記技術(shù)在萜類天然產(chǎn)物合成途徑研究中也發(fā)揮了重要作用。通過對萜類合成酶的活性探針標(biāo)記，研究人員能夠準(zhǔn)確地鑒定出參與萜類合成的關(guān)鍵酶，并深入研究其催化機(jī)制和底物特異性。在研究某植物中萜類化合物的合成途徑時，利用活性探針標(biāo)記技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了一種新型的萜類合成酶，該酶具有獨(dú)特的底物特異性和催化活性，能夠催化合成一種結(jié)構(gòu)新穎的萜類化合物，為進(jìn)一步研究該植物中萜類化合物的生物合成提供了重要的基礎(chǔ)。2.2.2非標(biāo)記技術(shù)非標(biāo)記化學(xué)蛋白質(zhì)組技術(shù)是一類不依賴于對蛋白質(zhì)或小分子進(jìn)行標(biāo)記的分析方法，它通過直接分析蛋白質(zhì)在不同條件下的物理、化學(xué)性質(zhì)變化，來研究蛋白質(zhì)與小分子之間的相互作用以及蛋白質(zhì)的功能和活性。這類技術(shù)具有操作簡單、無需標(biāo)記、能夠保留蛋白質(zhì)天然狀態(tài)等優(yōu)點(diǎn)，在萜類天然產(chǎn)物研究中具有獨(dú)特的應(yīng)用價值。藥物親和力反應(yīng)靶標(biāo)穩(wěn)定性（DrugAffinityResponsiveTargetStability，DARTS）技術(shù)是一種基于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性變化來鑒定小分子作用靶點(diǎn)的非標(biāo)記技術(shù)。其原理是基于小分子與靶標(biāo)蛋白結(jié)合后，能夠改變靶標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，使其對蛋白酶的降解具有更強(qiáng)的抗性。在實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞裂解液或組織勻漿與萜類天然產(chǎn)物孵育，使萜類天然產(chǎn)物與潛在的靶標(biāo)蛋白相互作用。然后加入蛋白酶進(jìn)行消化，由于與萜類天然產(chǎn)物結(jié)合的靶標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，不易被蛋白酶降解，而未結(jié)合的蛋白質(zhì)則會被蛋白酶迅速降解。通過蛋白質(zhì)凝膠電泳或質(zhì)譜分析，對比加入萜類天然產(chǎn)物前后蛋白質(zhì)的降解情況，能夠鑒定出與萜類天然產(chǎn)物結(jié)合并受其保護(hù)的靶標(biāo)蛋白。DARTS技術(shù)具有操作簡便、無需對小分子或蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，能夠在接近生理條件下研究小分子與蛋白質(zhì)的相互作用，避免了標(biāo)記過程對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的潛在影響。在萜類天然產(chǎn)物研究中，DARTS技術(shù)可用于快速篩選和鑒定其作用靶點(diǎn)。例如，在研究一種具有抗炎活性的萜類化合物時，利用DARTS技術(shù)，成功鑒定出多個與該萜類化合物相互作用的靶標(biāo)蛋白，這些靶標(biāo)蛋白涉及炎癥信號通路中的多個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為揭示該萜類化合物的抗炎作用機(jī)制提供了重要線索。細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移分析（CellularThermalShiftAssay，CETSA）技術(shù)是另一種常用的非標(biāo)記技術(shù)，它通過監(jiān)測蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的熱穩(wěn)定性變化來鑒定小分子的作用靶點(diǎn)。其原理是基于小分子與靶標(biāo)蛋白結(jié)合后，會改變靶標(biāo)蛋白的熱穩(wěn)定性，使其在加熱過程中發(fā)生變性的溫度發(fā)生變化。在實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞與萜類天然產(chǎn)物孵育，然后將細(xì)胞分成多個樣品，分別在不同溫度下進(jìn)行加熱處理。加熱后，通過離心或過濾等方法分離細(xì)胞裂解液中的可溶性蛋白和不溶性蛋白，利用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）或質(zhì)譜分析等技術(shù)，檢測不同溫度下靶標(biāo)蛋白在可溶性蛋白和不溶性蛋白中的分布情況。通過繪制蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性曲線，對比加入萜類天然產(chǎn)物前后蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性曲線的變化，能夠確定與萜類天然產(chǎn)物結(jié)合并導(dǎo)致其熱穩(wěn)定性改變的靶標(biāo)蛋白。CETSA技術(shù)能夠在活細(xì)胞環(huán)境中進(jìn)行，更真實(shí)地反映小分子與蛋白質(zhì)在生理狀態(tài)下的相互作用，同時該技術(shù)還具有高通量、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，適用于大規(guī)模篩選和鑒定小分子的作用靶點(diǎn)。在萜類天然產(chǎn)物研究中，CETSA技術(shù)可用于驗(yàn)證和深入研究已鑒定的作用靶點(diǎn)，以及發(fā)現(xiàn)新的潛在靶點(diǎn)。例如，在對一種具有神經(jīng)保護(hù)作用的萜類天然產(chǎn)物的研究中，運(yùn)用CETSA技術(shù)，不僅驗(yàn)證了前期通過其他方法鑒定出的靶標(biāo)蛋白，還發(fā)現(xiàn)了一些新的與該萜類天然產(chǎn)物相互作用的蛋白質(zhì)，進(jìn)一步豐富了對其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制的認(rèn)識。非標(biāo)記技術(shù)在萜類天然產(chǎn)物研究中具有獨(dú)特的優(yōu)勢。這些技術(shù)無需對蛋白質(zhì)或小分子進(jìn)行標(biāo)記，避免了標(biāo)記過程可能帶來的干擾和誤差，能夠更真實(shí)地反映蛋白質(zhì)與小分子之間的相互作用以及蛋白質(zhì)的功能和活性。非標(biāo)記技術(shù)操作相對簡單，實(shí)驗(yàn)周期較短，成本較低，適用于大規(guī)模的樣品分析和高通量的篩選。DARTS技術(shù)和CETSA技術(shù)能夠在接近生理條件下進(jìn)行，無論是在細(xì)胞裂解液還是活細(xì)胞環(huán)境中，都能有效地鑒定小分子的作用靶點(diǎn)，為研究萜類天然產(chǎn)物的作用機(jī)制提供了更加準(zhǔn)確和全面的信息。2.3技術(shù)選擇與優(yōu)化在萜類天然產(chǎn)物作用靶點(diǎn)及合成途徑的解析研究中，技術(shù)的選擇至關(guān)重要，直接影響到研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。不同的化學(xué)蛋白質(zhì)組技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)，需要結(jié)合萜類天然產(chǎn)物的特點(diǎn)進(jìn)行綜合考量和選擇?；跇?biāo)記的技術(shù)，如親和標(biāo)記和活性探針標(biāo)記，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)勢，能夠有效富集和鑒定與萜類天然產(chǎn)物相互作用的靶標(biāo)蛋白。親和標(biāo)記技術(shù)利用小分子配體與靶標(biāo)蛋白的特異性結(jié)合，并通過標(biāo)記物實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)蛋白的分離，對于確定萜類天然產(chǎn)物的直接作用靶點(diǎn)具有重要意義。活性探針標(biāo)記技術(shù)則能夠反映蛋白質(zhì)的活性狀態(tài)，有助于研究萜類天然產(chǎn)物對蛋白質(zhì)功能和活性調(diào)節(jié)的影響。然而，這些技術(shù)也存在一些局限性，如標(biāo)記過程可能會影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，對實(shí)驗(yàn)操作要求較高，且成本相對較高。非標(biāo)記技術(shù)，如DARTS和CETSA，具有操作簡單、無需標(biāo)記、能夠保留蛋白質(zhì)天然狀態(tài)等優(yōu)點(diǎn)，能夠在接近生理條件下研究小分子與蛋白質(zhì)的相互作用。DARTS技術(shù)通過檢測蛋白質(zhì)在蛋白酶作用下的穩(wěn)定性變化來鑒定小分子的作用靶點(diǎn)，操作簡便快捷，適用于快速篩選和鑒定萜類天然產(chǎn)物的作用靶點(diǎn)。CETSA技術(shù)則通過監(jiān)測蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的熱穩(wěn)定性變化來確定小分子的作用靶點(diǎn)，能夠在活細(xì)胞環(huán)境中進(jìn)行，更真實(shí)地反映小分子與蛋白質(zhì)的相互作用。但非標(biāo)記技術(shù)的靈敏度相對較低，對于低親和力靶點(diǎn)和瞬時相互作用靶點(diǎn)的檢測能力有限，且數(shù)據(jù)的定量分析相對困難。萜類天然產(chǎn)物具有結(jié)構(gòu)多樣、生物活性廣泛、在生物體內(nèi)含量較低等特點(diǎn)。其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)可能導(dǎo)致與蛋白質(zhì)的相互作用模式多樣，需要技術(shù)能夠準(zhǔn)確捕捉和鑒定這些相互作用。基于萜類天然產(chǎn)物的這些特點(diǎn)，本研究選擇綜合運(yùn)用多種化學(xué)蛋白質(zhì)組技術(shù)，以充分發(fā)揮各技術(shù)的優(yōu)勢，彌補(bǔ)其不足。在作用靶點(diǎn)鑒定方面，首先采用親和標(biāo)記技術(shù)，利用設(shè)計合成的與萜類天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相似的小分子探針，特異性地富集與萜類天然產(chǎn)物結(jié)合的靶標(biāo)蛋白，通過質(zhì)譜分析初步鑒定靶標(biāo)蛋白。然后運(yùn)用DARTS技術(shù)對初步鑒定的靶標(biāo)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證和補(bǔ)充，在接近生理條件下進(jìn)一步確認(rèn)小分子與蛋白質(zhì)的相互作用，提高靶點(diǎn)鑒定的準(zhǔn)確性和可靠性。在技術(shù)優(yōu)化方面，針對基于標(biāo)記的技術(shù)，優(yōu)化標(biāo)記條件，包括標(biāo)記試劑的濃度、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度等，以提高標(biāo)記效率，減少對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的影響。在親和標(biāo)記中，精確控制生物素等標(biāo)記物與小分子配體的連接比例，確保標(biāo)記后的小分子探針既能保持與靶標(biāo)蛋白的特異性結(jié)合能力，又能便于后續(xù)的親和富集和質(zhì)譜分析。對于非標(biāo)記技術(shù)，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)，提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。在DARTS技術(shù)中，優(yōu)化蛋白酶的種類和濃度、消化時間等參數(shù)，確保能夠準(zhǔn)確檢測到與萜類天然產(chǎn)物結(jié)合的靶標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性變化。在CETSA技術(shù)中，精確控制加熱溫度范圍和時間間隔，提高蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性曲線的分辨率，更準(zhǔn)確地確定小分子對蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的影響。通過合理選擇和優(yōu)化化學(xué)蛋白質(zhì)組技術(shù)，本研究能夠更全面、準(zhǔn)確地解析萜類天然產(chǎn)物的作用靶點(diǎn)及合成途徑，為萜類天然產(chǎn)物的深入研究和開發(fā)利用提供有力的技術(shù)支持。三、萜類天然產(chǎn)物作用靶點(diǎn)解析3.1萜類天然產(chǎn)物概述萜類天然產(chǎn)物是一類在自然界廣泛分布且結(jié)構(gòu)多樣的有機(jī)化合物，其基本組成單元為異戊二烯（C_5H_8），這些異戊二烯單元通過不同的連接方式和修飾手段，形成了種類繁多的萜類化合物。根據(jù)分子中所含異戊二烯單元的數(shù)量，萜類化合物可被系統(tǒng)地分類為半萜（含1個異戊二烯單元）、單萜（含2個異戊二烯單元）、倍半萜（含3個異戊二烯單元）、二萜（含4個異戊二烯單元）、三萜（含6個異戊二烯單元）等。半萜在自然界中含量稀少，其焦磷酸酯，如異戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP），是萜類化合物生物合成過程中至關(guān)重要的活性中間體，參與后續(xù)各類萜類化合物的合成反應(yīng)。單萜廣泛存在于高等植物的分泌組織中，如唇形科、傘形科、松科等植物的腺體、油室和樹脂道，它是植物揮發(fā)油中低沸點(diǎn)部分的主要成分，具有分子量小、脂溶性的特點(diǎn)，其含氧衍生物往往具有濃郁香氣和顯著生理活性，在醫(yī)藥、化妝品和食品工業(yè)中有著廣泛應(yīng)用。薄荷醇具有清涼和弱麻醉作用，常用于鎮(zhèn)痛、止癢以及防腐殺菌；龍腦（冰片）具有發(fā)汗、興奮、解痙和防蟲蛀蝕的功效，還具有顯著的抗缺氧功能，在蘇冰滴丸中發(fā)揮重要作用，同時也是香料工業(yè)的重要原料。倍半萜同樣常見于植物揮發(fā)油中，并且在海洋生物中也有大量發(fā)現(xiàn)，其結(jié)構(gòu)相較于單萜更為復(fù)雜多樣，生物活性也更為廣泛。青蒿素作為倍半萜內(nèi)酯類化合物的典型代表，是治療瘧疾的一線藥物，自被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于臨床以來，極大地降低了瘧疾的死亡率，拯救了無數(shù)生命，其獨(dú)特的過氧橋結(jié)構(gòu)是發(fā)揮抗瘧活性的關(guān)鍵。二萜由四個異戊二烯單元構(gòu)成，常見于植物的苦味素、樹脂和植物醇中，具有多種生物活性。紫杉醇是一種具有獨(dú)特抗癌機(jī)制的二萜類化合物，它能夠促進(jìn)微管蛋白聚合，抑制其解聚，從而穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)，阻礙細(xì)胞有絲分裂，被廣泛應(yīng)用于乳腺癌、卵巢癌、肺癌等多種癌癥的治療，顯著改善了癌癥患者的生存狀況和預(yù)后。三萜通常由六個異戊二烯單元組成，在自然界中分布廣泛，常見的有皂苷和樹脂等。人參皂苷是人參中的主要活性成分之一，屬于三萜皂苷類化合物，具有多種藥理活性，如調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗腫瘤、降血脂等，對人體健康有著重要的保健作用。四萜含有八個異戊二烯單元，典型代表為植物胡蘿卜素，它是一類重要的天然色素，在光合作用、光保護(hù)以及抗氧化等生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。萜類天然產(chǎn)物不僅結(jié)構(gòu)豐富多樣，而且具有廣泛的生物活性，在醫(yī)藥領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的藥用潛力。除了上述的青蒿素和紫杉醇，還有許多萜類化合物在疾病治療中發(fā)揮著重要作用。穿心蓮內(nèi)酯是穿心蓮中的主要活性成分，屬于二萜內(nèi)酯類化合物，具有顯著的抗炎、抗菌、抗病毒等作用，常用于治療呼吸道感染、腸道感染等疾病，能夠有效減輕炎癥癥狀，抑制病原體的生長和繁殖。齊墩果酸是一種五環(huán)三萜類化合物，具有保肝、抗炎、抗腫瘤、降血脂等多種生物活性，在肝臟疾病的治療中具有重要的應(yīng)用前景，能夠保護(hù)肝細(xì)胞，促進(jìn)肝細(xì)胞的再生和修復(fù)，降低轉(zhuǎn)氨酶水平，減輕肝臟炎癥反應(yīng)。在醫(yī)藥領(lǐng)域，萜類天然產(chǎn)物還為新藥研發(fā)提供了豐富的先導(dǎo)化合物。許多科學(xué)家以萜類化合物為基礎(chǔ)，通過結(jié)構(gòu)修飾和改造，開發(fā)出具有更高活性、更低毒性的新型藥物。對青蒿素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，得到了蒿甲醚、青蒿琥酯等衍生物，這些衍生物在保留青蒿素抗瘧活性的基礎(chǔ)上，具有更好的溶解性、穩(wěn)定性和生物利用度，進(jìn)一步提高了瘧疾的治療效果。在抗癌藥物研發(fā)中，以紫杉醇為模板，進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和改造，旨在尋找具有更強(qiáng)抗癌活性、更低毒副作用的新型抗癌藥物，為癌癥治療提供更多的選擇和希望。3.2作用靶點(diǎn)研究案例分析3.2.1案例一：海洋Cyclopianes二萜海洋Cyclopianes二萜是一類結(jié)構(gòu)新穎且具有重要生物活性的天然產(chǎn)物，在炎癥調(diào)節(jié)等生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。以ConidiogenoneC為例，它作為Cyclopianes二萜家族的重要成員，展現(xiàn)出顯著的抗炎活性，為深入研究萜類天然產(chǎn)物的作用靶點(diǎn)及機(jī)制提供了理想的研究對象。為了全面揭示ConidiogenoneC的作用機(jī)制，研究人員運(yùn)用化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)方法，展開了系統(tǒng)的靶點(diǎn)鑒定工作。首先，設(shè)計并合成了炔基標(biāo)記的ConidiogenoneC小分子探針，該探針保留了ConidiogenoneC的關(guān)鍵活性結(jié)構(gòu)，確保了其能夠特異性地與潛在的靶標(biāo)蛋白相互作用。通過一系列生物學(xué)活性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了該探針與ConidiogenoneC具有相似的生物學(xué)活性，能夠有效下調(diào)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中IFN刺激基因（ISG）Ifnb、Mx1的mRNA表達(dá)水平，這表明探針在后續(xù)的靶點(diǎn)篩選實(shí)驗(yàn)中具有可靠性和有效性?；谠撎结槪芯咳藛T利用定量化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對與ConidiogenoneC相互作用的潛在靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行了全面篩選。在實(shí)驗(yàn)過程中，將探針與細(xì)胞裂解液孵育，使探針與潛在的靶標(biāo)蛋白特異性結(jié)合，隨后通過生物素-鏈霉親和素親和層析等技術(shù)，將與探針結(jié)合的蛋白質(zhì)從復(fù)雜的蛋白質(zhì)組中富集出來。經(jīng)過高分辨質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)處理，在3次生物學(xué)重復(fù)中均檢測到59個蛋白，這些蛋白被認(rèn)為是ConidiogenoneC的潛在靶點(diǎn)。為了進(jìn)一步明確這些潛在靶點(diǎn)的生物學(xué)功能和潛在作用機(jī)制，研究人員對其進(jìn)行了KEGG富集分析和GO分析。KEGG富集分析結(jié)果顯示，這些靶點(diǎn)蛋白顯著富集在與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)相關(guān)的信號通路中，暗示ConidiogenoneC可能通過調(diào)節(jié)這些信號通路來發(fā)揮抗炎作用。GO分析則從分子功能、細(xì)胞組成和生物學(xué)過程等多個層面，對靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行了全面注釋，為深入理解ConidiogenoneC的作用機(jī)制提供了豐富的信息。在眾多潛在靶點(diǎn)中，免疫相關(guān)GTP酶家族M蛋白1（IRGM1）被確定為ConidiogenoneC發(fā)揮抗炎作用的關(guān)鍵靶標(biāo)。IRGM1在先天免疫和炎癥反應(yīng)中扮演著重要角色，是調(diào)節(jié)炎癥信號通路的關(guān)鍵蛋白之一。為了驗(yàn)證IRGM1與ConidiogenoneC之間的直接相互作用，研究人員進(jìn)行了一系列驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。通過在裂解液或活細(xì)胞中與ConidiogenoneC共孵育的競爭性pull-down實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明ConidiogenoneC能夠直接與IRGM1蛋白結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。進(jìn)一步的機(jī)制研究揭示了ConidiogenoneC通過激活I(lǐng)RGM1介導(dǎo)的線粒體自噬，來維持炎性巨噬細(xì)胞的線粒體質(zhì)量控制，從而抑制I型干擾素的產(chǎn)生。具體而言，沉默IRGM1后，ConidiogenoneC對IFN刺激基因ISGs表達(dá)的抑制作用消失，這表明IRGM1是ConidiogenoneC發(fā)揮抗炎作用的關(guān)鍵介導(dǎo)者。先前的研究表明，IRGM1主要通過調(diào)節(jié)線粒體自噬通量來影響線粒體DNA（mtDNA）依賴的IFN-I反應(yīng)。研究人員發(fā)現(xiàn)，ConidiogenoneC能夠減少mtDNA向胞漿的釋放，從而抑制I型IFN反應(yīng)。同時，ConidiogenoneC能夠激活I(lǐng)RGM1介導(dǎo)的功能失調(diào)的線粒體自噬，有效挽救LPS誘導(dǎo)的線粒體功能障礙。而使用自噬抑制劑或沉默IRGM1均會顯著減弱ConidiogenoneC的作用，進(jìn)一步證實(shí)了IRGM1介導(dǎo)的線粒體自噬在ConidiogenoneC抗炎機(jī)制中的核心地位。通過純蛋白位點(diǎn)質(zhì)譜分析，研究人員還發(fā)現(xiàn)ConidiogenoneC可與IRGM1共價結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)為半胱氨酸殘基C373、C374與C375。這種特異性的共價結(jié)合方式，可能是ConidiogenoneC激活I(lǐng)RGM1的關(guān)鍵機(jī)制之一，為深入理解ConidiogenoneC與IRGM1之間的相互作用提供了重要的結(jié)構(gòu)信息。本研究通過化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)方法，成功鑒定出海洋Cyclopianes二萜ConidiogenoneC的作用靶點(diǎn)為IRGM1，并深入揭示了其通過激活I(lǐng)RGM1介導(dǎo)的線粒體自噬來抑制I型干擾素產(chǎn)生的抗炎作用機(jī)制。這一研究成果不僅為深入理解海洋萜類天然產(chǎn)物的作用機(jī)制提供了重要范例，也為開發(fā)基于IRGM1的新型抗炎藥物提供了潛在的先導(dǎo)化合物，具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價值。3.2.2案例二：大戟科二萜大戟科二萜是大戟科植物中一類重要的次生代謝產(chǎn)物，具有結(jié)構(gòu)多樣、生物活性廣泛的特點(diǎn)，在藥物研發(fā)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的潛力。以12-脫氧佛波醇13-棕櫚酸酯（DP）為例，它作為一種具有獨(dú)特5/7/6/3環(huán)系碳骨架的惕各烷型二萜，在抗肝纖維化研究中表現(xiàn)出顯著的活性，成為了深入探究大戟科二萜作用靶點(diǎn)及機(jī)制的重要研究對象。在抗肝纖維化研究中，研究人員首先通過高內(nèi)涵篩選技術(shù)，對構(gòu)建的大戟科二萜類化合物庫進(jìn)行了系統(tǒng)篩選，旨在尋找具有強(qiáng)效抗肝纖維化活性的化合物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DP在體內(nèi)外均表現(xiàn)出強(qiáng)效的抗肝纖維化活性，能夠有效抑制TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2（人肝星狀細(xì)胞系）和JS-1（小鼠肝星狀細(xì)胞系）細(xì)胞激活，其在低濃度下的效果與陽性藥物吡非尼酮（Pirfenidone，PFD）在高濃度下的效果相當(dāng)。此外，DP還能夠抑制小鼠原代肝星狀細(xì)胞自激活，以及抑制LX-23D細(xì)胞球中α-平滑肌肌動蛋白（α-smoothmuscleactin，α-SMA）的表達(dá)，這些結(jié)果充分表明DP是一種極具潛力的抗肝纖維化先導(dǎo)化合物。為了深入探究DP的作用機(jī)制，研究人員利用化學(xué)生物學(xué)手段，對其作用靶點(diǎn)進(jìn)行了全面解析?；贒P，研究人員巧妙地合成了具有光親和標(biāo)記和點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)的探針DP-PT，該探針保留了DP的關(guān)鍵活性結(jié)構(gòu)，且活性與DP相當(dāng)，為后續(xù)的靶點(diǎn)垂釣實(shí)驗(yàn)提供了有力工具。通過膠內(nèi)熒光掃描實(shí)驗(yàn)，直觀地驗(yàn)證了探針DP-PT能夠與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合。接著，利用靶點(diǎn)垂釣技術(shù)，將與探針結(jié)合的蛋白質(zhì)從復(fù)雜的細(xì)胞蛋白質(zhì)組中富集出來，為進(jìn)一步鑒定靶點(diǎn)蛋白奠定了基礎(chǔ)。通過競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)、體外蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)和熒光共定位分析等一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)驗(yàn)證，最終證實(shí)DP的作用靶點(diǎn)為載脂蛋白L2（APOL2）。值得注意的是，研究發(fā)現(xiàn)DP不與APOL1結(jié)合，這表明DP對APOL2具有一定的選擇性，這種選擇性結(jié)合可能是DP發(fā)揮特定生物學(xué)功能的重要基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步明確DP與APOL2之間的相互作用位點(diǎn)和關(guān)鍵氨基酸，研究人員進(jìn)行了深入研究。通過APOL2片段化蛋白pull-down檢測，初步確定了DP與APOL2相互作用的關(guān)鍵區(qū)域。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合光交聯(lián)質(zhì)譜分析、分子對接模擬和蛋白點(diǎn)突變驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，精確地發(fā)現(xiàn)DP主要作用于APOL2蛋白的186?266aa區(qū)域，其中N212和V216為關(guān)鍵氨基酸結(jié)合位點(diǎn)。這些關(guān)鍵位點(diǎn)的確定，為深入理解DP與APOL2之間的相互作用機(jī)制提供了重要的結(jié)構(gòu)信息。研究人員還對APOL2與肝纖維化之間的關(guān)系進(jìn)行了深入探討。通過臨床肝纖維化病人數(shù)據(jù)庫分析，以及對人體和動物肝臟中APOL2蛋白表達(dá)量的檢測，發(fā)現(xiàn)與正常肝臟組織相比，APOL2在纖維化肝臟組織中的表達(dá)量顯著升高，且與疾病分期進(jìn)展以及α-SMA表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系。進(jìn)一步通過特定細(xì)胞標(biāo)記物與人類和小鼠纖維化肝臟組織中APOL2進(jìn)行共染色實(shí)驗(yàn)，明確了APOL2主要在活化的HSCs中高表達(dá)。通過調(diào)控LX-2細(xì)胞中APOL2表達(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲低APOL2能顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的纖維化指標(biāo)上調(diào)，而過表達(dá)APOL2能夠在沒有TGF-β1刺激的情況下誘導(dǎo)纖維化指標(biāo)上調(diào)。基于以上結(jié)果，利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了Apol2全身敲除（Apol2-/-）小鼠，并在體內(nèi)研究了Apol2敲除對肝纖維化的影響，結(jié)果顯示Apol2敲除可以顯著抑制CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化進(jìn)展，且無明顯的器官毒性。這些結(jié)果充分表明APOL2與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是治療肝纖維化的潛在重要靶點(diǎn)。在明確了DP的作用靶點(diǎn)和APOL2與肝纖維化的關(guān)系后，研究人員進(jìn)一步對DP的抗肝纖維化機(jī)制進(jìn)行了深入解析。初步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)DP處理或者敲低APOL2不影響經(jīng)典的TGF-β/Smad信號通路，這表明DP可能通過其他途徑發(fā)揮抗肝纖維化作用。通過免疫沉淀質(zhì)譜、免疫熒光共定位、外源表達(dá)結(jié)合免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶2（SERCA2），一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmicreticulum，ER）定位的Ca2+泵，可以與APOL2相互作用，且APOL2的N端負(fù)責(zé)與SERCA2結(jié)合。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在TGF-β1的刺激下，APOL2通過抑制SERCA2對ERCa2+的螯合功能，進(jìn)而激活PERK介導(dǎo)的ER應(yīng)激通路。而DP則可以靶向APOL2，阻斷APOL2與SERCA2結(jié)合，恢復(fù)SERCA2的功能，抑制肝纖維化的發(fā)生。通過RNA-seq和基因調(diào)控實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)APOL2-ER應(yīng)激的下游效應(yīng)因子是HES1，且DP或APOL2敲低的抗纖維化作用是由HES1介導(dǎo)的。動物實(shí)驗(yàn)也顯示DP給藥或Apol2敲除可以抑制PERK-HES1信號通路。綜上所述，DP通過抑制APOL2-SERCA2-PERK-HES1軸發(fā)揮抗肝纖維化功效。本研究通過高內(nèi)涵篩選、化學(xué)生物學(xué)手段以及多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)的綜合運(yùn)用，成功發(fā)現(xiàn)大戟科二萜DP的直接作用靶點(diǎn)為APOL2，并深入揭示了其抗肝纖維化的作用機(jī)制。這一研究成果不僅為抗肝纖維化藥物的研發(fā)提供了新的先導(dǎo)化合物DP，也首次確認(rèn)APOL2為治療肝纖維化的潛在新靶點(diǎn)，為肝纖維化的治療提供了新的理論依據(jù)和治療策略，具有重要的臨床意義和應(yīng)用前景。3.2.3案例三：三萜天然產(chǎn)物三萜天然產(chǎn)物在自然界中廣泛存在，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，生物活性豐富，在抗病毒、抗炎、抗腫瘤等多個領(lǐng)域展現(xiàn)出潛在的藥用價值。以具有廣譜抗病毒活性的某三萜天然產(chǎn)物（以下簡稱“該三萜”）為例，深入研究其作用靶點(diǎn)及抗病毒機(jī)制，對于開發(fā)新型抗病毒藥物具有重要的理論和實(shí)踐意義。為了揭示該三萜的抗病毒機(jī)制，研究人員首先根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和作用機(jī)制的假設(shè)，精心設(shè)計并合成了一系列分子探針。這些探針保留了該三萜的關(guān)鍵活性基團(tuán)，同時引入了便于檢測和富集的標(biāo)簽，如生物素或熒光基團(tuán)，以便于后續(xù)對與探針結(jié)合的靶標(biāo)蛋白進(jìn)行分離和鑒定。通過一系列體外抗病毒實(shí)驗(yàn)，研究人員發(fā)現(xiàn)該三萜能夠有效地抑制多種病毒的感染，包括流感病毒、皰疹病毒等，展現(xiàn)出顯著的廣譜抗病毒活性。為了確定其作用靶點(diǎn)，研究人員將合成的分子探針與病毒感染的細(xì)胞裂解液進(jìn)行孵育，使探針與潛在的靶標(biāo)蛋白特異性結(jié)合。隨后，利用親和富集技術(shù)，如生物素-鏈霉親和素親和層析，將與探針結(jié)合的蛋白質(zhì)從復(fù)雜的蛋白質(zhì)組中分離出來。對富集得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行高分辨質(zhì)譜分析，結(jié)合蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫比對，研究人員發(fā)現(xiàn)該三萜的分子探針能夠特異性地結(jié)合到病毒膜蛋白的HR2片段上。HR2片段在病毒膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能中起著關(guān)鍵作用，它參與了病毒與宿主細(xì)胞的融合過程，是病毒感染宿主細(xì)胞的重要環(huán)節(jié)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該三萜與病毒膜蛋白HR2片段的結(jié)合以及這種結(jié)合對病毒感染的影響，研究人員進(jìn)行了一系列驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。通過表面等離子共振（SPR）技術(shù)，精確測定了該三萜與HR2片段之間的結(jié)合親和力，結(jié)果顯示二者具有較高的親和力，能夠形成穩(wěn)定的復(fù)合物。利用冷凍電鏡技術(shù)，研究人員解析了該三萜與HR2片段復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，從原子層面揭示了二者的結(jié)合模式和相互作用機(jī)制。結(jié)果表明，該三萜通過與HR2片段上的特定氨基酸殘基形成氫鍵、疏水相互作用等非共價相互作用，穩(wěn)定了HR2片段的結(jié)構(gòu)，從而阻礙了病毒膜蛋白的正常構(gòu)象變化，抑制了病毒與宿主細(xì)胞的融合過程，最終實(shí)現(xiàn)了對病毒感染的抑制。為了深入探究該三萜抑制病毒感染的分子機(jī)制，研究人員進(jìn)行了細(xì)胞水平和動物水平的實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞水平上，通過熒光標(biāo)記的病毒感染實(shí)驗(yàn)，觀察到該三萜處理后的細(xì)胞中，病毒的感染效率顯著降低，病毒核酸和蛋白的合成受到明顯抑制。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，該三萜能夠抑制病毒感染引起的細(xì)胞內(nèi)信號通路的激活，如NF-κB信號通路和MAPK信號通路，這些信號通路在病毒感染后的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞免疫應(yīng)答中起著關(guān)鍵作用。在動物水平上，利用病毒感染的小鼠模型，給予該三萜處理后，小鼠的病毒載量顯著降低，臨床癥狀得到明顯改善，生存率顯著提高，表明該三萜在體內(nèi)也具有良好的抗病毒效果。本研究通過設(shè)計合成分子探針，結(jié)合多種先進(jìn)的分析技術(shù)，成功解析出三萜天然產(chǎn)物通過結(jié)合到病毒膜蛋白HR2片段，從而廣譜抑制病毒感染的機(jī)制。這一研究成果不僅為深入理解三萜天然產(chǎn)物的抗病毒作用提供了重要的理論依據(jù)，也為開發(fā)新型的廣譜抗病毒藥物提供了潛在的先導(dǎo)化合物和作用靶點(diǎn)，具有重要的科學(xué)價值和應(yīng)用前景。3.3靶點(diǎn)驗(yàn)證與功能研究在通過化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)初步鑒定出萜類天然產(chǎn)物的作用靶點(diǎn)后，需要進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)?shù)陌悬c(diǎn)驗(yàn)證，以確保所鑒定靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性和可靠性，進(jìn)而深入研究靶點(diǎn)的功能，揭示萜類天然產(chǎn)物的作用機(jī)制。Pulldown實(shí)驗(yàn)是一種常用的靶點(diǎn)驗(yàn)證方法，其原理基于蛋白質(zhì)與配體之間的特異性相互作用。在萜類天然產(chǎn)物靶點(diǎn)驗(yàn)證中，將萜類天然產(chǎn)物或其類似物固定在固相載體上，如瓊脂糖珠或磁珠，然后與細(xì)胞裂解液或含有靶標(biāo)蛋白的溶液孵育。在孵育過程中，與萜類天然產(chǎn)物具有特異性相互作用的靶標(biāo)蛋白會被固相載體捕獲，而其他非特異性結(jié)合的蛋白則在洗滌步驟中被去除。最后，通過蛋白質(zhì)凝膠電泳、免疫印跡或質(zhì)譜分析等技術(shù)，對捕獲的蛋白進(jìn)行鑒定和分析，以確認(rèn)其是否為之前鑒定出的靶點(diǎn)蛋白。這種方法能夠直觀地驗(yàn)證萜類天然產(chǎn)物與靶標(biāo)蛋白之間的直接相互作用，為靶點(diǎn)的真實(shí)性提供有力的證據(jù)。蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)也是驗(yàn)證靶點(diǎn)的重要手段。該實(shí)驗(yàn)利用抗原與抗體之間的特異性結(jié)合，在細(xì)胞裂解液中加入針對疑似靶點(diǎn)蛋白的特異性抗體，形成抗原-抗體復(fù)合物。通過加入ProteinA/G磁珠等，使抗原-抗體復(fù)合物與磁珠結(jié)合，經(jīng)過洗滌去除雜質(zhì)后，對免疫沉淀下來的蛋白復(fù)合物進(jìn)行分析。如果在復(fù)合物中檢測到萜類天然產(chǎn)物及其相關(guān)的信號分子，即可進(jìn)一步證明萜類天然產(chǎn)物與靶點(diǎn)蛋白在細(xì)胞內(nèi)存在相互作用，且這種相互作用可能參與了相關(guān)的生物學(xué)過程。蛋白質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛟诮咏項l件下驗(yàn)證蛋白質(zhì)之間的相互作用，對于揭示萜類天然產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的作用機(jī)制具有重要意義。蛋白位點(diǎn)質(zhì)譜是研究靶點(diǎn)功能的關(guān)鍵技術(shù)之一，它能夠精確地鑒定蛋白質(zhì)與萜類天然產(chǎn)物結(jié)合的具體位點(diǎn)。通過對與萜類天然產(chǎn)物結(jié)合的靶標(biāo)蛋白進(jìn)行酶解處理，將其消化成肽段，然后利用高分辨質(zhì)譜對肽段進(jìn)行分析。通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)，可以確定與萜類天然產(chǎn)物結(jié)合的肽段序列，進(jìn)而推斷出結(jié)合位點(diǎn)在蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中的位置。結(jié)合蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)信息，還可以深入了解結(jié)合位點(diǎn)對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的影響。在研究某萜類天然產(chǎn)物對酶活性的調(diào)節(jié)機(jī)制時，通過蛋白位點(diǎn)質(zhì)譜確定了其與酶活性中心附近的特定氨基酸殘基結(jié)合，從而影響了酶的催化活性和底物特異性，為深入理解萜類天然產(chǎn)物對該酶的調(diào)控機(jī)制提供了重要的結(jié)構(gòu)信息。為了全面深入地研究靶點(diǎn)的功能，還需要綜合運(yùn)用多種策略?；蚓庉嫾夹g(shù)，如CRISPR-Cas9系統(tǒng)，可對細(xì)胞或生物體中的靶點(diǎn)基因進(jìn)行敲除、敲入或定點(diǎn)突變，通過觀察基因編輯后細(xì)胞或生物體的表型變化，深入研究靶點(diǎn)基因在生理和病理過程中的功能。在研究某萜類天然產(chǎn)物的抗腫瘤作用機(jī)制時，利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除腫瘤細(xì)胞中的靶點(diǎn)基因，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力發(fā)生了顯著變化，表明該靶點(diǎn)基因在腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為中起著關(guān)鍵作用，進(jìn)一步證實(shí)了萜類天然產(chǎn)物通過作用于該靶點(diǎn)發(fā)揮抗腫瘤作用。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析也是研究靶點(diǎn)功能的重要策略。通過構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，能夠直觀地展示靶點(diǎn)蛋白與其他蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系，揭示靶點(diǎn)蛋白在細(xì)胞內(nèi)參與的信號傳導(dǎo)通路和生物學(xué)過程。利用生物信息學(xué)工具和數(shù)據(jù)庫，如STRING、BioGRID等，整合已有的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)，構(gòu)建包含靶點(diǎn)蛋白的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。通過對網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，確定靶點(diǎn)蛋白在網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)位置，預(yù)測其可能參與的生物學(xué)功能和信號通路。結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，深入研究靶點(diǎn)蛋白在這些生物學(xué)過程中的具體作用機(jī)制，為全面理解萜類天然產(chǎn)物的作用機(jī)制提供系統(tǒng)的視角。細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)也不可或缺。通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、免疫熒光染色、WesternBlot等技術(shù)，在細(xì)胞水平和分子水平上研究靶點(diǎn)蛋白對細(xì)胞生理功能的影響，以及萜類天然產(chǎn)物對靶點(diǎn)蛋白相關(guān)信號通路的調(diào)控作用。在研究某萜類天然產(chǎn)物的抗炎作用機(jī)制時，利用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該萜類天然產(chǎn)物能夠抑制炎癥細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡；通過免疫熒光染色和WesternBlot技術(shù)，檢測到炎癥相關(guān)信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)和磷酸化水平發(fā)生了變化，表明該萜類天然產(chǎn)物通過調(diào)節(jié)這些信號通路發(fā)揮抗炎作用。四、萜類天然產(chǎn)物合成途徑解析4.1萜類化合物合成途徑基礎(chǔ)萜類化合物在生物體內(nèi)的合成主要通過甲羥戊酸途徑（Mevalonatepathway，MVA途徑）和非甲羥戊酸途徑（Non-mevalonatepathway，MEP途徑），這兩條途徑在不同的生物部位和生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，且各自涉及一系列復(fù)雜的酶促反應(yīng)和中間產(chǎn)物。甲羥戊酸途徑主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，是真核生物和部分原核生物合成萜類化合物的重要途徑。該途徑以乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）為起始原料，在一系列酶的催化作用下逐步合成萜類化合物的基本結(jié)構(gòu)單元——異戊烯基焦磷酸（Isopentenylpyrophosphate，IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（Dimethylallylpyrophosphate，DMAPP）。具體反應(yīng)過程如下：首先，兩分子乙酰輔酶A在乙酰乙酰輔酶A硫解酶（Acetoacetyl-CoAthiolase）的催化下，縮合生成乙酰乙酰輔酶A；接著，乙酰乙酰輔酶A與另一分子乙酰輔酶A在3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAsynthase，HMG-CoAsynthase）的作用下，形成3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA，HMG-CoA）；HMG-CoA在3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAreductase，HMG-CoAreductase）的催化下，經(jīng)過兩步還原反應(yīng)，消耗兩分子NADPH，生成甲羥戊酸（Mevalonicacid，MVA）。甲羥戊酸是甲羥戊酸途徑中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，它的生成是該途徑的限速步驟，HMG-CoAreductase也是整個途徑中的關(guān)鍵限速酶，其活性受到多種因素的嚴(yán)格調(diào)控，如細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平、激素信號等，以維持細(xì)胞內(nèi)萜類化合物合成的平衡。甲羥戊酸生成后，在甲羥戊酸激酶（Mevalonatekinase，MVK）的作用下，被磷酸化生成5-磷酸甲羥戊酸（Mevalonate-5-phosphate）；5-磷酸甲羥戊酸再經(jīng)磷酸甲羥戊酸激酶（Phosphomevalonatekinase，PMK）催化，進(jìn)一步磷酸化形成5-二磷酸甲羥戊酸（Mevalonate-5-diphosphate）；5-二磷酸甲羥戊酸在5-二磷酸甲羥戊酸脫羧酶（Mevalonate-5-diphosphatedecarboxylase，MVD）的作用下，發(fā)生脫羧和磷酸化反應(yīng)，生成IPP。IPP在異構(gòu)酶的作用下，可以發(fā)生異構(gòu)化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為DMAPP，IPP和DMAPP是萜類化合物合成的通用前體，它們可以通過不同的酶促反應(yīng)，逐步聚合形成各種萜類化合物。非甲羥戊酸途徑，也稱為2-甲基赤蘚醇-4-磷酸途徑（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphatepathway，MEP途徑），主要存在于植物的質(zhì)體、某些細(xì)菌和藻類中，是這些生物合成萜類化合物的重要途徑。該途徑以丙酮酸（Pyruvate）和3-磷酸甘油醛（Glyceraldehyde-3-phosphate）為起始原料，在一系列酶的作用下合成IPP和DMAPP。具體過程為：丙酮酸和3-磷酸甘油醛在1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphatesynthase，DXS）的催化下，縮合生成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate，DOXP），DXS是MEP途徑的關(guān)鍵限速酶，其活性對MEP途徑的通量起著重要的調(diào)控作用，受到多種環(huán)境因素和代謝物的調(diào)節(jié)。DOXP在1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphatereductoisomerase，DXR）的催化下，發(fā)生還原異構(gòu)化反應(yīng)，生成2-甲基赤蘚醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP）。MEP在2-C-甲基赤蘚醇-4-磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphatecytidylyltransferase，MCT）的作用下，與CTP反應(yīng)，生成4-（胞苷-5'-二磷酸）-2-C-甲基赤蘚醇（4-（cytidine-5'-diphosphate）-2-C-methyl-D-erythritol，CDP-ME）；CDP-ME在4-（胞苷-5'-二磷酸）-2-C-甲基赤蘚醇激酶（4-（cytidine-5'-diphosphate）-2-C-methyl-D-erythritolkinase，CMK）的催化下，被磷酸化生成4-（胞苷-5'-二磷酸）-2-C-甲基赤蘚醇-2-磷酸（4-（cytidine-5'-diphosphate）-2-C-methyl-D-erythritol-2-phosphate，CDP-MEP）；CDP-MEP在2-C-甲基赤蘚醇-2,4-環(huán)二磷酸合酶（2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphatesynthase，MDS）的作用下，發(fā)生環(huán)化反應(yīng)，生成2-C-甲基赤蘚醇-2,4-環(huán)二磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate，MEcPP）；MEcPP在1-羥基-2-甲基-2-（E）-丁烯基-4-磷酸合酶（1-hydroxy-2-methyl-2-（E）-butenyl-4-phosphatesynthase，HDS）的催化下，經(jīng)過一系列復(fù)雜的反應(yīng)，生成1-羥基-2-甲基-2-（E）-丁烯基-4-磷酸（1-hydroxy-2-methyl-2-（E）-butenyl-4-phosphate，HMB-PP）；HMB-PP在1-羥基-2-甲基-2-（E）-丁烯基-4-磷酸還原酶（1-hydroxy-2-methyl-2-（E）-丁烯基-4-phosphatereductase，HDR）的作用下，被還原生成IPP和DMAPP。甲羥戊酸途徑和非甲羥戊酸途徑雖然起始原料和反應(yīng)步驟不同，但它們最終都生成了IPP和DMAPP這兩種通用前體，為后續(xù)萜類化合物的合成提供了基礎(chǔ)。在植物中，這兩條途徑并不是孤立存在的，它們之間存在著復(fù)雜的相互聯(lián)系和協(xié)同調(diào)控機(jī)制，共同參與植物萜類化合物的生物合成，以滿足植物生長、發(fā)育和應(yīng)對環(huán)境脅迫等多種生理過程的需求。4.2合成途徑研究案例分析4.2.1案例一：香紫蘇醇生物合成香紫蘇醇是一種重要的二萜類化合物，具有獨(dú)特的香氣和廣泛的生物活性，在香料、醫(yī)藥和農(nóng)藥等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價值。它主要用作合成天然龍涎香等香料產(chǎn)品和藥品的原料，其本身也是一種天然植物香料。然而，傳統(tǒng)的香紫蘇醇獲取方法主要是從香紫蘇中提取，由于植物成分復(fù)雜，分離純化困難，且培育種植受地理、氣候等因素影響，制約了香紫蘇醇的穩(wěn)定供應(yīng)。因此，構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠，通過引入異源萜類合成途徑并改造內(nèi)源代謝途徑，成為實(shí)現(xiàn)高值萜類化合物高效合成的重要策略。大連化物所周雍進(jìn)團(tuán)隊在釀酒酵母中構(gòu)建并優(yōu)化二萜香紫蘇醇生物合成途徑，取得了顯著成果。該團(tuán)隊以釀酒酵母為細(xì)胞工廠，系統(tǒng)改造其中心代謝，實(shí)現(xiàn)了以葡萄糖為原料高效合成香紫蘇醇，產(chǎn)量達(dá)到11.4g/L，為目前已有報道的二萜類最高產(chǎn)量。在研究過程中，該團(tuán)隊采取了一系列關(guān)鍵步驟和調(diào)控策略。首先，通過模塊化重新調(diào)整細(xì)胞代謝路徑，成功構(gòu)建了多功能酵母細(xì)胞工廠。研究人員將整個代謝路徑分為三個模塊，即供應(yīng)乙酰輔酶A的中心代謝途徑、類異戊二烯生物合成途徑和調(diào)節(jié)因子模塊。在中心代謝途徑模塊，為了減少繁瑣的基因改造步驟，團(tuán)隊通過重新調(diào)整底盤細(xì)胞的中心代謝，嘗試將細(xì)胞代謝從游離脂肪酸（FFA）的生物合成轉(zhuǎn)化為合成二萜化合物。具體而言，原位恢復(fù)了刪掉的FFA1/4，并去掉用于脂肪酸生物合成的過表達(dá)基因FAS1/2和TESA，從而構(gòu)建了一個可高效供應(yīng)乙酰輔酶A和NADPH的底盤菌株。在底盤中，過表達(dá)tHMG1、SpHMGR和ERG20基因，香紫蘇醇的產(chǎn)量為6.4mg/L，比對照菌株CXM21提高了5.2倍。進(jìn)一步過表達(dá)ERG10和HMG2基因，香紫蘇醇的產(chǎn)量為49.1mg/L，比對照菌株CXM22提高了22倍。與野生型相比，增強(qiáng)底盤細(xì)胞的中心代謝能更明顯改善類異戊二烯生物的合成。在類異戊二烯生物合成途徑模塊，團(tuán)隊通過基因拷貝增加與刪除嘗試提高產(chǎn)量。在菌株SCX32中，表達(dá)兩個HMG2*基因可以將香紫蘇醇產(chǎn)量提高到120.3mg/L；在菌株SCX38中，過表達(dá)融合基因BTS1-PaGGPPS使香紫蘇醇產(chǎn)量提高到347.4mg/L。在調(diào)節(jié)因子模塊，團(tuán)隊評估了優(yōu)化調(diào)節(jié)因子對香紫蘇醇產(chǎn)量的影響。刪除菌株SCX38中的調(diào)節(jié)基因ROX1、DOS2、VBA5、YER134C、YNR063W和YGR259C，并觀察到菌株SCX42中香紫蘇醇產(chǎn)量為918mg/L，較SCX38中的產(chǎn)量提高1.7倍。該團(tuán)隊還嘗試通過改造合成酶提高產(chǎn)量，他們在酵母基因上融合了Tps和Lpps兩種合成酶，這是鼠尾草中的I類和II類二萜合成酶，生物合成香紫蘇醇也是基于這兩種酶實(shí)現(xiàn)兩步酶促催化反應(yīng)。數(shù)據(jù)顯示，Tps-Lpps融合可有效將香紫蘇醇的產(chǎn)量提高6.7倍。然后，他們將Tps-Lpps的N端與麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）的一部分連接在一起，用以提高酶的穩(wěn)定性，這一優(yōu)化將香紫蘇醇的產(chǎn)量提高了43%。為了節(jié)省細(xì)胞催化劑構(gòu)建流程，該團(tuán)隊發(fā)展了代謝切換策略，將前期構(gòu)建的高產(chǎn)脂肪酸菌株Y&Z036快速切換為香紫蘇醇合成細(xì)胞工廠，節(jié)約了18個基因操作步驟，縮短了細(xì)胞工廠的構(gòu)建時間。借助轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝流分析技術(shù)，團(tuán)隊揭示了二萜高效合成菌株的代謝流調(diào)控規(guī)律，為構(gòu)建高效萜類合成細(xì)胞工程提供了理論指導(dǎo)。通過上述一系列關(guān)鍵步驟和調(diào)控策略，周雍進(jìn)團(tuán)隊成功實(shí)現(xiàn)了香紫蘇醇在釀酒酵母中的高效合成，不僅為香紫蘇醇的工業(yè)化生產(chǎn)提供了新的技術(shù)路線，也為其他萜類化合物的微生物合成提供了重要的參考和借鑒，推動了萜類天然產(chǎn)物合成生物學(xué)的發(fā)展。4.2.2案例二：圓柚酮生物合成圓柚酮是柚子味的特征分子，也是新一代安全的驅(qū)蟲劑，具有重要的應(yīng)用價值。然而，從柚子等植物中提取圓柚酮的產(chǎn)量和成本難以滿足市場的需求，急需建立新型替代的高效生物合成技術(shù)。益智是海南省特色道地中藥材，其成熟種子中含有豐富的圓柚酮，含量高低已作為判別益智果品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)。武漢大學(xué)魯麗/劉天罡課題組利用萜類前體高效供應(yīng)酵母底盤，解析了藥用植物益智中圓柚酮的生物合成途徑，并在酵母中成功重構(gòu)，為植物次生代謝途徑解析及高附加值天然產(chǎn)物的綠色生物合成提供了新的研究方法。該課題組利用前期開發(fā)的高效萜類前體供應(yīng)酵母底盤，通過邊篩選邊構(gòu)建的方式，逐步解析了圓柚酮的生物合成途徑。首先，通過第一輪高通量篩選，鑒定到合成關(guān)鍵前體瓦倫烯的萜類合酶AoVS，并將瓦倫烯合成酶整合到酵母基因組中，構(gòu)建了產(chǎn)瓦倫烯的工程酵母菌。接著，利用該菌株進(jìn)