ICS07.100.99

CCSB41

15

內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標準

DB15/T2076—2021

動物墊料中綠膿桿菌檢測

DetectionofPseudomonpsaeruginosainanimalbedding

2021-01-25發(fā)布2021-02-25實施

內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T2076—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由中華人民共和國呼和浩特海關(guān)提出并歸口。

本文件起草單位：中華人民共和國呼和浩特海關(guān)、二連浩特市疾病預防控制中心。

本文件主要起草人：趙治國、敖威華、楊帆、延涵、王海艷、陳林軍、崔強、韓祎陟、靳木子、郭

文麗、馬彩霞。

I

DB15/T2076—2021

動物墊料中綠膿桿菌檢測

1范圍

本文件規(guī)定了動物墊料中綠膿桿菌的定性檢測方法。

本文件適用于動物墊料中綠膿桿菌定性檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB19489實驗室生物安全通用要求

GB/T33682基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜鑒別微生物方法通則

SN/T1538.1培養(yǎng)基制備指南第1部分：實驗室培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證通則

SN/T1538.2培養(yǎng)基制備指南第2部分：培養(yǎng)基性能測試實用指南

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

動物墊料animalbedding

用于吸收動物排泄物，使動物保持舒適生活環(huán)境的鋪墊物。

注：包括動物籠內(nèi)非直接與動物機體接觸的鋪墊物。

4設(shè)備和材料

4.1冰箱：2℃～5℃。

4.2全自動細菌鑒定系統(tǒng)。

4.3飛行時間質(zhì)譜儀。

4.4二級生物安全柜。

4.5天平：感量0.1g。

4.6pH計。

4.7無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。

4.8高壓滅菌器。

4.9無菌量筒：250mL。

4.10無菌試管：18mm×180mm。

4.11均質(zhì)器及滅菌帶濾膜的均質(zhì)袋。

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DB15/T2076—2021

4.12恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。

4.13無菌接種針、接種環(huán)。

4.14光學顯微鏡。

4.15無菌培養(yǎng)皿：15mm×90mm。

4.16無菌試管：18mm×180mm。

4.17無菌棉簽。

4.18無菌鑷子。

4.19無菌剪刀。

4.20無菌勺。

4.21無菌載玻片。

5培養(yǎng)基和試劑

5.1實驗用水：符合GB/T6682的要求。

5.2SCDLP增菌液：見附錄A中A.2。

5.3假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基：見附錄A中A.3。

5.4假單胞菌CN選擇性培養(yǎng)基：見附錄A中A.4。

5.5氧化酶試驗：見附錄A中A.5。

5.6革蘭氏染液：見附錄A中A.6。

5.7綠膿菌素培養(yǎng)液：詳見詳見附錄A中A.7。

5.8硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基：見附錄A中A.8。

5.9明膠液化培養(yǎng)基：見附錄A中A.9。

5.10營養(yǎng)瓊脂：見附錄A中A.10。

5.11生化鑒定試劑盒。

5.12革蘭氏陰性菌生化鑒定卡。

5.13飛行時間質(zhì)譜儀靶板。

5.14綠膿桿菌標準菌株ATCC27853，或等效菌株。

6檢驗程序

綠膿桿菌檢驗程序見圖1。

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樣品制備

檢樣25g或25cm2樣液+225mLSCDLP增菌

36℃±1℃，24h±2h

和平板

CFCCN

挑取可疑菌落，接種營養(yǎng)瓊脂平板

36℃±1℃，18h～24h

革蘭氏染色

全自動細菌鑒定系統(tǒng)或飛行時間質(zhì)譜儀鑒定

硝

氧綠明4

酸

化膿膠2

鹽

酶菌還液℃

原

試素化生

產(chǎn)

驗試長

氣

報告

圖1綠膿桿菌檢驗程序

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DB15/T2076—2021

7操作步驟

7.1取樣

7.1.1取樣原則

應遵循隨機性、代表性的原則。取樣過程遵循無菌操作程序，防止一切可能的外來污染。

7.1.2樣品處理

7.1.2.1顆粒狀或粉末樣品

對送檢樣品包裝內(nèi)不同部位樣品進行隨機多點取樣至少250g，充分混勻后無菌稱取25g顆粒狀或

粉末狀墊料樣品，加入225mLSCDLP，充分振搖或均質(zhì)1min～2min，置36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。

7.1.2.2平面墊料樣品

無菌操作將滅菌規(guī)格板（5cmí5cm）放在平面墊料表面，用浸有無菌稀釋液（磷酸緩沖液或生理

鹽水）的棉拭子，在規(guī)格板內(nèi)來回均勻涂抹整個方格3次，并隨之轉(zhuǎn)動棉拭子，然后用滅菌剪刀剪去

棉拭子與手接觸的部分，將棉拭子頭置入裝有25mL無菌稀釋液的無菌錐形瓶中，根據(jù)樣品面積大小

重復取樣1～4個規(guī)格板面積，相應地將棉拭子頭置入25mL～100mL的無菌稀釋液中，充分振搖制成

樣品原液（1mL原液對應的樣品面積為1cm2），取樣量見表1。取25mL樣品原液加入225mLSCDLP，

充分振搖或均質(zhì)1min～2min，置36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。

表1不同面積平面類墊料樣品取樣量

樣品面積取樣量

規(guī)格板數(shù)

m2cm2

小于0.25（含）251

0.25～0.5（含）502

0.5～0.75（含）753

大于0.751004

7.2分離培養(yǎng)

用滅菌接種環(huán)取SCDLP增菌液，分別劃線接種于CFC平板和CN平板，于36℃±1℃分別培養(yǎng)24h

±2h，觀察菌落形態(tài)。綠膿桿菌在這兩種平板上通常呈現(xiàn)圓形、平滑、濕潤的黃綠色菌落，在紫外光

照射下可觀察到熒光。少數(shù)不形成黃綠色菌落，但有特殊芳香氣味。從每個平板上挑取5～10個（若少

于5個則全部挑?。┛梢删洌謩e接種到營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，取

純培養(yǎng)物進行鑒定。

7.3鑒定

7.3.1革蘭氏染色鏡檢

挑取營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上的純培養(yǎng)物，進行革蘭氏染色鏡檢，綠膿桿菌為革蘭氏陰性桿菌。

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7.3.2生化鑒定

7.3.2.1氧化酶試驗

挑取營養(yǎng)瓊脂平板上的純培養(yǎng)物，進行氧化酶試驗，綠膿桿菌氧化酶試驗結(jié)果呈陽性。

7.3.2.2綠膿菌素試驗

挑取營養(yǎng)瓊脂平板上的純培養(yǎng)物,接種在綠膿菌素測定培養(yǎng)基上,置36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h,

加入三氯甲烷3mL～5mL,充分振蕩使培養(yǎng)物中的綠膿菌素溶解于三氯甲烷液內(nèi),待三氯甲烷提取液呈藍

色時,用吸管將三氯甲烷提取液移到另一試管中并加入1mol/L的鹽酸1mL,振蕩后,靜置片刻。如上層鹽酸

液內(nèi)出現(xiàn)粉紅色到紫紅色時判為陽性,表示被檢樣品中有綠膿菌素存在。若結(jié)果為陰性，則繼續(xù)進行硝

酸鹽還原產(chǎn)氣試驗、明膠液化試驗和42℃生長試驗。

7.3.2.3硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗

挑取營養(yǎng)瓊脂平板上的純培養(yǎng)物，接種到硝酸鹽蛋白胨水中，置36℃±1℃分別培養(yǎng)24h±2h，小

導管中有氣體產(chǎn)生，判為陽性。

7.3.2.4明膠液化試驗

挑取營養(yǎng)瓊脂平板上的純培養(yǎng)物，劃線接種到明膠培養(yǎng)基中，置36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，取出放

2℃～8℃冰箱10min～30min，仍呈溶液狀為明膠液化試驗陽性，凝固不溶為陰性。

7.3.2.542℃生長試驗

挑取營養(yǎng)瓊脂平板上的純培養(yǎng)物，接種到普通營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，置42℃±1℃培養(yǎng)24h～48h，

能生長判為陽性。

7.3.2.6綠膿桿菌生化特征

綠膿桿菌生化特征見表2。或可用生化鑒定試劑盒進行綠膿桿菌生化鑒定，具體操作依據(jù)綠膿桿菌

生化鑒定試劑盒說明書。

表2綠膿桿菌生化特征

生化試驗綠膿桿菌

氧化酶+

綠膿菌素試驗+/-

硝酸鹽還原產(chǎn)氣+

明膠液化+

42℃生長+

注：“+”表示陽性；“?”表示陰性。

7.3.3輔助鑒定

可根據(jù)實驗室情況，選用全自動細菌鑒定系統(tǒng)或飛行時間質(zhì)譜儀等進行鑒定，具體操作依據(jù)標準

GB/T33682和設(shè)備操作規(guī)范進行。

8結(jié)果報告

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綜合生化鑒定結(jié)果和輔助鑒定結(jié)果，報告25g（cm2）動物墊料樣品中檢出或未檢出綠膿桿菌。

9生物安全措施

為了保護實驗人員安全，應由具備資格的工作人員檢測致病菌，所有培養(yǎng)物應小心處置，應按照GB

19489的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

10廢棄物處理和防治污染的措施

檢測過程中的廢棄物需經(jīng)121℃高壓滅菌處理至少30min后再棄置。

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附錄A

（規(guī)范性）

培養(yǎng)基和試劑

A.1培養(yǎng)基制備及質(zhì)量保證

按照SN/T1538.1和SN/T1538.2執(zhí)行，并對制備好的培養(yǎng)基進行性能測試，如使用等效的脫水合成

培養(yǎng)基，使用前對其進行驗收并按其說明書使用。

A.2SCDLP增菌液

A.2.1成分

酪蛋白胨17.0g

大豆蛋白胨3.0g

氯化鈉5.0g

磷酸氫二鉀2.5g

葡萄糖2.5g

卵磷脂1.0g

吐溫-807.0g

蒸餾水1000mL

A.2.2制法

將上述各成分加熱煮沸至完全溶解，調(diào)節(jié)pH至7.2～7.3，分裝適宜容器，121℃高壓滅菌20min。

A.3假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基

A.3.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基

A.3.1.1成分

蛋白質(zhì)20.0g

硫酸鉀10.0g

氯化鎂1.4g

十六烷三甲基溴化胺0.3g

瓊脂13.6g

丙三醇10mL

蒸餾水1000m

A.3.1.2制法

除瓊脂外，將其余成分溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.2±0.2加熱溶解，分裝適宜容器，121℃高壓

滅菌15min，備用。

A.3.2CFC添加劑

A.3.2.1成分

十六烷三甲基溴化胺5.0mg

頭孢菌素25.0mg

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DB15/T2076—2021

夫西地酸50.0mg

A.3.2.2制法

取無菌水和無水乙醇各1mL混合均勻，將上述成分溶解于混合液中，搖勻備用。

A.3.3使用方法

待基礎(chǔ)培養(yǎng)基冷卻至50℃左右，每500mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入2mL添加劑，傾注無菌平板。

A.4假單胞菌CN選擇性培養(yǎng)基

A.4.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基

A.4.1.1成分

蛋白胨16.0g

水解酪蛋白10.0g

硫酸鉀10.0g

氯化鎂1.4g

瓊脂15.0g

蒸餾水1000mL

A.4.1.2制法

除瓊脂外，將其余成分溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.2±0.2，加入瓊脂，加熱溶解，分裝適宜容器

121℃高壓滅菌15min，備用。

A.4.2CN添加劑

A.4.2.1成分

十六烷三甲基溴化胺100.0mg

無菌水1mL

無水乙醇1mL

A.4.2.2制法

取無菌水和無水乙醇各1mL混合均勻，將上述成分溶解于混合液中，搖勻備用。

A.4.3使用方法

待基礎(chǔ)培養(yǎng)基冷卻至50℃左右，500mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入2mL添加劑，搖勻后傾注平板。

A.5氧化酶試驗

A.5.1試劑

1％鹽酸二甲基對苯二胺溶液:少量新鮮配制，于冰箱內(nèi)避光保存。

1％a-萘酚乙醇溶液。

A.5.2試驗方法

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取白色潔凈濾紙沾取菌落，加鹽酸二甲基對苯二胺溶液1滴，陽性結(jié)果呈現(xiàn)粉紅色，并逐漸加深；

再加a-萘酚乙醇溶液1滴，陽性結(jié)果在0.5min內(nèi)呈現(xiàn)鮮藍色，陰性結(jié)果2min內(nèi)不變色?；蛴妹毠芪?/p>

取試劑，直接滴加于菌落上，其顯色反應與以上相同。

A.6革蘭氏染液

A.6.1染液制備

A.6.1.1結(jié)晶紫染色液

結(jié)晶紫1.0g

95%乙醇20mL

1%草酸銨水溶液80mL

將結(jié)晶紫溶于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。

A.6.1.2革蘭氏碘液

碘1.0g

碘化鉀2.0g

蒸餾水加至300mL

將碘與碘化鉀先進行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL。

A.6.1.3脫色液

95%乙醇。

A.6.1.4復染液

A.6.1.4.1沙黃復染液

沙黃0.25g

95%乙醇10mL

蒸餾水90mL

將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。

A.6.1.4.2石碳酸復紅工作液

稱取堿性復紅10g，研細，加95%乙醇100mL放置過夜，濾紙過濾。取該液10mL，加5%石碳酸水溶

液90mL混合，即為石碳酸復紅原液。再取此液10mL加水90mL，即為石碳酸復紅工作液。

A.6.2染色法

A.6.2.1將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染1min，水洗。

A.6.2.2滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗。

A.6.2.3滴加95%乙醇脫色，約30s或?qū)⒁掖嫉螡M整個涂片，立即傾去，再用乙醇滴滿整個涂片，脫

色10s，水洗。

A.6.2.4滴加沙黃或石碳酸復紅復染液，復染30s~1min，水洗，自然干燥，油鏡鏡檢。

A.7綠膿菌素測定培養(yǎng)基

A.7.1成分

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蛋白胨20.0g

氯化鎂1.4g

硫酸鉀10.0g

瓊脂18.0g

甘油10.0g

蒸餾水1000mL

A.7.2制法

將蛋白胨、氯化鎂和硫酸鉀加到蒸餾水中，加熱使其溶解，調(diào)節(jié)pH至7.4，加入瓊脂和甘油，加熱

溶解，分裝于試管內(nèi)，115℃高壓滅菌20min后，制成斜面?zhèn)溆谩?/p>

A.8硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基

A.8.1成分

蛋白胨10.0g

酵母浸膏3.0g

硝酸鉀