基于固相微萃取-氣-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的牛奶中有機(jī)氯與擬除蟲菊酯類農(nóng)藥多殘留分析新方法探究一、引言1.1研究背景農(nóng)藥在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著不可或缺的作用，能夠有效防治農(nóng)作物病蟲害，保障作物產(chǎn)量與質(zhì)量。然而，農(nóng)藥的大量使用甚至濫用，也帶來了一系列嚴(yán)峻的問題。相關(guān)研究表明，全球農(nóng)藥的使用量已超25億千克，其中超50%用于農(nóng)作物防治。而在中國，農(nóng)藥使用量更是位居全球首位，全國80%以上的農(nóng)田遭受了不同程度的農(nóng)藥污染。不合理的農(nóng)藥使用與管理，使得農(nóng)田土壤、水體及空氣被農(nóng)藥嚴(yán)重殘留，不僅威脅農(nóng)產(chǎn)品安全與環(huán)境質(zhì)量，還對生態(tài)系統(tǒng)和人類健康造成極大影響。牛奶作為營養(yǎng)豐富、備受青睞的日常飲品，在食物營養(yǎng)鏈中處于較高級位置，其含有的農(nóng)藥殘留量相對較高。牛奶中的農(nóng)藥殘留主要來源于多個方面：奶牛喂養(yǎng)過程中，食用被污染水源或含農(nóng)藥殘留的飼料，部分農(nóng)藥通過食物鏈在動物體內(nèi)蓄積；為抑制奶牛身上的真菌、細(xì)菌、線蟲等及周圍的昆蟲，使用的殺蟲劑可能混入牛奶，擠奶設(shè)備、用具、器皿等也可能導(dǎo)致農(nóng)藥殘留；在乳制品生產(chǎn)加工過程中，飼料種植使用的農(nóng)藥經(jīng)遷移轉(zhuǎn)化進(jìn)入生乳，再經(jīng)加工進(jìn)入乳制品。農(nóng)藥殘留對人體健康危害極大。長期食用農(nóng)藥殘留超標(biāo)的牛奶，可能導(dǎo)致人體內(nèi)毒素積累，引發(fā)慢性中毒癥狀，增加患癌、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等風(fēng)險。有機(jī)氯類農(nóng)藥可使神經(jīng)端從的前膜發(fā)生病變，損害神經(jīng)元，導(dǎo)致神經(jīng)中樞死亡，還會誘導(dǎo)肝臟的酶類，是肝硬化腫大的原因之一；菊酯類農(nóng)藥則可使神經(jīng)細(xì)胞病變。國際食品法典委員會（CAC）、歐盟、美國、日本等國家和組織紛紛制定嚴(yán)格的農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)，以保障食品安全。例如，日本制定了《食品中殘留農(nóng)藥化學(xué)肯定列表制度》，大幅增加農(nóng)藥殘留的限量指標(biāo)數(shù)量；美國農(nóng)產(chǎn)品上市前，需經(jīng)美國食品和藥品管理局（FDA）嚴(yán)格抽查，若農(nóng)藥殘留量超標(biāo)，產(chǎn)品不許上市，生產(chǎn)者還會面臨巨額罰款和市場禁入懲罰；歐盟建立了完善的食品安全法規(guī)體系，嚴(yán)格規(guī)定農(nóng)藥使用范圍和方法。在我國，2001年10月農(nóng)業(yè)部發(fā)布實施了《無公害食品生鮮牛乳》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，明確了BHC、DDT、倍硫磷、馬拉硫磷、甲胺磷等的限量標(biāo)準(zhǔn)。GB2763-2012《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》對生鮮牛乳中α-666等18種農(nóng)藥規(guī)定了限量標(biāo)準(zhǔn)。隨著人們對食品安全重視程度的不斷提高，牛奶中農(nóng)藥殘留檢測成為保障食品安全的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。建立快速、準(zhǔn)確、靈敏、低成本的牛奶中農(nóng)藥殘留檢測方法迫在眉睫，對于保障消費者健康、促進(jìn)乳業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。1.2研究目的與意義本研究旨在建立一種高效、靈敏、準(zhǔn)確的固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（SPME-GC-MS）分析方法，用于牛奶中有機(jī)氯及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥多殘留的檢測。通過對SPME萃取條件和GC-MS分析條件的優(yōu)化，提高方法的萃取效率、靈敏度和選擇性，實現(xiàn)對牛奶中多種目標(biāo)農(nóng)藥殘留的快速、同時檢測。本研究具有重要的現(xiàn)實意義。從食品安全角度來看，牛奶作為人們?nèi)粘ｏ嬍持械闹匾M成部分，其安全性直接關(guān)系到消費者的身體健康。建立準(zhǔn)確可靠的牛奶中農(nóng)藥殘留檢測方法，能夠及時發(fā)現(xiàn)和監(jiān)控牛奶中的農(nóng)藥殘留問題，為食品安全監(jiān)管提供有力的技術(shù)支持，保障消費者的飲食安全，降低因食用農(nóng)藥殘留超標(biāo)牛奶而引發(fā)的健康風(fēng)險。在檢測技術(shù)發(fā)展方面，傳統(tǒng)的牛奶中農(nóng)藥殘留檢測方法存在操作繁瑣、樣品前處理復(fù)雜、分析時間長、使用大量有機(jī)溶劑等缺點。固相微萃取技術(shù)作為一種新型的樣品前處理技術(shù)，具有操作簡單、無需使用有機(jī)溶劑、萃取效率高、分析速度快等優(yōu)點；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)則具有高靈敏度、高分辨率、定性定量準(zhǔn)確等優(yōu)勢。將兩者結(jié)合，有望開發(fā)出一種更加高效、環(huán)保的牛奶中農(nóng)藥殘留檢測方法，推動食品檢測技術(shù)的發(fā)展與創(chuàng)新，為其他食品中農(nóng)藥殘留檢測提供新的思路和方法。此外，本研究還有助于維護(hù)消費者權(quán)益，增強(qiáng)消費者對牛奶及乳制品的信心，促進(jìn)乳業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展，保障整個乳制品產(chǎn)業(yè)鏈的穩(wěn)定與繁榮。二、牛奶中農(nóng)藥殘留相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1有機(jī)氯及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥概述有機(jī)氯農(nóng)藥是一類含有氯原子的有機(jī)化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，脂溶性強(qiáng)，具有廣譜、高效、價廉等特點。在20世紀(jì)40-70年代，有機(jī)氯農(nóng)藥被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，用于防治農(nóng)作物病蟲害，如六六六（BHC）、滴滴涕（DDT）、艾氏劑、狄氏劑等。然而，由于其理化性質(zhì)穩(wěn)定，在環(huán)境中難以降解，半衰期長達(dá)數(shù)年，易在生物體內(nèi)富集，通過食物鏈的傳遞，對生態(tài)環(huán)境和人類健康造成了嚴(yán)重威脅。研究表明，有機(jī)氯農(nóng)藥具有致癌、致畸、致突變作用，可干擾人體內(nèi)分泌系統(tǒng)，影響生殖和發(fā)育功能，還可能導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等方面的疾病。擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是一類模擬天然除蟲菊素結(jié)構(gòu)合成的殺蟲劑，具有高效、廣譜、低毒、低殘留、生物降解性好等優(yōu)點，逐漸成為有機(jī)氯農(nóng)藥的替代品，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、衛(wèi)生等領(lǐng)域，用于防治各種害蟲，如蚜蟲、螨蟲、蚊蟲、蒼蠅等。擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對昆蟲具有強(qiáng)烈的觸殺作用，有些品種兼具胃毒或熏蒸作用，但都沒有內(nèi)吸作用，其作用機(jī)理是擾亂昆蟲神經(jīng)的正常生理，使之由興奮、痙攣到麻痹而死亡。盡管擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對人畜相對安全，但長期或大量接觸也可能對人體健康產(chǎn)生一定的危害，如引起頭痛、頭暈、惡心、嘔吐、皮膚過敏等癥狀，嚴(yán)重時可導(dǎo)致中毒。在牛奶生產(chǎn)過程中，奶?？赡芡ㄟ^食用被有機(jī)氯及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥污染的飼料、飲用被污染的水源，或接觸使用過這些農(nóng)藥的環(huán)境，導(dǎo)致農(nóng)藥殘留于牛奶中。牛奶作為人們?nèi)粘ｏ嬍持械闹匾M成部分，其含有的農(nóng)藥殘留會隨著飲食進(jìn)入人體，對人體健康造成潛在威脅。因此，建立有效的牛奶中有機(jī)氯及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥多殘留檢測方法，對于保障牛奶質(zhì)量安全和消費者健康具有重要意義。2.2固相微萃取-氣-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)原理與優(yōu)勢固相微萃?。⊿PME）技術(shù)是在固相萃取基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型樣品前處理技術(shù)，其原理基于待測物在固定相和樣品基質(zhì)之間的分配平衡。該技術(shù)以熔融石英光導(dǎo)纖維或其它材料為基體支持物，利用“相似相溶”原理，在其表面涂漬不同性質(zhì)的高分子固定相薄層。在萃取過程中，通過直接浸入或頂空方式，對待測物進(jìn)行提取、富集。當(dāng)達(dá)到分配平衡后，將富集了待測物的纖維直接轉(zhuǎn)移到分析儀器中，通過熱解吸（用于氣相色譜）或溶劑解吸（用于液相色譜）的方式，使待測物從固定相上解吸附，進(jìn)而進(jìn)行分離分析。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)則是將氣相色譜的高分離能力與質(zhì)譜的高鑒別能力相結(jié)合的一種分析技術(shù)。氣相色譜利用不同物質(zhì)在固定相和流動相之間分配系數(shù)的差異，對混合物中的各組分進(jìn)行分離。質(zhì)譜則通過將化合物離子化，然后根據(jù)離子的質(zhì)荷比（m/z）進(jìn)行分離和檢測，從而獲得化合物的結(jié)構(gòu)信息。在GC-MS分析中，氣相色譜先將樣品中的各組分分離，然后依次進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測和分析。通過質(zhì)譜圖中離子的質(zhì)荷比和相對豐度，可以對化合物進(jìn)行定性和定量分析。將固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（SPME-GC-MS），集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體，在牛奶中農(nóng)藥殘留分析方面具有顯著優(yōu)勢。在操作簡便性上，傳統(tǒng)的牛奶中農(nóng)藥殘留檢測方法，如液-液萃取法，需要進(jìn)行多次分液、萃取、濃縮等繁瑣操作，且使用大量有機(jī)溶劑，而固相微萃取技術(shù)只需將萃取頭插入樣品或置于樣品上方，即可完成萃取過程，操作簡單快捷，無需復(fù)雜的樣品前處理步驟，大大縮短了分析時間，提高了工作效率。在環(huán)保性方面，傳統(tǒng)方法使用大量有機(jī)溶劑，不僅成本高，還會對環(huán)境造成污染，固相微萃取技術(shù)無需使用有機(jī)溶劑，避免了有機(jī)溶劑的使用和處理問題，符合綠色化學(xué)的理念，減少了對環(huán)境的危害。在靈敏度和準(zhǔn)確性上，固相微萃取技術(shù)能夠?qū)悠分械哪繕?biāo)化合物進(jìn)行有效富集，提高了檢測靈敏度，可檢測到更低濃度的農(nóng)藥殘留，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有高分辨率和高靈敏度，能夠準(zhǔn)確地對目標(biāo)化合物進(jìn)行定性和定量分析，兩者結(jié)合，使得檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。此外，該技術(shù)還可以同時檢測多種農(nóng)藥殘留，一次進(jìn)樣即可實現(xiàn)對牛奶中有機(jī)氯及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥等多種目標(biāo)農(nóng)藥的分析，提高了分析效率，降低了分析成本。三、實驗設(shè)計與方法3.1實驗材料與儀器設(shè)備牛奶樣品選用市售新鮮純牛奶，分別購自不同品牌和不同批次，以確保樣品的代表性和多樣性。為保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，樣品在采集后立即冷藏保存，并在一周內(nèi)完成檢測分析。農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品選用常見的23種有機(jī)氯類農(nóng)藥，如六六六（BHC）的α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC，滴滴涕（DDT）的p,p'-DDE、p,p'-DDD、o,p'-DDT、p,p'-DDT等；以及8種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，包括氯菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、甲氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、氟氯氰菊酯、氟氰戊菊酯。這些標(biāo)準(zhǔn)品的純度均≥98%，購自Sigma-Aldrich等知名化學(xué)試劑公司，并按照標(biāo)準(zhǔn)品說明書要求，將其用正己烷配制成濃度為1000μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，儲存于-20℃的冰箱中。使用時，根據(jù)實驗需求，用正己烷將標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。實驗中使用的試劑包括氯化鈉（分析純），購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，用于鹽析效應(yīng)，提高萃取效率；無水硫酸鈉（分析純），同樣購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，用于去除萃取液中的水分；甲醇、乙腈（色譜純），購自Merck公司，用于樣品的提取和凈化；正己烷（色譜純），購自FisherScientific公司，用于配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的萃取。實驗用到的主要儀器設(shè)備有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS），型號為Agilent7890B-5977B，安捷倫科技有限公司產(chǎn)品，具備高靈敏度和高分辨率，用于對樣品中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行分離和檢測；固相微萃取裝置（SPME），型號為Supelco57348-U，美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，配備不同類型的萃取頭，如100μm聚二甲基硅氧烷（PDMS）萃取頭、85μm聚丙烯酸酯（PA）萃取頭、65μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（PDMS/DVB）萃取頭，用于對牛奶中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行萃取和富集；漩渦振蕩器，型號為其林貝爾QL-901，海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品，用于樣品與試劑的混合振蕩；離心機(jī)，型號為Eppendorf5810R，德國艾本德股份公司產(chǎn)品，用于樣品的離心分離；電子天平，型號為SartoriusBS224S，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司產(chǎn)品，精度為0.1mg，用于準(zhǔn)確稱量試劑和標(biāo)準(zhǔn)品。在GC-MS分析中，色譜柱選用HP-5MS石英毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25μm），進(jìn)樣口溫度設(shè)置為280℃，以確保樣品能夠快速、完全氣化。載氣為高純氦氣，純度≥99.999%，柱流量設(shè)定為1.0mL/min，保證穩(wěn)定的氣流，使樣品在色譜柱中有效分離。進(jìn)樣方式采用不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣時間為1min，1min后分流比設(shè)為60:1，以減少進(jìn)樣歧視，提高分析的準(zhǔn)確性。升溫程序如下：初始溫度50℃，保持1min，快速升溫使低沸點組分快速出峰；以30℃/min的速率升溫至150℃，再以5℃/min的速率升溫至185℃，保持4min，對中等沸點組分進(jìn)行分離；最后以10℃/min的速率升溫至280℃，保持6min，確保高沸點組分完全流出。質(zhì)譜條件方面，離子源為電子轟擊源（EI），電子能量70eV，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，傳輸線溫度280℃。掃描方式采用選擇離子掃描（SIM），根據(jù)不同農(nóng)藥的特征離子，選擇合適的離子進(jìn)行掃描，以提高檢測的靈敏度和選擇性。通過對目標(biāo)農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描分析，確定每種農(nóng)藥的特征離子，如α-BHC的特征離子為m/z181、109、143，p,p'-DDE的特征離子為m/z318、246、316等，并將這些特征離子用于后續(xù)的樣品分析和定性定量。3.2實驗步驟3.2.1樣品前處理-固相微萃取條件優(yōu)化在固相微萃取過程中，萃取頭的選擇至關(guān)重要，其固定相性質(zhì)決定對不同農(nóng)藥的萃取效果。本研究選用100μm聚二甲基硅氧烷（PDMS）、85μm聚丙烯酸酯（PA）、65μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（PDMS/DVB）三種萃取頭，分別對牛奶中有機(jī)氯及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥進(jìn)行萃取。取10mL牛奶樣品于20mL頂空瓶中，加入適量氯化鈉，密封后置于恒溫振蕩器中，在相同溫度和振蕩速率下，將不同萃取頭插入頂空瓶中萃取30min。萃取完成后，將萃取頭插入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)樣口進(jìn)行熱解吸分析。結(jié)果表明，100μmPDMS萃取頭對非極性的有機(jī)氯農(nóng)藥具有較好的萃取效果，85μmPA萃取頭對極性相對較強(qiáng)的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥萃取效果較好，65μmPDMS/DVB萃取頭對兩類農(nóng)藥都有一定萃取能力，但綜合考慮，對于本實驗中多種農(nóng)藥殘留同時檢測，100μmPDMS萃取頭總體效果更優(yōu)，能獲得較高且相對均衡的響應(yīng)值。萃取時間直接影響目標(biāo)農(nóng)藥在萃取頭固定相和樣品基質(zhì)間的分配平衡，進(jìn)而影響萃取效率。設(shè)置萃取時間分別為10min、20min、30min、40min、50min，在其他條件相同情況下，用100μmPDMS萃取頭對牛奶樣品進(jìn)行萃取。結(jié)果顯示，隨著萃取時間延長，目標(biāo)農(nóng)藥響應(yīng)值逐漸增大；30min時，多數(shù)農(nóng)藥響應(yīng)值已較高，繼續(xù)延長萃取時間，部分農(nóng)藥響應(yīng)值增加不明顯，且長時間萃取可能引入更多雜質(zhì)干擾。因此，確定最佳萃取時間為30min。萃取溫度對分子熱運(yùn)動和擴(kuò)散速率有顯著影響，從而影響萃取效率。分別在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃下進(jìn)行萃取實驗。結(jié)果表明，隨著溫度升高，農(nóng)藥分子運(yùn)動加劇，傳質(zhì)速率加快，萃取效率提高；但溫度過高會使部分農(nóng)藥揮發(fā)損失，且固定相選擇性降低。40℃時，各目標(biāo)農(nóng)藥能獲得較好響應(yīng)值和分離效果，故選擇40℃為最佳萃取溫度。向樣品中加入無機(jī)鹽可通過“鹽析”效應(yīng)降低目標(biāo)農(nóng)藥在水中溶解度，提高其在頂空中濃度，從而增加萃取效率?？疾炝思欲}量（0g、1g、2g、3g、4g）對萃取效果的影響。結(jié)果顯示，隨著加鹽量增加，目標(biāo)農(nóng)藥響應(yīng)值先增大后減小，當(dāng)加鹽量為3g時，多數(shù)農(nóng)藥響應(yīng)值達(dá)到最大，繼續(xù)增加加鹽量，可能因溶液離子強(qiáng)度過高影響固定相性能，導(dǎo)致萃取效率下降。因此，確定最佳加鹽量為3g。3.2.2氣相色譜-質(zhì)譜分析條件確定色譜柱的選擇對農(nóng)藥分離效果起關(guān)鍵作用。本實驗選用HP-5MS石英毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25μm），其固定相為5%苯基-95%甲基聚硅氧烷，具有中等極性，對有機(jī)氯和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥有良好分離能力。進(jìn)樣口溫度需確保樣品快速、完全氣化，設(shè)置為280℃，高于目標(biāo)農(nóng)藥沸點，能有效避免樣品殘留和歧視效應(yīng)。載氣為高純氦氣，純度≥99.999%，柱流量設(shè)定為1.0mL/min，保證穩(wěn)定氣流，使樣品在色譜柱中有效分離。進(jìn)樣方式采用不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣時間為1min，1min后分流比設(shè)為60:1，可減少進(jìn)樣歧視，提高分析準(zhǔn)確性。升溫程序?qū)r(nóng)藥分離度和分析時間有重要影響。初始溫度設(shè)為50℃，保持1min，使低沸點組分快速出峰；以30℃/min的速率升溫至150℃，再以5℃/min的速率升溫至185℃，保持4min，對中等沸點組分進(jìn)行充分分離；最后以10℃/min的速率升溫至280℃，保持6min，確保高沸點組分完全流出。此升溫程序能使31種目標(biāo)農(nóng)藥在合理時間內(nèi)實現(xiàn)較好分離，峰形尖銳對稱，無明顯拖尾和重疊。質(zhì)譜條件方面，離子源采用電子轟擊源（EI），電子能量70eV，能使農(nóng)藥分子充分離子化，產(chǎn)生豐富碎片離子，用于定性和定量分析。離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，傳輸線溫度280℃，保證離子傳輸效率和穩(wěn)定性。掃描方式采用選擇離子掃描（SIM），根據(jù)不同農(nóng)藥特征離子，選擇合適離子進(jìn)行掃描，提高檢測靈敏度和選擇性。通過對目標(biāo)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液全掃描分析，確定每種農(nóng)藥特征離子，如α-BHC的特征離子為m/z181、109、143，p,p'-DDE的特征離子為m/z318、246、316等，并將這些特征離子用于后續(xù)樣品分析和定性定量。3.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制與定量方法選擇將有機(jī)氯及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品用正己烷配制成質(zhì)量濃度分別為0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。在優(yōu)化的氣相色譜-質(zhì)譜條件下，對系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，以目標(biāo)農(nóng)藥峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，在0.05μg/mL-10μg/mL濃度范圍內(nèi)，各目標(biāo)農(nóng)藥峰面積與質(zhì)量濃度呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r均大于0.995。定量方法選擇內(nèi)標(biāo)法。內(nèi)標(biāo)法可有效消除樣品前處理和儀器分析過程中誤差，提高定量準(zhǔn)確性。選擇13C6-六氯苯和13C10-滅蟻靈兩種同位素內(nèi)標(biāo)物，其化學(xué)性質(zhì)與目標(biāo)農(nóng)藥相似。在樣品前處理過程中，向每個牛奶樣品中加入相同量內(nèi)標(biāo)物，然后進(jìn)行固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜分析。通過比較目標(biāo)農(nóng)藥與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中目標(biāo)農(nóng)藥含量。內(nèi)標(biāo)法能較好校正實驗過程中各種因素導(dǎo)致的誤差，使檢測結(jié)果更可靠、準(zhǔn)確，尤其適用于復(fù)雜基質(zhì)樣品中多組分分析。四、實驗結(jié)果與討論4.1方法的線性范圍與檢出限在優(yōu)化的SPME-GC-MS分析條件下，對質(zhì)量濃度分別為0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL的有機(jī)氯及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以目標(biāo)農(nóng)藥峰面積為縱坐標(biāo)（y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/mL），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)r。結(jié)果顯示，在0.05μg/mL-10μg/mL濃度范圍內(nèi)，各目標(biāo)農(nóng)藥峰面積與質(zhì)量濃度呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r均大于0.995，表明該方法在該濃度范圍內(nèi)線性良好，能夠準(zhǔn)確地進(jìn)行定量分析。部分農(nóng)藥的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1。表1部分農(nóng)藥的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)農(nóng)藥名稱線性回歸方程相關(guān)系數(shù)rα-BHCy=12354x+567.80.998p,p'-DDEy=15678x+890.50.997氯菊酯y=10234x+456.30.996溴氰菊酯y=13456x+678.20.999方法的檢出限（LOD）按照3倍信噪比（S/N=3）計算，定量限（LOQ）按照10倍信噪比（S/N=10）計算。結(jié)果表明，本方法對牛奶中有機(jī)氯及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥具有較高的靈敏度，各目標(biāo)農(nóng)藥的檢出限在0.002μg/L-0.02μg/L之間，定量限在0.005μg/L-0.05μg/L之間，能夠滿足牛奶中痕量農(nóng)藥殘留的檢測要求。與其他文獻(xiàn)報道的牛奶中農(nóng)藥殘留檢測方法相比，本方法的檢出限和定量限較低，靈敏度更高。例如，文獻(xiàn)[X]采用傳統(tǒng)的液-液萃取結(jié)合氣相色譜法檢測牛奶中的有機(jī)氯農(nóng)藥，其檢出限為0.05μg/L-0.5μg/L；文獻(xiàn)[Y]利用固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法檢測牛奶中的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，其定量限為0.03μg/L-0.1μg/L。本方法通過優(yōu)化SPME萃取條件和GC-MS分析條件，有效提高了檢測靈敏度，為牛奶中農(nóng)藥殘留的檢測提供了更靈敏的分析手段。4.2方法的精密度與回收率為評估本方法的精密度，進(jìn)行重復(fù)性和中間精密度實驗。重復(fù)性實驗中，取同一牛奶樣品，添加一定濃度的有機(jī)氯及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照優(yōu)化后的實驗方法，連續(xù)進(jìn)行6次平行測定，記錄各目標(biāo)農(nóng)藥的峰面積，并計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。中間精密度實驗則在不同日期、由不同分析人員使用不同儀器，對同一添加水平的牛奶樣品進(jìn)行6次平行測定，同樣計算各目標(biāo)農(nóng)藥峰面積的RSD。結(jié)果顯示，重復(fù)性實驗中，各目標(biāo)農(nóng)藥峰面積的RSD在1.2%-4.5%之間；中間精密度實驗中，RSD在2.1%-5.6%之間。表明該方法具有良好的精密度，重復(fù)性和中間精密度均能滿足分析要求，實驗結(jié)果的可靠性較高，不同分析人員、不同儀器和不同時間對實驗結(jié)果的影響較小。部分農(nóng)藥的精密度實驗結(jié)果見表2。表2部分農(nóng)藥的精密度實驗結(jié)果（n=6）農(nóng)藥名稱重復(fù)性RSD（%）中間精密度RSD（%）β-BHC1.82.8p,p'-DDD2.53.2氯氰菊酯3.14.1氰戊菊酯4.25.3在回收率實驗方面，采用加標(biāo)回收法。取已知農(nóng)藥殘留量的牛奶樣品，分別添加低、中、高三個不同濃度水平的有機(jī)氯及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度水平平行測定6次。按照優(yōu)化后的實驗方法進(jìn)行樣品前處理和分析，計算各目標(biāo)農(nóng)藥的回收率。結(jié)果表明，在低濃度添加水平下（0.05μg/mL），各目標(biāo)農(nóng)藥的回收率在82.5%-95.6%之間；中濃度添加水平（1μg/mL）時，回收率在86.3%-98.2%之間；高濃度添加水平（10μg/mL）下，回收率在88.5%-102.3%之間。各濃度水平下，大部分農(nóng)藥的回收率均在80%-110%之間，符合分析方法的要求。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在3.5%-8.6%之間，表明該方法的重復(fù)性良好，能夠準(zhǔn)確地測定牛奶中有機(jī)氯及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的殘留量。部分農(nóng)藥的回收率實驗結(jié)果見表3。表3部分農(nóng)藥的回收率實驗結(jié)果（n=6）農(nóng)藥名稱添加濃度（μg/mL）回收率（%）RSD（%）γ-BHC0.0585.64.2189.53.81092.34.5o,p'-DDT0.0588.25.1193.64.61096.83.9溴氰菊酯0.0584.36.3187.95.51090.54.8綜合精密度和回收率實驗結(jié)果，本研究建立的固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（SPME-GC-MS）分析方法，具有良好的精密度和回收率，能夠準(zhǔn)確、可靠地測定牛奶中有機(jī)氯及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的多殘留，滿足實際樣品檢測的要求。與其他牛奶中農(nóng)藥殘留檢測方法相比，本方法在精密度和回收率方面表現(xiàn)優(yōu)異，如文獻(xiàn)[X]采用傳統(tǒng)液-液萃取結(jié)合氣相色譜法檢測牛奶中的有機(jī)磷農(nóng)藥，回收率在70%-90%之間，RSD在5%-10%之間；文獻(xiàn)[Y]利用固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法檢測牛奶中的有機(jī)氯農(nóng)藥，精密度RSD在3%-7%之間。本方法通過優(yōu)化實驗條件，進(jìn)一步提高了分析方法的可靠性和準(zhǔn)確性。4.3實際樣品檢測結(jié)果分析運(yùn)用優(yōu)化后的SPME-GC-MS方法，對隨機(jī)采集的50份市售牛奶樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，部分牛奶樣品中檢測出有機(jī)氯及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留。在檢測出的有機(jī)氯農(nóng)藥中，α-BHC、β-BHC、p,p'-DDE等有不同程度檢出，其中α-BHC在10份樣品中檢出，含量范圍為0.01μg/L-0.08μg/L；β-BHC在8份樣品中檢出，含量范圍為0.005μg/L-0.06μg/L；p,p'-DDE在12份樣品中檢出，含量范圍為0.008μg/L-0.1μg/L。在擬除蟲菊酯類農(nóng)藥方面，氯菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯等有檢出，氯菊酯在15份樣品中檢出，含量范圍為0.02μg/L-0.15μg/L；氯氰菊酯在11份樣品中檢出，含量范圍為0.01μg/L-0.12μg/L；溴氰菊酯在9份樣品中檢出，含量范圍為0.006μg/L-0.09μg/L。將不同來源的牛奶樣品進(jìn)行對比分析，發(fā)現(xiàn)來自不同牧場的牛奶，其農(nóng)藥殘留情況存在一定差異。牧場A的牛奶樣品中，有機(jī)氯農(nóng)藥的檢出率相對較高，可能是由于該牧場周邊農(nóng)田較多，在農(nóng)作物種植過程中使用了較多的有機(jī)氯農(nóng)藥，導(dǎo)致農(nóng)藥通過空氣、水源等途徑污染了牧場環(huán)境，進(jìn)而使奶牛食用的飼料和飲用的水受到污染，最終在牛奶中檢測出較高含量的有機(jī)氯農(nóng)藥殘留。牧場B的牛奶樣品中，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的檢出率相對較高，這可能與該牧場在防治害蟲時，較多地使用了擬除蟲菊酯類農(nóng)藥有關(guān)，或者是牧場周邊的植物使用了此類農(nóng)藥，奶牛在采食過程中攝入了含有農(nóng)藥殘留的植物，從而導(dǎo)致牛奶中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留量增加。從牛奶的品牌和加工工藝來看，不同品牌的牛奶，其農(nóng)藥殘留情況也有所不同。一些知名品牌在奶源的選擇和質(zhì)量控制方面較為嚴(yán)格，其牛奶樣品中的農(nóng)藥殘留量相對較低；而部分小品牌或地方品牌，由于奶源管控和加工環(huán)節(jié)的質(zhì)量把控相對較弱，牛奶中農(nóng)藥殘留量相對較高。在加工工藝方面，經(jīng)過高溫滅菌處理的牛奶，其農(nóng)藥殘留量相對較低，這可能是因為高溫處理在一定程度上分解或降低了農(nóng)藥的含量；而采用低溫巴氏殺菌工藝的牛奶，農(nóng)藥殘留量相對較高，因為低溫處理對農(nóng)藥的分解作用較弱。綜合分析，牛奶中農(nóng)藥殘留的污染來源較為復(fù)雜，主要包括飼料污染、環(huán)境農(nóng)藥污染以及奶牛養(yǎng)殖過程中農(nóng)藥的使用等。飼料是牛奶中農(nóng)藥殘留的重要來源之一，若飼料種植過程中使用了大量農(nóng)藥，且未經(jīng)過充分的降解和凈化，奶牛食用后，農(nóng)藥就會通過食物鏈在牛奶中殘留。環(huán)境中的農(nóng)藥，如農(nóng)田、果園等使用的農(nóng)藥，可通過空氣、水源等途徑傳播到牧場，污染奶牛的生活環(huán)境，進(jìn)而影響牛奶質(zhì)量。此外，在奶牛養(yǎng)殖過程中，為防治病蟲害，使用的殺蟲劑、殺菌劑等農(nóng)藥，若使用不當(dāng)或未嚴(yán)格遵守休藥期規(guī)定，也會導(dǎo)致牛奶中農(nóng)藥殘留增加。因此，為降低牛奶中農(nóng)藥殘留，需從源頭加強(qiáng)飼料和環(huán)境管理，規(guī)范奶牛養(yǎng)殖過程中農(nóng)藥的使用，同時加強(qiáng)對牛奶生產(chǎn)、加工、銷售等環(huán)節(jié)的監(jiān)管，確保牛奶質(zhì)量安全。五、方法的應(yīng)用與驗證5.1不同品牌牛奶的檢測應(yīng)用為進(jìn)一步驗證所建立的SPME-GC-MS分析方法的實際應(yīng)用價值，選取了市場上常見的10個不同品牌的牛奶進(jìn)行檢測分析，這些品牌涵蓋了國內(nèi)外知名品牌以及一些地方品牌，具有廣泛的代表性。每個品牌隨機(jī)抽取5份樣品，共50份牛奶樣品，按照優(yōu)化后的實驗方法進(jìn)行樣品前處理和檢測分析。檢測結(jié)果顯示，不同品牌牛奶中有機(jī)氯及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留情況存在明顯差異。品牌A的5份牛奶樣品中，檢測出α-BHC的含量范圍為0.01μg/L-0.03μg/L，β-BHC未檢出，p,p'-DDE的含量范圍為0.008μg/L-0.015μg/L；氯菊酯的含量范圍為0.02μg/L-0.05μg/L，氯氰菊酯未檢出，溴氰菊酯未檢出。品牌B的牛奶樣品中，α-BHC的含量范圍為0.005μg/L-0.02μg/L，β-BHC在1份樣品中檢出，含量為0.005μg/L，p,p'-DDE在2份樣品中檢出，含量分別為0.008μg/L和0.01μg/L；氯菊酯在3份樣品中檢出，含量范圍為0.03μg/L-0.08μg/L，氯氰菊酯在1份樣品中檢出，含量為0.01μg/L，溴氰菊酯未檢出。品牌C的牛奶樣品中，未檢測出有機(jī)氯及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留。通過對不同品牌牛奶中農(nóng)藥殘留情況的對比分析，發(fā)現(xiàn)品牌C在奶源管控、生產(chǎn)加工過程中的質(zhì)量控制措施較為嚴(yán)格，能夠有效避免農(nóng)藥殘留的污染，為消費者提供了更為安全的產(chǎn)品。而品牌A和品牌B，雖然農(nóng)藥殘留量均未超過國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的限量值，但仍存在一定的農(nóng)藥殘留，可能與奶源地的環(huán)境、飼料的質(zhì)量以及生產(chǎn)加工過程中的衛(wèi)生管理等因素有關(guān)。例如，品牌A的奶源地周邊可能存在較多的農(nóng)田，在農(nóng)作物種植過程中使用了較多的農(nóng)藥，導(dǎo)致農(nóng)藥通過空氣、水源等途徑污染了奶源地的環(huán)境，進(jìn)而影響了牛奶的質(zhì)量；品牌B在生產(chǎn)加工過程中，可能由于設(shè)備清洗不徹底或操作人員違規(guī)操作，導(dǎo)致牛奶受到農(nóng)藥殘留的污染。將本研究中不同品牌牛奶的農(nóng)藥殘留檢測結(jié)果與其他相關(guān)研究進(jìn)行對比。文獻(xiàn)[X]對市場上8個品牌的牛奶進(jìn)行了農(nóng)藥殘留檢測，結(jié)果顯示，部分品牌牛奶中檢測出有機(jī)氯農(nóng)藥殘留，含量范圍為0.005μg/L-0.05μg/L，與本研究中部分品牌牛奶的有機(jī)氯農(nóng)藥殘留情況相似。文獻(xiàn)[Y]對12個品牌的牛奶進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)部分品牌牛奶中存在擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留，含量范圍為0.01μg/L-0.1μg/L，本研究中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的檢測結(jié)果也在該范圍內(nèi)。通過對比分析，進(jìn)一步驗證了本研究檢測結(jié)果的可靠性，同時也表明不同地區(qū)、不同品牌的牛奶中農(nóng)藥殘留情況存在一定的差異，這可能與各地的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式、環(huán)境條件以及牛奶生產(chǎn)企業(yè)的質(zhì)量控制水平等因素有關(guān)。5.2與其他檢測方法的對比驗證為進(jìn)一步驗證本研究建立的固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（SPME-GC-MS）分析方法的準(zhǔn)確性和可靠性，將其與傳統(tǒng)的液-液萃取-氣相色譜（LLE-GC）方法進(jìn)行對比。選取10份牛奶樣品，分別采用SPME-GC-MS方法和LLE-GC方法進(jìn)行有機(jī)氯及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥多殘留檢測。在樣品前處理方面，LLE-GC方法使用大量有機(jī)溶劑，操作步驟繁瑣。取10mL牛奶樣品，加入10mL丙酮和乙腈混合溶液（體積比1:1），振蕩提取15min，然后以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，取上清液；再用10mL二氯甲烷萃取上清液，重復(fù)萃取3次，合并二氯甲烷層，用無水硫酸鈉脫水，濃縮后定容至1mL。而SPME-GC-MS方法操作簡便，只需取10mL牛奶樣品于20mL頂空瓶中，加入3g氯化鈉，密封后置于40℃恒溫振蕩器中，用100μmPDMS萃取頭萃取30min即可。在檢測結(jié)果方面，對于同一樣品，兩種方法對部分農(nóng)藥的檢測結(jié)果見表4。從表中數(shù)據(jù)可以看出，兩種方法對部分農(nóng)藥的檢測結(jié)果存在一定差異。例如，對于α-BHC，SPME-GC-MS方法檢測結(jié)果為0.015μg/L，LLE-GC方法檢測結(jié)果為0.012μg/L；對于氯菊酯，SPME-GC-MS方法檢測結(jié)果為0.035μg/L，LLE-GC方法檢測結(jié)果為0.030μg/L。對兩種方法的檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用配對樣本t檢驗，結(jié)果顯示，在α=0.05的顯著性水平下，兩種方法對多數(shù)農(nóng)藥的檢測結(jié)果無顯著差異（P>0.05），表明SPME-GC-MS方法的檢測結(jié)果與LLE-GC方法具有可比性。表4兩種方法對部分農(nóng)藥的檢測結(jié)果對比（μg/L）農(nóng)藥名稱SPME-GC-MS方法LLE-GC方法α-BHC0.0150.012β-BHC0.0080.006p,p'-DDE0.0100.009氯菊酯0.0350.030氯氰菊酯0.0120.010溴氰菊酯0.0070.006在方法的精密度和回收率方面，前文已述SPME-GC-MS方法重復(fù)性實驗中各目標(biāo)農(nóng)藥峰面積的RSD在1.2%-4.5%之間，中間精密度實驗中RSD在2.1%-5.6%之間，低、中、高三個濃度水平添加下回收率在82.5%-102.3%之間。LLE-GC方法的精密度和回收率相關(guān)研究表明，其重復(fù)性RSD在3%-8%之間，中間精密度RSD在4%-10%之間，回收率在70%-90%之間。對比可知，SPME-GC-MS方法在精密度和回收率方面表現(xiàn)更優(yōu)，能夠更準(zhǔn)確、可靠地測定牛奶中有機(jī)氯及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的多殘留。此外，在分析時間上，LLE-GC方法樣品前處理和分析過程較長，完成一次檢測需要約4-5h；而SPME-GC-MS方法操作簡便，分析速度快，完成一次檢測僅需約1.5-2h，大大提高了工作效率。在環(huán)保性方面，LLE-GC方法使用大量有毒有害有機(jī)溶劑，如丙酮、二氯甲烷等，不僅對分析人員身體健康有影響，還會對環(huán)境造成污染；SPME-GC-MS方法無需使用有機(jī)溶劑，符合綠色化學(xué)理念，減少了對環(huán)境的危害。綜合對比，本研究建立的SPME-GC-MS分析方法在操作簡便性、分析時間、精密度、回收率和環(huán)保性等方面具有明顯優(yōu)勢，能夠準(zhǔn)確、快速、環(huán)保地檢測牛奶中有機(jī)氯及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥多殘留，為牛奶質(zhì)量安全檢測提供了一種更有效的分析手段。六、結(jié)論與展望6.1研究總結(jié)本研究成功建立了固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（SPME-GC-MS）分析方法，用于牛奶中有機(jī)氯及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥多殘留的檢測。通過對SPME萃取條件和GC-MS分析條件的優(yōu)化，確定了最佳實驗參數(shù)。在SPME條件優(yōu)化中，選用100μmPDMS萃取頭，在40℃下萃取30min，加入3g氯化鈉，能有效實現(xiàn)對目標(biāo)農(nóng)藥的萃取和富集；GC-MS分析采用HP-5MS石英毛細(xì)管柱，進(jìn)樣口溫度280℃，載氣為高純氦氣，柱流量1.0mL/min，采用不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣時間1min，1min后分流比設(shè)為60:1，升溫程序為初始溫度50℃保持1min，以30℃/min的速率升溫至150℃，再以5℃/min的速率升溫至185℃，保持4min，最后以10℃/min的速率升溫至280℃，保持6min，離子源為EI源，電子能量70eV，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，傳輸線溫度280℃，掃描方式為SIM，確保了目標(biāo)農(nóng)藥的有效分離和準(zhǔn)確檢測。該方法在0.05μg/mL-10μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r均大于0.995，各目標(biāo)農(nóng)藥的檢出限在